DE PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS
ANNA PAULLA SIMON
MODIFICAÇÃO ANÓDICA DE IMPLANTES A BASE DE TITÂNIO E ESTUDO DE SUA UTILIZAÇÃO COMO PLATAFORMA PARA LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
PATO BRANCO 2019
MODIFICAÇÃO ANÓDICA DE IMPLANTES A BASE DE TITÂNIO E ESTUDO DE SUA UTILIZAÇÃO COMO PLATAFORMA PARA LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Quí-micos e BioquíQuí-micos da Universidade Tecnológica Federal do Paraná como requisito parcial para ob-tenção do título de “Mestre em Tecnologia de Pro-cessos Químicos e Bioquímicos - Área de concen-tração: Química de Materiais”.
Professor Orientador: Dr. Henrique Emilio Zorel Ju-nior
Co-orientador: Dra. Mariana de Souza Sikora
PATO BRANCO 2019
Ficha Catalográfica elaborada por Suélem Belmudes Cardoso CRB9/1630 Biblioteca da UTFPR Campus Pato Branco
utilização como plataforma para liberação de fármacos / Anna Paulla Simon. -- 2019.
78 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Prof. Dr. Henrique Emilio Zorel Junior Coorientadora: Profa. Dra. Mariana de Souza Sikora
Dissertação (Mestrado) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos. Pato Branco, PR, 2019.
Bibliografia: f. 67 - 78.
1. Nanotubos. 2. Eletrólitos. 3. Materiais biomédicos. 4. Termogravimetria. I. Zorel Junior, Henrique Emilio, orient. II. Sikora, Mariana de Souza, coorient. III. Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos. IV. Título.
CDD (22. ed.) 660.281
TERMO DE APROVAÇÃO Nº 84
TÍTULO DA DISSERTAÇÃO
“MODIFICAÇÃO ANÓDICA DE IMPLANTES A BASE DE TITÂNIO E ESTUDO DE SUA UTILIZAÇÃO COMO PLATAFORMA PARA LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS”
Autora
Anna Paulla Simon
Esta dissertação foi apresentada às oito horas e trinta minutos do dia 18 de fevereiro de 2019, como requisito parcial para a obtenção do título de MESTRE EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS – Linha de pesquisa em Materiais– no Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos. A autora foi arguida pela Banca Examinadora abaixo assinada, a qual, após deliberação, considerou o trabalho aprovado.
____________________________________
Prof. Dr. Henrique Emilio Zorel Junior UTFPR/PB
Orientador
______________________________________
Profa. Dra. Márcia Margarete Meier UDESC/Joinvile
Examinadora
__________________________________ Prof. Dr. Francisco Trivinho Strixino
UFSCar/Sorocaba Examinador
__________________________________ Profa. Mariana de Souza Sikora
UTFPR/PB Examinadora
Visto da Coordenação
Prof. Dr. Edimir Andrade Pereira
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos - PPGTP
O Termo de Aprovação assinado encontra-se na Coordenação do PPGTP
Ministério da Educação
Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Câmpus Pato Branco
Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos
Agradeço primeiramente à Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR), ao corpo docente e discente que contribuíram para minha formação desde a graduação, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) que vêm permitindo financiamento científico e finalmente a Alexandra A. Elbakyan, por literalmente “remover todas as barreiras no caminho da ciência”.
Agradeço ao meu orientador Henrique Emilio Zorel Junior por conceder a oportunidade de realizar este estudo, mesmo que para o mesmo estivesse a frente de novos desafios em outras áreas de trabalho. Agradeço também a minha co-orientadora, Mariana de Souza Sikora, pela orientação desde a graduação e o mestrado. Aqui registra-se minha gratidão pela amizade, por todo conhecimento que compartilhou comigo, por acreditar em mim e principalmente por me dar liberdade para tomar minhas próprias escolhas.
Agradeço também todas as contribuições técnicas e de redação dadas pela Vidiany Apare-cida Queiroz Santos, Andressa Rodrigues, Janaina Soares Santos, Francisco Trivinho Strixino. Agradeço especialmente ao Francisco Trivinho Strixino e à Márcia Margarete Meier pele aceite na participação da banca. Agradeço também à ABL - Antibióticos do Brasil pelo fornecimento de CS, à UFSCar, Central de Análises da UTFPR-PB, ao Laboratório Nacional de Nanotec-nologia (LNNano) no Centro Nacional de Pesquisas de Energia e Materiais (CNPEM) e ao Laboratório de Análises Clínicas do Biocentro.
Àos meus pais pelo incentivo e por sempre me mostrarem que apesar de árduo, o caminho do conhecimento emancipa o ser humano. Àos meus irmãos pelo apoio, principalmente à Anna Jhulia, por vir nos finais de semana comigo no laboratório. Há um “dedinho” seu sempre em tudo o que faço.
Aos amigos que sempre estiveram presente mesmo não presentes constantemente, Bruna Yohann, Thariane Bicas, Ana Maria de Araújo, Matheus Fascicolo, Maiara Taniguchi, Tiago Favero, Matheus Calegari, Gabrielle Calegari e Renata Deda por toda paciência, discussões, cafés e principalmente pela companhia no laboratório N007 e N009.
Finalizo agradecendo a minha companheira de laboratório Carlise Ferreira, pelas caronas, pela ajuda no laboratório e por me trazer a realidade sempre que minha cabeça gostaria de fazer muito mais. À Anaclara Prasniewski por todas as discussões e modificações que carinhosa-mente fez este projeto evoluir, mas principalcarinhosa-mente pela sua amizade nestes últimos anos que foram essenciais a minha sanidade. Agradeço também ao Marcos Paulo Belançon por me aju-dar a desenvolver uma consciência científica e por me fazer entender que a complexidade da ciência não está em desenvolver produtos ou processos mas sim em contornar problemas muitas vezes de viés sociais e políticos.
Visando o desenvolvimento de biomateriais anódicos a base de titânio que apresentem pro-priedades adequadas à aplicação biomédica, a modificação da superfície e o aperfeiçoamento da atividade bacteriana foram explorados neste trabalho. Nanotubos de Titânio (TiNTs) foram crescidos a partir dos substratos Ticp (T) e sua liga Ti6Al4V (A), por anodização potencios-tática (25 V - 90 min) em eletrólito modificado com Solução de Fluido Corporal Simulado (SBF) mantido a 10 e 40◦C. A investigação do perfil térmico foi realizada por termogravime-tria (TGA) e Calorimetermogravime-tria Diferencial de Varredura (DSC), sendo definidas as temperaturas de transição de fase para o tratamento térmico (TT). Parâmetros morfológicos e estruturais foram avaliados por Microscopia Eletrônica de Varredura por Emissão de Campo FE-SEM, Difração de Raios X (XRD), ângulo de contato (CA) e nanoindentação. Os resultados mostram que as matrizes nanotubulares auto-organizadas foram sintetizadas sob todas as condições de síntese. A temperatura do eletrólito pôde ser relacionada a um aumento no diâmetro interno (Di) dos TiNTs e alteração da molhabilidade. O efeito do TT foi relacionado com o colapso das TiNTs, tornando-se evidente com o aumento da temperatura de TT. A caracterização por nanoindenta-ção revela que tanto a temperatura do eletrólito quanto a de TT têm pequenos efeitos na dureza e no módulo de elasticidade dos revestimentos. Em resumo, este estudo mostra que condições de síntese a 40◦C (com TT para as amostras do substrato A) podem modificar significativamente as propriedades dos TiNTs, relacionadas ao melhor desempenho dos revestimentos como biomate-rial. Buscando o desenvolvimento de implantes resistente à infecções bacterianas, este trabalho apresenta também um estudo de modificação das melhores condições de síntese de TiNTs as utilizando como reservatório de cefazolina sódica (CS), cobertos com Quitosana (CH) e carbo-ximetilcelulose (CM) para o controle da cinética de liberação. Os dados da taxa de liberação de fármaco mostraram que a cobertura polimérica reduziu significativamente a cinética de li-beração. Em adição, o teste de disco-difusão mostra o alto perfil bacteriostático de todas as amostras. O ensaio de atividade hemolítica revela que as amostras possuem baixa porcentagem de hemólise, exceto por duas condições. Pode ser destacado que as amostras que obtiveram os melhores resultados foram as que receberam a cobertura polimérica de CM. Em resumo, tanto as propriedades de superfície quanto de cobertura polimérica revelaram-se como parâmetros importantes a ser considerados no design de biomateriais à base de titânio.
Palavras-chave: Nanotubos de Titânio; Eletrólito à base de SBF; Biomateriais; Liberação de fármaco.
