CURSO DE GRADUAÇÃO EM LICENCIATURA EM QUÍMICA
FERNANDA RECHOTNEK
ESTUDO VISANDO A OBTENÇÃO DE SENSORES BASEADOS EM
FILMES POLIMÉRICOS ULTRAFINOS PARA DETECÇÃO DE
TOXINAS EM CASTANHA-DO-BRASIL
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
CAMPO MOURÃO 2017
ESTUDO VISANDO A OBTENÇÃO DE SENSORES BASEADOS EM
FILMES POLIMÉRICOS ULTRAFINOS PARA DETECÇÃO DE
TOXINAS EM CASTANHA-DO-BRASIL
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à disciplina de Trabalho de Conclusão de Curso 2 (TCC2), do Curso de Licenciatura em Química do Departamento Acadêmico de Química DAQUI da Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR, como requisito parcial para obtenção do título de Licenciado em Química.
Orientadora: Profª. Drª. Rafaelle Bonzanini
Romero
CAMPO MOURÃO 2017
Aos meus pais, Valdelice e João, e a minha irmã, Raquel, pelo incentivo, apoio e confiança que depositaram em mim para alcançar meus objetivos. Amo vocês!
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pela proteção e sabedoria ao guiar meus passos proporcionando esta conquista.
Agradeço aos meus pais, por sempre estarem ao meu lado. Pelo amor, paciência e todos os ensinamentos, que foram primordiais nessa caminhada. Muito obrigada!
Ao Bruno pela contribuição, apoio, paciência e dedicação na realização desse trabalho.
Agradeço à minha orientadora professora Dra. Rafaelle Bonzanini Romero por aceitar me orientar. Pela atenção, dedicação e ensinamentos disponibilizados para que alcançássemos nossos objetivos.
Aos professores Msc. Adriano Lopes Romero e Dra. Patrícia Valderrama, pelo apoio e contribuição neste trabalho.
Aos professores que contribuíram para a minha formação acadêmica, Natália, Estela, Rafaelle, Adriano, Letícia, Gustavo, Marcilene, Nelson, Regiane, Vivian, Patrícia, Daniela, Piza, Ethiene, Matheus, Emerson e Elizabete. Obrigada!
Aos professores membros da banca examinadora, Nelson Consolin Filho e Stênio Cristaldo Heck por aceitarem o convite e por todas as valiosas contribuições.
À Vanessa e ao professor Dr. Adley da Universidade Estadual de Maringá pela ajuda com as análises.
Agradeço à Universidade Tecnológica Federal do Paraná pela oportunidade. Agradeço a todos os meus amigos que estiveram ao meu lado durante esta caminhada, vocês são muito especiais.
E a todos que de forma direta ou indiretamente contribuíram para minha formação pessoal e acadêmica.
RESUMO
RECHOTNEK, Fernanda. Estudo visando à obtenção de sensores baseados em filmes poliméricos ultrafinos para detecção de toxinas em castanha-do-Brasil. 2017. 97 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Curso de Licenciatura em Química), Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Campo Mourão, 2017.
A castanha-do-Brasil é uma semente do fruto da castanheira, em que a maior parte é situada na região Amazônica. Apresenta benefícios à saúde devido a sua composição entre macronutrientes e micronutrientes como, por exemplo, o selênio, importante antioxidante que está presente em alta porcentagem nas castanhas. A castanha-do-Brasil é considerada de grande importância para a exportação brasileira seguindo os fluxos de consumo interno e exportação. No entanto, são propensas a contaminações por toxinas produzidas por fungos, conhecidas como micotoxinas, as quais podem causar doenças ou morte em humanos e animais quando ingeridas. Os fungos que se destacam nas castanhas-do-Brasil são os do gênero Aspergillus, produtores da micotoxina aflatoxina. Quando exportadas, as castanhas devem obedecer a um limite máximo de aflatoxinas permitido que varia os por métodos cromatográficos sofisticados e caros. Sendo assim, para solucionar esta problemática, métodos com sensores eletroquímicos simples e de baixo custo vêm sendo empregados no controle de qualidade de alimentos. O objetivo desse trabalho é utilizar um sensor eletroquímico do tipo língua eletrônica para detecção de aflatoxinas. A utilização dessa técnica permite característica como, leveza, reutilização, portabilidade e custo baixo de obtenção. Além disso, os sensores utilizados nessa metodologia são de placas de fenolite e fibra de vidro, materiais de baixo custo comparados à metodologia tradicional que utiliza eletrodos interdigitados de ouro. O método utilizado baseia-se na deposição por automontagem, camada por camada, em que substâncias catiônicas e aniônicas são depositadas em um substrato a fim de formar uma dupla camada elétrica, ou seja, uma bicamada. Conforme as bicamadas são depositadas forma-se um filme. Para o desenvolvimento da língua eletrônica foram realizadas análises iniciais em substrato de vidro com diferentes composições de filmes a fim de obter os melhores filmes para utilização nos sensores que compõem a língua eletrônica. Foram adquiridos 6 sensores de fenolite e 3 sensores de fibra de vidro que foram utilizados, primeiramente, na toxina ácido fusárico para construção de curva de calibração e, posteriormente, na aflatoxina para analisar o percentual da mesma.
ABSTRACT
RECHOTNEK, Fernanda. Study in order to obtain sensor-based films polymeric ultrathin for the detection of toxins in Brazil nuts. 2017. 97 f. Monografia (Curso de Licenciatura em Química), Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Campo Mourão, 2017.
Brazil nuts is a seed of the nut tree fruit, being most of it located in the Amazon region. The nuts presents health benefits due to its macro and micronutrients, for example, the selenium, that is an important antioxidant can be found in high tield. The seed has significant importance in Brazilian shiping market. However, suceptable to fungi produced toxin contamination, wich can lead diseases or even death in animals and humans. The most concerning fungi in Brazil nuts are Aspergillus type, responsible for the production of the aflatoxin mycotoxin. The maximum range of aflatoxin permitted overseas is 10 to 20 g/kg. The methods to measure aflatoxin are usually expensive and complex chromatographic methods. Therefore, electrochemical sensors cheap and simple use may be the logical repleacment. The ain of this work was to carachterize an electrochemical tongue sensor suitable to detects aflatoxins. Benefits as lightness, reuse, portability and cheap cost of manufacturing can be obtained if this type of sensor. In addition, low cost electrodes such as phenolite and fiberglass based electrodes were tested in comparison with high cost interdigited gold electrodes. The electrode construction method was based on Layer-by-Layer deposition, in which cationic and anionic substances are deposited in a substrate in order to form a double electric layer. As the double layers are deposited a film is formed. In order to develop the electric tongue, analyzes were first performed on glass substrate, with different films compositions, so the best films could be used in electrode composition. Six phenolite sensors and three fiber glass sensors were used, being tested first in the construction of the calibration curve using furaric acid toxin and then aflatoxin concentrations were analyzed.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Representação da distribuição da castanheira-do-Brasil ... 22
FIGURA 2: Preços médios mensais da castanha-do-Brasil ... 24
FIGURA 3: Castanha-do-Brasil: balanço de oferta e demanda no Brasil ... 24
FIGURA 4: Estrutura química das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 ... 28
FIGURA 5: Representação esquemática do processo de automontagem de uma bicamada ... 34
FIGURA 6: Estrutura dos monômeros dos polímeros ... 40
FIGURA 7: Estrutura química dos compostos utilizados na fabricação dos filmes automontados ... 41
FIGURA 8: Eletrodo interdigitado utilizado na fabricação dos sensores ... 42
FIGURA 9: Ilustração do sistema de medidas ... 47
FIGURA 10: Espectro de absorbância versus comprimento de onda do FTC em diferentes concentrações ... 48
