INSTITUTO DE QUÍMICA
JULIANA CRUCELLO
DESENVOLVIMENTO DE MODULADOR COM FLUXO DIFERENCIAL PARA CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE: ESTUDOS
FUNDAMENTAIS E APLICAÇÕES
CAMPINAS 2019
JULIANA CRUCELLO
DESENVOLVIMENTO DE MODULADOR COM FLUXO DIFERENCIAL PARA CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE: ESTUDOS
FUNDAMENTAIS E APLICAÇÕES
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Química na área de Química Analítica.
Orientador: Prof. Dr. Leandro Wang Hantao
O arquivo digital corresponde à versão final da Dissertação defendida pela aluna Juliana Crucello e orientada pelo Prof. Dr. Leandro Wang Hantao.
CAMPINAS 2019
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Leandro Wang Hantao (Orientador)
Prof. Dr. Stanislau Bogusz Junior (IQSC-USP)
Prof. Dr. José Alberto Fracassi da Silva (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Este exemplar corresponde à redação final da Dissertação de Mestrado defendida pela aluna Juliana Crucello, aprovada pela Comissão Julgadora em 17 de julho de 2019.
“All that I saw and learned that was new delighted me. It was like a new world opened to me, the world of science, which I was at last permitted to know in all liberty.”
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço ao Prof. Leandro por todo apoio, confiança, paciência e suporte dados durante a realização do projeto. Obrigada pela melhor orientação que eu poderia ter e por ter me auxiliado no crescimento pessoal e profissional.
Agradeço aos meus pais Sérgio e Salete pelo apoio, compreensão e esforços para que eu pudesse realizar tanto a graduação quanto o mestrado. Muito obrigada por tudo.
Agradeço a toda minha família por sempre estarem junto comigo e me apoiarem durante toda minha trajetória. Agradeço em especial aos meus primos Lucas, Gabriel e Rafael por sempre ajudarem a trajetória a ser mais leve e fácil.
Aos amigos Igor (Caju), por sempre me auxiliar nos estudos e conselhos e estar presente por toda a graduação, e Bruno (Chimbinha) pelas histórias, estudos e por ter me indicado o Leandro como orientador, se não fosse você hoje não estaria onde estou hoje.
A todos meus amigos e companheiros de laboratório: Dr. Fábio Augusto, Lucília Vilela, André (Fresta), Amilton (Motoboy, o cara mais rico do lab), Isabela (Isa), Rose, Raisa, Victor, Carlos (Bezerro), Fernanda (Fer, muitas saudades), Luiz (Coruja), Gustavo (o bebê prodígio do grupo).
Agradeço em especial aos amigos e companheiros de laboratório João e Breno por estarem comigo por toda essa jornada, por corrigirem meu caipirês, por todos os ensinamentos da técnica e pelas inúmeras cincadas e idas ao posto. Obrigada por sempre tornarem o ambiente de trabalho mais legal e por todo o companheirismo!
Aos amigos da república Cassino: Lucas (Pac), Natália, Nara, Carlos (Cadu), Marina (Nina), Phelipe, Gabriel, Filipe, Diego (Crânio). Obrigada por aguentarem meus surtos de estresse, pela companhia pra Goiaba e por todos os momentos divertidos (incluindo ou não as aparições do japonês).
Aos demais amigos que estiveram presentes de alguma forma nesta jornada: Miguel, Júlia, Karina, Raul, Angelo, Lígia, Caíque, Beatriz e Artur.
A todos do Instituto de Química da UNICAMP, em especial a Coordenadoria da Pós-Graduação (CPG) por todo auxílio prestado durante o desenvolvimento do projeto.
A Nova Analítica, pelo contínuo suporte e parceria.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Processo 400182/2016-5).
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP Processo 2017/25490-1).
A Pró-reitoria de Pesquisa da UNICAMP (FAEPEX 519.292). A Petrobras S.A. (Processo 2017/00358-3).
RESUMO
Com o surgimento das técnicas cromatográficas multidimensionais, em especial a cromatografia gasosa multidimensional (MDGC), um aumento sem precedentes no poder de separação da análise foi alcançado. Este aumento se deve pela combinação de dois ou mais estágios de separação em uma única análise. Ainda, a possibilidade de acoplamento desta técnica com outras técnicas instrumentais como espectrometria de massas, torna possível a detecção de centenas de compostos. Este atributo torna possível a investigação de sistemas bastante desafiadores, como aqueles encontrados na petroleômica e metabolômica.
Entretanto, os sistemas de separações MDGC mais adotados atualmente envolvem o consumo de fluídos criogênicos, agregando alto valor à técnica, o que acaba por restringi-la. Recentemente, porém, a confecção de interfaces livres de consumíveis para MDGC vem ganhando destaque como uma boa alternativa aos dispositivos criogênicos. Neste contexto, é proposto no Capítulo 2 o desenvolvimento e caracterização de um modulador com fluxo diferencial, um dispositivo que permite a conversão da técnica de cromatografia gasosa monodimensional (1D-GC) para cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GCGC) sem a utilização de fluídos criogênicos.
As principais aplicações de GCGC residem na separação de misturas complexas que excedem a capacidade de pico da 1D-GC. Amostras complexas, que apresentam elevado número de compostos com ampla faixa de volatilidade ou grandes números de coeluições, podem ser resolvidas utilizando estas técnicas. Neste contexto, nos Capítulos 3, 4 e 5 são apresentados estudos de caso utilizando a interface desenvolvida neste projeto para amostras de alta complexidade. No Capítulo 3, o sistema foi utilizado para realizar a separação de bifenilas policloradas em óleos de transformador; também, o desempenho da técnica para análises quantitativas foi avaliado. No Capítulo 4 é demonstrado o potencial de uso da técnica de GCGC acoplada com espectrometria de massas (GCGC-MS) combinada com técnicas de microextração na obtenção do perfil de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras de vinho. Por fim, no Capítulo 5 foi apresentado um estudo de caso empregando técnicas de microextração combinadas com GCGC-MS na detecção de contaminantes em concentrações traço em amostras de solução nasal.
ABSTRACT
Since the development of the multidimensional chromatographic techniques, particularly the multidimensional gas chromatography (MDGC), the separation power of the analysis was greatly improved. Such improvement was achieved by the combination of two separation steps in a single analysis. Also, the possibility of coupling this technique with other techniques such as mass spectrometry, makes it possible the detection of hundreds of compounds. This feature allows the investigation of challenging systems, such as petroleomics and metabolomics.
However, the systems more adopted for MDGC are intermediated by cryogenic fluids, which elevates the operational cost of the technique, restricting its adoption worlwide. Recently, though, the confection of interfaces free from consumables for MDGC has drawing attention as a good alternative for the usage of cryogenic systems. In such scenario, it is proposed in the Chapter 2 the development and characterization of a differential flow modulator, an apparatus that allows the conversion of the mono-dimensional gas chromatography (1D-GC) to the comprehensive two-dimensional gas chromatography (GCGC) without the use of cryogenic fluids.