Aiming the development of anodic titanium-based biomaterials that presents suitable pro-perties for biomedical application, the surface modification and the enhancement of bacterial activity were explorated this work. Titanium nanotubes (TiNTs) were grown over Ticp (T) and Ti6Al4V alloy (A) substrates by potentiostatic anodization (25 V - 90 min) in Simulated Body Fluid Solution (SBF) modified electrolyte kept at 10 and 40 ◦C. Thermal profile investiga-tion was performed by thermogravimetry (TGA) and Differential Scanning Calorimetry (DSC), being defined the phase transition temperatures for annealing process (TT). Morphological and structural parameters were evaluated by Field Emission Scanning Electron Microscopy (FE-SEM), X-Ray Diffraction (XRD), contact angle (CA) and nanoindentation. The results showed that self-organized nanotubular matrices were grown under all synthesis conditions. Electrolyte temperature was related to an increase in the nanotube inner diameter (Di) and alteration of wettability. The effect of TT was related with TiNTs collapse, becoming more evident with in-creasing annealing temperature. The nanoindentation analyses revealed that both the electrolyte and TT temperature have small effects on coatings hardness and elasticity modulus. In sum-mary, this study showed that 40 ◦C of synthesis conditions (with TT for substrate A samples) can significantly modify TiNTs properties, related to better coatings performance as biomate-rial. In order to develop implants with resistance to bacterial activity, this work also presents a study of the modification of the best TiNT synthesis conditions using them as cefazolin sodium reservoir, covered with Chitosan (CH) and carboxymethylcellulose (CM) for control the drug release kinetics. Data from drug release assay showed that polymer covering can significantly reduce release rate. In addition, the disc-diffusion test showed a high bacteriostatic profile from all samples. The hemolytic activity assay showed that samples have low hemolysis percentage, except for two conditions. It can be highlighted that samples that had obtained the best results were those that received the CM polymer coating. In summary, both the surface and polymeric coverage properties were important parameters to be considered in titanium-based biomaterials design.
Figura 1 – Estruturas cristalinas de T iO2: a) rutilo (Tetragonal), b) anatase (Tetragonal) e c) brookita (ortorrômbico). . . 10 Figura 2 – Curva cronoamperométrica referente à anodização potenciostática de titânio
em meio contendo fluoreto. . . 14 Figura 3 – Diagrama esquemático do mecanismo de reação da transformação da fase
amorfa para anatase na presença de íons F−durante o TT. . . 22 Figura 4 – Diagrama esquemático da transformação de fase e evolução da morfologia
em nanotubos de T iO2durante TT. . . 22 Figura 5 – Ilustração do processo de anodização. As letras indicam a) a fonte de
ano-dização; b) multímetro; c) eletrodos e reator de anodização e d) banho ter-mostático. . . 28 Figura 6 – Etapas para obtenção dos dados de Die Doatravés do tratamento de imagem
pelo software ImageJ. . . 30 Figura 7 – Etapas para obtenção do CA através do tratamento de imagem pelo software
ImageJ. . . 32 Figura 8 – Etapas do processo de inserção do fármaco CS e cobertura polimérica de
CH e CM. . . 33 Figura 9 – Manipulação dos dados de liberação de CS com e sem cobertura polimérica
de CH e CM. . . 35 Figura 10 – Etapas do processo de inserção do fármaco CS e cobertura polimérica de
CH e CM. . . 37 Figura 11 – Curvas cronoamperométricas obtidas durante a anodização potenciostática
dos substratos T e A a a) 10◦C; c) 40◦C e respectiva ampliação nos quadros b) e d). . . 39 Figura 12 – Variação da razão l/A mostrada sobre as curvas cronoamperométricas (Fig
11). . . 41 Figura 13 – Micrografias e imagens de ângulo de contato dos revestimentos de TiNTs
anodizados potenciostáticamente usando ambos os substratos a 10 e 40 ◦C, com e sem TT. . . 43 Figura 14 – Esquema demonstrando o efeito da alteração da viscosidade em parâmetros
morfológicos de revestimentos de TiNTs no eletrólito usado para o cresci-mento dos mesmos. . . 45 Figura 15 – Estimativa de espessura (µ) da camada de TiO2 dos revestimentos T1AR
(100 kx), T4A (25 kx) e T4AR (35 kx) recém formados e a respectiva am-pliação utilizada para a medida. . . 46
Figura 17 – Difratogramas dos revestimentos de TiNTs anodizados potenciostáticamente a 10 e 40◦C sob todas as condições de TT obtidas utilizando o substrato a)T e b) A. . . 48 Figura 18 – Valores médios de dureza (GPa) e módulo de elasticidade (GPa) em função
do deslocamento na superfície (µm) através da técnica de nanoindentação. . 51 Figura 19 – Comprimento de onda característico e curva de calibração do fármaco
Cefa-zolina Sódica em meio tampão fosfato-salino. . . 54 Figura 20 – Massa acumulativa normalizada de CS liberada em função do tempo (min)
por filmes de TiNTs sintetizado sob as condições escolhidas: T1, A1A, T4 e A4A, antes e após o recebimento de cobertura polimérica, e respectiva ampliação da liberação em tempos iniciais. . . 55 Figura 21 – Exemplo da extração dos parâmetros da equação Difusão com Cobertura
Polimérica (PCD). . . 59 Figura 22 – Qualidade gráfica do ajuste dos dados experimentais de liberação pela
equa-ção de Korsmeyer-Peppas (KP) e Difusão pela Cobertura Polimérica (PCD). 60 Figura 23 – Zona de inibição contra S. aureus apresentados pelos revestimentos de TiNTs
preenchido por CS e após a adição da cobertura polimérica de CH e CM. . . 61 Figura 24 – Gráfico da variação da concentração liberada em função do tempo para todas
as amostras da Fig. 20 sob perspectiva da Concentração Inibitória Mínima (MIC) e Concentração Bacteriostática (CB). . . 63 Figura 25 – Fluído centrifugado proveniente do teste de hemólise após 1h de contato
com Triton-X (à esquerda), amostra T40 (ao centro) e T40CM (à direita). . . 64 Figura 26 – Porcentagem de hemólise obtida através da Eq. 4.8, após do teste de
Tabela 1 – Características biomecânicas ósseas e dos biomateriais a base de Ti ASTM F67, Ti ASTM F136 e aço cirúrgico. . . 10 Tabela 2 – Concentração Iônica do Plasma sanguíneo Humano em comparação com a
solução de SBF. Legenda: [Ci]: Concentração Iônica (mM). . . 17 Tabela 3 – Características mecânicas de materiais a base de T iO2. Legenda: TT -
Tra-tamento Térmico e STT - Sem TraTra-tamento Térmico. . . 23 Tabela 4 – Expoente de difusão e mecanismo de liberação de soluto de acordo com a
geometria do dispositivo. . . 27 Tabela 5 – Matriz de planejamento das condições de síntese e TT de TiNTs. . . 29 Tabela 6 – Matriz de planejamento para as amostras escolhidas que receberam CS e
revestimento polimérico. . . 34 Tabela 7 – Parâmetros eletroquímicos extraídos das curvas cronoamperométricas
(Fi-gura 11). . . 40 Tabela 8 – Parâmetros morfológicos, superficiais, estruturais e mecânicos obtidos
atra-vés do tratamento de imagem (Fig. 13), de difratograma (Fig. 17) e caracte-rização direta dos revestimentos de TiNTs. . . 44 Tabela 9 – Tempo para a liberação total da massa do fármaco - 1 mg (T1mg) e
coeficien-tes de regressão KP e PCD para filmes de TiNTs que receberam Cefazolina Sódica cobertos ou não com polímeros Quitosana e Carboximetilcelulose. . 56 Tabela 10 – Zona de Inibição normalizada (NIZ) contra o microrganismo S. aureus
A: Liga Ti6Al4V - Ti ASTM F136 (do inglês, alloy).
ANOVA: Análise de Variância Uni-fatorial (do inglês, One-way Analysis of Variance). BHI: Meio nutriente de Infusão de Cérebro e Coração (do inglês, Brain Heart Infusion). CA: Ângulo de Contato (do inglês, Contact Angle).
CB: Concentração bactericida.
CD: Densidade de Corrente (do inglês, Current Density). CS: Cefazolina Sódica.
CH: Quitosana (do inglês, Chitosan).
CLSI: Instituto de Normas Clínicas e Laboratoriais (do inglês, Clinical and Laboratory Stan-dards Institute).
CM: Carboximetilcelulose (do inglês, Carboxymethyl cellulose). DP: Desvio Padrão.
DSC: Calorimetria Exploratória Diferencial (do inglês, Differential Scanning Calorimeter). E: Elasticidade (do inglês, Elasticity).
ERCs: Eritrócitos. FE-SEM: Microscopia Eletrônica de Varredura por Emissão de Campo (do inglês, Field Emission Scanning Electron Microscopy).