FIGURA 11: Curvas de calibração do FTC obtidas nos comprimentos de onda de 623 e 659 nm ... 49
FIGURA 12: Espectro de absorbância versus comprimento de onda do NOF em diferentes concentrações ... 49
FIGURA 13: Curva de calibração do NOF obtida no comprimento de onda de 541 nm ... 50
FIGURA 14: Espectro de absorbância versus comprimento de onda do VIO em diferentes concentrações ... 50
FIGURA 15: Curvas de calibração do VIO obtidas nos comprimentos de onda de 541 e 590 nm ... 51
FIGURA 16: Espectro de absorbância versus comprimento de onda do BTB em diferentes concentrações ... 51
FIGURA 17: Curva de calibração do BTB obtida no comprimento de onda de 473 nm ... 52
FIGURA 18: Espectro de absorbância versus comprimento de onda do MO em diferentes concentrações ... 52
FIGURA 19: Curva de calibração do MO obtida no comprimento de onda de 472 nm ... 53 FIGURA 20: Imagens de Microscopia óptica do filme de QT1/FTC depositado em placa de vidro ... 54 FIGURA 21: Espectro de absorção no UV-Vis do filme de QT1/FTC em função do número de bicamadas depositadas, com ênfase na absorção do FTC ... 54 FIGURA 22: Curva de crescimento do FTC nos comprimentos de onda de 613 e 667 nm ... 55 FIGURA 23: Imagens de Microscopia óptica do filme de QT1/NOF depositado em placa de vidro ... 55 FIGURA 24: Espectro de absorção no UV-Vis do filme de QT1/NOF em função do número de bicamadas depositadas, com ênfase na absorção do NOF ... 56 FIGURA 25: Curva de crescimento do NOF no comprimento de onda de 480 nm ... 56 FIGURA 26: Imagens de Microscopia óptica do filme de QT1/BTB depositado em placa de vidro ... 56 FIGURA 27: Espectro de absorção no UV-Vis do filme de QT1/BTB em função do número de bicamadas depositadas, com ênfase na absorção do BTB ... 57 FIGURA 28: Curva de crescimento do BTB no comprimento de onda de 442 nm .... 57 FIGURA 29: Imagens de Microscopia óptica do filme de QT1/MO depositado em placa de vidro ... 57 FIGURA 30: Espectro de absorção no UV-Vis do filme de QT1/MO em função do número de bicamadas depositadas, com ênfase na absorção do MO ... 58 FIGURA 31: Curva de crescimento do MO nos comprimentos de onda de 442 e 460 nm ... 58 FIGURA 32: Imagens de Microscopia óptica dos filmes de (a) PVA1 e (b) PVA4 com VIO depositados em placa de vidro ... 59 FIGURA 33: Espectro de absorção no UV-Vis do filme de PVA1/VIO em função do número de bicamadas depositadas, com ênfase na absorção do VIO ... 59 FIGURA 34: Curva de crescimento do VIO nos comprimentos de onda de 571 e 603 nm ... 59 FIGURA 35: Espectro de absorção no UV-Vis do filme de PVA4/VIO em função do número de bicamadas depositadas, com ênfase na absorção do VIO ... 60 FIGURA 36: Curva de crescimento do VIO nos comprimentos de onda de 565 e 603 nm ... 60
FIGURA 37: Imagens de Microscopia óptica do filme de CMC1/VIO depositado em placa de vidro ... 61 FIGURA 38: Espectro de absorção no UV-Vis do filme de CMC1/VIO em função do número de bicamadas depositadas, com ênfase na absorção do VIO ... 61 FIGURA 39: Curva de crescimento do VIO nos comprimentos de onda de 615 e 642 nm ... 61 FIGURA 40: Imagens de Microscopia óptica da placa de fenolite após deposição do filme de QT1/FTC com (a) 1 bicamada (b) 5 bicamadas e (c) 10 bicamadas ... 62 FIGURA 41: Espectro de absorção no UV-Vis do filme de QT1/FTC depositado em placa de fenolite ... 63 FIGURA 42: Curva de crescimento de FTC em placa de fenolite no comprimento de onda de 615 nm com (a) 9 bicamadas depositadas e (b) 10 bicamadas depositadas ... 63 FIGURA 43: Curva de crescimento de FTC em placa de fenolite no comprimento de onda de 672 nm com (a) 9 bicamadas depositadas e (b) 10 bicamadas depositadas ... 64 FIGURA 44: Imagens de Microscopia óptica do eletrodo de (a) fenolite e (b) placa de vidro, recobertos com filme de QT1/FTC ... 65 FIGURA 45: Micrografias de MEV da superfície da placa de vidro após deposição do filme de quitosana com FTC, em ampliações diferentes ... 66 FIGURA 46: Micrografias de MEV da superfície da placa de fenolite após deposição do filme de quitosana com FTC em diferentes regiões: (a) e (b) superfície eletrodo, (c) e (d) superfície da fenolite e (e) e (f) superfície da trilha de cobre, em ampliações diferentes... 67 FIGURA 47: Micrografias de MEV da superfície da placa de vidro após deposição do filme de quitosana com NOF, em ampliações diferentes ... 68 FIGURA 48: Micrografias de MEV da superfície da placa de fenolite após deposição do filme de quitosana com NOF em diferentes regiões: (a) e (b) superfície eletrodo, (c), (d) e (e) superfície da fenolite e (f) e (g) superfície da trilha de cobre, em ampliações diferentes ... 69 FIGURA 49: Micrografias de MEV da superfície da placa de fenolite após deposição do filme de quitosana com BTB em diferentes regiões: (a) e (b) superfície eletrodo, (c), (d) e (e) superfície da fenolite e (f) e (g) superfície da trilha de cobre, em ampliações diferentes ... 70
FIGURA 50: Espectro de EDS obtido da superfície da placa de vidro após deposição do filme de quitosana com FTC em diferentes regiões ... 72 FIGURA 51: Espectro de EDS obtido da superfície do eletrodo de fenolite após deposição do filme de quitosana com FTC em diferentes regiões: (a) superfície da fenolite e (b) superfície da trilha de cobre ... 73 FIGURA 52: Espectro de EDS obtido da superfície da placa de vidro após deposição do filme de quitosana com NOF em diferentes regiões ... 73 FIGURA 53: Espectro de EDS obtido da superfície do eletrodo de fenolite após deposição do filme de quitosana com NOF em diferentes regiões: (a) superfície da fenolite e (b) superfície da trilha de cobre ... 73 FIGURA 54: Espectro de EDS obtido da superfície do eletrodo de fenolite após deposição do filme de quitosana com BTB em diferentes regiões: (a) superfície da fenolite e (b) superfície da trilha de cobre ... 74 FIGURA 55: Imagens de Microscopia Óptica do sensor de fenolite com deposição do filme de: (a) QT1/NOF, (b) QT1/BTB e (c) QT1/MO com 10 bicamadas ... 74 FIGURA 56: Imagens de Microscopia Óptica do sensor de fenolite com deposição do filme de: (a) QT1/FTC, (b) PVA1/VIO e (c) PVA4/VIO com 10 bicamadas ... 75 FIGURA 57: Imagens de Microscopia Óptica do sensor de fibra de vidro com deposição do filme de: (a) QT1/FTC, (b) QT1/NOF e (c) QT1/BTB com 10 bicamadas ... 75 FIGURA 58: Medidas de capacitância das soluções do ácido fusárico obtidas pelos sensores de fenolite ... 78 FIGURA 59: Medidas de capacitância das soluções do ácido fusárico obtidas pelos sensores de fibra de vidro ... 78
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Estrutura de polímeros condutores com suas respectivas condutividades elétricas ... 32 TABELA 2: Polímeros utilizados para a fabricação de filmes automontados ... 35 TABELA 3: Composição e código dos sensores obtidos pela técnica de automontagem ... 44 TABELA 4: Composição atômica (%) da superfície das placas de vidro e dos eletrosos de fenolite após deposição dos filmes de quitosana com FTC, NOF ou BTB ... 72 TABELA 5: Medidas de capacitância das soluções de cloreto de sódio obtidas pelos sensores de fenolite ... 76 TABELA 6: Medidas de capacitância das soluções do ácido fusárico obtidas pelos sensores de fenolite ... 77 TABELA 7: Medidas de capacitância das soluções do ácido fusárico obtidas pelos sensores de fibra de vidro ... 77 TABELA 8: Medidas de capacitância das soluções das aflatoxinas G1, G2, B1 e B2 em benzeno/acetonitrila obtidas pelos sensores de fenolite ... 79 TABELA 9: Medidas de capacitância das soluções das aflatoxinas G1, G2, B1 e B2 em benzeno/acetonitrila obtidas pelos sensores de fibra de vidro ... 79 TABELA 10: Medidas de capacitância das soluções das aflatoxinas G1, G2, B1 e B2 em metanol obtidas pelos sensores de fenolite e fibra de vidro ... 80
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AFL Aflatoxina AFLs Aflatoxinas
CCD Cromatografia de Camada Delgada UV-Vis Ultravioleta-visível
