Aula - Tecnologia do rDNA e microoganismos (2017-1)

BIOTECNOLOGIA

BACHARELADO EM

Microrganismos e a Tecnologia do

DNA Recombinante

Introdução

Produção de proteínas recombinantes Processo-chave

Alternativa  extração/purificação de proteínas nativas Sazonalidade

Contaminações  toxicidade, reação pirogênica, infecção Isoformas

1970  Produção heteróloga≠ células-hospedeiras

Tecnologia do DNA recombinante Eng. genética

1º. Produtos  fármacos e enzimas

03

20 fármacos recombinantes

13 bi € (2013) 10 bi € (2016)

Otimização de processos  cultivos

Biorreatores

Tecnologia do DNA Recombinante?

04

Definição

Isolar/multiplicar DNA ( organismos) Identificar Combinar “Conjunto” técnicas:

 Molécula repositória da informação genética;  2 cadeias complementares de ácido desoxirribonucleico; Cadeias → direções opostas;

 Desnaturado e renaturado;  Síntese química Propriedades:

Mecanismos  replicação e expressão gênica Determinação genes sequências proteínas

Desenvolvimento de culturas microbianas  moléculas recombinantes:

Insulina Hormônios

Vacinas (proteína ou DNA) Enzimas

Aplicações da Tecnologia do DNA recombinante

Terapias gênicas Diagnósticos médicos Obtenção de transgênicos Tecnologia forense 06

Clonagem gênica

Técnica central 06 Identificação Isolamento Propagação (Células hospedeiras)

Objetivos gerais

Mistura heteróloga A C D B A B C D Separação & Identificação Gene específico D D D D D No. cópias ou Amplificação 08

Etapas gerais da Clonagem

Preparação (Vetor e DNA doador)

Ligação (Fragmento  Vetor) Introdução (DNAr  Hospedeiro) Seleção e Identificação (Clones recombinantes) 09

Principais componentes

Inserto Nucleases (Endonucleases de restrição) Enzimas modificadoras Vetores Células hospedeiras 10

Inserto

Fragmento de DNA  “gene”

DNA doador Clonagem demanda:

DNA total (genômico)  tecidos / células DNA plasmidial

DNA de fago  partículas virais

Convencionais  CTAB

Obtenção  DNA doador:

Kits  Floraclean ou DNAzol

Obtenção:

Digestão enzimática Quebra mecânica controlada Síntese enzimática

Síntese química  oligodesoxirribonucleotídeos

11

Nucleases

Ligação fosfodiéster

2 tipos:

Exonucleases  removem um nucleotídeo por vez (extremidades); Endonucleases  quebra ligações internas

12

Quebram:

Endonucleases de restrição

Clivar:

Vetor de clonagem (plasmídeo)

DNA (inserto)

Vetor recombinante Inserido

13

Sítios Sítios Sítios

Endonucleases de restrição

Divididas  Classes:

Estrutura; Atividade;

Sítio  reconhecimento e clivagem

+ utilizadas (DNAr)  Tipo II “Enzimas de restrição”

Mecanismo de defesa → infecção viral

 Especificidade “Sítios de restrição”

Especializadas → degradar DNA exógeno (Bactérias)

14

Enzimas de restrição (ER Tipo II)

Monômeros / Dímeros Cofator (Mg+₎ Sítio de restrição (reconhecimento/ligação) ...GAA TTC... ...CTT AAG... Sequência palindrômica

a) Clivagem  Eixo de simetria b) Clivagem  Flancos (eixo de simetria)

Extremidades abruptas (AluI)

Extremidades coesivas (EcoRI)

Nomenclatura das enzimas de restrição

Abreviaturas organismo/estirpes

Eco

R

I

Escherichia coli

Estirpe RY13

1a _{enzima isolada (estirpe)}

16

Ligases

Reparadoras  quebras e descontinuidades

Extremidades coesivas Abruptas

Une fragmentos:

18

Mecanismo de ação da DNA ligase

Etapas: 1) Adenilação da ligase Lys Lys (Eucariotos e fagos) (Procariotos)

Mecanismo de ação da DNA ligase

2) Ativação do grupo P → DNA

Lys

Ativação → grupo P 5’