H: Dureza (do inglês, Hardness).
HSD: Teste de Significância (do inglês, Honest Significance Test). IRAS: Infecção relacionadas aos cuidados de saúde.
ISC: Infecção de sítio cirúrgico. LF: Liberação de Fármaco.
MACD: Máximo de Densidade de Corrente (do inglês, Maximum Current Density). MCD: Mínimo de Densidade de Corrente (do inglês, Minimum Current Density). MIC: Concentração Inibitória Mínima (do inglês, Minimum inhibitory concentration). NIZ: Zona de Inibição Normalizada (do inglês, Normalized Inhibition Zone).
PB: Tampão fosfato (do inglês, Phosphate Buffer).
PBS: Tampão fosfato-salino (do inglês, Phosphate Buffer Saline).
PCD: Difusão pela Cobertura Polimérica (do inglês, Polymer-Covered Diffusion).
QCSM: Método de Medição de Rigidez Quase-contínua (do inglês, quasi-continuous stiffness measurement).
SBF: Solução de Fluido Corporal Simulado (do inglês, Simulated Body Fluid). STT: Sem Tratamento Térmico.
T: Titânio comercialmente puro - Ti ASTM F67.
TGA: Termogravimetria (do inglês, Thermogravimetry). TiNTs: Nanotubos de titânio (do inglês, Titanium Nanotubes). T iO2: Dióxido de Titânio.
1 INTRODUÇÃO . . . . 5
2 OBJETIVOS . . . . 7
2.1 OBJETIVO GERAL . . . 7
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS . . . 7
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA . . . . 8
3.1 TITÂNIO COMO IMPLANTE ORTOPÉDICO E ORTODÔNTICO . . . 8
3.2 PROPRIEDADES IMPORTANTES À OSSEOINTEGRAÇÃO . . . 11
3.2.1 Estratégias de Modificação da Superfície . . . 12
3.2.1.1 Anodização potenciostática . . . 12
3.2.2 Presença de Íons de Interesse Biológico . . . 17
3.2.3 Morfologia e Molhabilidade . . . 18
3.2.3.1 Efeito da temperatura do eletrólito . . . 19
3.2.4 Cristalinidade . . . 20
3.2.4.1 Efeito do tratamento térmico (TT) . . . 21
3.2.5 Nanotubos de titânio como plataforma para liberação de fármacos . . . . 23
3.2.5.1 Associação do fármaco Cefazolina Sódica e cobertura polimérica . . . 25
4 METODOLOGIA . . . . 28
4.1 ANODIZAÇÃO POTENCIOSTÁTICA . . . 28
4.2 CARACTERIZAÇÃO . . . 29
4.2.1 Termogravimetria (TGA), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) e Tratamento Térmico (TT) . . . 29
4.2.2 Análise Eletroquímica e Microscopia Eletrônica de Varredura com feixe de íons (FE-SEM) . . . 29
4.2.3 Difratometria de Raios X (XRD) . . . 31
4.2.4 Ângulo de Contato (CA) . . . 31
4.2.5 Nanoindentação . . . 32
4.3 INSERÇÃO DE FÁRMACO, COBERTURA POLIMÉRICA E TESTE DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS IN VITRO . . . 33
4.3.1 Ensaio de Liberação de Fármacos . . . 33
4.3.2 Concentração Inibitória Mínima (MIC) e disco-difusão . . . 35
4.3.3 Atividade Hemolítica . . . 37
5.1.1 Curva Cronoamperométrica . . . 39
5.1.2 Caracterização das Amostras Anódicas . . . 42
5.1.2.1 Morfologia das amostras recém-formadas. . . 42
5.1.2.2 Análise Térmica. . . 46
5.1.2.3 Morfologia e cristalinidade das amostras tratadas termicamente . . . 47
5.1.2.4 Molhabilidade . . . 49
5.1.2.5 Nanoindentação . . . 51
5.2 UTILIZAÇÃO DE TiNTs COMO PLATAFORMA PARA LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS . . . 53
5.2.1 Investigação do Perfil de Liberação de Fármaco . . . 54
5.2.2 Ensaio de Disco-difusão e Concentração Inibitória Mínima (MIC) . . . 60
5.2.3 Teste de Atividade Hemolítica . . . 63
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS . . . . 66
1 INTRODUÇÃO
O uso de dispositivos médicos implantáveis revela-se como uma das alternativas atuais mais eficientes para o tratamento de doenças degenerativas e o restabelecimento de funções mecânicas e biológicas (BRÅNEMARK et al., 2001), provocadas pelo aumento da população geriátrica, distúrbios cardiovasculares e ortopédicos (Grand View Research, 2018a).
Como o número de pacientes que precisam desses dispositivos cresce a cada ano, estima-se que o mercado global de biomateriais chegue a US$ 250,4 bilhões até 2025 (Grand View Research, 2018a) e o de dispositivos ortopédicos à US$ 47,7 bilhões até 2026 (Grand View Research, 2018b).
Sobre os materiais utilizados como biomateriais, o titânio e suas ligas se destacam por oferecerem excelente resistência mecânica e química (MURUGAN; RAMAKRISHNA, 2005), responsáveis pelas maiores taxas de osseointegração nestes materiais. Essa reação é favorecida em biomateriais que mimetizam a estrutura óssea, como materiais nanoestruturados, obtidos pela modificação da superfície de titânio pelo método eletroquímico de anodização (REGONINI et al., 2013).
Pesquisas médicas indicam que os nanotubos de titânio (TiNTs) poderiam ser usados como plataforma adequada para liberação de drogas, possibilitando o tratamento in situ em procedimentos pós-cirurgicos (FENG et al., 2016). Assim, antibióticos poderiam ser usados como estratégia na preveção de infecções bacterianas, apontadas como uma das complicações mais graves neste tipo de procedimento (POPAT et al., 2007).
Além das estratégias de TiNTs carregadas com antibióticos, a fabricação de cobertu-ras biopoliméricas, utilizando Quitosana (CH) e Carboximetilcelulose (CM), revolucionou a aplicação dessa classe de dispositivos médicos (KORSMEYER; PEPPAS, 1981b) ao induzir maiores taxas de biocompatibilidade e diminuição da taxa de liberação de drogas, superando as limitações associadas à administração oral ou intravenosa de drogas, como a baixa concentração de fármaco no local da alocação do implante. Os biopolímeros tornaram-se populares devido à sua alta disponibilidade; não toxicidade; biodegradabilidade e biocompatibilidade (ELIEH-ALI-KOMI; HAMBLIN, 2016) (LAM et al., 2018).
Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da temperatura do eletrólito e de tratamento térmico (TT) na modificação de biomateriais à base de titânio por ano-dização potenciostática, realizada em eletrólito contendo Solução de Fluído Corporal Simulado (SBF) (SIMON; SIKORA, 2018), e sobre os aspectos morfológicos, estruturais e mecânicos.
Após a determinação das melhores condições de síntese e de TT, também realizou-se o estudo da utilização das amostras de TiNTs como reservatório do antibiótico Cefazolina Sódica como estratégia para remediação de infecções bacterianas pós-operatórias. Para reduzir o tempo de liberação deste fármaco no organismo, foram também investigados os efeitos da cobertura
das amostras com os polímeros CH e CM.
Os resultados mostram que tanto as propriedades de superfície quanto as de cobertura polimérica são parâmetros importantes a ser considerados no design de biomateriais à base de titânio.
2 OBJETIVOS
2.1
OBJETIVO GERAL
O objetivo do presente trabalho é a investigação do efeito da temperatura do eletrólito e do TT na síntese em diversas propriedades de filmes nanotubulares de dióxido de titânio, cresci-dos sobre os substratos Ti ASTM F67 (T) e sua liga Ti ASTM F136 - Ti6Al4V (A) pelo método eletroquímico de anodização potenciostática em eletrólito contendo Solução de SBF. Também realizou-se o estudo da utilização destas nanoestruturas como reservatório do antibiótico Cefa-zolina Sódica e sua cobertura com os polímeros CH e CM, como estratégia para diminuição de infecções bacterianas pós-operatórias.
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Sintetizar revestimentos auto-organizados de TiNTs utilizando o método eletroquímico de anodização potenciostática a 10 e 40◦C.
• Estudar o efeito do TT em revestimentos de TiNTs.
• Investigar a influência da temperatura do eletrólito e do TT sobre a morfologia, estrutura, molhabilidade e propriedades mecânicas de revestimentos TiNTs.
• Estudar o perfil de liberação do fármaco Cefazolina Sódica e o efeito do recobrimento polimérico com CH e CM como limitador difusional do fármaco Cefazolina Sódica (CS) em dispositivos nanotubulares a base de TiNTs.