DNA Ácido Desoxirribonucléico RNA Ácido Ribonucléico
IARC- Agência Internacional para Pesquisa em Câncer IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística EUA Estados Unidos da América
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária IPEA Instituto de Pesquisa Econômica Aplicada
LbL Deposição camada por camada LE Língua Eletrônica
PVA Poli(vinil álcool) QT Quitosana
CMC Carboximetilcelulose de sódio FTC Ftalocianina tetrasulfonada de níquel NOF Nanopartículas de óxido de ferro BTB Azul de bromotimol
MO Alaranjado de metila
MOb Alaranjado de metila em meio básico VIO Violeta cristal
AFB1 Aflatoxina Blue 1 AFB2 Aflatoxina Blue 2 AFG1 Aflatoxina Green 1 AFG2 Aflatoxina Green 2
QT1 Quitosana com concentração de 0,01 g.mL-1 QT4 Quitosana com concentração de 0,04 g.mL-1 PVA Poli(vinil álcool) com concentração de 0,1 g.mL-1 PVA1 Poli(vinil álcool) com concentração de 0,01 g.mL-1 PVA4 Poli(vinil álcool) com concentração de 0,04 g.mL-1 CMC Carboximetilcelulose com concentração de 0,01 g.mL-1
QT1/FTC Filme de quitosana com ftalocianina tetrasulfonada de níquel QT1/NOF Filme de quitosana com nanopartículas de óxido de ferro QT1/BTB Filme de quitosana com azul de bromotimol
QT1/MO Filme de quitosana com alaranjado de metila
QT1/CMC Filme de quitosana com carboximetilcelulose de sódio QT4/BTB Filme de quitosana com azul de bromotimol
QT4/MO Filme de quitosana com alaranjado de metila PVA/BTB Filme de poli(vinil álcool) com azul de bromotimol PVA/MO Filme de poli(vinil álcool) com alaranjado de metila
PVA1/FTC Filme de poli(vinil álcool) com ftalocianina tetrasulfonada de níquel PVA1/NOF Filme de poli(vinil álcool) com nanopartículas de óxido de ferro PVA1/BTB Filme de poli(vinil álcool) com azul de bromotimol
PVA1/VIO Filme de poli(vinil álcool) com violeta cristal
PVA4/CMC Filme de poli(vinil álcool) com carboximetilcelulose de sódio PVA4/FTC Filme de poli(vinil álcool) com ftalocianina tetrasulfonada de níquel PVA4/NOF Filme de poli(vinil álcool) com nanopartículas de óxido de ferro PVA4/BTB Filme de poli(vinil álcool) com azul de bromotimol
PVA4/MO Filme de poli(vinil álcool) com alaranjado de metila PVA4/VIO Filme de poli(vinil álcool) com violeta cristal
CMC/VIO Filme de carboximetilcelulose de sódio com violeta cristal BV Banda de Valência
BC Banda de condução
LISTA DE SÍMBOLOS mm milímetros nm nanômetros nF nanoFaraday pF picoFaraday micrograma S Siemens
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 19
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 21
2.1 CASTANHA-DO-BRASIL ... 21
2.1.1 Aspectos de produção e demanda ... 23
2.2 FUNGOS E MICOTOXINAS ... 25
2.2.1 Contaminação da castanha-do-Brasil por micotoxinas ... 25
2.2.2 Aspergillus ... 27 2.2.3 Aflatoxinas ... 27 2.3 SENSORES ELETROQUÍMICOS ... 29 2.3.1 Polímeros condutores... 31 2.3.2 Técnica de automontagem ... 33 2.3.3 Língua eletrônica ... 36 3 OBJETIVOS ... 39 3.1 OBJETIVO GERAL ... 39 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 39 4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 40
4.1 MATERIAIS PARA A PREPARAÇÃO DOS SENSORES... 40
4.2 PREPARAÇÃO DOS SENSORES ... 41
4.2.1 Preparação das soluções ... 41
4.2.2 Obtenção do eletrodo interdigitado ... 42
4.2.3 Deposição dos filmes ... 42
4.3 CARACTERIZAÇÃO DOS MATERIAIS ... 45
4.3.1 Espectroscopia de Absorção UV-Vis ... 45
4.3.2 Microscopia Óptica ... 45
4.3.3 Microscopia Eletrônica de Varredura ... 45
4.3.4 Análise de Espectroscopia de Energia Dispersiva ... 46
4.3.5 Medidas de Capacitância ... 46
4.4 TRATAMENTO DOS DADOS ... 47
4.4.1 Calibração do sensor ... 47
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 48
5.2 Análise do crescimento dos filmes por UV-Vis ... 53
5.3 Microscopia Eletrônica de Varredura ... 64
5.4 Análise de Espectroscopia de Energia Dispersiva ... 71
5.5 Sensores eletroquímicos ... 74
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 82
REFERÊNCIAS ... 84
1 INTRODUÇÃO
As amêndoas da castanha-do-Brasil apresentam alto teor nutritivo em percentuais lipídico, proteico, de fibras e de vitaminas em sua composição. Ainda apresentam em sua composição micronutrientes como, o selênio, que possui propriedades antioxidantes importantes na redução de câncer, Alzheimer, entre outras patologias (SANTOS, 2012), sendo a castanha-do-Brasil a melhor fonte de selênio entre as nozes de árvores (MARTINS, 2014). Embora a castanha-do-Brasil apresente benefícios à saúde, é susceptível a contaminações por fungos toxigênicos. Desta maneira, o mercado da castanha-do-Brasil vem decaindo devido à qualidade, principalmente em relação aos processos de colheita e armazenamento (LEITE, 2014), onde são contaminadas por diferentes micotoxinas presentes no solo (MARTINS, 2014).
Entre os fungos encontrados nas castanhas-do-Brasil destacam-se os da espécie Aspergillus flavus, produtores de aflatoxinas que se desenvolvem em regiões com clima semelhante ao encontrado na Região Amazônica, além de outros fatores que contribuem para o crescimento dos fungos (MARTINS, 2014; SÁNCHEZ, 2015). A contaminação por esta espécie além de ocasionar perdas na produção, pode causar diversos danos à saúde humana e dos animais, principalmente, devido ao seu aspecto cancerígeno.
Diferentes programas de monitoramento de níveis de micotoxinas em alimentos são relatados, as identificações são feitas em laboratórios, geralmente, utilizando-se técnicas cromatográficas como em camada delgada, gasosa, de alta eficiência (acoplada com espectrometria de massas), entre outras (LEITE, 2014; MARTINS, 2014). No entanto, esses equipamentos possuem custo elevado para obtenção, manuseio e assistência técnica.
Neste sentido, sensores eletroquímicos nanoestruturados com polímeros condutores vêm recebendo atenção devido a suas diferentes aplicações e eficiência. Segundo Mattoso (2002), coordenador no desenvolvimento da primeira língua eletrônica à base de polímeros condutores no mundo, a língua eletrônica é um conjunto de unidades sensoriais formadas por diferentes filmes, os quais são imersos na solução a ser analisada, de modo a interagirem com a substância presente na solução e obterem-se respostas elétricas em cada unidade sensorial.
Os filmes são depositados por automontagem ou LbL, em que as deposições ocorrem camada por camada. A técnica consiste na deposição alternada de policátions e poliânions em um substrato sólido, de modo que forma-se uma dupla camada elétrica, consequentemente, com as repetições tem-se a formação de filmes poliméricos.
Em comparação aos métodos tradicionais a utilização de sensores é ótima alternativa para o controle de qualidade em indústrias, principalmente, quando aplicados em áreas da saúde relacionada à toxicidade (VOLPATI, 2012).
Na literatura (monografias, dissertações, teses e artigos disponíveis na internet) não foram encontrados trabalhos que utilizam sensores para a análise de micotoxinas na castanha-do-Brasil, apenas os métodos tradicionais por cromatografia. Baseado nisso, esta monografia tem como objetivo a obtenção de sensores por meio da deposição de filmes poliméricos ultrafinos pela técnica de automontagem para detecção de micotoxinas em castanha-do-Brasil.
Os sensores foram desenvolvidos em placas de fenolite e placas de fibra de vidro, recobertas com cobre, como metodologia alternativa aos sensores de vidro interdigitados com ouro ou platina. Assim, o custo da obtenção e utilização dos sensores é mais baixo comparado às metodologias tradicionais.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 CASTANHA-DO-BRASIL
A castanha-do-Brasil, de nome científico Bertholletia excelsa H.B.K., da família Lecythidaceae é uma semente do fruto da castanheira, situada na região Amazônica. Em 1808, foi descrita pela primeira vez, pelos pesquisadores Humboldt, Bompland, e posteriormente Kunth, denominando-a como árvore majestosa da Amazônia, e recebendo as iniciais dos seus nomes (MENNINGER, 1977).