The main applications of the GCGC are the separation of complex mixtures that exceeds the peak capacity of the 1D-GC. Complex samples, that presents a high number of compounds exhibiting a large volatile range or a high number of coelutions, may be resolved by using such technique. In this context, in the Chapters 3, 4 and 5 are presented cases studies using the interface developed in this project for samples with high complexity. In the Chapter 3, the system was used to separate polychlorinated biphenyls in insulation oils; also, the performance of the technique to quantitative analysis was evaluated. In Chapter 4 is demonstrate the potential of the technique of GCGC coupled to mass spectrometry (GCGC-MS) matched with microextraction techniques to obtain the profile of volatile and semi-volatile organic compounds in wine samples. Lastly, in Chapter 5 is presented a case study employing microextraction techniques combined with GCGC-MS for the detection of contaminants in trace concentration from samples of nasal solution.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Representação simplificada de um sistema típico de cromatografia gasosa multidimensional de frações parciais. Fonte autoral. ...22 Figura 1.2. Esquema de interface tipo “Deans Switch” para GC-GC representando os modos bypass (a) e injeção (b). Adaptado de Seeley, J. V.; Micyus, N. J.; Bandurski, S. V.; Seeley, S. K.; McCurry, J. D. Anal. Chem. 2007 79 1842 [1] ...23 Figura 1.3. Cromatograma de um corte GC-GC-FID de óleo de tagetes. No detalhe em vermelho está apresentado parte do cromatograma 1D-GC da mesma amostra. O retângulo em cinza presente no detalhe destaca a região que foi escolhida para a análise sequencial. Retirado de Apps, P. J. Sep. Sci. 2006 29 2346 [2]. ... 25 Figura 1.4. Representação teórica da capacidade máxima de pico para GCGC. Cada quadrado representa uma região do cromatograma no qual pode ser alocado um pico cromatográfico de uma série homóloga com um valor de resolução de 2,5. Adaptado de Murray, J. A. J. Cromatogr. A 2012 1261 59 [3]. ...26 Figura 1.5. Representação simplificada de um sistema típico de GC×GC. Fonte autoral. ...27 Figura 1.6. Representação da obtenção de dados e dos cromatogramas GCGC: (a) bandas eluídas por uma coluna primária e sequencialmente fatiadas em diversas frações para um PM específico. O número de “cortes” ou “fatias” de cada banda será igual a MR; (b) a resposta do detector é então plotada com base no PM como diagrama de contorno ou (c) de forma tridimensional. Adaptado de Meinert, C.; Meierhenrich, U. J. Angew. Chem. Int. Ed. 2012 51 10462 [4]...28 Figura 1.7. Exemplo de cromatograma 1D-GC ordenado de amostra de n-alcanos. Adaptado da Restek [27].. ...29 Figura 1.8. Exemplo de cromatograma GCGC de diesel usando combinação de colunas apolar polar. Isômeros se alinham em bandas diagonais e grupos congêneres ou homólogos aparecem como bandas separadas. Retirado de Meinert, C.; Meierhenrich, U. J. Angew. Chem. Int. Ed. 2012 51 10462 [4]...30 Figura 1.9. Simulação da retenção de compostos para GCGC empregando isoterma em ambas as dimensões (a); isoterma na 1D e temperatura programada na 2D (b); temperatura programada em ambas as dimensões (c); e temperatura programada em ambas as dimensões com três séries homólogas (d). Retirado de Phillips, J. B.; Beens J. J. Cromatogr. A 1999 856 334. ...32
Figura 1.10. Representação de um modulador de dessorção térmica de dois estágios. A e B se referem à 1D e 2D, respectivamente. C representa o segmento da 2D localizado fora do forno cromatográfico. L1, L2 e L3 são condutores elétricos que permitem que a corrente elétrica flua alternativamente entre o primeiro estágio (S1) e o segundo estágio (S2) do modulador. Retirado de Edwards, M.; Mostafa, A.; Górecki, T. Anal. Bioanal. Chem. 2011 401 2339 [5] ...34 Figura 1.11. Representação do modo de operação de um modulador criogênico de dois estágios (quadjet). Nesta figura ilustra-se duas modulações sequenciais. O jato resfriado (em azul) aprisiona as bandas eluídas pela 1D. As bandas são então transferidas para a 2D através da dessorção causada pela incidência de um jato aquecido (em vermelho). Retirado de Hantao, L. W. Aplicação de métodos quimiométricos na investigação do metaboloma de eucalipto por técnicas cromatográficas multidimensionais hifenadas à espectrometria de massas. Tese – UNICAMP. Campinas, 2014. ...35 Figura 1.12. Representação de um modulador de válvula. Em (a) o efluente da coluna primária é direcionado para a coluna secundária enquanto o gás auxiliar é direcionado para a exaustão; enquanto em (b) o efluente da coluna primária é direcionado para a exaustão enquanto o gás auxiliar é direcionado para a separação na coluna secundária. Adaptado de Edwards, M.; Mostafa, A.; Górecki, T. Anal. Bioanal. Chem. 2011 401 2344 [5]...37 Figura 1.13. Representação esquemática do sistema GCGC empregando modulador com fluxo diferencial proposto por Seeley et al. Adaptado de Seeley, J. V.; Kramp, F.; Hicks, C. J. Anal. Chem. 2000 72 4347 [6]. ...38 Figura 1.14. Modulador com fluxo diferencial operando em modo concorrente (forward fill/flush - FFF), demonstrando a etapa de coleta (a); a etapa de reinjeção (b). A seta preta representa a vazão da coluna primária e a seta laranja a vazão do gás auxiliar. ...39 Figura 1.15. Modulador com fluxo diferencial operando em modo contracorrente (reverse fill/flush – RFF) durante (a) a etapa de coleta e em (b) a etapa de reinjeção. Adaptado de Griffith, J.F.; Winniford, W.L.; Sun, K.; Edam, R.; Luong, J.C. J. Chromatogr. A 2012 1226 116 [7].40 Figura 1.16. Comparação de desempenho de moduladores de fluxo operando no modo concorrente (FFF) e contracorrente (RFF) para diferentes concentrações de acetato de 1-hexenol. Retirado de Griffith, J. F.; Winniford, W.L.; Sun, K.; Edam, R.; Luong, J.C. J. Chromatogr. A 2012 1226 116 [7]. ...41 Figura 2.1. Esquema hierárquico do funcionamento do modulador (cima) destacando o módulo eletrônico (azul), o módulo pneumático (vermelho) e o GC (verde). Módulo eletrônico responsável pela sincronização dos eventos do modulador com o cromatógrafo a gás (baixo)
destacando os componentes eletrônicos (a), o protótipo lacrado (b) e demonstrando o acoplamento do módulo no cromatógrafo a gás TRACE 1310 (c). ...46 Figura 2.2. Modulador com fluxo baseado em placas microfluídicas: divisor de três e de quatro portas (a). Válvula diafragma utilizada para realizar o chaveamento de gás auxiliar (b). Destaque para o sistema de divisores imobilizado dentro do forno do cromátografo (c). Fonte autoral. ...47 Figura 2.3. Modo de funcionamento do modulador desenvolvido. O modulador opera em duas etapas: a etapa de coleta das bandas eluídas pela coluna primária (a) e a etapa de reinjeção do conteúdo da alça de amostragem (b). ...48 Figura 2.4. Simulação da vazão da coluna primária ao longo da coluna cromatográfica. O período de modulação simulado é de 3 s e o pulso de reinjeção 0,1 s. Adaptado de Harvey, P. McA.; Shellie, R.A.; Haddad, P.R. J. Chromatogr. Sci. 2010 48 245 [3]. ...51 Figura 2.5. Representação da montagem do modulador realizada para os testes de detectabilidade; ambas as saídas do capilar de restrição e da coluna secundária estão conectadas a detectores por ionização em chama. ...52 Figura 2.6. Cromatograma GC×GC-FID de óleo diesel utilizando o modulador desenvolvido no projeto. Em azul está registrado o sinal do FID #1 conectado à 2D. Em laranja foi registrado o sinal do FID #2 conectado ao capilar de restrição. Inset: expansão de uma região aleatória do cromatograma GC×GC-FID para ilustrar a ausência de picos no registro do FID #2. Fonte autoral.. ...53 Figura 2.7. Cromatogramas GCGC-FID de amostra de maltenos destacando o comportamento do perfil cromatográfico utilizando vazão de gás auxiliar de 5,20 (a), 5,30 (b), 5,40 (c) e 5,50 mL min-1. As linhas tracejadas em vermelho destacam a variação do tempo morto de análise com o aumento da vazão de gás auxiliar. O círculo em roxo destaca a redução no espaço de separação na segunda dimensão com o aumento da pressão de gás auxiliar. Fonte autoral. ....55 Figura 2.8. Cromatogramas GCGC-FID de amostra de maltenos utilizando pulsos de reinjeção de 120 (a), 150 (b), 220 (c) e 250 ms (d). Fonte autoral. ...56 Figura 2.9. Gráfico de barras comparando os métodos GCGC avaliando o volume de pico (a) e a razão sinal-ruído (b). As vazões de gás de arraste e auxiliar foram operadas de modo constante-constante (CC); constante-programada (CP) e programada-programada (PP). Fonte autoral. ...58 Figura 2.10. Cromatograma GC×GC-FID de gasolina. Injeção: 1 µL da amostra diluída 100 vezes em n-hexano. Colunas: Petrocol – 22,5 m × 0,2 mm; 0,50 µm + HP-50+ – 5 m × 0,25
