Avaliação da influência de insumos de alto e baixo custo na produção de diferentes metabólitos por yarrowia lipolytica para emprego na indústria de alimentos / Evaluation of the influence of high and low cost inputs in the production of different metaboli

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.4,p.20544-20553 apr. 2020. ISSN 2525-8761

Avaliação da influência de insumos de alto e baixo custo na produção de

diferentes metabólitos por yarrowia lipolytica para emprego na indústria de

alimentos

Evaluation of the influence of high and low cost inputs in the production of

different metabolites by yarrowia lipolytica for employment in the food

industry

DOI:10.34117/bjdv6n4-288

Recebimento dos originais:24/03/2020 Aceitação para publicação:22/04/2020

Adejanildo Pereira da Silva Doutor em Ciência de Alimentos

Instituição: Universidade Federal do Rio de Janeiro Endereço: Escola de Química – UFRJ,

Endereço:Av. Athos da Silveira Ramos, 149, Bloco E - Sala E-123 - Ilha do Fundão, Rio de Janeiro - Brasil - CEP 21941-909

E-mail: adejanildosp@gmail.com

Adrian Chaves Beserra Penha Graduando em Engenharia de Bioprocessos Instituição: Universidade Federal do Rio de Janeiro

Endereço: Escola de Química – UFRJ,

E-mail: acbp_adrian14@hotmail.com

Jully Lacerda Fraga Mestre em Ciência de Alimentos

Instituição: Universidade Federal do Rio de Janeiro Endereço: Escola de Química – UFRJ,

Endereço: Av. Athos da Silveira Ramos, 149, Bloco E - Sala E-123 - Ilha do Fundão, Rio de Janeiro - Brasil - CEP 21941-909

E-mail: jully.lfraga@gmail.com

Priscilla Filomena Fonseca Amaral

Doutora em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos Instituição: Universidade Federal do Rio de Janeiro

Endereço: Escola de Química – UFRJ,

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.4,p.20544-20553 apr. 2020. ISSN 2525-8761 RESUMO

A produção de metabólitos por microrganismos é um importante foco de pesquisas científicas na área biotecnológica, e estes produtos têm sido amplamente empregados na indústria de alimentos. Porém, esta produção pode apresentar grandes alterações quando o microrganismo é colocado em diferentes meios de cultura, o principal meio utilizado na fermentação de Yarrowia lipolytica (que é uma levedura) é o YPD e a os materiais que compõem esse meio são obtidos através de empresas fornecedoras. Tais materiais acabam apresentando diferenças quanto a proporção de compostos nitrogenados e outros substratos presentes por serem insumos muito complexos, difíceis de padronizar durante sua produção. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi utilizar a Y. lipolytica para observar como materiais semelhantes de fabricantes diferentes alteram os fatores de produção em 78 horas de cultivo. Os parâmetros avaliados foram crescimento celular, pH do meio e produção de metabólitos que podem ser empregados na indústria de alimentos (lipase extracelular, biossurfactante e ácido cítrico-isocítrico) . Durante o experimento foi possível verificar que o meio de cultura 1 utilizado, apesar de apresentar um menor custo de produção, apresentou maior produção dos metabólitos avaliados, o que indica que não necessariamente materiais com o maior custo de produção acarretam em resultados positivos.

Palavras-chave: Ácido cítrico e isocítrico; Biotecnologia; Leveduras; Meios de cultivo; Lipase extracelular; Biossurfactantes.

ABSTRACT

The production of metabolites by microorganisms is an important focus of scientific research in the biotechnological area, and these products have been widely used in the food industry. However, this production can present major changes when the microorganism is placed in different culture media, the main medium used in the fermentation of Yarrowia lipolytica (which is a yeast) is YPD and the materials that compose this medium are obtained through companies suppliers. Such materials end up showing differences in the proportion of nitrogenous compounds and other substrates present as they are very complex inputs, difficult to standardize during their production. Thus, the aim of this study was to use Y. lipolytica to observe how similar materials from different manufacturers change the factors of production in 78 hours of cultivation. The parameters evaluated were cell growth, pH of the medium and production of metabolites that can be used in the food industry (extracellular lipase, biosurfactant and citric-isocitric acid). During the experiment it was possible to verify that the culture medium 1 used, despite having a lower production cost, presented a higher production of the evaluated metabolites, which indicates that not necessarily materials with the highest production cost lead to positive results.