Lys

19

20

3´-OH ataca o P→ ligação fosfodiéster:

Mecanismo de ação da DNA ligase

3) Deslocamento da AMP

Ligação fosfodiéster

Polimerases

2. Síntese de novas fitas  fita molde

DNA polimerase Taq DNA polimerase

RNA polimerase

Exemplo:

21

DNA polimerase Desoxirribonucleotídeo trifosfato

Taq DNA polimerase

Taq (EC 2.7.7.7) Polimerase termoestável

Thermus aquaticus Bactéria extremófila Fontes hidrotermais

1965 Geises (parque Yellowstone)

Taq ( temperaturas) atividade a 94 oC, 40 min

Característica desejável PCR

22

Vetores

DNA circular:

Características:

Capacidade e facilidade  Inserção

Capacidade de replicação ↓ Massa molecular Fácil  recuperação

Conter genes  seleção

Organismo (Doador) Organismo (hospedeiro) inserto DNA recombinante Organismo transgênico

Vetores Plasmídeos, Fagos, YEps 23

Plasmídeos

dsDNA circular  Elementos:

MSC Plasmídeo Cromossomo bacteriano Replicação autônoma 5-400 Kb 24

Transferência de genes em bactérias

3 mecanismos:

25

1) Conjugação → transferência direta do material genético

Cél. doadora Cél. receptora

Ponte citoplasmática

Transferência do DNA replicado

Separação Replicação do DNA e recombinação

Transferência de genes em bactérias

3 mecanismos:

2) Transformação → DNA do meio

26

Transferência de genes em bactérias

3 mecanismos:

2)Transdução → transferência via bacteriófagos

27

Principais estruturas:

Cabeça e cauda Filamentoso Cabeça

Cauda

Capsídeo

Padrão de infecção  Etapas:

Biossíntese Ciclo Lítico (virulento) Maturação Injeção Liberação Ancoragem 28

Bacteriófagos (fagos)

Vírus  infectam bactérias

Vetores para leveduras

2 categorias:

29

Plasmídio epissomal  YEp ou plasmídio 2 m Autônomos  ARS (origens de replicação)

Cromossomo artificial  YAC

ARS

Integrativos (YIps) Integrados ao genoma do hospedeiro

Preparação do Vetor e DNA doador

30

Células hospedeiras

Vetores recombinantes  quantidades de DNAr Escolha  Objetivo:

Isolar gene p/ análise estrutural  Sistemas simples (fácil uso)

Expressar informação genética  eucariotos  Sistemas específicos (uso complexo)

Célula hospedeira Ideal:

Crescimento rápido

Capacidade de crescimento  meio simples e custo Fácil  manipulação/propagação

Aceitar  muitos vetores Disponibilidade   estirpes 31 GRAS Generally Regarded As Safe

Sistemas de Expressão

Levedura Bactéria Mamífero Inseto Plantas

32

Breve histórico

1855 →

Dr. Theodor Escherich

–

Isolamento e caracterização de

uma bactéria de cólon;

–

Bacterium colon commune

–

Escherichia coli → 1919

Auxílio →estudos pioneiros (biomol)

•

> 100 mil publicações

•

Procariotos mais estudados

•

Década de 80, 1

a

_proteína

recombinante aprovada pela FDA

Genoma (1997 e 2009) →

4,63 M pb

(~4300 genes) → 8% humanos

Principais características

Peptideoglicano

Bacilos gram -  Envelope celular  Corante violeta de genciana Microbiota intestinal Anaeróbicas facultativas Enterobacteriaceae

Esporuladas

Cromossomo circular Nucleóide Pilos e flagelos

34

Vantagens do sistema E. coli

• Pouco exigente nutricionalmente • Meio mínimo ou rico

–Extrato de levedura – Fonte de C –Triptona e Peptona: fonte aminoácidos

• Cresce rapidamente a 37o_{C → divisão 20 min}

• ↑ Disponibilidade → vetores de clonagem e expressão

• Processo escalonável (scale-up)