Apesar de ser popularmente conhecida como castanha-do-Pará, o Ministério da Agricultura por meio do Decreto N°51.209 de 18 de agosto de 1961, regulamentou a denominação de castanha-do-Brasil, para efeito de comércio exterior (BRASIL, 1961). Possui outras denominações que variam em relação ao seu local de origem como, por exemplo, castanha-do-Maranhão, castanha-do-Pará, Brazil nuts, Para nuts, almendras, noix Du Bresil, noix Du Para, entre outras (MARTINS, 2014; PACHECO, 2007).
A castanheira apresenta classificação botânica descrita pelas seguintes divisões: é uma Angiosperma, da classe Dicotiledonea, da ordem Myrtiflorae, da família das Lecythidacea, gênero Bertholletia, espécie excelsa (SANTOS, 2012). É uma árvore de grande porte, atingindo 50 metros de altura e 2 metros de diâmetro na base (LEITE, 2014; MARTINS, 2014). Seu fruto é conhecido como ouriço que contém em seu interior em média de 12 a 24 castanhas ou sementes, as quais envolvem as amêndoas (parte comestível) (SANTOS, 2012) que são altamente nutritivas (LEITE, 2014).
Embora a maior parte da castanheira seja encontrada na região Amazônica com uma faixa média de 300 milhões de hectares, outros países também possuem uma pequena parte da planta, como a Bolívia com 10 milhões e o Peru com 2,5 milhões (SANTOS, 2012). Conforme a Figura 1, no Brasil, é encontrada nas regiões dos rios Madeira, Purus, Negro e Solimões (Estado do Amazonas), e também nos Estados do Maranhão, Mato Grosso, Roraima, Rondônia, Acre Pará e Amapá (PACHECO, 2007).
Figura 1. Representação da distribuição da castanheira-do-Brasil. Fonte: Adaptado de Pacheco (2007, p.19).
A castanha é beneficiada e comercializada com casca e sem casca, podendo ser classificada em diversos tamanhos segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e do Abastecimento (BRASIL, 1998). É considerada como um dos alimentos mais nutritivos, devido ao seu elevado conteúdo lipídico (60-70%), protéico (13-20%), de carboidratos (8-17%) e fibras (3-8%) (MARTINS, 2014; SANTOS, 2012; SILVA, 2012). Estes valores podem variar em relação ao tamanho, origem e variedade (PACHECO, 2007).
Além de sua constituição por macronutrientes, apresenta em sua composição substâncias com ação antioxidante, tais como fitoesteróis, tocoferol, esqualeno e compostos fenólicos, relacionados a diferentes benefícios a saúde (MARTINS, 2014). Como, também, selênio, cálcio, fósforo, magnésio, potássio (MARTINS, 2014), ferro, sódio, zinco, cobre, manganês (FREITAS-SILVA, 2011) e vitamina E (SANTOS, 2012).
Entre os minerais citados, o selênio se destaca com alto percentual nas castanhas-do-Brasil e como importante antioxidante, bem como, a vitamina E (SANTOS, 2012), de forma que, entre as nozes de árvores, a castanha-do-Brasil é reconhecida como a melhor fonte de selênio (MARTINS, 2014). Este mineral atua no metabolismo energético e proteção contra danos ao DNA, além da aplicação na prevenção de câncer, cardiopatias e hepatopatias, manutenção da glândula tireoide,
redução de níveis de colesterol, Alzheimer (SANTOS, 2012) e combate ao envelhecimento celular (EMBRAPA, 2016).
Como
de selênio, dependendo do peso médio. Sendo assim, duas castanhas diariamente seriam indicadas para obtenção dos efeitos antioxidantes (THOMSON et al., 2008). No entanto, segundo a EMBRAPA (2016), estudos realizados na Universidade Federal de Lavras mostram que a quantidade de selênio na castanha-do-Brasil varia de acordo com as regiões produtoras. Os cientistas ainda não descobriram quais fatores estão influenciando nesta diferença, sendo resultados iniciais não podem ser tidos como padrão. Desta forma, alertam os consumidores a observarem a quantidade de selênio nos rótulos das castanhas para considerar a porção diária.
2.1.1 Aspectos de produção e demanda
A castanha-do-Brasil desponta como diferencial, sendo considerada importante na pauta de exportação brasileira (SANTOS, 2012). É a única semente comercializada internacionalmente que é recolhida na floresta (SILVA, 2011). A produção brasileira de castanha-do-Brasil obedece a dois fluxos no que se refere ao comércio, o consumo interno e a exportação (CONAB, 2012). O Brasil exporta, cada vez mais, castanha-do-Brasil com casca para a Bolívia por não possuir exigências em relação à qualidade das castanhas quando comparado as técnicas de beneficiamento e adequação às exigências de países da União Europeia, que comercializam produtos de melhor qualidade (SANTOS, 2012).
Os preços internacionais da castanha-do-Brasil sofreram algumas alterações ao longo dos anos, no entanto, em 2015 fecharam com média de US$ 10/kg, como mostra o Figura 2.
Figura 2. Preços médios mensais da castanha-do-Brasil. Fonte: Conab (2015, p.85).
Segundo pesquisa realizada pelo IPEA (2015), identificaram-se 31 agentes que comercializam a castanha, sendo 64,5% extrativista, 12,9% atravessadores, 9,6% cooperativas e 13% comerciantes. Sendo que, o maior problema citado pelos agentes que comercializavam a castanha foi a falta de espaço para armazenagem, deteriorando a qualidade do produto. Mesmo assim, segundo pesquisas realizadas pelo IBGE, a castanha-do-Brasil desponta entre as oleaginosas, apresentado valores altos de produção, estando na 13ª posição do ranking nacional de produtos vegetais. A Figura 3 ilustra o movimento da produção brasileira, consumo e exportação, sendo que os Estados do Acre, Amazonas e Rondônia são responsáveis por praticamente 90% da produção nacional (CONAB, 2015).
Figura 3. Castanha-do-Brasil: balanço de oferta e demanda no Brasil. Fonte: Conab (2015, p.86).
As oscilações de quedas e elevações nas exportações podem ser resultados da elevação da produção e da evolução das técnicas de beneficiamento dos países produtores, somando-se as dificuldades de manuseio e fatores socioeconômicos e ambientais. Sendo que, as castanhas destinam-se, em grande parte, as indústrias alimentícias (SANTOS, 2012).
2.2 FUNGOS E MICOTOXINAS
2.2.1 Contaminação da castanha-do-Brasil por micotoxinas
Um dos maiores desafios para a produção e comercialização das castanhas está relacionado à contaminação por fungos produtores de micotoxinas. Tem-se uma grande variedade de fungos nos alimentos, os que se destacam nas castanhas-do-Brasil são os do gênero Aspergillus, produtores da micotoxina aflatoxina. Estes fungos afetam a qualidade das castanhas, havendo índices cada vez menores do valor comercial do produto e de exportação pela dificuldade de controle da contaminação. Spencer, em 1921, foi o primeiro a descrever sobre a perda de qualidade da castanha-do-Brasil devido a infecção fúngica, tendo um percentual de perda de 10 a 25% nas exportações das castanhas da região Amazonas para os EUA.
mykes significa
toxican
metabólitos secundários tóxicos, produzidas por fungos filamentosos do campo ou fungos durante a colheita e armazenagem, podendo causar doenças ou morte em humanos e animais quando ingeridas (FANI, 2016), além de efeitos a algumas plantas e microrganismos (MAZIERO e BERSOT, 2010).
Portanto, para que uma substância seja classificada como micotoxina deve atender aos critérios: ser produzida por fungo; ocorrer na natureza; ser causadora de doença em animais e/ou homens; e, ser aguda ou cronicamente tóxica (KANZAKI, 2009).
A história e termo das micotoxinas teve início em 1960 nos arredores de Londres, Inglaterra, com um surto de mortes de 100.000 aves que ficou conhecido como turkey X disease, em que turkey significa peru e disease significa doença. A causa foi a alimentação com amendoim contaminados por uma substância produzida pelo fungo da espécie Aspergillus flavus, que ficou conhecida como aflatoxina (FANI, 2016; MIDORIKAWA, 2014).
A ingestão de alimentos que contenham micotoxinas pode causar a micotoxicose, afetando órgãos como fígado, rins, cérebro, músculo e sistema nervoso, em que a gravidade depende do grau de exposição, idade e estado nutricional (KANZAKI, 2009; MAZIERO e BERSOT, 2010). Entre os fungos de armazenamento, tem-se o Aspergillus que são indicadores da deterioração de sementes e grãos, causando danos como, descoloração, alterações nutricionais, estágios iniciais de deterioração microbiológica e perda da matéria seca (SÁNCHEZ, 2015).