Keywords: Citric and isocitric acid; Biotechnology; Yeasts; Culture media; Extracellular lipase; Biosurfactants

1 INTRODUÇÃO

As leveduras são capazes de metabolizar compostos nitrogenados, tais como aminoácidos, bases nitrogenadas, uréia e amônio, utilizando-se de vários sistemas de transporte para as diversas fontes (Basso et al. 1996). Segundo Reed (1982) as leveduras possuem uma necessidade nutricional específica, e desta forma o meio de crescimento deve contar com a presença de vitaminas como a biotina, tiamina ou outras. Em laboratório geralmente esta suplementação é feita

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através do extrato de levedo, já em processos comerciais a suplementação é realizada através da adição de compostos minerais solúveis e vitaminas sintéticas, geralmente suplementadas com levedura ou extrato de levedura (Reed, 1982).

É possível que a escolha dos materiais que compõem o meio de cultivo com leveduras tenha forte influência na produção de metabólitos. Diferentes empresas produzem e fornecem substratos utilizados para ferementação em escala laboratorial e estes insumos podem diferir quanto a concentração dos nutrientes necessários para a manutenção do crescimento microbiano, algo que interfere diretamente no metabolismo da levedura e consequentemente nos produtos gerados por esta (assim como as concentrações destes no meio de produção).

A levedura Yarrowia lipolytica é estritamente aeróbia, e possui a capacidade de produzir uma grande gama de metabólitos ativos. É considerado um microrganismo não-patogênico e possui status GRAS, sendo seguro para uso em medicamentos e alimentos segundo a agência que regulamenta os alimentos e medicamentos dos Estados Unidos (FDA) (Barth & Gallardin, 1997). Algumas espécies de Y. lipolytica são capazes de degradar uma grande variedade de compostos orgânicos, incluindo hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos e esta capacidade é frequentemente acompanhada pela pela habilidade de produzir biossurfactantes (Albuquerque et

al., 2006). Os biossurfactante produzido pela Y. lipolytica pode ser caracterizado como um

complexo de lipídeo-carboidrato-proteína com alta atividade de emulsificação e estabilidade em uma ampla faixa de pH (3-9), possuindo a habilidade de formar emulsões óleo-em-água com hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos com perfluorocarbonos (Amaral et al., 2006). Esta substância devido ao status GRAS da Y. lipolytica pode ser empregada em alimentos como agente emulsionante em diferentes formulações como sucos mistos (Fraga, 2016).

O ácido cítrico (2-hydroxy-1 ,2,3-propanetricarboxylic) e o ácido isocítrico ( 1-Hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid) que são intermediários do ciclo de Krebs, são um dos diversos metabólitos excretados pela Y. lipolytica. A condição de cultivo para produção de ácido cítrico e isocítrico e sua excreção por Y. lipolytica é a limitação do crescimento celular pela deficiência em excesso de carbono e nitrogênio do meio de cultura (Fickers et al., 2005). Na produção, após a deficiência de nitrogênio na fase estacionária de crescimento, a atividade metabólica da levedura se mantém e esta continua assimilando carbono e produzindo tais ácidos (Morgunov et al., 2004). O uso desta levedura para produção do ácido cítrico e isocítrico tem como vantagem sobre os fungos filamentosos: o alto grau de conversão, aumento da produtividade e a melhora do controle do processo devido a natureza unicelular da levedura (Fickers et al., 2005). A principal desvantagem é o fato da Y. lipolytica produzir uma grande concentração de ácido

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isocítrico durante a fermentação em níveis acima de 50%. O ácido isocítrico é um contaminante do ácido cítrico cristalizando o ácido durante a etapa de purificação.