• Facilidade → cultivo, manutenção e armazenamento

• ↓Custo

• ↑ Níveis de expressão → proteínas heterólogas

• ↑ Disponibilidade → cepas comerciais

• Possibilidade de alterações → melhorar a expressão

35

Desvantagens do sistema E. coli

•

Formação ineficiente →

pontes S-S

•

Possibilidade →

mau enovelamento protéico (citoplasma)

•

Formação →

corpos de inclusão

•

Maioria das cepas →

processamentos pós-traducionais

– Glicosilação

•

Secreção ineficiente

•

Proteólise

•

Presença de endotoxinas (LPS)

36 % d o N o . to ta l d e p u b lica çõ e s Ano 37

Cepas comerciais de E. coli

38

Cultivo de microrganismos

Generalidades:

 Macronutrientes (C, H, N, O, P, S, K, Mg, Na, etc.);

 Micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.);

 Fatores de crescimento → Vitaminas e aminoácidos

 Condições adequadas → pH, oxigênio e temperatura.

Classificação dos meios:

• Consistência;

• Composição;

• Utilização.

39

Classificação dos meios de cultura

a) Consistência

•

Sólido → gelificantes

40

- Observar diferenças (superfície) - Obtenção e conservação  “culturas puras” - Agar (agar-agar; agarose)

Agaropectina (3-10%)

-1,3 D-galactose

-1,4,3,6 anidro-L-galactose

a) Insolúvel → H2O fria.

b) Expansão → 20X próprio peso

c) Rápida dissolução → H2O quente (Tfusão 85-100 oC).

d) Transparente → solubilização e) 1,5% de agar → gel sólido (32 a 45 ºC).

f) Gel semi-sólido→ ↓concentrações (0,5%).

g) Metabolizado → crescimento microbiano→ Nutriente

h)↑Disponibilidade → marcas e fornecedores

Propriedades do Ágar

Agente solidificante ideal

Classificação dos meios de cultura

a) Consistência

• Semi-sólido↓ [ágar] (fermentação; mobilidade bacteriana; crescimento)

42

Apresenta 2 desvantagens:

1) Revelam características especiais →limitando o processo de identificação; 2) Separação de espécies bacterianas → misturas.

•Líquido → caldo nutritivo de crescimento

Classificação dos meios de cultura

b) Composição

• Sintéticos → quimicamente definidos

Extratos: • Carne; • Leveduras; • Peptonas.

• Complexos → Indefinidos

43

Classificação dos meios de cultura

c) Utilização

• Meios de isolamento → culturas puras

• Meios de pré-enriquecimento → dessensibilização

• Meios de enriquecimento→ meios básicos suplementados

• Meios de identificação → características bioquímicas

• Meios de estocagem → vida latente (viabilidade)

44

Métodos de inoculação em meios sólidos

Espalhamento

Métodos de inoculação em meios sólidos

Estrias ou esgotamento

46

Colônias isoladas

47

Métodos de inoculação em meios sólidos

Incorporação (pour plate)

Métodos de inoculação em meios sólidos

Picada central

Meios usados para o cultivo de E. coli

50

 Extrato de carne/ levedura - Fonte de C, N, vitaminas e

sais minerais.

 Peptona – Fonte de N, peptídeos e aminoácidos

 Cloreto de sódio -

↑ pressão osmótica e mantém a

isotonia do meio

 Agar – solidificação - metabolizado.

Funções dos componentes do meio LB

51

Cultivo da E. coli - Cuidados

1) Dividir o meio em dois ou mais frascos

2) Aguardar 12-24 horas após autoclavagem 3) Encher ¾ do frasco

4) Não fechar totalmente a tampa do frasco antes →autoclavagem 5) Antibióticos – filtros de esterilização

6) Meios mantidos – 1 mês.

7) Meios inoculados → inativados e autoclavados

Referência: Sambrook and Russel 3.ed., Volume 3 52

Filtro estéreis

Fitorreguladores  auxinas e citocininas Biomoléculas

Esterelização de substâncias termossensíveis

Recipientes para o cultivo da E. coli

54

Cultivo da E. coli – meios prontos

Concentrações : 1X ou 10X

55

Crescimento das culturas de E. coli

4 fases:

56

Abs600 nm

Leveduras como células hospedeiras

Vacúol o Mitocôndria Núcleo Parede celular Célula-filha Célula-mãe Pichia pastoris e Sacharomyces cerevisae

Modificações pós-traducionais  Glicosilação

Organização celular  Eucariotos superiores

Outros eucariotos  Aspergillus, CHO, Sf9 e protoplastos

Utilização de leveduras

58

Modificações pós-traducionais

59

Por que P. pastoris e não S. cereviciae?