mm; 0,25 µm. Programação do forno: 50˚C (5 min) até 200˚C a 3˚C min-1. Período de modulação de 4 s. Fonte autoral. ...59 Figura 2.11. Cromatograma GC×GC-FID de querosene. Injeção: 1 µL da amostra diluída 100 vezes em n-hexano. Colunas: Petrocol – 22,5 m × 0,2 mm; 0,50 µm + HP-50+ – 5 m × 0,25 mm; 0,25 µm. Programação do forno: 50˚C (1 min) até 250˚C a 3˚C min-1. Período de modulação de 4 s. Fonte autoral. ...59 Figura 2.12. Cromatograma GC×GC-FID de diesel. Injeção: 1 µL da amostra diluída 100 vezes em n-hexano. Colunas: Petrocol – 22,5 m × 0,2 mm; 0,50 µm + HP-50+ – 5 m × 0,25 mm; 0,25 µm. Programação do forno: 80˚C até 350˚C a 3˚C min-1. Período de modulação de 4 s. Fonte autoral ...60 Figura 2.13. Cromatograma GC×GC-FID de biodiesel. Injeção: 1 µL da amostra diluída 100 vezes em n-hexano. Colunas: Petrocol – 22,5 m × 0,2 mm; 0,50 µm + HP-50+ – 5 m × 0,25 mm; 0,25 µm. Programação do forno: 80˚C até 350˚C a 3˚C min-1. Período de modulação de 4 s. Fonte autoral ...60 Figura 2.14. Cromatograma GC×GC-FID de óleo vegetal hidrotratado (VGO). Injeção: 1 µL da amostra diluída 100 vezes em n-hexano. Colunas: Petrocol – 22,5 m × 0,2 mm; 0,50 µm + HP-50+ – 5 m × 0,25 mm; 0,25 µm. Programação do forno: 80˚C até 350˚C a 3˚C min-1. Período de modulação de 4 s. Fonte autoral. ...60 Figura 2.15. Cromatograma GC×GC-FID de petróleo. Injeção: 1 µL da amostra diluída 100 vezes em n-hexano. HT8 – 10,5 m × 0,32 mm; 0,10 µm + HP-50+ – 5 m × 0,25 mm; 0,25 µm. Programação do forno: 100˚C até 350˚C a 4˚C min-1. Período de modulação de 4s. Fonte autoral. ...61 Figura 3.1. Estrutura de cátions e ânions mais utilizados no preparo de líquidos iônicos. Retirado de Hantao, L. W.; Toledo, B. R.; Augusto, F. Quim. Nova 2016 39 82 [18]. ...67 Figura 3.2. Cromatogramas GCGC-FID de óleo de transformador contaminado com PCBs obtidos pelo conjunto de colunas do set apolar polaridade média (a) e polar apolar (b). Fonte autoral. ...71 Figura 3.3. Cromatograma GCGC-ECD de óleo de transformador contaminado com PCBs obtido utilizando o set de colunas polar apolar. Fonte autoral. ...72 Figura 3.4. Gráfico de resíduos obtido para a curva analítica de faixa de concentração de 10 a 50 µg mL-1. Fonte autoral. ...73 Figura 4.1. Procedimento de extração via HS-SPME destacando as etapas de amostragem e acoplamento ao cromatógrafo. Fonte autoral. ...77
Figura 4.2. Cromatogramas GCGC compostos por J pixels de I amostras após o desdobramento e alinhamento dos dados em uma matriz de dados (X) de dimensões (I J). A MPCA decompõe X em uma matriz (T) de escores (I F), uma matriz transposta (PT) de loadings (F J) e uma matriz (E) de residuais (I J). F deve ser menor ou igual o mínimo dos termos I e J e é o número de PCs necessários para modelar 100% de variação em X. Adaptado de Pierce, K.M.; Parsons B.A.; Synovec, R.E. Elsevier 2015 427-457 [40] ...82 Figura 4.3. Perfis de extração obtidos pelas diferentes fibras de SPME. Os perfis de extração foram obtidos por HS-SPME e GCGC-FID para um vinho brasileiro modelo. A área absoluta foi obtida pela soma de todas as áreas dos picos do cromatograma. Fonte autoral. ...88 Figura 4.4. Cromatogramas GCGC-QMS do perfil de voláteis e semi-voláteis do vinho tinto modelo utilizando HS-SPME com as fibras PA (a), DVB/CAR/PDMS (b), ([VC6IM][Cl]) (c), ([VC16IM][NTf2]) (d) e ([VBC16IM][NTf2]) (e). Fonte autoral ...89 Figura 4.5. Cromatograma de íons totais das amostras de vinho investigadas utilizando HS-SPME com a fibra ([VC16IM][NTf2]). As amostras de vinho investigadas foram produzidas pelos seguintes cultivares de uvas: “Isabella” produzida em 2015 (a) e 2016 (c); e “BRS Magna” produzida em 2015 (b) e 2016 (d). Fonte autoral...99 Figura 4.6. Cromatogramas de íons totais GCGC-QMS sobrepostos de todas as amostras “Isabella” e “BRS Magna” destacando a janela de eluição no início (a) e no final do cromatograma (b). Os deslocamentos dos tempos de retenção na segunda dimensão apresentaram variações abaixo de 5%. Fonte autoral. ...101 Figura 4.7. MPCA de dois componentes baseados em pixels para amostra de vinhos brasileiros utilizando os dados GCGC-QMS. Os perfis de voláteis e semi-voláteis foram obtidos utilizando a fibra 50/30 DVB/CAR/PDMS (a) e a fibra ([VC16IM][NTf2]) baseada em PILs (b). Legenda: “Isabella” 2015 – i88; “Isabella” 2016 – i97; “BRS Magna” 2015 -m6; “BRS Magna” 2016 -m16. Fonte autoral. ...102 Figura 4.8. Bi-plots obtidos a partir da razão de Fisher utilizando o software GC Image para criar um template de picos com as regiões com altos valores de F (a). Exemplo de uma correspondência de templates utilizando o GC Image para atribuir potenciais picos específicos a cada cultivar nos cromatogramas de íons totais GCGC-QMS de uma amostra de vinho “BRS Magna” produzida em 2016 (b). Fonte autoral. ...104 Figura 4.9. Média das áreas do pico (log10) dos analitos relevantes para a diferenciação de classes, utilizando a análise por razão de Fisher baseada em pixels (esquerda). Perfil cromatográfico 3D do butanoato de etila (1); etil-metil-succinato (2); ocatonato de etila (3);
ácido octanóico (4) (direita). Legenda: “Isabella” 2015 – i88, 2016 – i97; “BRS Magna” 2015 -m6, 2016 – m16. Fonte autoral. ...105 Figura 5.1. Escopo das investigações de E&L (a) e potenciais efeitos causados por lixiviáveis (b). Fonte autoral. ...109 Figura 5.2. Cromatograma de íons totais obtidos por GCGC-MS de uma amostra estressada (a), uma amostra controle (b) e do branco (c) utilizando DI-SPME com fibra de PDMS/DVB. Fonte autoral ...113 Figura 5.3. MPCA de duas componentes das amostras avaliadas, sendo as soluções nasais após o experimento de estabilidade acelerada marcadas como “estressado” e o grupo controle como “controle”. Fonte autoral. ...114 Figura 5.4. Criação de um template de picos utilizando os vetores de loadings (a) do cromatograma reconstruído; e (b) emprego do template demarcando os potenciais lixiviáveis no cromotagrama de íons totais GCGC-MS de uma amostra de solução nasal estressada. Fonte autoral.. ...127
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1. Vazões de gás de arraste e gás auxiliar avaliadas para a otimização da dessorção da fibra de SPME. ...57 Tabela 2.2. Análise de n-alcanos usando GC×GC com um modulador criogênico de quatro jatos. ... 58 Tabela 3.1. Composição química das fases estacionárias avaliadas neste estudo de caso. ...68 Tabela 3.2. Valores de constantes do sistema das colunas avaliadas neste estudo de caso [23,24] ...71 Tabela 3.3. Faixa de concentração dos analitos, limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) obtidos para cada curva analítica. ...73 Tabela 3.4. Valores de recuperações obtidas para amostras certificadas de óleo de transformador contaminadas com diferentes concentrações de PCBs. ...74 Tabela 4.1. Amostras de vinho analisadas neste estudo de caso. ...83
Tabela 4.2. Composição dos PILs utilizados como fase sorvente para SPME utilizados neste
estudo de caso. ... 84