A lipase é uma enzima muito versátil do grupo das esterases capaz, principalmente, de catalisar a hidrólise de triglicerídeos, além disso, ela atua em reações de esterificação, transesterificação e interesterificação. Durante o processo, há a liberação de glicerol, diglicerídeos, monoglicerídeos e ácidos graxos livres. Devido a sua multifuncionalidade e diversificação nos produtos de suas reações, a lipase é um metabólito de grande interesse industrial, tendo utilidade na indústria de alimentos, indústria de produtos de limpeza, indústria farmacêutica, entre outras. A lipase é produzida pela Y. lipolytica durante o início da fermentação, e a medida que a disponibilidade da fonte de nitrogênio diminui (fonte primária de energia), a célula começa a excretar para o meio a lipase armazenada em seu interior a fim de assimilar o substrato remanescente no meio (Nunes, 2015). Apesar de apresentar grande estabilidade em solventes orgânicos e grandes faixas e temperatura e pH, a lipase de Y. lipolytica apresenta seus picos de atividade em pH perto da neutralidade e em temperaturas próximas de 37º C.

Acredita-se que a escolha de insumos (matérias-primas) utilizados na preparação do meio de cultura seja um fator relevante durante o processo fermentativo, pois a composição destes podem interfirir no metabolismo das leveduras e consequentemente alterar os metabólitos excretados e a sua concentração no meio extracelular. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi observar como materiais semelhantes de fabricantes diferentes (utilizados na preparação de dois meios) alteram o crescimento e a produção de lipase extracelular, biossurfactante e ácido cítrico-isocítrico em 78 horas de cultivo com Yarrowia lipolytica.

2 MATERIAL E MÉTODOS

A levedura empregada foi a cepa selvagem de Yarrowia lipolytica (IMUFRJ 50682) selecionada de um estuário da Baía de Guanabara no Rio de Janeiro, Brasil (Hagler e Mendonça-Hagler, 1981). As células foram conservadas a 4°C após 24 horas de crescimento em tubos de ensaio com meio YPD (Yeast Extract, Peptone, Dextrose) contendo (em p/v): extrato de lêvedo 1%, peptona 2%, glicose 2% e Agar-agar 2%. (Amaral, 2007). A partir dos tubos de ensaio com YPD contendo as células de Yarrowia lipolyca inoculou-se, de forma estéril com uma alça de platina, 200 mL de meio de cultivo YPD (m/m: extrato de lêvedo 1%, peptona 2%, glicose 2%) em erlenmeyers de 500 mL. Após cerca de 70 horas em um incubador rotatório a 29°C, 160 rpm, a absorvância (570 nm) de uma amostra deste cultivo foi determinada e, em seguida as células foram centrifugadas a 3.000 g por 10 minutos e ressuspensas em 1 mL de meio de cultivo servindo

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.4,p.20544-20553 apr. 2020. ISSN 2525-8761 de inóculo. (Amaral, 2007).

Para avaliar se as marcas influenciam no processo fermentativo e consequentemente na produção de ácido cítrico e biossurfactante pela Y. lipolytica foram utilizados neste estudo duas formulações de meio:

Meio de cultivo 1 - Extrato de lêvedo (Sigma-Aldrich), peptona (Oxoid) e glicose (VETEC) – insumos com maior custo.

Meio de cultivo 2 - Extrato de lêvedo (Kasvi), peptona (Kasvi) e glicose (VETEC) – insumos com menor custo.

2.1 QUANTIFICAÇÃO DE BIOSSURFACTANTES PRODUZIDOS POR Y. LIPOLYTICA O índice de emulsificação (IE) foi realizado segundo Cooper e Goldenberg (1987), com algumas modificações. Este procedimento consistiu na adição de 1 mL de n-hexadecano a 1 mL do meio de cultura fermentado e livre de células em tubo de ensaio, seguido por agitação em vórtex por 2 minutos. Após 24 horas, calculou-se a razão entre a altura da região emulsificada e altura total de amostra presente no tubo de ensaio (Eq. 1).

