UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS FÍSICAS E MATEMÁTICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
RICARDO RAMPANELLI
SENSOR ELETROQUÍMICO PARA ÁCIDO FÓLICO EM AMOSTRAS ALIMENTÍCIAS UTILIZANDO UM COMPÓSITO DE NANOTUBOS DE
CARBONO E HIDRÓXIDO DE NÍQUEL
Florianópolis Julho/2019
RICARDO RAMPANELLI
SENSOR ELETROQUÍMICO PARA ÁCIDO FÓLICO EM AMOSTRAS ALIMENTÍCIAS UTILIZANDO UM COMPÓSITO DE NANOTUBOS DE
CARBONO E HIDRÓXIDO DE NÍQUEL
Relatório apresentado ao Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito parcial da disciplina de Estágio Supervisionado II (QMC 5512).
_____________________________________________ Orientador: Prof.a Dra. Cristiane Luisa Jost
_____________________________________________ Coorientador: Me. João Paulo Winiarski
Florianópolis Julho/2019
Dedico este trabalho a minha
família.
AGRADECIMENTOS
Com certeza, em toda jornada percorrida acumulamos muitos momentos e sentimentos. Sejam estes, alegres, eufóricos, tristes, apaixonantes, angústias, superações ou conquistas. Em todos eles sempre tiveram algum ombro amigo, um amparo, um abraço ou uma palavra para acolher, e a todos que participaram desta jornada ao meu lado quero transmitir meus mais profundos agradecimentos. Todos vocês foram demasiadamente importantes para mim. Cada pessoa que fez parte desta etapa, seja corpo técnico, auxiliares, pessoal terceirizado, ou ainda, os que muito brevemente passaram por minha vida, no corredor, numa turma, no centro acadêmico ou em uma festa, obrigado!
Sobretudo, agradeço meus pais e meus irmãos, que são sem sombra de dúvidas, meu ponto de equilíbrio. Meu pai pela sensatez, toda vez que necessitei de um conselho. Minha mãe pelo amor, uma ligação e resolvia qualquer fosse meu medo. Meus irmãos, Lauri, que me incitou independência; e Rafael, que me ensinou persistência, sempre foram motivo de admiração e parceria. Agradeço a minha namorada Júlia, que participou intensivamente e foi espectadora e protagonista de diversas conquistas nesta etapa. E ao meu grande amigo, irmão de vida, Sulivan, que muito esteve comigo em diversos momentos e fases de minha vida, participou de muitas lutas e conquistas, nunca importou a distância, ocasião ou qualquer coisa que fosse, é uma pessoa com quem sempre pude contar para o que quer que seja!
Em seguida, agradeço meu grupo de pesquisa, em especial meu coorientador João, por toda dedicação e persistência, por ter me impulsionado a chegar até aqui, a minha orientadora Cris, pelo trabalho realizado maravilhosa e exemplarmente bem, e aos demais amigos Ray, Edinho, Caio, Paola, Giles, Everton, Marília, Fran e Daniel, pelos momentos juntos e pelo conhecimento trocado. Tem um pouquinho de cada um de vocês nesse trabalho.
Agradeço também à professora Dani e ao colega Jean por cederem os nanotubos de carbono que foram utilizados neste trabalho.
Por fim agradeço a UFSC pelo acolhimento, aos meus queridos professores e professoras, aos quais são tantos (comecei a escrever os nomes), e só então percebi como, sem exceção, todos marcaram de alguma forma e contribuíram na construção de minha formação profissional. E ainda a todos os colegas que tive o prazer de conviver esses anos.
Meu objetivo é gerar tanto
resultado que transborde as pessoas
a minha volta.
RESUMO
O ácido fólico, também conhecido como vitamina B9, é essencial para o funcionamento e
produção de células saudáveis. Por ser uma vitamina que não pode ser armazenada no corpo humano, várias estratégias são utilizadas para o combate de doenças relacionadas à ausência dessa vitamina. Alimentos são fortificados com ácido fólico e ferro, por exemplo, para prevenir essas deficiências. Dessa maneira, um novo método voltamétrico foi desenvolvido para a determinação de ácido fólico em matrizes alimentícias com o intuito de verificar o controle de qualidade desse analito em alimentos fortificados. Utilizando um material compósito de nanotubos de carbono funcionalizados e decorados com hidróxido de níquel(II) (f-MWCNT/Ni(OH)2), criou-se uma nova arquitetura
eletródica. Juntamente com um polímero do tipo silsesquioxano, conhecido como Si4Pic+Cl−, pela primeira vez, utilizou-se do mesmo para a dispersão do compósito. O
material resultante (f-MWCNT/Ni(OH)2-Si4Pic+Cl−) foi aplicado na modificação de um
eletrodo de carbono vítreo e foi caracterizado por espectroscopia de impedância eletroquímica. Utilizando a voltametria de pulso diferencial com os parâmetros otimizados, foram construídas curvas de calibração na faixa 0,5 a 26 mol L−1. Os limites
de detecção e quantificação obtidos foram de 0,095 e 0,3 mol L−1, respectivamente. O
sensor proposto apresentou-se útil à quantificação de ácido fólico em amostras reais de suplemento vitamínico, fortificante de farinhas e farinha de trigo. Medidas comparativas foram realizadas pelo método espectrométrico, identificando-se concordância entre os dados. Desta forma, a nova plataforma eletródica GCE/f-MWCNT/Ni(OH)2-Si4Pic+Cl−
se mostra promissora para a determinação de ácido fólico e emprego em protocolos de análise de rotina em indústrias.