Diante de tantos problemas causados pelas micotoxinas, a maioria dos países se adaptaram a leis que estabelecem a concentração máxima dessas micotoxinas nos alimentos. Pois, segundo SÁNCHEZ (2015) e Martins (2014), a produção de micotoxinas ocorre com o crescimento do fungo. No Brasil, tem-se o Projeto de monitoramento e controle de micotoxinas na castanha-do-Brasil (BRASIL, 2002) e o Plano Nacional de Segurança e Qualidade dos Produtos de Origem Vegetal - PNSQV (BRASIL, 2003) que analisam esses níveis de contaminantes. Alterações na temperatura, umidade e precipitação são alguns dos fatores que podem interferir no crescimento desses fungos (SÁNCHEZ, 2015; MARTINS, 2014; SILVA, 2011). Ainda, a incidência de contaminação de micotoxinas e suas concentrações estão relacionadas ao período do ano e a região geográfica.
Logo, deve-se haver um controle mais exigente para as castanhas, com o intuito de gerar mais produtos qualificados e, consequentemente, mais exportações; além da extrema importância para população em relação à saúde, visando a adoção de medidas tecnológicas.
2.2.2 Aspergillus
O gênero Aspergillus possui grande importância por apresentar ampla distribuição, sendo conhecidas mais de 200 espécies deste gênero (MIDORIKAWA, 2014). Além disto, faz parte deste gênero o grupo Aspergillus da seção Flavi que possui potencial para a produção de aflatoxinas (AFLs), como B1, B2, G1 e G2, que
são detectadas nas castanhas (FANI, 2016; MAZIERO e BERSOT, 2010). A probabilidade de desenvolvimento do Aspergillus é maior em períodos de chuva, pois há umidade e temperatura favoráveis, tendo-se as temperaturas de armazenamento entre 25 a 30 °C e a umidade em 97%, logo, são passíveis de contaminação. Essa característica de umidade e temperatura é observada na região Amazônica (MARTINS, 2014; FREITAS-SILVA, 2011).
Dentre essas, foi relatado 16 espécies encontradas na castanha-do-Brasil, em que as mais importantes são A. flavus, A. parasiticus e A. nomius (MIDORIKAWA, 2014). Sendo que, a espécie A. flavus é uma das mais importantes do gênero, por ser a principal produtora de aflatoxinas nas castanhas-do-Brasil (SASSI, 2015).
2.2.3 Aflatoxinas
Existem mais de 300 micotoxinas descritas na literatura, no entanto, a aflatoxina (AFL) é o grupo mais importante e estudado devido ao seu potencial tóxico (MIDORIKAWA, 2014; FREITAS-SILVA, 2011) e as legislações empregadas em relação aos níveis de concentração nos alimentos (MARTINS, 2014). As AFLs são incolores, inodoras e não alteram o sabor nos alimentos (SÁNCHEZ, 2015), o que dificulta sua identificação. Apresentam características cancerígenas, genotóxicas (mutagênicas) e hepatotóxicas (SILVA, 2011). São produzidas pelas espécies Aspergillus flavus (de onde derivou seu nome), Aspergillus parasiticus e
Após a contaminação da ração de animais na cidade de Londres, em 1962 estudos detectaram por cromatografia em camada delgada (CCD) que a substância tóxica (aflatoxina) possuía fluorescência azul e verde quando exposta a luz ultravioleta (UV), logo, foram nomeados os compostos Aflatoxina B (Blue = azul) que representa AFB1 e AFB2 e os compostos Aflatoxina G (Green = verde), sendo AFG1 e AFG2 (SÁNCHEZ, 2015; MARTINS, 2014; EMBRAPA, 2007). A AFB1 é considerada o composto mais tóxico entre os citados, sendo a mais importante deste grupo, pois é produzida por todas as linhagens produtoras de aflatoxinas (FANI, 2016). As estruturas químicas dessas aflatoxinas podem ser observadas na Figura 4.
Figura 4. Estrutura química das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2. Fonte: EMBRAPA, 2007.
As aflatoxinas são perigosas, pois atacam o DNA e o RNA. A aflatoxina B1 liga-se covalentemente ao DNA nuclear, dificultando sua transcrição e diminuindo a síntese do RNA, induzindo mutações pontuais que são consideradas lesões genéticas predominantes (FANI, 2016). A biotransformação da AFB1 é a mais estudada devido ao seu potencial cancerígeno, que ocorre quando este composto sofre ativação metabólica e forma AFB1-epóxido, com capacidade de se ligar a guanina do DNA gerando mecanismos de efeitos carcinogênicos (SASSI, 2015; PEREIRA, 2011). De acordo com a Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (Internacional Agency for Research on Câncer IARC), as aflatoxinas são
classificadas como carcinógenos do grupo 1, que pertencem as micotoxinas com efeitos cancerígenos para o homem (PEREIRA, 2011).
Se for constatada a contaminação de um lote por aflatoxinas, pouco pode ser feito, mesmo com procedimentos de descontaminação, pois estes em larga escala apresentam custo/benefício elevado e resultados bastante discutíveis, como a aplicação de altas temperaturas em amendoim. Logo, a contaminação por AFLs pode levar a perdas econômicas em países exportadores que rejeitam os lotes
contaminados, ou seja, lotes acima do nível permitido de aflatoxinas, assim, estes produtos voltam para o país de origem (MARTINS, 2014).
Populações de países em desenvolvimento são as mais susceptíveis a doenças por aflatoxinas, devido a menor rigorosidade nos níveis de concentração e controle dos alimentos (MIDORIWAKA, 2014). No Brasil, o Ministério da Saúde estabeleceu pela Resolução RDC n° 274, da ANVISA, de 15 de outubro de 2002, que para amêndoas com casca, descascada, cru ou tostada, o limite máximo de
da Agricultura, Pecuária e Abastecimento publicou em agosto de 2011 no Diário Oficial da União a Instrução Normativa n° 25, a redução dos limites tolerados de AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2 nas
castanhas-do-, em relação ao tamanho da castanha e se esta apresenta casca (SACRAMENTO, 2016; MIDORIWAKA, 2014; MAZIERO e BERSOT, 2010).
Esses níveis de concentração de aflatoxinas nas castanhas-do-Brasil são medidos por métodos cromatográficos sofisticados, os quais são caros e demandam de uma estrutura específica e recursos humanos especializados para sua análise. Para contribuir para a minimização destes problemas, sensores eletroquímicos vêm sendo empregados no controle de qualidade de diferentes alimentos, beneficiando-os. A partir disto, este método pode ser vantajoso para o emprego em análises de aflatoxinas em castanhas-do-Brasil.
2.3 SENSORES ELETROQUÍMICOS
Os avanços tecnológicos têm aumentado, principalmente, nas áreas de medicina, eletrônica, química e meio ambiente, com a utilização de sensores empregando filmes poliméricos ultrafinos com propriedades condutoras, de forma a gerar um sinal passível de ser medido analiticamente (CARVALHO, 2016; SILVA, 2012). O aumento na procura e obtenção desses materiais tem ocorrido devido aos desafios impostos por amostras de interesse industrial, clínico e ambiental (SCONTRI, 2015).
Parte desses desafios pode ser alcançada com o desenvolvimento de sensores com novos eletrólitos poliméricos utilizando técnicas de desenvolvimento de filmes ultrafinos como, por exemplo, a automontagem. De modo que, estes polímeros possam interagir seletivamente com outras moléculas (CONSOLIN-FILHO, 2002). Segundo Scontri (2015), as pesquisas nesta área tem mostrado crescimento exponencial, com a maior taxa de trabalhos publicados entre os anos 2013 a 2014, indicando interesse da comunidade científica.
A utilização de técnicas eletroquímicas no desenvolvimento de sensores constitui-se como um recurso eficiente devido a características fundamentais como, leveza, elevada sensibilidade nas determinações, reutilização, portabilidade, possibilidade de miniaturização e, principalmente, custo mais baixo de obtenção quando comparado à cromatografia de alta eficiência (CLAE), entre outros métodos cromatográficos mais sofisticados (CARVALHO, 2016; SCONTRI, 2015).
Possui possibilidade em diversas aplicações, tais como controle de qualidade de alimentos e bebidas, detecção de acidez em frutas, detecção de pesticidas, entre outras diversas aplicações existentes e ainda a serem estudadas, que podem ser empregadas, por exemplo, nas indústrias alimentícias, têxteis, eletrônica, de comunicação e informática (MEDEIROS, et al., 2015). Diante disto, vários sensores já são desenvolvidos e comercializados para indústrias com o intuito do controle da qualidade e identificação de diferentes produtos (WIZIACK, 2010).