(Efeito Crabtree) 60



Viabilidade

 Estabilidade genética  ↑ tempo  Evitar mutações

.

Métodos de manutenção microbiológica

Objetivos:

62



Escolha de técnica de conservação

:

OBSERVAÇÃO!!

• Microrganismo • Métodos • Custo • Capacidade laboratorial • Disponibilidade de equipamentos

 Métodos de curto prazo: repicagem contínua;

 Métodos de médio prazo: preservação em óleo mineral,

água esterilizada, congelamento comum;

 Métodos de longo prazo: liofilização, criopreservação.

Classificação dos métodos de manutenção

de microrganismos

Tempo máximo de preservação:

63



Inoculação → meio adequado: favorável à multiplicação e estocagem à ↓ temperaturas.

 5-8 o_{C → 3 - 12 meses}

Vantagens: facilidade; ↓custo; estresse; reativação dos microrganismos  Desvantagens: ↑ risco de contaminação; perdas de características genéticas; ↑espaço físico para armazenamento; logística inconveniente.

Repicagem contínua

Sub-cultivo ou periódica:

64



Armazenamento → água esterilizada ou solução salina,  Indicação → microrganismos sensíveis a ↓ pressões osmóticas Restrição de nutrientes  ↓ metabolismo; latência

 3 meses – 2 anos

 Vantagens: Custo; facilidade e reprodutibilidade; Desvantagens: contaminações e instabilidade genética

Manutenção em água estéril

Método de Castellani:

65



Conservação → temperaturas relativamente baixas entre (-4 e -20 °C),  3 meses – 2 anos

↓ metabolismo; latência

 Vantagens: Simples; ↓ custo ; equipamentos complexos; preparo de material

Desvantagens: ↓ viabilidade; instabilidade genética

Congelamento comum



Desidratação → vácuo e ↓ temperaturas  Viabilidade → 20 anos

 Vantagens: Reprodutibilidade; ↑ estabilidade; ↓ mutação;

monitoramento/manutenção frequentes; transporte/armazenagem Desvantagens: Custo

Liofilização

67



Manutenção  ↓ temperaturas (-20°C a -80°C) e ultrabaixas

temperaturas (-150°C a -196 °C)

Criopreservação

68

 Fatores: • Espécie

• Tamanho e estrutura celular • Fase e taxa de desenvolvimento • Temperatura de incubação • Composição dos meios de cultivo • pH

• Teor de água das células • Teor lipídico

• Tempo de estocagem

• Condições para recuperação das culturas • Taxa de resfriamento (exemplo, -1°C/min)



Ideal TR lenta  congelamento/evitar a formação de gelo intracelular

Observação!

69

 Vitrificação  formação de cristais

Danos decorrentes da criopresevação

• Formação de cristais de gelo intracelular

• Alteração estrutural da membrana celular;

• Desidratação

• ↑[solutos intracelulares]→ instabilidade osmótica

• Perda → viabilidade celular

70

Crioprotetores

•DMSO

•Etilenoglicol

•Metanol

•Glicerol

•Manitol

•Dextran

• AFPs

71

Esterilização pelo calor úmido

72

Manômetro

73

Cestos para autoclavagem

Água destilada Resistência Suporte

Manutenção do autoclave

75

Preparo de materiais para autoclavagem

76

Preparo de materiais para autoclavagem

77 78

Preparo de materiais para autoclavagem

Não recomendado: 79

O

rgan

izaç

ão

do

mat

eri

al

no

au

toc

lav

e

Autoclavagem de placas, tubos e pipetas

81

Autoclaves automatizados

Indicadores biológicos: Geobacillus stearothermophilus Temperatura ideal: 50-60 oC 83

Eficiência da autoclavagem

Indicadores químicos: Teste Bowie-Dick; Fita de autoclavagem 84

Eficiência da autoclavagem

85