Tabela 4.3. Identificação dos analitos encontrados na fração volátil e semi-volátil das amostras de vinho Isabella e BRS Magna por HS-SPME e GCGC-QMS. O “x” presente na Tabela indica qual foi a fibra responsável pela extração de cada analito. Todos os analitos foram identificados considerando uma similaridade mínima do espectro MS de 80% e desvio de 15 no LTPRI a partir do NIST Web Book. Os descritores de odor e sabor foram obtidos através das bibliotecas Pherobase e the Good Scents Company. ...90 Tabela 5.1. Abordagem modificada do FDA/CDER/CBER para análise de risco de lixiviáveis. Reproduzido de USP 39 (2016). ...110 Tabela 5.2. Identificação de potenciais lixiviáveis em solução nasal após o teste de estabilidade acelerada ...116 Tabela A1. Descrição da composição química das colunas investigadas durante o projeto ..133 Tabela A2. Constantes SPM das colunas investigadas durante o projeto [70,120]. Valores obtidos para 100 °C. ...133
LISTA DE ABREVIATURAS
1D – Coluna primária/Primeira dimensão 2D – Coluna secundária/Segunda dimensão 2D - Bidimensional1D-GC – Cromatografia Gasosa Monodimensional E&L – Extraíveis e Lixiviáveis
ECD – Detector de Captura de Elétrons (Electron Capture Detector) D.I. – Diâmetro Interno
FID – Detector de Ionização em Chama (Flame Ionization Detector) FFF – Modo concorrente (Forward Fill/Flush)
GC – Cromatografia Gasosa (Gas Chromatography) GC-GC – Cromatografia Gasosa por Frações Parciais
GCGC – Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente IL – Líquido iônico (Ionic Liquids)
LMCS – Sistema Criogênico Longitudinalmente Modulado (Longitudinally Modulated Cryogenic System)
LOD – Limite de Detecção (Limit of Detection)
LOQ – Limite de Quantificação (Limit of Quantitation)
MAOT – Temperatura Máxima de Trabalho (Maximum Allowable Operating Temperature) MDGC – Cromatografia Gasosa Multidimensional (Multidimensional Gas Chromatography) MR – Razão de Modulação
MS – Espectrometria de Massas (Mass Spectrometry) PCB – Bifenila Policlorada (Polychlorinated Biphenyl) PDMS/DVB – Polidimetilsiloxano-divinilbenzeno PM – Período de Modulação
RFF – Modo contracorrente (Reverse Fill/Flush)
RSD – Desvio Padrão Relativo (Relative Standard Deviation) S/N – Razão Sinal-Ruído
SPME – Microextração em Fase Sólida (Solid Phase Microextraction) VOCs – Compostos Orgânicos Voláteis (Volatile Organic Compounds)
SUMÁRIO
1. CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO GERAL E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...20
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...21
1.1. Cromatografia gasosa multidimensional ...21
1.2. Ortogonalidade ...30
1.3. Modulação ...32
1.4. Detecção e aquisição de dados em GCGC ...41
2. DESENVOLVIMENTO E ESTUDOS FUNDAMENTAIS DE UM MODULADOR COM FLUXO DIFERENCIAL OPERANDO EM MODO CONTRACORRENTE PARA CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ...43
2.1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ...44 2.2. OBJETIVOS ...44 2.2.1. Objetivos gerais...44 2.2.2. Objetivos específicos ...45 2.3. MATERIAIS E MÉTODOS ...45 2.3.1. Montagem do modulador ...45 2.3.2. Cromatógrafo a gás ...48 2.3.3. Materiais e reagentes ...49 2.3.4. Pneumática do sistema ...49 2.3.5. Parâmetros de modulação...51 2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...52
2.4.1. Avaliação do efeito do modulador na detectabilidade do sistema...52
2.4.2. Características operacionais do modulador ...53
2.4.3. Faixa de volatilidade ...58
2.5. CONCLUSÕES PARCIAIS ...61
3. ESTUDO DE CASO I: DETERMINAÇÃO DE BIFENILAS POLICLORADAS EM ÓLEOS DE TRANSFORMADOR ...63
3.1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ...64
3.2. MATERIAIS E MÉTODOS ...67
3.2.1. Materiais e reagentes ...67
3.2.2. Análise GCGC-FID e GCGC-ECD ...68
3.2.3 Quantificação de PCBS ...69
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO...69
3.3.1. Desenvolvimento de método para GCGC ...69
3.3.2. Seleção do set de colunas ...70
3.3.3. Quantificação das PCBs ...72
3.4. CONCLUSÕES PARCIAIS ...74
4. ESTUDO DE CASO II: CARACTERIZAÇÃO DO PERFIL VOLÁTIL DE NOVOS VINHOS BRASILEIROS ...75
4.1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ...76
4.2. MATERIAIS E MÉTODOS ...83
4.2.2. Materiais e reagentes ...84
4.2.3. Método de SPME ...84
4.2.4. Método GCGC-QMS. ...85
4.2.5. Identificação ...86
4.2.6. Análise quimiométrica baseada em pixels ...86
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO...86
4.3.1. Otimização do método SPME ...86
4.3.2. Perfil de compostos voláteis e semi-voláteis de vinhos ...98
4.3.3. Comparação das fibras de SPME por análise exploratória ...100
4.3.4. Análise discriminatória utilizando dados baseados em pixels e em tabelas de picos ...102
4.4. CONCLUSÕES PARCIAIS ...105
5. ESTUDO DE CASO III: AVALIAÇÃO DE LIXIVIÁVEIS NA INDÚSTRIA FARMACÊUTICA ...107
5.1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ...108
5.2. MATERIAIS E MÉTODOS ...111
5.2.1. Amostras e reagentes ...111
5.2.2. Perfil de lixiviáveis em solução nasal ...111
5.2.3. Método GCGC-MS...112
5.2.4. Análise de dados...112
5.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO...113
5.3.1. Avaliação de lixiviáveis em solução de droga nasal ...113
5.4. CONCLUSÕES PARCIAIS ...116
6. CONCLUSÕES GERAIS ...117
6.1. CONCLUSÕES GERAIS...118
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...119
CAPÍTULO 1:
1. Revisão Bibliográfica
1.1. Cromatografia Gasosa Multidimensional
A cromatografia gasosa (GC), técnica analítica utilizada para separar misturas baseada nas diferentes propriedades físico-química das moléculas que as compõem, foi introduzida em 1952 por James e Martins, que demonstraram o potencial da técnica ao realizar com sucesso a separação de ácidos graxos voláteis [4,8]. A popularização da técnica ocorreu principalmente após o desenvolvimento da tecnologia de colunas capilares, que permitiu separações com alta resolução cromatográfica [4,9]. O avanço tecnológico alcançado através da combinação do uso de colunas capilares com fases estacionárias altamente seletivas e do desenvolvimento de sistemas modernos de introdução e detecção de amostras levaram a técnica a ser adotada de modo rotineiro no mundo todo, sendo de extrema importância para diversas áreas da indústria e em pesquisa e desenvolvimento. Por apresentar grande importância analítica, é estimado que atualmente mais de 400.000 equipamentos de GC devem estar em operação por todo o mundo [4].
Embora a técnica apresente elevada capacidade de separação, análises de amostras que possuam um elevado número de compostos com ampla faixa de volatilidade – o caso de amostras de origem biológica, alimentos, bebidas, petróleo, entre outras – ainda não podem ser totalmente resolvidas. É estimado que a probabilidade de resolver todos os componentes em amostras complexas seja de 19 a 37%, variando de acordo com a complexidade da amostra e da pureza desejada [10]. Este cenário teve uma grande melhora com o segundo grande salto tecnológico da técnica de GC, a introdução da cromatografia gasosa multidimensional (MDGC). A MDCG é uma técnica de separação que emprega dois ou mais estágios diferentes de separação em uma única análise. Com a introdução de um estágio adicional de separação, a seletividade do sistema de separação é elevada, aumentando de forma sem precedentes o poder de resolução e capacidade de pico do sistema [4,10,11]. Este aumento no poder de separação também é resultante da conservação da resolução obtida em cada etapa de separação, utilizando para este fim interfaces que ficam localizadas entre as colunas cromatográficas [12,13].
Atualmente, o maior número de estudos envolvendo MDGC utiliza somente dois estágios de separação, sendo desta forma conhecida por Cromatografia Gasosa Bidimensional. A Cromatografia Gasosa Bidimensional pode ter dois modos de operação distintos: Cromatografia Gasosa de Frações Parciais (GC-GC) e Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GCGC). A grande distinção entre ambas as técnicas é a capacidade de pico do sistema: em GC-GC somente algumas frações da amostra passarão pela etapa secundária de
separação, enquanto em GCGC a amostra será integralmente analisada em ambas as dimensões de separação [10,12,13].