Os sensores eletroquímicos podem reproduzir os sentidos fundamentais do corpo humano (visão, audição, olfato, tato e paladar) podendo ser, por exemplo, do tipo língua eletrônica, nariz eletrônico, entre outros, que são inspirados em alguma parte sensorial da percepção humana (WIZIACK, 2010). Como aponta Alessio (2012), o uso de sensores ainda não é completamente compreendido, pois é existente há pouco tempo. Deste modo, diferentes técnicas já foram utilizadas para a confecção destes equipamentos e novas técnicas ainda são estudadas, bem como a utilização de diferentes polímeros condutores para diferentes aplicações.
2.3.1 Polímeros condutores
Os polímeros são moléculas que contém uma unidade elementar que se repete ao longo da cadeia, chamada mero. Os polímeros representam um grande número de substâncias, algumas naturais, como a seda e a celulose e outras sintéticas, como o polipropileno (PP) e o poli(cloreto de vinila), entre outros (FAEZ et al., 2000; SPINACÉ e DE PAOLI, 2005).
Comumente, os polímeros são solicitados para aplicação industrial devida suas propriedades isolantes, a qual tem substituído materiais à base de papel, graxas ou óleos. No entanto, os polímeros tem recebido destaque na comunidade acadêmica e industrial para aplicação condutora, ou seja, a possibilidade de conduzir corrente elétrica (RIBAS, 2004; SPINACÉ e DE PAOLI, 2005).
Os estudos envolvendo polímeros condutores iniciaram na segunda metade do século XX no Japão, mas foi somente nos anos 2000 que ganhou dimensão global, com o físico Alan J. Heeger e os químicos Alan G. MacDiarmid e Hideki Shirakawa que desenvolveram estudos com esses materiais, recebendo o Nobel de Química por suas pesquisas (CARVALHO, 2016). No entanto, Shirakawa e MacDiarmid começaram as pesquisas com este material ainda na década de 70, descobrindo a propriedade condutora do poliacetileno. E a partir deste, outros polímeros foram preparados (GREGORUT, 2010; FAEZ et al., 2000).
Os polímeros condutores têm recebido grande atenção nos últimos anos por serem versáteis, leves e relativamente baratos, além de apresentarem características especiais por combinarem propriedades mecânicas com propriedades elétricas, ópticas e magnéticas semelhante aos metais e
2010; FAEZ et al., 2000; MATTOSO, 1995). Alguns polímeros condutores importantes são apresentados na Tabela 1.
Os polímeros conjugados são formados por cadeias com ligações simples e duplas conjugadas, como observado na Tabela 1
(redução) ou doar elétrons (oxidação) formando um íon (CARVALHO, 2016; GREGORUT, 2014). Essa conjugação permite que seja criado um fluxo de elétrons
em condições específicas, como o processo de dopagem, em que portadores de carga são introduzidos na cadeia polimérica, convertendo o polímero de isolante em condutor ou semicondutor (GREGORUT, 2010; FAEZ et al., 2000).
A condutividade elétrica dos polímeros foi previamente analisada com base
estabelecem a banda de valência (BV) e os níveis vazios de menor energia constituem a banda de condução (BC); os quais são separados por uma faixa de energia conhecida como bandgap, cuja largura determina as propriedades elétricas do material. Para que os elétrons desloquem-se da banda de valência para a banda de condução é necessária a dopagem (FAEZ et al., 2000).
Tabela 1. Estrutura de polímeros condutores com suas respectivas condutividades elétricas.
Polímero Condutor Condutividade / S.cm-1
Poliacetileno 103 a 106 Polianilina 10 a 103 Polipirrol 600
Fonte: Faez et al. (2000, p.14).
2.3.2 Técnica de automontagem
A pesquisa em deposição de filmes ultrafinos para o desenvolvimento de sensores ainda é recente e está em desenvolvimento no mundo todo. Existem várias opções de processamento de materiais na forma de filmes, como evaporação
térmica, dip-coating, spin-coating, sputtering, Langmuir Blodgett (LB), layer-by-layer, entre outras (CARVALHO, 2016; ALESSIO, 2012).
Entre as técnicas utilizadas para a obtenção dos filmes, a automontagem,
Layer-by-Layer e significa deposição camada por camada, é um método que possibilita a produção de filmes ultrafinos organizados em um nível nanométrico, por meio de diferentes tipos de materiais, de maneira simples e de baixo custo, podendo ser feita a aplicação manualmente (GREGOURT, 2012).
As primeiras tentativas de produção de filmes ultrafinos a partir de camadas alternadas foi em 1966 com Iler, por meio das interações eletrostáticas com adsorção alternada de partículas coloidais carregadas positiva e negativamente (FURINI, 2016; ALESSIO, 2012; VOLPATI, 2012). Anos depois, na década de 1990, Decher e colaboradores propuseram um método de formação de multicamadas (LbL
-by-eletrostáticas entre moléculas contendo grupos iônicos, retomando a ideia de Iler, no entanto, empregando-se polieletrólitos catiônicos e aniônicos (ALMEIDA, 2012; VOLPATI, 2012; LARANJEIRA, 2011; PATERNO, MATTOSO, OLIVEIRA Jr., 2001).
A técnica LbL consiste na adsorção de camadas alternadas de policátions e poliânions em um substrato sólido com superfície eletricamente carregada, sem a necessidade de intervenção externa, pois a autodeposição ocorre com caráter espontâneo (LIMA, 2014; VOLPATI, 2012; ALMEIDA, 2012). Isso acontece devido ao transporte de carga da solução para o substrato ser favorecido pelo potencial químico que na superfície do substrato é menor que o da solução, logo, ocorre a adsorção natural de íons (CARVALHO, 2016).
A forma de produção dos filmes poliméricos é ilustrada na Figura 5, em que a técnica de LbL consiste na imersão do substrato sólido, por um período de tempo, em uma solução aquosa contendo o material a ser depositado, uma vez que o substrato imerso possui em sua superfície carga elétrica oposta à da solução de interesse, ocorrendo a adsorção eletrostática. Em seguida, o conjunto é lavado com o intuito de eliminar o excesso de material adsorvido e então é seco. Com a adsorção, a carga da superfície do substrato é invertida e a espessura da camada é fina devida a repulsão eletrostática. Posteriormente, o substrato é imerso numa solução contendo outro material, de forma, que a carga desta substância deve ser
contrária para que ocorra adsorção por atração eletrostática, sendo lavado e seco novamente, concluindo o processo de deposição de uma bicamada (FURINI, 2016; GREGOURT, 2014; LIMA, 2014; VOLPATI, 2012; PATERNO, 2001).
Figura 5. Representação esquemática do processo de automontagem de uma bicamada. Fonte: Adaptado de DANTAS (2009, p.30).
Após a repetição sucessiva dessas etapas, formam-se os filmes ultrafinos
catiônicas e aniônicas alternadamente adsorvidas. Logo, por meio da repetição desse processo, tem-se a formação de filmes ultrafinos com multicamadas (GREGOURT, 2014; VOLPATI, 2012; PATERNO, MATTOSO, OLIVEIRA Jr., 2001). Como há repulsão entre cargas iguais, em um determinado tempo a adsorção é interrompida impossibilitando a adsorção de material em excesso na superfície do substrato, portanto, o processo de adsorção é autorregulado tornando possível o controle das multicamadas (BRAGA, 2012).
Diferentes materiais orgânicos vêm sendo utilizado pelo método proposto por Decher, tais como: polieletrólitos convencionais, polímeros condutores, compostos, proteínas e enzimas (VOLPATI, 2012; PATERNO, MATTOSO, OLIVEIRA Jr., 2001). Um grande número de polímeros tem sido depositado pelo método de automontagem, dentre eles polianilina, polipirrol, poli(vinil álcool), quitosana, carboximetilcelulose, entre outros, como mostra a Tabela 2.
O processo de automontagem pode ser aperfeiçoado controlando vários parâmetros como, tempo de imersão, concentração das soluções, força iônica, pH, presença ou ausência de secagem entre as etapas, entre outros (ALESSIO, 2012).
Tabela 2. Polímeros utilizados para a fabricação de filmes automontados.
Fonte: Paterno (2001).