• Caracterizar as amostras pelos ensaios in vitro de disco-difusão, concentração inibitória mínima e atividade hemolítica.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1
TITÂNIO COMO IMPLANTE ORTOPÉDICO E
ORTODÔN-TICO
Materiais a base de titânio e derivados têm recebido interesse significativo nas últimas décadas em função de sua utilização no âmbito de aplicações tecnológicas como em fotovol-taicas (BAI et al., 2014) e fotocatálise (TAYADE; GANDHI, 2018), destacando-se o emprego destes materiais no desenvolvimento de dispositivos médicos implantáveis e administração lo-cal de drogas (TAYADE; GANDHI, 2018).
Segundo Grand View Research (2018a), o fomento do desenvolvimento e da modifica-ção de biomateriais a base de titânio voltada a área da ortopedia e ortodontia está relacionada principalmente ao envelhecimento da população geral e o consequente aumento de doenças e ocorrências relacionadas ao sistema ósseo, como câncer, fraturas e osteoporose, tendo como principal função o restabelecimento de funções mecânicas e orgânicas dos pacientes.
Apesar da utilização de biomateriais ser conhecida a muito tempo, segundo Nandi e Biswas (2013) grandes desenvolvimentos científicos desta área foram realizados durante a Se-gunda Guerra Mundial, melhorando a qualidade de vida de milhares de pessoas. E se tratando do cenário da implantologia para a substituição de tecidos duros, como os ossos, os materiais mais utilizados são os metais, destacando-se o titânio comercialmente puro (Ti ASTM F67), sua liga T i6Al4V (ASTM F136) e aço cirúrgico, em consequência da alta resistência mecânica, requerida para sustentação do corpo, e química, impactando na estabilidade do implante (MU-RUGAN; RAMAKRISHNA, 2005).
Segundo Leyens e Peters (2005), o titânio foi descoberto através do mineral de ilme-nita por Willian Gregor em 1791 (Inglaterra), sendo isolado posteriormente por J. J. Berzelius. Sua ampla comercialização se deu na década de 50 pela empresa Titanium Metals Company of America (TMCA). Com a alta disseminação do metal no comércio químico e aeronáutico, o desenvolvimento de ligas de titânio tornou-se crescente, em busca de melhorar as propriedades que este apresentava. Um estudo conduzido principalmente pelas indústrias aeronáuticas de-senvolveu a liga T i6Al4V. Esta liga apresenta menor peso, alta resistência à fadiga e à corrosão (DONACHIE, 2000), ideal para o emprego neste setor.
Segundo Balazic et al. (2007), o titânio puro é classificado como um metal de transição que possui transição alotrópica em torno de 882 ± 2◦C. Abaixo desta temperatura, sua estrutura cristalina é da forma hexagonal compacta (HC), denominada de fase α. Acima desta tempera-tura, sua estrutura cristalina passa a ser de forma cúbica de corpo centrado (CCC), denominada de fase β. Estas estruturas possuem propriedades diferentes entre si e é a chave da ampla gama de propriedades metalúrgicas e mecânicas apresentada por estes materiais.
Segundo Leyens e Peters (2005), a adição de substâncias ditas estabilizadores de fase podem induzir ao aumento (α Estabilizadores) ou a diminuição (β estabilizadores) da tempera-tura de transformação alotrópica, originando ainda novas propriedades, como as apresentadas pela liga T i6Al4V.
Historicamente, a utilização de biomateriais a base de titânio data as décadas de 40 e 50, sendo utilizado primeiramente em materiais de ancoragem óssea (LEVENTHAL, 1951) (BOTHE; BEATON; DAVENPORT, 1940). Embora mencionado nestes períodos, a ampla uti-lização do titânio se deu após os estudos de Brånemark et al. (1969). Segundo Instituto Brane-mark (2017), ao estudar protocolos de procedimentos cirúrgicos, mais especificamente o papel da circulação em áreas operadas em tíbias de coelhos, Branemark observou que a câmara utili-zada para observação, composta de vidro e titânio, e o osso se integraram, sem sofrer rejeições. Este fenômeno foi então chamado de osseointegração e foi posteriormente muito estudado por Branemark e colaboradores em implantes por intertravamento.
O fenômeno da osseointegração é descrito por uma série de reações complexas de ca-ráter biomineralizador, caracterizada por três etapas principais: a osteocondução, neoformação óssea e remodelação. Nestas reações, a superfície de dispositivos médicos é assimilada ao te-cido ósseo pela ação das células primárias ósseas (osteoblastos). Na etapa de osteocondução, estas células dirigem-se a interface do tecido ósseo com o biomaterial e sintetizam a matriz or-gânica. Esta matriz orgânica é conhecida por servir como sítio para a deposição de íons, como cálcio e fosfato (precursores do mineral Hidroxiapatita (HA)), que passam posteriormente por um processo de mineralização (Van Scoy et al., 2017).
Durante a reação de mineralização ocorre a união das matrizes orgânica (composta por 20% de colágeno, 9% de água, 3% de Proteínas não-colagênicas, morfogenéticas, sialo proteí-nas e serum proteíproteí-nas e outros traços como polissacarídeos, lipídios, células ósseas primárias) e inorgânica (composta por 60% de HA, 4% de carbonato, 0,9% de citrato, 0,7% de sódio, 0,5% de Magnésio e outros traços iônicos (LEGEROS, 1991); (PARK, 2012); (MURUGAN; RAMAKRISHNA, 2005). Segundo Lakes (1993), o resultado desta reação de mineralização é a formação de arquiteturas nanométricas hierárquicas naturais, o osso como propriamente o conhecemos. Este, possui a dureza necessária para a sustentação do organismo, proporcionado pelos minerais HA e β-fosfato tricálcico (β-TRI), e a elasticidade para superar forças como a de compressão e torção, proporcionado por substâncias da matriz orgânica, como o colágeno.
O grande êxito na utilização de biomateriais a base de titânio, que impacta nas reações de osseointegração, é a sua natureza passivante (FADL-ALLAH; MOHSEN, 2010). Esta na-tureza faz com que haja a formação espontânea de um filme fino de óxido na superfície do metal proveniente da sua oxidação em ambientes hostis, o deixando passivo em relação aquele sistema. A passivação de metais pode ser definida como a transição de um comportamento ele-troquímico ativo para um de menor atividade, que resulta em uma diminuição de energia livre (BARD, 2000). Em oposição, metais não passiváveis, como o Ferro, quando inserido nestes ambientes, oxidam e os seus íons se dissolvem no ambiente não ocorrendo a formação desta
película de óxido protetor.
O corpo humano se apresenta como um ambiente hostil ao metal por possuir em sua composição alta concentração de íons. O titânio quando exposto ao mesmo se oxida, podendo apresentar estados de oxidação variáveis de acordo com a espécie com o qual reagiu. O estado de oxidação +4 resulta no cátion mais estável e mais comum nesses ambientes, formando o dióxido de titânio (T iO2). Este óxido é um pó branco atóxico, amplamente utilizado como pigmento em tintas, ocorrendo na natureza nos minerais brookita, octaedrita, anatase e rutilo.
O T iO2 apresenta três polimorfos estáveis em condições ambientes: anatase, rutilo e brookita (Fig. , estabilizadas através de TT (LIU; ZHANG, 2009). Dentre estas fases, a que possui a menor energia livre é a fase rutilo (MO; CHING, 1995). Embora mais rara, a fase anatase é a que detenta maior interesse por ser utilizada em dispositivos tecnológicas em função do band-gap adequado a aplicações com luz solar (MACAK et al., 2007).
Figura 1 – Estruturas cristalinas de T iO2: a) rutilo (Tetragonal), b) anatase (Tetragonal) e c) brookita (ortorrômbico).
Fonte: Retirado de (SMITH, 2019) e (REGONINI et al., 2013)
Outra vantagem da utilização de substratos de titânio e derivados, provém de proprie-dades mecânicas, como o módulo de Young, resistência a tração, à compressão e à fadiga mais próximas dos ossos quando comparado a outros materiais, como pode ser visto na tabela 1. Tabela 1 – Características biomecânicas ósseas e dos biomateriais a base de Ti ASTM F67, Ti
ASTM F136 e aço cirúrgico.
Propriedades Osso Cortical Osso trabecular Ti ASTM F67 Ti ASTM F136 Aço cirúrgico
Módulo de Young (GPa) 14-20 0,05-0,5 110 120 190
Resistência à tração (MPa) 50-150 10-20 300-740 860-1140 500-950
Resistência à compressão (MPa) 170-193 7-10 550 860 600
Fonte: (MURUGAN; RAMAKRISHNA, 2005), (LEGEROS, 1991), (PARK, 2012), (WEISS, 1983), (ONG; LOVALD; BLACK, 2014), (ASM International Handbook Committee, 1990) e (BLACK; HASTINGS, 2013).