E24 (%) = HeL/HS * 100 (1)

Onde: E24 = IE após 24 h;

Hel = altura da emulsão;

Hs = altura total

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE LIPASE PRODUZIDOS POR Y. LIPOLYTICA

Para a determinação da atividade hidrolítica foi realizada a variação de absorbância a 410 nm em espectrofotômetro (Shimadzu modelo UV-1800) devido à oxidação do p-nitrofenil laurato (p-NFL). O substrato (p-NFL) foi preparado solubilizando 0,018 g deste em 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) e, em seguida, diluído em 100 mL de tampão fosfato de potássio (50 mM) pH 7,0. Para determinação da atividade enzimática tubos de ensaio contendo 1,90 mL do substrato foram previamente aclimatados a 37ºC por, aproximadamente, 15 minutos. Após esse tempo, adicionou-se 0,10 mL da fração enzimática a ser analisada e a absorbância foi acompanhada em espectrofotômetro de 410 nm contra o branco da reação (1,90 mL do substrato e 0,10 mL do tampão), por 100 segundos (AMARAL, 2007).

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2.3QUANTIFICAÇÃO DE ÁCICO CÍTRICO-ISOCÍTRICO PRODUZIDOS POR Y.

LIPOLYTICA

A determinação de ácidos orgânicos foi realizada em cromatógrafo de fase líquida de alta eficiência (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC, Waters 1525) com sistema de dupla bomba e um detector ultravioleta com lâmpada de zinco a 214 nm. A coluna analítica utilizada é de polímero de octadecilsilano (YMC-Pack ODSAQ,S-5 µm, 12nm). A fase móvel consiste em 10 % de solução metanol (70 %) e 90 % de uma solução tampão KH2PO4 (pH 2,45), ambos

previamente desgaseificadas em banho de ultrasom (Sonicador Ultrasonic Cleaner).

O procedimento consistiu em injetar a amostra previamente filtrada por membrana de 0,45 µm de porosidade na coluna, que foi arrastada a uma vazão de 0,5 m/min. A temperatura da coluna foi mantida constante e igual a 35 ºC em forno. Os resultados foram registrados em cromatograma gerado pelo software cromatográfico Breeze e a quantificação das concentrações dos ácidos presentes nas amostras foi realizada através de curvas analíticas feitas através de soluções com padrões dos ácidos cítrico e isocítrico.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Durante o cultivo da Yarrowia lipolytica em diferentes meios, foi possível observar que não há grandes diferenças quanto ao comportamento do crescimento e os valores de pH durante o processo fermentativo. Entretanto, pode-se observar que o Meio 2 é um meio de cultivo mais pobre em compostos nitrogenados ou mais propício para a produção de hidrolases, o que pode ser observado pela leve diferença no pH mais básico (8,20) enquanto que o Meio 1 apresentou valor de pH 8,54 em torno de 75h. Foi observada queda no crescimento celular em torno das 54h de fermentação no Meio 2, porém o Meio 1 continuou apresentando crescimento após o mesmo período. Essa observação pode ser feita devido a capacidade da levedura de gerar hidrolases que metabolizam a peptona presente do meio que gera como resultado dessa reação, a amônia, que causa um aumento no pH.

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.4,p.20544-20553 apr. 2020. ISSN 2525-8761 Figura 1. Perfil de crecimento de Yarrowia lipolytica e pH para o Meio de cultivo 1.

Figura 2. Perfil de Crescimento de Yarrowia lipolytica e pH para o Meio de cultivo 2.