Como as propriedades sensoativas dependem da porosidade, rugosidade e espessura do filme, é importante que sejam controladas ao longo da produção do filme, o qual é possível ajustando fatores como força iônica, pH das soluções e número de camadas (MADEIROS et al., 2015; MELLO, 2014), pois estão relacionadas a adsorção de estruturas moleculares sobre o substrato (CARVALHO, 2016). Diversos tipos de materiais podem servir de substrato para os filmes automontados como vidro, plástico, metal e cerâmica (GREGORUT, 2010).
A automontagem recebe atenção por oferecer muitas vantagens, entre elas a independência na forma e tamanho do substrato, tempo de deposição, utilização de pequena quantidade de material para a produção dos filmes, controle na espessura da camada e a possibilidade de diferentes aplicações (MEDEIROS, et al., 2015; SILVA, 2012).
Além disto, materiais na forma de filmes finos podem apresentar vantagens em relação ao custo operacional, eficiência, controle molecular dos filmes fabricados (FURINI, 2016), menor peso, fácil integração à tecnologia do circuito integrado, baixa voltagem de operação, alta velocidade, possibilidade de fabricação de estruturas em nível microscópico e a possibilidade de utilizar água como solvente. Ou seja, o método é simples e barato, e possui diversas vantagens e aplicações, como por exemplo em língua eletrônica (VOLPATI, 2012; PATERNO, MATTOSO, OLIVEIRA Jr., 2001).
2.3.3 Língua eletrônica
A língua eletrônica (LE) é um dispositivo que reproduz artificialmente a sensação de sabor como em uma língua biológica (ARCA, 2016). A língua humana identifica os sabores básicos como, doce, salgado, azedo ou ácido, amargo e umami, logo, pode-se dizer que funciona com seletividade global. Enquanto, o dispositivo da língua eletrônica tem a capacidade de discriminar cada substância química, ou seja, apresenta seletividade específica (BRAGA, 2012).
Os filmes automontados podem ser empregados na língua eletrônica, a qual é formada por um conjunto de unidades sensoriais de diferentes filmes e utilizada para sistemas líquidos. Quando este conjunto de unidades sensoriais é imerso na solução a ser analisada, seus diferentes sensores interagem de modo distinto a fim de fornecer medidas elétricas características de cada unidade sensorial. As respostas obtidas são analisadas por computadores, semelhante ao trabalho desenvolvido pelo cérebro que interpreta o sinal transmitido pelos neurônios na conversão da informação do sabor em um sinal elétrico, permitindo o reconhecimento das sensações básicas do paladar (GREGORUT, 2010; VOLPATI, 2012).
Diferentes materiais podem ser empregados nos sensores da língua eletrônica, obtendo-se sensores com composições e características diferentes, bem como, ainda podem ser diferenciados quanto à espessura dos filmes depositados na LE. Esta variedade de materiais permite propiciar a sensibilidade da LE quando
imersa em diferentes analitos (GREGORUT, 2010). A língua eletrônica é altamente especializada para captar diversos estímulos (WIZIACK, 2010), de forma que utiliza diferentes unidades sensoriais e a partir das combinações das respostas individuais é possível obter um padrão de respostas para a amostra analisada (ALESSIO, 2012).
Devido ao grande número de possibilidades de combinação de materiais e sensores, a LE tem permitido aplicações quantitativas para estudos de identificação, classificação e detecção de substâncias, bem como, aplicações quantitativas em controle de processos (ARCA, 2016). Na literatura são encontrados trabalhos sobre a língua eletrônica que se diferem no método de detecção, como potenciometria, voltametria cíclica, condutiviometria, espectroscopia de impedância e métodos óticos (DANTAS, 2013; BRAGA, 2012; VOLPATI, 2012; WIZIACK, 2010).
A língua eletrônica que será obtida neste trabalho consiste da utilização de filmes poliméricos ultrafinos depositados sobre a superfície de um eletrodo pela técnica de automontagem, buscando medidas de impedância para as análises da amostra.
O sensor do tipo LE baseado em medidas de impedância foi desenvolvido em 2002 por Riul e coautores, que analisaram interações entre os analitos e os materiais que constituem as unidades sensoriais utilizando a técnica Langmuir-Blodgett (RIUL Jr. et al., 2002). As vantagens dessa técnica consistem na dispensa do uso de eletrodo de referência e a detecção de substâncias que não formam eletrólitos em baixas concentrações moleculares, o que se apresenta como um problema para análises potenciométricas (STELUTI, 2008).
Como apresenta FURINI (2016), o conceito de impedância pode ser comparado ao de resistência, entendendo-se a resistência total do sistema. A medida é realizada por um analisador de impedância e consiste em aplicar uma diferença de potencial e medir a amplitude e fase da corrente em relação à tensão aplicada.
A LE é capaz de analisar a qualidade de alimentos por meio de um sistema economicamente mais viável do que as tecnologias convencionais como, por exemplo, cromatografia gasosa e de alta eficiência (STELUTI, 2008). Sendo assim, este trabalho parte da premissa que as LE podem ser materiais viáveis para a
detecção de toxinas em castanhas-do-Brasil, as quais são empecilhos na exportação e consumo deste produto.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Com o objetivo de propor um método mais vantajoso e barato para a determinação de toxinas em castanha-do-Brasil, o presente trabalho busca contribuir com o estudo de sensores por meio da deposição de filmes poliméricos ultrafinos pela técnica de automontagem.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter sensores utilizando os polímeros: quitosana, carboximetilcelulose e poli(vinil álcool) pela técnica de automontagem.
Investigar o efeito da espessura das camadas dos polímeros na obtenção dos sensores.
Montar uma língua eletrônica para detecção das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 MATERIAIS PARA A PREPARAÇÃO DOS SENSORES
Os polímeros utilizados para a fabricação dos sensores foram: poli(vinil álcool) (PVA, MM 86.090 g.mol-1), quitosana (QT, baixo peso molecular e grau de desacetilação de 75-85%) e carboximetilcelulose de sódio (CMC) que foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Na Figura 6 estão apresentadas as estruturas dos meros de cada polímero.
Figura 6. Estrutura dos meros dos polímeros. Fonte: Autoria própria.
Como compostos aniônicos utilizou-se ftalocianina tetrasulfonada de níquel (FTC), nanopartículas de óxido de ferro (NOF) cedidos pelo Prof. Leonardo Paterno, azul de bromotimol (BTB) e alaranjado de metila (MO), que foram adquiridos da Sigma-Aldrich. O composto violeta cristal (VIO) foi utilizado como substância catiônica, adquirido da Sigma-Aldrich. As estruturas dos compostos estão apresentadas na Figura 7. Todos os reagentes utilizados apresentam pureza analítica.
Figura 7. Estrutura química dos compostos utilizados na fabricação dos filmes automontados. Fonte: Autoria própria.
4.2 PREPARAÇÃO DOS SENSORES
4.2.1 Preparação das soluções
A fim de verificar a influência da espessura das camadas dos polímeros na obtenção dos sensores, as dispersões dos polímeros foram preparadas em diferentes concentrações de acordo com a viscosidade de cada polímero. As concentrações preparadas para os polímeros foram: 10 e 40 mg.mL-1 para QT; 10, 40 e 100 mg.mL-1 para PVA e 10 mg.mL-1 para CMC. Buscamos preparar concentrações em que houvesse a solubilidade dos compostos, assim, foram preparadas as seguintes soluções: MO 10 mg.mL-1; BTB 10 mg.mL-1; VIO 10 mg.mL
-1
4.2.2 Obtenção do eletrodo interdigitado
Os eletrodos interdigitados foram desenvolvidos manualmente a partir de placas de circuito impresso de fenolite e de fibra de vidro revestidas com uma camada de cobre com espessura de 1 Oz. A Figura 8 apresenta o eletrodo interdigitado com 2 dígitos com tamanho de 18X20 mm.
Figura 8. Eletrodo interdigitado utilizado na fabricação dos sensores. Fonte: Autoria Própria.
4.2.3 Deposição dos filmes
Os filmes foram depositados em placas de vidro (substrato) de tamanho 40x15 mm pela técnica de automontagem, com intuito de analisar a espessura e o controle da deposição dos filmes ultrafinos. Para isso, imergiu-se o substrato em uma dispersão do polímero (policátion) deixando por 3 minutos. Em seguida, lavou-se o substrato em água destilada, com intuito de lavou-se retirar o excesso de polímero não depositado, e secou-se o substrato ao ar. Sobre a camada do polímero, uma camada do composto utilizado como poliânion foi depositada por imersão do substrato nesta solução, durante 3 minutos. O substrato foi lavado em água destilada por 2 minutos e seco ao ar. A cada deposição das bicamadas, o
crescimento e deposição das mesmas, foram analisados em um espectrofotômetro UV-Vis T70+, PG Instruments.
