Contagem de micro-organismos
Os diversos métodos existentes para a contagem de micro-organismos podem ser divididos em dois grupos principais, aqueles que quantificam o número de células e aqueles que quantificam a massa celular.
Alguns métodos determinam as células viáveis (vivas), enquanto outros determinam as células totais (vivas e mortas).
Métodos para quantificar micro-organismos
Diretos
Contagem em
Placa
NMP
Filtração
Contagem
Direta ao
Microscópio
1. Contagem em placas
Este é o principal método de contagem de células viáveis. É um método demorado, visto que é necessário aguardar a multiplicação de uma célula no meio sólido, de modo que está forme uma colônia macroscopicamente visível a ser contada.
Pode ser utilizado tanto para materiais com alta concentração microbiana, neste caso sendo utilizado o método das diluições seriadas, como também para materiais líquidos com pouca concentração microbiana, nos quais o método da filtração é o mais apropriado.
Contagem em placas
Na contagem, o ideal é que cada placa escolhida contenha um número considerado significativo no método em questão, o que para bactérias, em geral é de no mínimo 20-30 colônias e no máximo 200-300 colônias.
Para que os resultados obtidos sejam estatisticamente válidos, sugere-se que sejam preparadas pelo menos três placas-réplica para cada diluição.
Após os cálculos adequados, levando-se em conta os volumes utilizados, e as diluições empregadas,
determina-se o número de micro-organismos presentes em um determinado peso ou volume do material inicial.
Contagem em placas
O método das diluições pode ser realizado de duas formas:
- a. Espalhamento em superfície, ou em placa. - b. Espalhamento em profundidade (pour plate);
No método do espalhamento em superfície o inóculo, geralmente de 0,1 a 1,0 mL, é espalhado uniformemente na superfície do meio já solidificado, com o auxilio da alça de Drigalsky, de modo a separar ao máximo as células microbianas presentes. Neste caso só crescerão colônias na superfície do meio sólido.
Métodos
Pour plate Espalhamento
em placa
Figura 2 – Metodologia utilizada para a contagem de colônias em placa. Fonte: Tortora, 2000.
Contagem em placas
No método do espalhamento em profundidade o inóculo, geralmente 1,0 mL, é adicionado ao fundo da placa estéril, vazia, e o meio de cultura contendo ágar, ainda líquido, mantido a cerca de 40-45°C, é vertido sobre ele. A homogeneização do inoculo com o meio é feita através de movimentos rotacionais suaves. É preciso garantir que o meio não solidifique antes da homogeneização, nem fique muito quente para não matar as células microbianas. As colônias crescerão não só na superfície, como também no interior do meio de cultura.
2. Método da filtração
É utilizado para materiais líquidos onde se espera uma pequena quantidade de micro-organismos, como por ex, a água de abastecimento das cidades, que apresenta um baixo número de bactérias, pois é previamente tratada com cloro.
Neste método, volumes de cerca de 100mL da amostra são filtrados em uma membrana porosa adequada, que deverá reter os micro-organismos. Em seguida, ela é colocada na superfície de uma placa contendo meio de cultura. A difusão dos nutrientes pela membrana permite que os micro-organismos retidos se multipliquem e formem colônias, que poderão então ser contadas.
Método da filtração
Nesta técnica são consideradassignificativas as contagens em placas que apresentem de 20 a 200 colônias.
Este método também exige que se trabalhe com réplicas para que os resultados possam ser estabelecidos válidos.
Contagem de micro-organismos do ar
3. Contagem direta em câmera de contagem
Neste método a suspensão microbiana em questão, que deverá ser bastante densa para garantir resultados significativos, é colocada em lâmina
especial, dentro de um poço com dimensões
conhecidas, cujo fundo é quadriculado. Após a adição de uma lamínula, ela é levada ao microscópio para a realização da contagem das células em vários campos visuais. O número de células totais será a média das contagens obtidas nos diversos campos, multiplicada por um fator que correlaciona a contagem obtida ao volume de suspensão analisado.
Este método fornecerá a contagem total de células vivas e mortas, e não se aplica a qualquer micro-organismo (por ex, fungos e bactérias filamentosas).
Câmera de Newbauer
Câmara Superior Câmara Inferior
Câmera de Newbauer
Para leveduras e bactérias, pela prática é melhor escolher para trabalhar os quadrantes “A”, sendo que a contagem é viável, quando há de 8 - 20 células em cada um dos 16 quadrados deste quadrante. Quando há mais do que 20 células em cada quadrado fica muito difícil conta-las, sendo então necessário fazer a diluição da amostra.
4. Método do Número Mais Provável (NMP)
Esta é uma técnica estatística na qual volumes da amostra original, em geral 10 e 1 mL, são inoculados em series de tubos contendo um meio de cultura líquido apropriado. Comumente são empregadas três ou cinco séries de tubos, nas quais são inoculadas replicas correspondentes de cada volume ou diluição da amostra original. Após incubação pelo tempo apropriado, conta-se o número de tubos nos quais é observado crescimento, ou uma reação diferencial típica, como a mudança da cor do indicador de pH ou a produção de gás, em cada um dos tubos de cada série.
Número Mais Provável (NMP)
Método do Número Mais Provável (NMP)
→ Com o número obtido pela combinação do número de tubos positivos de cada série pode-se determinar o numero mais provável de micro-organismos na amostra, a partir da consulta de tabelas especificas.
→ Sendo um método estatístico, os resultados obtidos garantem apenas 95% de probabilidade de que o número de micro-organismos determinados na análise corresponda ao número real de micro-organismos presentes na amostra.
Indiretos
Turbidimetria
Peso Seco
1. Turbidimetria
Figura 8 – Determinação do número de micro-organismos por turbidimetria.
1b. Escala de McFarland
Utiliza uma escala de turvação baseada numa suspensão de sulfato de bário, um sal insolúvel.
Neste caso adquire-se um conjunto de tubos lacrados contendo suspensões do referido sal em quantidades crescentes, em que quanto maior a quantidade do sal, maior a turvação da suspensão.
A medida é feita por uma comparação visual entre as turvações da escala de Macfarland e a turvação da suspensão microbiana. Existe uma equivalência, descrita pelo fabricante, entre a densidade ótica de cada tubo da escala e a concentração de bactérias ou leveduras presentes na suspensão.
3. Peso Seco
Pode ser usado para qualquer micro-organismo, mas é especialmente útil para micro-organismos filamentosos, incluindo bactérias e fungos, cuja contagem não pode ser determinada por outros métodos. Neste caso, a massa de células é obtida por filtração, após o que é lavada e seca em forno ou dessecador, até peso constante.
Crescimento das culturas bacterianas
O crescimento bacteriano é considerado o aumento do número de indivíduos e não o aumento de tamanho de uma determinada célula.
As bactérias normalmente se reproduzem por fissão binária.
Tempo de Geração
Tempo necessário para uma célula se dividir;
na maioria das bactérias esse tempo é de 1 a 3h ( pode ter tempo
de 20 min. ou 24h);
sofre variações entre os organismos (temperatura, nutrientes,
entre outros).
Figura 11– Representação gráfica logarítmica (pontilhada) e aritmética (contínua) da curva de crescimento de uma população em fase de crescimento exponencial
Fases do Crescimento
Figura 12 – Curva de crescimento bacteriano mostrando as fases típicas de crescimento Fonte: Tortora, 2000.