3.2
PROPRIEDADES IMPORTANTES À
OSSEOINTEGRA-ÇÃO
Apesar da longa história do uso de implantes de titânio, falhas pós-operatórias de di-versas origens não são raras, tornando-se cada vez mais necessário o estudo meticuloso destes biomateriais. Estas falhas podem ser relacionadas desde a seleção do material, sua manufatura, ou mesmo o estado de saúde do paciente, bem como a sua não bioatividade.
Segundo LeGeros (2002), materiais bioativos são definidos como materiais que propor-cionam a osseointegração através de sua respectiva alta afinidade química com o tecido ósseo e estimulação da atividade das células osteoblásticas.
Estudos revelaram que a camada amorfa de T iO2 que se forma espontaneamente na superfície do titânio é pouco bioativa, ou seja, possui baixa capacidade de estimular a reações como a de osseointegração (KIM; RAMASWAMY, 2009). Neste contexto, a modificação da superfície pode ser usada como alternativa para o aumento da afinidade química do biomaterial com o tecido ósseo receptor através das estratégias:
• Anodização potenciostática em meios contendo íons de interesse biológico: proposta em função do crescimento de nanoestruturas que estão relacionadas ao aumento da área su-perficial, que está relacionada com o auemnto de contato com o tecido ósseo e disponibili-zação de áreas para deposição das matrizes ósseas (CORDIOLI et al., 2000), mimetidisponibili-zação da estrutura da matriz óssea, que também é nanométrica (LAKES, 1993), aumento da re-sistência ao cisalhamento osso-implante (BUSER et al., 1999) e da constituição de íons presentes no meio biológico durante o crescimento do filme de óxido através da adição da solução de SBF (SIMON; SIKORA, 2018).
Alguns estudos sugerem que a morfologia nanotubular, em forma singular, não é sufi-ciente para direcionar a respostas celulares (NASIRPOURI et al., 2017). Neste contexto, foi ainda estudada as estratégias:
• Alteração da morfologia e molhabilidade pela alteração da temperatura do eletrólito: pro-posta em função da alteração do diâmetro dos nanotubos, pois esta propriedade está relacionada ao fenômeno chamado de “cell fate” (destino celular), entendido como “o caminho” de diversas etapas de diferenciação celular usadas para explicar o estágio fi-nal celular (SAHA et al., 2018) (OH et al., 2009). Esta alteração morfológica surte um efeito macroscópico relacionado com a interação destes revestimentos com fluídos. Neste contexto, pode-se destacar que superfícies que apresentam alta molhabilidade estão rela-cionada com a maior adsorção de proteínas importantes as reações de osseointegração (OTHMAN et al., 2018).
• Cristalinidade através do emprego do TT: proposto em função da estabilização das fases cristalinas anatase e rutilo em função do aumento da resistência mecânica, evitando o
de-bridamento da superfície (SILVA, 2016). Além disso, estudos relacionados mostram que a proliferação de células MG63 está relacionada positivamente com o aumento molhabi-lidade dos filmes através do aumento da proporção de anatase em filmes nanoporosos de dióxido de titânio (SAHA et al., 2018) e (LU et al., 2018).
• Utilização de TiNTs como plataforma para liberação de fármacos: proposta em função do tratamento in situ, visando a diminuição de taxas de rejeição por infecção e inflamação (JUNIOR, 2009). Neste contexto, pode ainda se destacar que as taxas de infecções bacte-riana são apontadas como uma das complicações mais graves após a cirurgia de implante ortopédico (POPAT et al., 2007).
Neste contexto, o sinergismo entre composição química, morfologia da superfície, ru-gosidade, fase cristalina e molhabilidade devem ser considerados como estratégia para modifi-cação do desempenho in vivo, como interação celular, e osseointegração e outros, sendo crucial também para o sistema de liberação de fármaco (LIU et al., 2014) (ZHANG et al., 2017) (KIM et al., 2014).
3.2.1
Estratégias de Modificação da Superfície
3.2.1.1 Anodização potenciostáticaApesar da formação do filme passivo ser espontânea em biomateriais a base de titâ-nio, este revestimento pode ser induzido por várias técnicas, podendo-se citar eletrodeposição, anodização (MACAK et al., 2007), electrostripping, dentre outros.
O método eletroquímico de anodização potenciostática foi desenvolvido por Akkas et al. (2013) e posteriormente por V. Zwilling E. Darque-Ceretti (1999) durante o estudo de pro-cedimentos de anodização de titânio em eletrólito contendo ácido crômico e fluorídrico. Este método de crescimento de TiNTs se destaca pela simplicidade, baixo custo e alto controle de variáveis do processo (LIU et al., 2014) (KIM; RAMASWAMY, 2009).
É justamente pelo controle das variáveis de anodização que há a possibilidade de textu-rização da superfície pelo crescimento de estruturas com dimensões nanométricas, mimetizando a estrutura óssea (LAKES, 1993) e levando à otimização de propriedades como rugosidade e molhabilidade. Estas características são apontadas como um fator crítico, capaz de modificar a interação do implante com o organismo (LIU; DU; WANG, 2016), desempenhando um papel importante no contato entre os fluídos do corpo humano e o biomaterial.
O sistema de anodização é compreendido pela fonte de alimentação, célula eletrolítica (formada pela união dos eletrodos de trabalho (titânio), contra-eletrodos (platina) e solução ele-trolítica) e multímetro. Através da aplicação de uma diferença de potencial (DDP) ou corrente contante entre os eletrodos, reações de oxidação e de redução são estabelecidas, resultando na formação de uma camada de óxido sobre a superfície do titânio.
Em relação ao método de alimentação, os arranjos de TiNTs podem ser crescidos ele-troquímicamente através de duas formas: galvanostática (corrente constante) ou potenciostá-tica (potencial constante). Apesar de ambos os métodos induzirem a oxidação do substrato metálico, a anodização potenciostática em baixos potenciais possui algumas vantagens em re-lação ao método galvanostático, sendo este método associado com o design e crescimento de estruturas nanoporosas que podem mimetizar estruturas biológicas por conta do alto grau de auto-organização (REGONINI et al., 2013).
A DDP aplicada polariza os eletrodos positiva e negativamente, e como consequência das interações eletrostáticas haverá o deslocamento de íons em solução à interface dos eletro-dos (MULLER, 2008). Como resultado desta polarização, cátions do eletrólito, como os íons H+, são reduzidos nos contra-eletrodos. E concomitante a este processo, o eletrodo de titânio polarizado positivamente atrai íons negativos, em geral íons F−, OH−e O2−. Estes íons reagem com o íon titânio IV, formando óxidos, hidróxidos e complexos.
Apesar do método de alimentação representar grande papel durante a anodização, sua relação com a natureza da solução eletrolítica é considerado como o fator determinante da morfologia superficial.
Segundo Regonini et al. (2013), o histórico de evolução das soluções eletrolíticas utili-zadas na anodização passou por três momentos bem específicos culminando na quarta geração atualmente utilizada. Inicialmente, a condução de anodização em eletrólitos aquosos em que o óxido superficial não é solúvel gera a condição de óxido chamado barreira de espessura crítica de 1-3 nm/V (LOHRENGEL, 1993).
A inserção de íons fluoreto em meios contendo baixas porcentagens de água (0,5 a 10%) em soluções orgânicas viscosas nas gerações posteriores culminaram no alto ajuste das condições de anodização levando a produção de nanoarquiteturas na superfície do eletrodo de trabalho, sendo considerada como solução ideal para ser utilizada no tratamento de superfície de implantes.
Neste contexto, pode-se destacar que os íons que constituem a solução eletrolítica são responsáveis tanto pelo transporte elétrico quanto mássico (J) e podem acontecer em 3 formas: difusão, convecção e migração, descritas pela equação de Nernst-Planck (THEBAULT et al., 2009). ∂C ∂t =−∇J = ∇ · " D∇c − vC+ Dze kBT C∇φ # (3.1)
Em que, t representa o tempo, D a difusividade das espécies químicas, C a concentração, z é a valência de íons, e a carga elementar, kb é a constante Boltzmann, T é a temperatura, v a velocidade do fluído e φ o fluxo elétrico.
O termo D∇c faz menção a difusão de espécies iônicas, que nas condições da anodiza-ção pode ser descrita pela equaanodiza-ção de Stokes-Einstein:
D= kBT
Em que η remete a viscosidade e r ao raio da partícula esférica. Enquanto o termo [kDze
BTc∇φ] faz menção a migração de íons em função do campo
elé-trico, que nas condições da anodização pode ser descrita pela equação de Nernst-Einstein: λ = zuF = z2DF2
RT (3.3)
Em que u remete a mobilidade iônica, F a constante de Faraday e R a constante universal dos gases.