A GC-GC é uma técnica de MDGC que realiza uma etapa de separação adicional para algumas regiões-alvo da amostra analisada [14]. Desta forma, análises por GC-GC usualmente são realizadas após uma análise preliminar em cromatografia gasosa monodimensional (1D-GC). Se forem identificadas regiões de interesse analítico no cromatograma 1D-GC que apresentem coeluição de picos – ou que exista suspeita de coeluições - a GC-GC pode ser empregada [5,11]. Estas regiões de interesse serão então submetidas a etapa sequencial de separação.
A técnica de GC-GC emprega duas colunas capilares com fases estacionárias distintas acopladas em série (Figura 1.1) [14]. O uso de fases estacionárias de seletividades distintas é primordial para o aumento na capacidade de pico do sistema, como abordado no tópico 1.2. Também, para gerar o aumento da capacidade de pico é necessária a presença de uma interface de transferência. Esta interface geralmente fica posicionada entre as colunas cromatográficas e será responsável pela transferência das bandas eluídas pela coluna primária (1D) para a coluna secundária (2D).
Figura 1.1. Representação simplificada de um sistema típico de cromatografia gasosa multidimensional de frações parciais. Fonte autoral.
Assim, a análise por GC-GC será iniciada com a injeção da amostra no cromatógrafo do mesmo modo que em 1D-GC. A análise irá se comportar como 1D-GC até o momento da eluição da região de interesse. Neste período, a interface de transferência estará configurada de forma que o eluato da coluna primária seja direcionado a um capilar de restrição que, por sua vez, pode estar conectado com um detector (Figura 1.2a). Esta configuração é conhecida como modo bypass. A interface permanecerá no modo bypass até o momento de eluição da região de interesse. Então, a interface altera sua configuração para o modo injeção, fazendo com que as
bandas eluídas da 1D sejam direcionadas para a 2D, onde ocorrerá a segunda etapa de separação (Figura 1.2b). O processo de transferência permanecerá até que a região de interesse seja totalmente eluída pela 1D. Após o término da transferência da região de interesse, a interface volta a sua posição original (Figura 1.2a) [11,14].
Figura 1.2. Esquema de interface tipo “Deans Switch” para GC-GC representando os modos bypass (a) e injeção (b). Adaptado de Seeley, J. V.; Micyus, N. J.; Bandurski, S. V.; Seeley, S. K.; McCurry, J. D. Anal. Chem. 2007 79 1842 [1].
Ao realizar uma análise GC-GC, é estimada que a capacidade de pico (nGC-GC) que pode ser alcançada seja proporcional à capacidade de pico da coluna primária (n1) somada à capacidade de pico da coluna secundária (n2) multiplicada pelo número de frações que serão submetidas à análise sequencial (F) [11,13,14]:
nGC-GC = n1 + (n2 F)
Na GC-GC, a coluna secundária normalmente possui dimensões similares à de colunas utilizadas em análises 1D-GC - isto é, mesmo comprimento e diâmetro – e desta forma,
normalmente são operadas nas mesmas condições de temperatura e vazão de análises 1D-GC [2]. Como ambas colunas 1D e 2D possuem geometrias – e capacidade de pico – similares, o tempo de análise necessário em cada dimensão é um fator importante a ser considerado em GC-GC. O número de frações que serão submetidas à segunda etapa de separação também é um parâmetro importante: com o aumento no número de transferências realizadas, aumenta-se a probabilidade de ocorrência de misturas entre compostos que já haviam sido previamente separados. A mistura de bandas previamente separadas, entretanto, será aceitável se todos os analitos-alvo permanecerem separados [14].
O coração das técnicas cromatográficas bidimensionais reside nos dispositivos de transferência entre as colunas. Para GC-GC as interfaces de transferência podem ser classificadas em dois grupos distintos: acionamento direto e acionamento indireto. Ambas as interfaces utilizam válvulas para realizar a transferência, embora o modo de operação seja distinto. Interfaces baseadas em acionamento direto empregam uma válvula onde as colunas cromatográficas e o capilar de restrição serão conectadas. A transferência das bandas ocorrerá então através da mudança de posição da válvula. Já as interfaces baseadas em acionamento indireto utilizam um gás auxiliar que irá direcionar as bandas para a coluna secundária ou para o capilar de restrição. O gás auxiliar por sua vez será chaveado entre a 2D e o capilar de restrição por meio de uma válvula, que normalmente é imobilizada externamente ao forno cromatográfico [14].
O sistema GC-GC baseado em acionamento indireto foi descrito pela primeira vez no final dos anos 60 por Deans. Este sistema representou um grande avanço para a MDGC [15], especialmente pela localização da válvula responsável pelo chaveamento do gás auxiliar: ao lado de fora do forno cromatográfico. Com esta configuração, diversos problemas apresentados pelos sistemas de acionamento direto foram mitigados, como o limite térmico de operação, a formação de artefatos, o efeito de memória e o contato direto entre partes da válvula e os compostos da amostra. Além disso, outra grande vantagem desta interface é o alargamento mínimo das bandas cromatográficas [14].
As aplicações da técnica, de forma geral, envolvem três grandes áreas: (i) análises de petróleo e combustíveis; (ii) análises de fragrâncias e alimentos; e (iii) análises de contaminantes ambientais [14]. Por exemplo, Apps utilizou GC-GC para obter a separação de compostos responsáveis pelo aroma e sabor de plantas e alimentos a partir de plantas sul africanas (Figura 1.3) [10]. Embora as técnicas cromatográficas multidimensionais estejam em expansão, o número de artigos publicados utilizando a GC-GC é menor quando comparado com pesquisas envolvendo 1D-GC e GC-MS [14].
Figura 1.3. Cromatograma de um corte GC-GC-FID de óleo de tagetes. No detalhe em vermelho está apresentado parte do cromatograma 1D-GC da mesma amostra. O retângulo em cinza presente no detalhe destaca a região que foi escolhida para a análise sequencial. Retirado de Apps, P. J. Sep. Sci. 2006 29 2346 [2].
A introdução da GCGC representou um marco na história da cromatografia gasosa. Embora a técnica tenha sido proposta pela primeira vez por Giddings em 1984 [16], somente em 1991 foi apresentado o primeiro cromatograma GCGC por Liu e Philips [17]. O grande aspecto revolucionário da técnica é oriundo da amostra ser integralmente submetida à duas etapas sequenciais de separação com seletividades complementares [11,12,18]. Ainda, a possibilidade do acoplamento da técnica com sistemas seletivos de detecção ou outras técnicas de separação, como é o caso da MS por exemplo, torna a GCGC a técnica analítica mais poderosa de separação de compostos orgânicos voláteis e semi-voláteis. De fato, a capacidade de pico teórica (Figura 1.4) que pode ser alcançada utilizando GCGC (nGCGC), considerando n1 a capacidade de pico da coluna primária e n2 a capacidade de pico da coluna secundária é de
Figura 1.4. Representação teórica da capacidade máxima de pico para GCGC. Cada quadrado representa uma região do cromatograma no qual pode ser alocado um pico cromatográfico de uma série homóloga com um valor de resolução de 2,5. Adaptado de Murray, J. A. J. Cromatogr. A 2012 1261 59 [3].
O modo de operação da GCGC é similar ao descrito para GC-GC; a maior diferença entre as técnicas reside na interface que conecta as colunas capilares (Figura 1.5). Em GCGC as interfaces de transferência são conhecidas como moduladores, e são responsáveis pela transferência das bandas eluídas pela coluna primária para a coluna secundária de forma periódica e contínua durante toda a análise cromatográfica [10,18]. Este processo é conhecido como modulação. Em GCGC a duração de um ciclo completo de modulação é chamada de período de modulação (PM). A seleção do PM dependerá da identidade da amostra a ser analisada e da razão de modulação (MR) que ele irá fornecer, conforme detalhado na seção 1.3. A MR irá determinar quantos ciclos de modulação irão ocorrer para cada banda eluída pela 1D, e pode ser obtida a partir da razão entre a largura dos picos eluídos pela 1D (1Wb) e o PM:
𝑀𝑅 = 𝑊𝑏 1
𝑃𝑀
Figura 1.5. Representação simplificada de um sistema típico de GC×GC. Fonte autoral.