Posteriormente, os sensores da LE foram obtidos pela deposição de filmes ultrafinos pela técnica de automontagem sobre eletrodos interdigitados de fenolite e de fibra de vidro. Sendo que, as deposições feitas em placas de fenolite não puderam ser analisadas em um espectrofotômetro UV-Vis T70+, pois o feixe não consegue atravessar essas placas por possuírem um material espesso, diferentes do vidro. Sendo assim, uma placa de fenolite foi lixada para que pudéssemos analisar o crescimento com a deposição do filme QT1/FTC. O mesmo ocorreu para o eletrodo interdigitado de fibra de vidro, em que não foi possível realizar uma análise do crescimento do filme devido à espessura do eletrodo. Por isso, utilizaram-se os resultados das deposições realizadas em vidro como referência.
No total foram depositadas 10 bicamadas. A Tabela 3 apresenta um resumo dos sensores preparados. Foram selecionados os melhores filmes obtidos nas placas de vidro para serem depositados nos sensores.
Como policátions foram utilizados os polímeros poli(vinil álcool) e quitosana e o composto violeta cristal. Como poliânions foram utilizados o polímero carboximetilcelulose de sódio e os compostos ftalocianina tetrasulfonada de níquel, nanopartículas de óxido de ferro, azul de bromotimol e alaranjado de metila em meio ácido (a) e em meio básico(b).
A língua eletrônica é composta por um conjunto de sensores poliméricos, cada sensor foi constituído por um eletrodo interdigitado recoberto com um tipo de policátion e poliânion. O sensor sem filme (referência) também foi inserido para compor a língua eletrônica com o intuito de analisar alterações nas respostas elétricas em virtude da presença do filme.
Tabela 3. Composição e código dos sensores obtidos pela técnica de automontagem.
Fonte: Autoria própria. Sigla dos sensores Concentração da solução dos policátions (mg.mL-1) Policátions Poliânions Referência - - - QT1/FTC 10 QT FTC QT1/NOF 10 QT NOF QT1/CMC 10 QT CMC QT1/BTB 10 QT BTB QT1/MOa 10 QT MOa QT1/MOb 10 QT MOb PVA1/FTC 10 PVA FTC
PVA1/NOF 10 PVA NOF
PVA1/BTB 10 PVA BTB
PVA1/MOa 10 PVA MO
PVA1/MOb 10 PVA MOb
PVA1/VIO 10 PVA VIO
PVA4/FTC 40 PVA FTC
PVA4/NOF 40 PVA NOF
PVA4/CMC 40 PVA CMC
PVA4/BTB 40 PVA BTB
PVA4/MOa 40 PVA MO
PVA4/MOb 40 PVA MOb
PVA4/VIO 40 PVA VIO
QT4/BTB 40 QT BTB
QT4/MO 40 QT MO
PVA/BTB 100 PVA BTB
PVA/MOa 100 PVA MO
4.3 CARACTERIZAÇÃO DOS MATERIAIS
4.3.1 Espectroscopia de Absorção UV-Vis
Após cada etapa de automontagem de uma dupla camada elétrica foram realizadas análises do crescimento dos filmes depositados na superfície do eletrodo de vidro por meio da espectroscopia de absorção UV-Vis, a fim de observar e analisar o controle na espessura das camadas, de modo que, apresente eficiência para a utilização na língua eletrônica. As análises foram em realizadas em Espectrofotômetro UV-Vis T70+, PG Instruments.
4.3.2 Microscopia Óptica
A formação das bicamadas foram analisadas no Microscópio óptico Digital USB, ampliação 20-800x.
4.3.3 Microscopia Eletrônica de Varredura
As análises de microscopia eletrônica de varredura (MEV) foram realizadas em um Microscópio Quanta 250, voltagem de aceleração de 15 kV e intensidade de corrente de 30 mA. Foram utilizadas duas placas de vidro e três placas de fenolite de 5X10 mm. Nas placas de vidro foram depositados os filmes QT1/FTC e QT1/NOF, e nas placas de fenolite QT1/FTC, QT1/NOF e QT1/BTB. A superfície dos eletrodos foram previamente cobertas com uma fina camada de ouro. As análises foram realizadas na Universidade Estadual de Maringá, por intermédio do prof. Dr. Adley Forti Rubira.
4.3.4 Análise de Espectroscopia de Energia Dispersiva
As análises de espectroscopia de energia dispersiva (EDS) também foram realizadas no Microscópio Quanta 250, voltagem de aceleração de 20 kV e intensidade de corrente de 30 mA. Foram utilizadas duas placas de vidro e três placas de fenolite de 5X10 mm. Nas placas de vidro foram depositados os filmes QT1/FTC e QT1/NOF, e nas placas de fenolite QT1/FTC, QT1/NOF e QT1/BTB. A superfície dos eletrodos foi previamente cobertas com uma fina camada de ouro. As análises foram realizadas na Universidade Estadual de Maringá, por intermédio do prof. Dr. Adley Forti Rubira.
4.3.5 Medidas de Capacitância
Para avaliar a funcionalidade da língua eletrônica foram preparadas soluções de cloreto de sódio (NaCl) e como micotoxina modelo o ácido fusárico (adquirido da Sigma-Aldrich), em diferentes concentrações, para análise dos sinais gerados e construção de curva de calibração. E posteriormente, utilizou-se uma mistura contendo as aflatoxinas G1, G2, B1 e B2, nas concentrações 50 g/mL, 15 g/mL, 50 g/mL e 15 g/mL, respectivamente. O sensor foi imerso nestas soluções com o intuito de gerar um sinal elétrico, como resposta as diferentes interações com os polímeros. O sistema de medidas de capacitância elétrica é composto por um sensor conectado ao equipamento Ponte LCR MX-1010, Minipa. Os sensores ficaram imersos em cada solução analisada durante 3 segundos.
Figura 9. Ilustração do sistema de medidas. Fonte: Autoria própria.
4.4 TRATAMENTO DOS DADOS
4.4.1 Calibração do sensor
O sensor foi calibrado por meio de uma curva de calibração entre os dados obtidos em diferentes concentrações e diferentes eletrodos. As informações dos sinais obtidos foram processadas por meio de um Raspberry PI3 que apresenta o resultado final em um display.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Curva de calibração dos compostos
Inicialmente obtiveram-se os espectros de absorção das soluções dos compostos FTC, NOF, BTB, MO e VIO em diferentes concentrações (Figuras 10, 12, 14, 16 e 18), a fim de analisar a absorbância máxima de cada composto. A partir destes gráficos foi possível construir uma curva analítica, correlacionando a absorção versus concentração de cada composto (Figuras 11, 13, 15, 17 e 19).
A Figura 10 apresenta o espectro de absorção do FTC, em que a curva de calibração, Figura 11, foi construída a partir das absorbâncias máximas em aproximadamente 623 e 659 nm. Esses valores de absorbância estão de acordo com dados da literatura (BAGGIO, 2014).
Figura 10. Espectro de absorbância versus comprimento de onda do FTC em diferentes concentrações.
Fonte: Autoria própria.
600 800 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 Comprimento de onda (nm) Concentração ( g/mL) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 11. Curvas de calibração do FTC obtidas nos comprimentos de onda de 623 e 659 nm. Fonte: Autoria própria.
Os gráficos dos espectros de absorção dos compostos NOF e VIO são apresentados nas Figuras 12 e 14, respectivamente. O NOF apresentou absorbância máxima em aproximadamente 480 nm (Figura 13) e o VIO em 541 e 590 nm (Figura 15). Por meio dos gráficos de absorção foi possível construir as curvas de calibração correlacionando a absorbância versus concentração dos compostos.
Figura 12. Espectro de absorbância versus comprimento de onda do NOF em diferentes concentrações.
Fonte: Autoria própria.
0 20 40 60 80 100 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Concentração ( g/mL) 623 nm y=0,01001x+0,02233 R2= 0,99644 0 20 40 60 80 100 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Concentração ( g/mL) 659 nm y=0,00648x+0,0394 R2 = 0,99025 200 400 600 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Comprimento de onda (nm) Concentração ( g/mL) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 13. Curva de calibração do NOF obtida no comprimento de onda de 541 nm. Fonte: Autoria própria.
Figura 14. Espectro de absorbância versus comprimento de onda do VIO em diferentes concentrações.
Fonte: Autoria própria.
0 20 40 60 80 100 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 541 nm y = 0,00107x R2=0,98436 Concentração ( g/mL) 400 600 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Comprimento de onda (nm) Concentração ( g/mL) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