Em processos de anodização realizados sem a agitação externa do eletrólito, ou seja, desconsiderando a convecção representada pelo termo vC (que também pode ser causada por gradientes de densidade ou arraste causado por bolhas de gás), o fluxo de partículas pode ser simplificado em termos migracionais (movimento de partículas carregadas devido a uma DDP aplicada) e difusionais (movimento de partículas devido um gradiente de concentração).
O crescimento dos filmes TiNTs nanoporosos passam por várias etapas, sendo estas facilmente detectadas através do registro de densidade de corrente elétrica (do inglês, Current Density(CD)) em função do tempo de anodização, obtendo-se as chamadas curvas cronoampe-rométricas (Fig. 2).
Figura 2 – Curva cronoamperométrica referente à anodização potenciostática de titânio em meio contendo fluoreto.
Fonte: Retirado de Lima e Sikora (2015)
Para explicar este comportamento, diversos mecanismos têm sido propostos para a ano-dização. Segundo Regonini et al. (2013), os mecanismos mais difundidos são o regime de oxidação e dissolução assistida por campo associada ao fluxo plástico de campo, em que o crescimento dos TiNTs está relacionado com o campo elétrico.
Inicialmente, pode ser visualizada a queda abrupta de CD relacionado ao aumento da resistência do sistema devido ao crescimento do filme de óxido barreira. Como no início da reação o campo elétrico é intenso, a formação do filme se dá pelo regime de oxidação assistida por campo, cuja cinética é controlada pelo fluxo migracional (estágio I, Fig. 2).
O que na verdade ocorre é a passagem de uma corrente elétrica pelo eletrólito faz com que ocorra a eletrólise da água, descrita nas equações 3.4 e 3.5:
Reação anódica:
2H2O(l) → O2(g)+ 4H+(aq)+ 4e− (3.4) Reação catódica:
2H2O(l)+ 2e−→ H2(g)+ 2OH−(aq) (3.5) Íons decorrentes da decomposição da água sofrem a influência do campo elétrico do sistema, se deslocando através da solução eletrolítica. Por conta das interações coulombianas, os íons positivos são atraídos ao cátodo (polo negativo), sendo reduzido conforme mostra a equação 3.6.
4H(aq)+ + 4e−→ 2H2(g) (3.6)
Em função da DDP aplicada ao sistema, o eletrodo de trabalho polarizado positivamente se oxida conforme a reação mostrada abaixo (Eq. 3.7):
T i(s) → T i4++ 4e− (3.7)
Concomitantemente, íons negativos da solução são atraídos ao eletrodo de trabalho for-mado na Eq. 3.5 e reagem com o íon titânio IV, mostrado abaixo:
T i4++ 4OH(aq)− → T i(OH)4(s) (3.8) Através de reações de condensação, este hidróxido se decompõe a T iO2(s), segundo a equação 3.9:
T i(OH)4(s) → T iO2(s)+ 4H+(aq) (3.9) Evidências teóricas utilizando a Teoria do funcional da densidade (DFT), abordado nos trabalhos de Su, Bu e Zhou (2009), indicam a ocorrência de dissociação heterolítica de molé-culas de água orientadas na interface eletrólito/óxido em função do alto campo elétrico. Este fenômeno sugere a formação direta de O2−
aq e H+aq, que devem ser atraído aos eletrodos, levando também a formação de T iO2mostrado pela Eq. 3.10.
T i4++ 2O2−(aq)→ T iO2(s) (3.10) Como mencionado, a formação de óxido na superfície no eletrodo de trabalho está rela-cionada à uma diminuição da CD registrada em função de sua crescente resistência do sistema, levando à um mínimo de CD (MCD), como consequência da igualdade apresentada na equação 3.11.
U = Ri = (ρl
O termo U denota o potencial aplicado, R a resistência total do sistema e i a corrente elétrica.
Se abrirmos o termo de resistência, podemos correlacionar com a resistividade do óxido ρ, que multiplica a razão chamada de razão de crescimento (l/a) onde l indica a espessura e A a área superficial de óxido.
O limite entre a região I e II ocorre quando o sistema atinge um limite de espessura do filme de óxido. Assim, a resistência aumenta a ponto de diminuir substancialmente o campo elétrico. Como consequência desse fenômeno, estudos indicam que tanto a reação de formação quanto de dissolução agora passa a ser controlado pela difusão das espécies iônicas (MACAK et al., 2005).
Segundo Regonini et al. (2013), como o filme não cresce linearmente na superfície do metal, regiões de fronteira menor e/ou maior espessura da camada, defeitos e eventuais rachaduras atuam como zonas de menor resistência, induzindo a reação de dissolução (Eq. 3.14) e portanto a texturização da superfície, o que aumenta a área de contato com o eletrólito (estágio II, Fig. 3.2.1.1).
Quando este fenômeno ocorre, há uma mudança brusca no coeficiente angular (referido também como Slope) levando à um máximo de CD registrada (MACD), que pode ser analisado pela Lei de Ohm (Eq. 3.11). De acordo com esta equação, a variação da CD está com a variação da razão de crescimento visto que ρ considera-se constante. Deste modo, o aumento da CD registrada indica que há um aumento brusco da A do filme de óxido induzida pela reação de dissolução pelos íons fluoreto, que aumenta a CD à um máximo. Após este ponto, os valores voltam a diminuir, indicando que há um aumento agora de l, reduzindo os valores de l/A que está relacionado à uma diminuição da CD.
A porosidade induzida pelos íons fluoreto se deve à formação do complexo [T iF6]2−. Como este íon é altamente estável em água (REGONINI et al., 2013), ao ser formado migra para a solução, dando origem a porosidade na superfície do óxido barreira. Assim, esta região é conhecida pela nucleação de poros. Segundo a literatura, íons fluoreto também podem reagir tanto com o íon metálico,óxido e a camada hidratada, conforme as reações 3.12, 3.13 e 3.14.
T i4(aq)+ + 6F(aq)− → [(T iF)6]2−(aq) (3.12)
T i(OH)4+ 6F −
(aq)→ [(T iF)6]2−(aq)+ 4OH −
(3.13)
T iO2(s)+ 6F(aq)− → [(T iF)6]2−(aq)+ 2H2O(l) (3.14) Este sistema evolui então para a região III, caracterizado pela chegada ao estado estaci-onário. Este estado é caracterizado pela igualidade entre as taxas de formação e dissolução do óxido, onde há o crescimento da espessura dos nanotubos.
3.2.2
Presença de Íons de Interesse Biológico
A alteração de dispositivos a base de titânio com íons de interesse biológico têm sido amplamente investigada ao longo dos anos como uma estratégia para melhorar a biocompatibi-lidade e adesão de óxidos (LI et al., 2017) (LIN et al., 2010).
Estudos mostram que a modificação da superfície através da deposição por diferentes técnicas de compostos presentes no tecido ósseo, como a HA, são capazes de aumentar a intera-ção destes biomateriais com o osso humano (PILLAI; FRASNELLI; SGLAVO, 2018)(MURU-GAN; RAMAKRISHNA, 2005) (KIM; RAMASWAMY, 2009). Se destaca que a geometria tridimensional deste mineral é apropriada a formar ligações e concentrar proteínas morfogené-ticas provenientes da circulação (LEGEROS, 2002).
Estudos também mostram a inserção de íons, como Mg2+, podm ser utilizada na modifi-caçao de nanotubos de diversas matrizes, impactando na molhabilidade e indução da deposição de HA (LIN et al., 2010).
Como são determinadas pelas composição e propriedades superficiais do material, as interações químicas e biológicas do dispositivo dependerão principalmente da presença de íons de interesse biológico e sua respectiva energia de interface, resultando em reações complexas que determinaram a estabilidade e ancoramento do biomaterial, como a interação de grupos da superfície com a água, íons, reações de mineralização, interação celular, dentre outros, como citado no trabalho de Palmquist et al. (2010).
Com base no tema discorrido anteriormente, o eletrólito pode ser apontado como um dos fatores principais no crescimento de nanoestruturas. De modo a estimular estas intera-ções iniciais, a anodização pode ser conduzida em meios em que haja a presença destes íons, como eletrólitos parcialmente substituídos pela SBF (do inglês, Simulated Body Fluid – SBF), segundo a metodologia apresentada em (SIMON; SIKORA, 2018).
A solução de SBF foi inicialmente idealizada por Kokubo (1991) buscando a formula-ção de uma soluformula-ção com concentraformula-ção análoga ao fluído corpóreo natural de seres humanos, mostrada na tabela 2, em busca de mimetizar processos complexos de deposição mineral (osse-ointegração) que ocorrem na superfície óssea após os procedimentos de implantação.