Para que a resolução de cada etapa de separação seja conservada, é aconselhável que o PM selecionado forneça valores de MR entre 3 e 4: valores de MR < 2 podem resultar em sub-amostragem, podendo levar a prejuízos na resolução obtida na separação da 1D [19]. Por exemplo, se a duração do PM for muito maior do que o tempo total de eluição de uma banda – i.e. a largura de base dos picos - então bandas diferentes que já haviam sido separadas na 1D podem voltar a se misturar no modulador [20]. Fatores relacionados com a qualidade das análises quantitativas, como precisão e exatidão, também podem ser prejudicados. Valores de MR 4, por outro lado, levam a amostragens excessivas. Embora amostragens excessivas não levem à perdas na separação da 1D, a redução no PM reduz também o tempo de análise da coluna secundária [20]: idealmente, o tempo de separação na 2D é igual ao PM.
Em GCGC, as separações na coluna secundária ocorrem de forma rápida e eficiente. Idealmente devem ocorrer no intervalo de duração do PM para evitar a presença de picos fora de fase, i.e. picos que levam mais de um PM para serem eluídos, prevenindo assim que ocorram coeluições com bandas oriundas de modulações subsequentes [21,22]. Desta forma, as colunas 2D são mais curtas, sendo operadas em condições de fast ou ultrafast GC [23].
A forma de apresentação dos cromatogramas obtidos em GCGC é similar ao formato dos cromatogramas tradicionais de 1D-GC. Os dados obtidos são apresentados em um plano de retenção bidimensional, com ambos os eixos de abscissa e ordenada sendo os tempos de retenção das colunas 1D e 2D, respectivamente [11,24]. Para a visualização dos dados obtidos neste plano de retenção bidimensional, um software apropriado utiliza o PM e a taxa de aquisição do detector para gerar o cromatograma que pode ser visualizado de forma tridimensional ou, mais comumente, na forma de diagrama de cores (Figura 1.6) [3,24].
Figura 1.6. Representação da obtenção de dados e dos cromatogramas GCGC: (a) bandas eluídas por uma coluna primária e sequencialmente fatiadas em diversas frações para um PM específico. O número de “cortes” ou “fatias” de cada banda será igual a MR; (b) a resposta do detector é então plotada com base no PM como diagrama de contorno ou (c) de forma tridimensional. Adaptado de Meinert, C.; Meierhenrich, U. J. Angew. Chem. Int. Ed. 2012 51 10462 [4].
Além do aumento na capacidade de pico do sistema cromatográfico, a GCGC também apresenta outras vantagens: o aumento da relação sinal/ruído (S/N), efeito observado sobretudo quando há focalização das bandas durante a modulação [25]; e a obtenção de cromatogramas estruturados – i.e. a separação dos compostos é obtida de forma ordenada - [4,11], resultado da maior dimensionalidade da técnica. O termo “dimensionalidade” foi introduzido por Giddings em 1995, que definiu os conceitos de dimensionalidade de sistema e de amostra [26]: a dimensionalidade do sistema representa o número de mecanismos de separação que uma determinada fase estacionária é capaz de explorar na separação de uma determinada amostra. A dimensionalidade da amostra, por sua vez, pode ser determinada com base no número de
parâmetros – ou mecanismos de separação - necessários para resolver todos constituintes da amostra [3].
Uma separação é considerada ordenada se a dimensionalidade do sistema é igual ou maior que a dimensionalidade da amostra [3]. Por exemplo, um cromatograma 1D-GC de uma mistura de n-alcanos é considerado ordenado pois os n-alcanos podem ser separados unicamente por sua volatilidade e, baseado na ordem de eluição do cromatograma, cada n-alcano pode ser identificado (Figura 1.7). Em separações multidimensionais, a amostra pode ser separada por múltiplos mecanismos, resultado da combinação das diferentes fases estacionárias, o que eleva de maneira significativa a dimensionalidade do sistema [4,11,26].
Figura 1.7. Exemplo de cromatograma 1D-GC ordenado de amostra de n-alcanos. Adaptado da Restek [27].
Se na mistura de n-alcanos outros compostos forem adicionados, como por exemplo alcanos ramificados e hidrocarbonetos aromáticos, a dimensionalidade da amostra passa a exceder a dimensionalidade do sistema para 1D-GC [11,28]. Desta forma, a ordem de eluição dos compostos não irá mais ser capaz de fornecer informações sobre a natureza química de um analito em particular. A GCGC, por outro lado, permite a obtenção de cromatogramas estruturados mesmo para misturas complexas. Assim, em um cromatograma GCGC a separação entre alcanos e compostos aromáticos é facilmente visualizada (Figura 1.8). Ainda, é possível observar estruturações dentro de uma mesma classe de compostos: os compostos aromáticos, por exemplo, podem ser agrupados de acordo com o número de anéis aromáticos.
Cabe destacar que a obtenção de cromatogramas estruturados em GCGC não se limita à combinações específicas de colunas, sendo encontrados tanto em combinações tradicionais de colunas (i.e. apolar polar), quanto em combinação reversa de colunas (i.e. polar apolar) [3]. Devido as vantagens apresentadas, a GCGC vem se tornando uma técnica separação cada vez mais adotada pela comunidade científica, com aplicações nas mais diversas áreas, como análises clínicas, forenses, ambientais, petroleômica, fragrâncias, alimentos, entre outras [10,29,30]. O alto número de artigos publicados anualmente em GCGC mostra o potencial da técnica vir a substituir a GC convencional e se transformar numa técnica de rotina no futuro.
Figura 1.8. Exemplo de cromatograma GCGC de diesel usando combinação de colunas apolar polar. Isômeros se alinham em bandas diagonais e grupos congêneres ou homólogos aparecem como bandas separadas. Retirado de Meinert, C.; Meierhenrich, U. J. Angew. Chem. Int. Ed. 2012 51 10462 [4].
1.2. Ortogonalidade
O aumento na separação das amostras ocorre com a combinação de fases estacionárias ortogonais entre si, ou seja, fases estacionárias com diferentes mecanismos de retenção. Uma separação é considerada verdadeiramente ortogonal se a informação cruzada entre ambas as dimensões é zero – ou seja, o mecanismo de retenção das moléculas em cada coluna deve ser independente [4].
Como os mecanismos de interação entre dois compostos são limitados, as separações em GCGC se correlacionam necessariamente em algum nível, mesmo empregando colunas com fases estacionárias distintas [31]. A minimização das informações cruzadas leva a uma maior ocupação do espaço cromatográfico pelos constituintes da amostra, aumentando a capacidade de pico do sistema [4,32]. Por outro lado, um alto grau de correlação entre as fases estacionárias pode reduzir uma separação multidimensional a uma separação unidimensional [32]. Assim, para que o sistema apresente ortogonalidade, também é necessário realizar ajustes no processo de separação de forma que ocorra o cancelamento, ou minimização, das informações cruzadas [25]. Diversas estratégias podem ser utilizadas para ajustar o processo de separação em GC, mas a forma mais fácil – e mais empregada - de realizar este ajuste é controlando a temperatura de separação.
Por exemplo, os membros de uma série homóloga apresentam os mesmos grupos funcionais, de forma que a interação entre os analitos e as diversas fases estacionárias será similar. Neste caso, a diferença na retenção dos constituintes da série irá variar somente em função da sua volatilidade [25]. Como somente a volatilidade irá separar os constituintes de uma série homóloga, separações isotérmicas realizadas em qualquer fase estacionária serão correlacionadas: uma substância mais volátil terá menor retenção em quaisquer fases; uma substância menos volátil terá maior retenção em qualquer fase (Figura 1.9a). Desta forma, separações isotérmicas apresentam alta correlação entre as dimensões, o que reduz a ortogonalidade do sistema [25,32].
Uma forma de ajustar as condições de separação é fazer com que a temperatura de separação da 2D seja progressivamente elevada em função do progresso da corrida da coluna primária (i.e., programação de temperatura). Com o aumento progressivo da temperatura, ocorrerá a eliminação do efeito da volatilidade na separação que ocorrerá na 2D [32]. Desta forma, todos os membros de uma série homóloga apresentarão retenção constante na coluna secundária, como observado na Figura 1.9b.