Quanto a produção de lipase, pode-se observar uma grande diferença entre os meios de cultivo. Enquanto o meio 1 apenas apresentou atividade significativa de lipase extracelular no último ponto observado da fermentação (285,86 U/L), no Meio 2 foi possível observar atividade enzimática (755,14 U/L) mais alta antes de com até 24h de cultivo. Entretanto o atraso no pico de produção pode ser atribuído à diferença na capacidade de oxigenação do meio em frasco de Erlenmeyer (na proporção volume de frasco e volume de meio de 2:5) e a capacidade de

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oxigenação num biorreator multifásico utilizado por Amaral (2007). Os dados foram apresentados na Tabela 1. Como a fonte de carbono e a cepa utilizada em ambos os meios não foi alterada, apenas pode-se atribuir essa diferença às fontes nitrogenadas, extrato de lêvedo e peptona.

Através do índice de emulsificação, foi possível observar essas mesmas diferenças entre os meios. Durante todo o processo, o Meio 2 foi capaz de produzir uma maior quantidade de biossurfactante, apenas com algumas baixas de produção em alguns pontos. Com o Meio 2 – ponto 48h – foi possível atingir picos de produção de biossurfactante com até 24h de antecedência em relação ao Meio 1 – ponto 78h. Tanto para a análise de índice de emulsificação e atividade de lipase extracelular, é possível observar que o Meio 1 apenas atinge picos de produção durante o final do período de fermentação analisado.

Houve uma baixa produção dos ácidos cítrico e isocítrico com os meios testados durante às 78h de análise. Além disso, o método utilizado para a análise no HPLC não foi capaz de diferenciar os dois ácidos, portanto, foi observado apenas o potencial de produção nos diferentes meios. De acordo com Silva (2010), em geral, as cepas de Yarrowia lipolytica, em proporções variáveis, produzem quantidade de ácido cítrico maiores que de ácido cítrico. Levando esses fatores em consideração, foi possível observar que o Meio 1 não chegou a produzir os ácidos em questão e o Meio 2 produziu quantidades muito pequenas apenas no final no período analisado, como observado na Tabela 1.

Tabela 1 – Atividade enzimática, índice de emulsificação e concentração de ácido cítrico-isocítrico produzidos por

Yarrowia lipolytica nos Meios 1 e 2

Atividade de lipase extracelular (U/L) Índice de emulsificação (%) Concentração de ácido cítrico e isocítrico (g/L)

Tempo (h) Meio 1 Meio 2 Meio 1 Meio 2 Meio 1 Meio 2

0 46,96 46,99 53,5 49,9 0 0 3 64,84 45,05 48,6 52,9 0 0 5 42,09 46,30 48,6 51,2 0 0 24 29,97 202,46 56,7 53,1 0 0 27 55,38 315,31 52,7 52,5 0 0 30 34,84 118,20 50,3 45,5 0 0 48 28,05 104,09 53,4 60,4 0 0 51 19,84 110,71 49,1 56,8 0 0 54 6,71 755,14 54,7 56,8 0 0 72 160,74 569,02 52,2 59,9 0 0,06 75 133,71 339,46 56,3 61,7 0 0,1 78 285,86 258,24 58,2 59,0 0 0,1

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n.4,p.20544-20553 apr. 2020. ISSN 2525-8761 4 CONCLUSÕES

Através do estudo foi possível utilizar a Yarrowia lipolytica, como forma de estudar a influência da utilização de diferentes substratos na produção do meio de cultivo. Foi possível verificar perfis semelhantes de crescimento e grandes diferenças na produção de metabólitos pelo microrganismo em diferentes meios de cultivo.

Quanto a atividade de lipase extracelular, o Meio de cultivo 2 apresentou uma produção de até 164% maior em relação ao Meio 1 quando comparados os picos de produção. Um comportamento semelhante pode ser observado através do índice de emulsificação e quando comparamos a produção de ácidos cítrico e isocítrico, vemos que um dos meios não chega a produzir os metabólitos em questão. Há grandes diferença entre os picos de produção dos meios, sendo os picos de atividade observados durante o estado estacionário da fermentação, em ambos os casos em torno de 54h.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o suporte financeiro da CAPES e FAPERJ.

REFERÊNCIAS

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