Tabela 2 – Concentração Iônica do Plasma sanguíneo Humano em comparação com a solução de SBF. Legenda: [Ci]: Concentração Iônica (mM).
[Ci] (mM) Na+ K+ Mg2+ Ca2+ Cl− HCO− 3 HPO 3− 4 S O 2− 4 Plasma Sanguíneo Humano 142,0 5,0 1,5 2,5 147,8 4,2 1,0 0,5
Solução de SBF 142,0 5,0 1,5 2,5 103,0 27,0 1,0 0,5
Fonte: Adaptado de Kokubo e Takadama (2006)
Segundo a metodologia utilizada, substitui-se uma porcentagem da solução eletrolítica pela solução de SBF. Esta substituição parcial não é óbvia pois o organismo humano é
consi-derado um ambiente hostil à biomateriais metálicos, promovendo sua corrosão do tipo pit em função dos íons cloreto presente na corrente sanguínea.
Apesar da solução de SBF ser corrosiva ao metal, em pequenas quantidades pode ser usado para o fornecimento de espécies presentes naturalmente no organismo, como Cálcio, Magnésio e Fosfato, podendo ser usada para aumentar a proximidade da constituição química do organismo, promoção de maiores taxas de osseointegração de células ósseas ou mesmo a otimização da molhabilidade e morfologia.
3.2.3
Morfologia e Molhabilidade
Segundo Othman et al. (2018), a adsorção de proteínas é o primeiro evento de interação do biomateriais com o organismo receptor e podem determinar processos subsequentes de cres-cimento, diferenciação e adesão celular. A quantidade e propriedades da adsorção de proteínas dependem altamente da área exposta, sua morfologia e a molhabilidade da superfície.
Estudos revelam que a morfologia e rugosidade da superfície de implantes de titânio representam uma maior resistência ao cisalhamento osso-implante (BUSER et al., 1999) e área de contato ósseo (CORDIOLI et al., 2000) em comparação com superfície não rugosas, sendo associada com o aumento da proliferação de osteoblastos tipo MG63 (KIM et al., 2014).
Este último estudo concluí que diferenças nas superfícies dos implantes, como a to-pografia e composição química, podem afetar o crescimento de células MG63 (semelhantes a osteoblastos), presumivelmente pelo controle da expressão de proteínas envolvidas neste pro-cessos. Cordioli et al. (2000) também mostram que em superfícies micro/nanotexturizadas ocorre maturação óssea mais rápida, sem comprometer a massa óssea. Portanto, a morfologia e rugosidade da superfície pode ser usada em novas abordagens para melhorar os resultados clínicos de cirurgias ortopédicas e ortodônticas.
O diâmetro dos poros, propriedade que reflete na rugosidade da superfície, parece ser uma propriedade importante no campo dos biomateriais no governo do cell fate. Apesar de pouco consenso na área, estudos relatam diâmetros menores (15-30nm) são ótimos para induzir a adesão e disseminação celular, enquanto nanotubos de diâmetros internos maiores (70-100 nm) induzem maiores taxas de diferenciação osteogênica (OH et al., 2009) (SHI et al., 2015) (TIAN et al., 2015). Park et al. (2007) mostraram que para TiNTs aplicados a biomateriais, a faixa de 30-70 nm representa o limite para governar o cell fate.
Como a biocompatibilidade dos biomateriais está estreitamente relacionada ao compor-tamento celular na superfície, além de propriedades superficiais, a integração do biomaterial com o osso deve refletir nas interações eletrostáticas das células e a superfície (ROACH; FAR-RAR; PERRY, 2005), sendo a molhabilidade e a energia superficial as propriedades importantes neste fenômeno. A hidrofilicidade de superfícies de T iO2está relacionada com a densidade dos grupos hidroxila e sua distribuição sobre a superfície. Esses grupos interagem com moléculas de água, através de ligações de hidrogênio, resultando em maior molhabilidade da superfície e interação com fluídos corpóreos (SAHA et al., 2018).
3.2.3.1 Efeito da temperatura do eletrólito
Como a osseointegração está relacionada a propriedades químicas, morfológicas e es-truturais em biomateriais a base de titânio, a modificação das características de filmes anó-dicos, como o diâmetro de poro, também pode ser estudadas como forma de bioativação de biomateriais nanoestruturados, podendo ser gerada através da alteração de variáveis químicas e termodinâmicas do processo de anodização, como a alteração da temperatura do eletrólito.
Com base no mecanismo de crescimento anódico de óxido e teoria cinética de partículas carregadas, a alteração da temperatura do eletrólito altera principalmente a taxa de dissolução química do óxido superficial. Isto ocorre pois ao alterar a temperatura do eletrólito, altera-se a viscosidade do meio, alterando o fluxo de matéria por difusão.
Como sob um campo elétrico, o movimento de uma partícula pode ser entendido como resultante das forças que atuam sobre ela: A força elétrica, Fe, que conduz ao movimento elétrico de mesma orientação que o campo elétrico, e a força de atrito viscoso, Fat, orientada em oposição ao deslocamento iônico. O balanço das duas forças leva à definição de mobilidade iônica (u) sob um campo elétrico constante, descrita por:
u= Fe Fat
= zeE
6πηa (3.15)
Em que, ze faz menção à carga do íon, E ao módulo do campo elétrico, η a viscosidade e a o raio hidrodinâmico do átomo.
De acordo com a definição da mobilidade iônica (Eq. 3.15), podemos perceber a relação inversa entre a velocidade de migração iônica e a viscosidade do meio. Este fato ocasionou a uma grande revolução no método eletroquímico de anodização potenciostática, através da introdução de espécies orgânicas não ionizáveis no eletrólito. Assim, a mobilidade iônica do íon fluoreto era reduzida em função do aumento da viscosidade do meio e, por consequência, se verificava um menor ataque iônico da superfície otimizando a produção de TiNTs (WANG; LIN, 2009).
Como a viscosidade de um fluído em fase líquida é função de sua força de atrito interna, ou seja de sua coesão, ao aumentar a temperatura ocorre um aumento de energia cinética das partículas, diminuindo assim o intervalo médio de tempo de interação entre as moléculas, ou seja, diminuindo sua coesão e assim a viscosidade. Ao diminuir-se a viscosidade, a mobilidade iônica aumenta pois são inversamente proporcionais.
Estas relações podem ser vistas também através da equação de Nernst-Einstein (MIR-ZOEV et al., 2019) abaixo:
D= µqkBT
q (3.16)
Em que D remete a constante de difusão, q a carga elétrica da partícula, µq, a mobilidade elétrica da partícula carregada, kba constante de Boltzmann e T é a temperatura absoluta.
Em soluções com baixo número de Reynolds (solução apresenta baixa resistência ao cisalhamento), a equação 3.16 se torna a equação 3.2 chamada de Stokes-Einstein (ZHANG et al., 2010):
Segundo Macak e Schmuki (2006), em meios organo-aquosos contendo fluoreto, a faixa de 0 - 40◦C que mostram os melhores resultados. Neste estudo, pôde ser visualizado também a forte dependência dos resultados morfológicos em relação a temperatura e a viscosidade do ele-trólito, indicando que a difusão dos reagentes é o fator limitante de crescimento dos nanotubos. Assim, quão maior a temperatura do eletrólito até o valor máximo de 40 ◦C, maior o diâmetro de poro e maior seu comprimento.
Como consequência da alteração da temperatura do eletrólito, os autores Prida et al. (2007) e Kapusta-Kołodziej et al. (2014) verificaram que a espessura do óxido, o diâmetro do poro e a porosidade das camadas de T iO2formadas aumentam gradualmente com o aumento da temperatura do eletrólito, podendo levar também a alteração da molhabilidade. De fato, Bram-mer et al. (2009) demonstrou que o aumento do diâmetro provoca uma diminuição do ângulo de contato e foi atrelado ao aumento da área superficial. Deste modo, a inserção de espécies da solução de SBF bem como a alteração na temperatura do eletrólito, serão utilizadas como técnicas de bioativação da superfícies de biomateriais anodizados, explorados neste trabalho.
3.2.4
Cristalinidade
Do ponto de vista biomédico, a otimização da molhabilidade tem um efeito imunomo-dulador mais forte do que o aumento da rugosidade (HOTCHKISS et al., 2016). Neste cenário, o comportamento hidrofílico deve estar relacionado à melhor absorção das proteínas e, em se-guida, à resposta celular.
Saha et al. (2018) relata em seus estudos que a molhabilidade da superfície não cristalina de T iO2está relacionada a uma maior densidade de grupos hidroxila em sua superfície quando comparada com outras fases cristalinas, a tornando a superfície ligeiramente negativa. Porém, autores destacam que a fase cristalina foi um fator dominante nos comportamentos plaquetários pois interfere tanto na molhabilidade quanto na rugosidade da superfície (HUANG et al., 2017), havendo um efeito sinérgico destas propriedades.