Por exemplo, assumindo uma combinação apolar polar de colunas e considerando que os efeitos de volatilidade são excluídos na 2D pela programação de temperatura, a separação na 2D ocorrerá somente baseada na diferença de polaridade dos compostos (Figura 1.9c). Desta forma, mesmo que membros de séries homólogas distintas apresentem coeluição na 1D, eles podem ser separados na segunda dimensão, desde que possuam polaridades diferentes (Figura 1.9d). Assim, a separação em cada coluna será independente e as duas dimensões são consideradas ortogonais [25].
Figura 1.9. Simulação da retenção de compostos para GCGC empregando isoterma em ambas as dimensões (a); isoterma na 1D e temperatura programada na 2D (b); temperatura programada em ambas as dimensões (c); e temperatura programada em ambas as dimensões com três séries homólogas (d). Retirado de Phillips, J. B.; Beens J. J. Cromatogr. A 1999 856 334.
1.3. Modulação
A modulação é intermediada por um modulador, e ocorrerá de forma periódica e contínua durante toda a análise cromatográfica. A modulação deve ocorrer da forma mais rápida e eficiente o possível. Alguns parâmetros podem ser utilizados como forma de avaliação do desempenho da modulação, como o ciclo de trabalho e a capacidade de pico resultante do sistema [19].
Ciclo de trabalho pode ser definido como a fração da amostra que é transferida da coluna primária para a coluna secundária. Por exemplo, um modulador que é capaz de transferir integralmente todo o eluato da 1D para a 2D tem um ciclo de trabalho igual a 1,0, operando de forma abrangente [19,33]. Moduladores com ciclo de trabalho abrangente apresentam grande
vantagem frente a moduladores com ciclos de trabalho baixos pois apresentam detectabilidade aumentada e, também, alta S/N.
A capacidade de pico (nc) do sistema bidimensional também pode ser utilizada como parâmetro para avaliar o processo de modulação. A nc para cada etapa de separação, considerando uma unidade de resolução (Rs = 1), pode ser definida como a razão entre o tempo total de separação da etapa e a largura de base média dos picos:
𝑛𝑐 = 𝑡 𝑖 𝑤𝑏 𝑖
onde it é o tempo total de separação para a i-ésima etapa de separação e iwb é a largura de base para a i-ésima etapa de separação. Para uma separação bidimensional abrangente, considerando o tempo de separação na 2D igual ao PM tem-se que
𝑛𝑐,2𝐷 = 𝑡 1 𝑤𝑏 𝑖 × 𝑡 2 𝑤𝑏 2 = 𝑡 1 𝑤𝑏 1 × 𝑃𝑀 𝑤𝑏 2
Desta forma, a máxima capacidade de pico para um sistema 2D é alcançada com a minimização das larguras de base dos picos em ambas as dimensões. Se o modulador for capaz de transferir as bandas na forma de pulsos estreitos, largura de base na separação na 2D será minimizada. Assim, a máxima capacidade de pico que pode ser obtida numa separação 2D dependerá essencialmente do modulador. Cabe destacar que, embora a equação acima seja uma boa estimativa da capacidade de pico de um sistema bidimensional, a equação é uma simplificação do cálculo de capacidade de pico, que deve levar em consideração o efeito deletério causado pela amostragem lenta dos picos da primeira dimensão e a razão de fases das colunas selecionadas [44].
Os moduladores podem ser classificados em duas classes: moduladores térmicos e moduladores pneumáticos. Moduladores térmicos utilizam diferença de temperatura para aprisionar as bandas eluídas pela 1D e posteriormente injetá-las na coluna 2D. Estes moduladores podem utilizar aquecimento ou fluídos criogênicos para realizar a modulação. Os moduladores pneumáticos, por sua vez, podem ser do tipo acionamento direto ou indireto. Moduladores de acionamento direto utilizam válvulas para realizar a modulação, enquanto moduladores de acionamento indireto utilizam um gás auxiliar para direcionar as bandas eluídas da coluna primária a coluna secundária.
O primeiro modulador desenvolvido para GCGC foi introduzido em 1991 por Liu e Phillips, o modulador de dessorção térmica de dois estágios (TDM) [17]. Na configuração proposta, o segmento inicial da coluna secundária é mantido do lado de fora do forno cromatográfico (Figura 1.10). Conforme as bandas da coluna 1D são transferidas para a coluna 2D, que está em temperatura ambiente, é gerada uma focalização por conta da redução da temperatura em relação ao forno cromatográfico. Após o tempo de focalização, um pulso elétrico é acionado, levando ao aquecimento do primeiro segmento do modulador. Este aquecimento dessorve rapidamente as bandas, terminando o primeiro estágio de modulação. Este processo se repetirá no segundo segmento do modulador. Embora este tipo de modulador tenha sido capaz de realizar modulação de forma abrangente, fatores como reprodutibilidade e robustez limitavam o uso do TDM, fazendo com que eles fossem preteridos por moduladores criogênicos.
Figura 1.10. Representação de um modulador de dessorção térmica de dois estágios. A e B se referem à 1D e 2D, respectivamente. C representa o segmento da 2D localizado fora do forno cromatográfico. L1, L2 e L3 são condutores elétricos que permitem que a corrente elétrica flua alternativamente entre o primeiro estágio (S1) e o segundo estágio (S2) do modulador. Retirado de Edwards, M.; Mostafa, A.; Górecki, T. Anal. Bioanal. Chem. 2011 401 2339 [5].
Marriott e Kinghorn introduziram o primeiro modulador criogênico, o sistema criogênico longitudinalmente modulado (LMCS) [34]. O modulador proposto empregava um dispositivo móvel de aprisionamento criogênico, que continha uma câmara resfriada por CO2. Este dispositivo era responsável por resfriar o início da coluna secundária, focalizando as bandas eluídas pela coluna 1D. Posteriormente o dispositivo se movia, expondo esta região resfriada ao calor do forno cromatográfico, o que levava a rápida dessorção das bandas cromatográficas [34].
O sistema proposto se destacou pelo grande aumento na razão S/N, resultado da alta eficiência de focalização das bandas [5]. Também, o modulador proposto poderia ser empregado na separação de compostos de alta e de baixa volatilidade, embora não em uma única análise [33]. As maiores limitações encontradas estavam relacionadas à remobilização de compostos de alta massa molecular; também, o emprego de partes móveis aumentava a probabilidade de quebras, o que reduzia seu tempo de trabalho [5,33].
Atualmente, os moduladores criogênicos utilizam sistemas compostos por jatos de nitrogênio resfriado e aquecido [33]. Nestes moduladores, as bandas eluídas pela 1D que alcançam o começo da coluna 2D são aprisionadas através de um jato frio, que é incidido diretamente sob a coluna cromatográfica (Figura 1.11). Posteriormente, um jato de ar quente é acionado e as bandas serão rapidamente dessorvidas. Tipicamente, o número de jatos pode variar entre dois e quatro – isto é, um jato frio e um jato quente ou dois jatos frios e dois jatos quentes - [5,35]. CO2 líquido ou N2 líquido podem ser utilizados para gerar os jatos frios. Entretanto, N2 líquido é usualmente mais adotado por apresentar maior eficiência de aprisionamento, sobretudo para compostos altamente voláteis, como compostos C5 e C6 [5].
Figura 1.11. Representação do modo de operação de um modulador criogênico de dois estágios (quadjet). Nesta figura ilustra-se duas modulações sequenciais. O jato resfriado (em azul) aprisiona as bandas eluídas pela 1D. As bandas são então transferidas para a 2D através da dessorção causada pela incidência de um jato aquecido (em vermelho). Retirado de Hantao, L. W. Aplicação de métodos quimiométricos na investigação do metaboloma de eucalipto por técnicas cromatográficas multidimensionais hifenadas à espectrometria de massas. Tese – UNICAMP. Campinas, 2014.
n
1D 2D
Embora sistemas GCGC empregando moduladores criogênicos apresentem alta eficiência, a técnica possui alto custo operacional devido ao consumo de fluídos criogênicos, limitando a propagação da técnica e sua adoção em análises de rotina [36]. Por exemplo, é estimado que um sistema GCGC empregando modulador criogênico consome cerca de 30 litros de N2 líquido por dia [5], fazendo com que a conversão do sistema 1D-GC em GC×GC gere um gasto com consumíveis de cerca de R$ 3.000,00 mensais.