Saha et al. (2018) e Lu et al. (2018) mostraram que a proliferação de células MG63 es-tava relacionada positivamente com o aumento molhabilidade dos filmes através do aumento da proporção de anatase em filmes nanoporosos de dióxido de titânio. O mesmo foi observado por Zhang et al. (2017), onde o comportamento plaquetário mostra melhor adesão, melhor viabili-dade, agregação e ativação em amostras contendo anatase, relacionadas à melhor molhabilidade também.
A otimização da cristalinidade dos filmes de TiNTs pode ser investigada e empregadas sobre outros aspectos, como o de deposição do mineral HA. Segundo Li et al. (1994), a exis-tência de grupos Ti-OH na superfície de géis de titânio se mostram essenciais para a nucleação da apatita. Porém, curiosamente no estudo de Uchida et al. (2002), géis amorfos que presumi-velmente possuíam maior grupos Ti-OH não foram capazes de induzir sua formação, sendo que esta era maior em materiais que possuíam anatase.
A explicação dada no trabalho foi que a fase cristalina anatase pode fornecer arranjos atômicos adequadas para a epitaxia de cristais de HA. De todo modo, Kodama et al. (2009) destaca que o aumento do diâmetro de nanotubo pode ser positivo à maior deposição de HA através da diminuição de efeitos de capilaridade e de transporte de massa.
É lógico que existe um efeito sinérgico entre todas as propriedades até então destacada: a presença de íons de interesse biológico na camada de óxido altera a composição química que está relacionada com a molhabilidade. A síntese de biomateriais com alta rugosidade, como por exemplo materiais nanoporosos, em solução que apresenta estes íons gera um biomaterial com maior potencial à biocompatibilidade enquanto disponibiliza maiores áreas para o armaze-namento de líquidos, impactando novamente na molhabilidade e assim por diante.
3.2.4.1 Efeito do tratamento térmico (TT)
Em função da baixa energia aplicada ao sistema, a síntese de filmes pelo método de anodização potenciostática gera uma superfície de baixa cristalinidade (amorfo). Em função disto, o filme resultante pode apresentar algumas propriedades insatisfatórias na utilização deste material como dispositivo médico implantável: resistência mecânica limitada, baixa adesão ao substrato e baixa molhabilidade em relação à revestimentos que apresentem cristalinidade, restringindo o emprego de nanotubos de TiNTs em escala industrial.
Do ponto de vista biomédico, a utilização de dispositivos nanoporosos de titânio se mos-tram viáveis, mas, para tanto, o TT posterior a síntese deve ser empregado para transformar o óxido amorfo em cristalino, melhorando tanto propriedades mecânicas quanto superficiais. Du-rante o TT, cede-se energia ao sistema amorfo, sendo esta parcialmente utilizada na organização dos átomos em arranjos definidos denominados células unitárias. Dependendo das condições utilizadas para o TT, a estrutura cristalina resultante pode ser anatase, rutilo, brookita ou a mistura destas fases (REGONINI et al., 2013).
Segundo o trabalho de Yu e Wang (2010), o mecanismo de transformação de fase de nanotubos de dióxido de titânio não está totalmente esclarecido, mas baseia-se na interação eletrostática entre dois vértices comuns entre octaedros amorfos, que se unem por atração ele-trostática em uma reação de desidratação. A presença de hidróxidos e impurezas de precursores, como o íon F−, catalisam essa reação de desidratação em função de formar pontes entre os gru-pos OH ou O de vértices de dois octaedros diferentes, alinhando os octaedros e facilitando a desidratação, como mostrado na Figura 3.
As transformações de fase habituais do T iO2ocorrem em geral as temperaturas de 450, 600 e superiores a 1000◦C, para as fases anatase, rutilo e brookita, respectivamente. Com base em observações experimentais, o modelo que descreve a transformação de fase tanto da fase amorfa para anatase e anatase para rutilo (ART) pode ser explicadas através do crescimento do cristalito e reações de estado sólido.
A medida em que o TT avança a temperaturas maiores que 400 ◦C (dependendo do método de síntese), o pico de difração referente a anatase começa a aparecer, originado através
Figura 3 – Diagrama esquemático do mecanismo de reação da transformação da fase amorfa para anatase na presença de íons F−durante o TT.
Fonte: Retirado de Yu e Wang (2010)
da re-organização e união de óxidos amorfos ou hidróxidos pela energia térmica.
Ao realizar o estudo do TT, Liu e Zhang (2009) reportaram que o início da transforma-ção de fase do óxido amorfo para a anatase se deu entre 300 e 400 ◦C, enquanto a fase rutilo em 600 ◦C. Através do TT sob mesmo procedimento, Yu e Wang (2010) e Bai et al. (2011) reportaram transições de fase anatase em 450◦C e para rutilo em 600◦C, reportando também a completa destruição dos nanotubos em tratamento de 700 e 750◦C, respectivamente.
Neste contexto, análises de Espectroscopia de raios X por dispersão em energia (EDX) realizada pelos autores Yu e Wang (2010) revelam que nanotubos crescidos eletroquímicamente em meio contendo NH4F contêm além de Ti e O, uma pequena quantidade de fluoreto e água intersticial e atuam como catalisadores desta conversão de fase (YU; DAI; CHENG, 2010)
Como destacado pelo autor Yu e Wang (2010), o sinal do íon fluoreto desaparece no espectro de EDX após calcinação a 400◦C, revelando que esta impureza poderia ser eliminada através da oxidação térmica. A medida então que se prossegue o TT, os cristalitos coalescem se tornando a fase rutilo. Segundo Fang et al. (2011) e Yu e Wang (2010), em temperaturas maiores que 600 ◦C se observa o crescimento da célula unitária do rutilo, chegando esta a ser maior do que a parede do nanotubo. Em função disto, esta fase geralmente emerge destruindo as nanoestruturas, evidenciado na Figura 4.
Figura 4 – Diagrama esquemático da transformação de fase e evolução da morfologia em nano-tubos de T iO2 durante TT.
Fonte: Retirado de Yu e Wang (2010)
Macroscopicamente, o TT pode ser traduzido em função das propriedades que o mate-rial apresenta, como as propriedades mecânicas. Muitos estudos demonstram a importância da
fase cristalina anatase na área de biomateriais, principalmente durante a diferenciação e proli-feração celular, como nos trabalhos de Oh et al. (2006) e He et al. (2008), baseados em uma relativa maior indução da deposição do mineral HA em relação à estrutura do rutilo descrita por Uchida et al. (2002), e, portanto, mais benéfica para o crescimento ósseo.
Como pode ser visto na tabela 3, a fase rutilo (que começa a aparecer em aproximada-mente 530◦C) apresenta valores maiores tanto de rigidez quanto módulo de Young nos testes de nanoindentação quando empregado um TT de 400◦C referente à fase anatase, segundo o estudo conduzido por Silva (2016). Segundo os autores Bai et al. (2011), a mistura entre estas fases (anatase e rutilo) possui vantagens biomecânicas pois, uma maior rigidez está relacionado a um maior desgaste, como apresentada pela fase rutilo, e baixos módulos de Young estão relaciona-dos a uma menor chance do fenômeno de stress shielding, como apresentado pela fase anatase. Sendo assim, é de extrema importância o estudo de propriedades que apresentem altos valores de módulo de Young mas com rigidez reduzida, obtida através da mistura das duas fases. Tabela 3 – Características mecânicas de materiais a base de T iO2. Legenda: TT - Tratamento
Térmico e STT - Sem Tratamento Térmico.
TT (◦C) STT 300 400 530 600 700
Rigidez (GPa) 0,5 - 2 0,2 - 0,9 0,2 - 0,8 0,3 - 1 0,5 - 2,8 3,2 - 8,5 Módulo de Young (GPa) 40 - 115 50 - 55 20 - 80 18 - 95 50 - 105 155 - 215
Fonte: (SILVA, 2016)
Porém, nota-se através da literatura vigente a inexistência de estudos completos que abordem com maiores detalhes a influência de fatores durante a síntese e de TT e destes relaci-onados, como químicos, físicos e mecânicos, que elucidem a relação entre a osteocondução, a molhabilidade, o tamanho de cristalito, a resistência mecânica e a corrosão com diversas pro-priedades que estes materiais vêm apresentando.
Como neste trabalho foi adicionado ainda ao eletrólito a solução de SBF, a caracteri-zação térmica é de fundamental influência para a determinação da influência iônica da solução durante o crescimento e propriedades mecânicas apresentadas após o TT. Por este motivo, o estudo objetivou estudar a influência da temperatura do eletrólito e de TT e sua a relação entre as propriedades apresentadas através da caracterização.