Neste contexto, uma alternativa mais econômica aos moduladores criogênicos são os moduladores pneumáticos. Os primeiros moduladores pneumáticos utilizavam válvulas do tipo diafragma. Bruckner et al. [37] introduziram em 1998 um modulador composto por uma válvula diafragma de baixo volume morto, onde as colunas cromatográficas eram acopladas. Durante a etapa de transferência das bandas para a coluna 2D, a válvula ficava posicionada de forma que o efluente da coluna 1D fosse direcionado para a coluna 2D (Figura 1.12a). Após a transferência das bandas, a válvula mudava de direção e o efluente da 1Dera direcionado para exaustão (Figura 1.12b). O modulador proposto foi empregado com sucesso em análises de determinação de hidrocarbonetos aromáticos em combustíveis de aviação e nafta, apresentando atributos como boa repetibilidade e sendo capaz de gerar picos bastante estreitos [33,38]. Entretanto, o modulador apresentava duas grandes limitações: (i) o baixo ciclo de trabalho do sistema causava perdas significativas, sendo inadequado para análises em concentrações traço; (ii) o limite térmico de operação da válvula diafragma restringia sua aplicabilidade [19]. Estas limitações fizeram com que esses sistemas fossem preteridos para os sistemas empregando moduladores pneumáticos de acionamento indireto, ou moduladores de fluxo diferencial.
Figura 1.12. Representação de um modulador de válvula. Em (a) o efluente da coluna primária é direcionado para a coluna secundária enquanto o gás auxiliar é direcionado para a exaustão; enquanto em (b) o efluente da coluna primária é direcionado para a exaustão enquanto o gás auxiliar é direcionado para a separação na coluna secundária. Adaptado de Edwards, M.; Mostafa, A.; Górecki, T. Anal. Bioanal. Chem. 2011 401 2344 [5].
O primeiro modulador com fluxo diferencial foi introduzido em 2000 por Seeley [6]. A interface proposta também utilizava uma válvula diafragma, porém, apresentava duas mudanças significativas na sua configuração: a presença de uma alça de amostragem e a localização da válvula. A alça de amostragem gerou um aumento no ciclo de trabalho do modulador, sendo capaz de transferir uma maior fração do efluente da coluna primária para a secundária [6,33]. O segundo aprimoramento foi a localização da interface, fora do forno cromatográfico (Figura 1.13), o que permitia análises em maiores temperaturas. A válvula entretanto era mantida em blocos de aquecimento para evitar a redução da mobilidade das bandas [6]. O modulador proposto operava em duas etapas: coleta e reinjeção. Durante a coleta, a válvula direcionava o efluente da coluna 1D para a alça de amostragem. Na próxima etapa, a reinjeção, o gás auxiliar injetava o conteúdo da alça de amostragem para a coluna secundária. Este tipo de modulador utilizava altas vazões de gás auxiliar para assegurar a injeção de bandas estreitas e uma separação rápida na 2D: tipicamente, as vazões de gás auxiliar são cerca de 20 vezes maior que a vazão de gás de arraste.
Figura 1.13. Representação esquemática do sistema GCGC empregando modulador com fluxo diferencial proposto por Seeley et al. Adaptado de Seeley, J. V.; Kramp, F.; Hicks, C. J. Anal. Chem. 2000 72 4347 [6].
Com as modificações propostas por Seeley, o sistema foi capaz de produzir picos de largura similar aos obtidos por sistemas empregando moduladores criogênicos. Também, o ciclo de trabalho aumentou de forma significativa em relação aos primeiros moduladores baseados em válvulas diafragma: de 10% para aproximadamente 80% [39]. Entretanto, este tipo de modulador ainda apresentava limitações: a alta vazão de gás auxiliar impediria o uso de colunas microbore devido a alta pressão necessária para gerar esta vazão de gás [5]. Também, embora a localização da válvula tenha levado a um maior limite térmico de operação, misturas complexas que apresentavam constituintes de baixa volatilidade não poderiam ser efetivamente modulados devido à redução na mobilidade causada pela baixa temperatura em que a válvula se encontrava [5].
A popularidade dos moduladores com fluxo foi alavancada em 2006, quando Seeley introduziu um dispositivo capaz de transferir 100% do eluato da coluna primária para a coluna secundária [1]. Na configuração proposta, o acionamento pneumático é realizado de forma indireta, evitando o contato direto das bandas eluídas com a válvula. Desta forma, a restrição de temperatura máxima imposta pela válvula foi mitigada, sendo uma grande vantagem apresentada por este tipo de modulador. Assim, a vazão de gás auxiliar é a única responsável pelo direcionamento das bandas da coluna 1D para a coluna 2D. O chaveamento do gás auxiliar, por sua vez, era realizado por uma válvula do tipo solenoide. Nesta interface, as colunas de separação, a alça de amostragem e as colunas responsáveis pela alimentação do gás auxiliar foram conectadas utilizando uniões em T. O modulador proposto foi empregado com sucesso
na análise de combustíveis, apresentando largura de pico similar aos obtidos por moduladores criogênicos.
Atualmente, com o desenvolvimento da tecnologia microfluídica, muitos moduladores com fluxo empregam interfaces microfluídicas de baixo volume morto. Estas interfaces levam ao alargamento mínimo das bandas cromatográficas [5], sendo uma alternativa interessante em relação aos moduladores criogênicos em termos de capacidade de pico e resolução, além de apresentarem custo operacional reduzido. A primeira geração de moduladores com fluxo diferencial utilizando tecnologia microfluídica operava em modo concorrente (ou forward fill/flush - FFF). Como observado na Figura 1.14b, o modo concorrente se caracteriza pelo sentido da vazão de gás auxiliar no momento da reinjeção, que é igual ao sentido de preenchimento do canal de amostragem.
Figura 1.14. Modulador com fluxo diferencial operando em modo concorrente (forward fill/flush - FFF), demonstrando a etapa de coleta (a); a etapa de reinjeção (b). A seta preta representa a vazão da coluna primária e a seta laranja a vazão do gás auxiliar.
Na modulação com fluxo é necessário que o tempo máximo da fase de coleta seja precisamente conhecido, evitando que ocorra sobrecarga no canal de amostragem. O tempo mínimo de reinjeção também deve ser conhecido para assegurar que todo o conteúdo presente no canal de amostragem seja transferido para a coluna secundária [36]. A utilização de tempos de coleta e reinjeção inadequados podem fazer com que não ocorra retorno à linha base entre modulações consecutivas, acarretando em perdas de resolução [7,40,41]. Desta forma, é importante que os PM sejam reduzidos para preservar a resolução do sistema. Na prática, foi observado que sistemas empregando moduladores com fluxo do tipo FFF apresentavam largura
de base muito maior que os valores previstos mesmo empregando PM adequados. Este efeito se torna substancialmente maior quando maiores concentrações de amostra são injetadas [40].
Em 2012, Griffith et al. introduziram uma variação deste modulador, operando em modo contracorrente (ou reverse fill/flush - RFF) [7]. No modulador proposto por Griffith, o sentido da vazão de gás auxiliar no momento da reinjeção é oposto ao de preenchimento da alça de amostragem (Figura 1.15). Além do sentido da vazão de gás auxiliar na reinjeção, o modulador proposto por Griffith apresentava um capilar de restrição, responsável pelo controle da vazão no capilar de amostragem [7].
Figura 1.15. Modulador com fluxo diferencial operando em modo contracorrente (reverse fill/flush – RFF) durante (a) a etapa de coleta e em (b) a etapa de reinjeção. Adaptado de Griffith, J.F.; Winniford, W.L.; Sun, K.; Edam, R.; Luong, J.C. J. Chromatogr. A 2012 1226 116 [7].
A presença da alça de amostragem nos moduladores RFF permitem a utilização de maiores valores de PM sem deteriorar a qualidade da modulação e consequentemente a separação na 2D. Também, a inversão do sentido da vazão no momento da reinjeção leva a minimização da transferência de bandas não moduladas para a coluna secundária durante a coleta [36]: se ocorrer sobrecarga da alça de amostragem, as bandas não moduladas são direcionadas para o capilar de restrição limitando a contribuição do alargamento no espaço (Figura 1.15a). Neste sistema, o capilar de restrição de alta impedância controla a vazão da coluna primária e alça de amostragem [7]. Já a vazão gerada na 2D será inversamente proporcional à sua impedância relativa em relação ao capilar de restrição. Como observado na Figura 1.16, os moduladores do tipo RFF apresentam maior simetria de pico e menor formação de caudas nos picos quando comparados com os moduladores do tipo FFF. Este efeito é pronunciado sobretudo para amostras mais concentradas. As vantagens apresentadas por esses