Palavras-chave: ácido fólico, nanotubos de carbono, hidróxido de níquel (II),
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Estrutura química do cloreto de 3-n-propil(4-metilpiridínio) silsesquioxan 17 Figura 02: Classificação dos tipos de CNTs. --- 18 Figura 03: Esquema de Funcionalização e Decoração de CNTs. --- 18 Figura 04: Esquema de dispersão dos nanotubos de carbono em silsesquioxano e o gotejamento da dispersão no eletrodo de carbono vítreo. --- 24 Figura 05: Espectroscopia de impedância eletroquímica para: ● GCE eletrodo não
modificado, ►GCE/Si4Pic+Cl−; ◄ GCE/f-MWCNT-Ni(OH)
2-Si4Pic+Cl− (3 µL);
▲ GCE/f-MWCNT-Ni(OH)2-Si4Pic+Cl− (4 µL); ▼ GCE/f-MWCNT-Ni(OH)2
-Si4Pic+Cl− (5 µL) em solução de KCl 0,1 mol L−1 contendo 5,0 mmol L−1
[Fe(CN)6]4−/3−. O potencial aplicado foi de 0,245 V vs. Ag/AgCl. --- 28
Figura 06: Voltamogramas cíclicos para 30 µmol L−1 de FA utilizando diferentes
arquiteturas eletródicas. --- 29 Figura 07: (A) Efeito do pH no comportamento eletroquímico do FA 5 µmol L−1 (B)
Distribuição das diferentes espécies no meio e (C) Estruturas químicas referentes às espécies verificadas no diagrama de espécies. --- 30 Figura 08: Efeito da concentração do eletrólito de suporte sobre o comportamento eletroquímico do FA. --- 32 Figura 9: (A) Variação da corrente com a velocidade de varredura para o FA. (B) Gráfico do log i versus log v. --- 33 Figura 10: Relação entre potencial de pico de oxidação e o logaritmo da velocidade de varredura. --- 34 Figura 11: Reação de oxidação do FA no GCE/f-MWCNT/Ni(OH)2-Si4Pic+Cl−. --- 34
Figura 12: Voltamogramas de FA 10 µmol L−1 sobre GCE/f-MWCNT/Ni(OH) 2
-Si4Pic+Cl− em tampão PBS 0,1 mol L−1 pH 7,0 em diferentes técnicas
eletroanalíticas. --- 35 Figura 13: Voltamogramas de FA 10 µmol L-1 sobre GCE/f-MWCNT/Ni(OH)
2
-Si4Pic+Cl− em tampão PBS 0,1 mol L−1 pH 7,0 variando os parâmetros de (a)
Figura 14: (A) Voltamogramas de pulso diferencial para diferentes concentrações de FA e a (B) curva de calibração obtida em tampão PBS 0,1 mol L−1 (pH = 7,0) --- 38
Figura 15: Voltamogramas de pulso diferencial e curvas de adição de padrão para as amostras de (A) suplemento de FA; (B) fortificante de farinha de trigo e (C) farinha de trigo --- 40
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Tabela 01: Níveis de fortificação de farinhas com FA em países com programas de fortificação. --- 14 Tabela 02: Parâmetros analíticos da curva de calibração para o FA utilizando o
GCE/f-MWCNT/Ni(OH)2-Si4Pic+Cl− --- 38
Tabela 03: Comparação das diferentes arquiteturas eletródicas para determinação de FA. --- 38 Tabela 04: Determinação de FA em três diferentes matrizes utilizando o método voltamétrico e o método espectrométrico. --- 40
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária;
CMEs - Eletrodos quimicamente modificados (do inglês, chemically modified electrode); CNTs - Nanotubos de carbono (do inglês, carbon nanotubes);
CV - Voltametria cíclica (do inglês, cyclic voltammetry);
DPV - Voltametria de pulso diferencial (do inglês, differential pulse voltammetry); EIS - Espectroscopia de impedância eletroquímica (do inglês, electrochemical impedance
spectroscopy);
Ep - Potencial de pico;
FA - Ácido fólico (do inglês, folic acid);
f-MWCNT/Ni(OH)2 - Nanotubos de carbono de carbono de múltiplas paredes
funcionalizados decorados com hidróxido de níquel II;
f-MWCNT/Ni(OH)2-Si4Pic+Cl− - Nanotubos de carbono de carbono de múltiplas paredes
funcionalizados decorados com hidróxido de níquel II disperso em cloreto de 3-n-propil(4-metilpiridínio) silsesquioxano;
f-MWCNTs - Nanotubos de carbono de carbono de múltiplas paredes funcionalizados (do inglês, functionalized multi-walled carbon nanotubes);
GCE - Eletrodo de carbono vítreo (do inglês, glassy carbon electrode);
GCE/f-MWCNT/Ni(OH)2-Si4Pic+Cl− - Eletrodo de carbono vítreo modificado com
nanotubos de carbono de carbono de múltiplas paredes funcionalizados decorados com hidróxido de níquel II disperso em cloreto de 3-n-propil(4-metilpiridinio) silsesquioxano; HPLC - Cromatografia liquida de alta eficiência (do inglês, high performance liquid
chromatography);
LoQ - Limite de quantificação (do inglês, limit of quantification);
LSV - Voltametria de varredura linear (do inglês, linear sweep voltammetry);
MWCNTs - Nanotubos de carbono de múltiplas paredes (do inglês, multi-walled carbon
nanotubes);
PBS - Solução tampão fosfato (do inglês, phosphate buffer solution); Si4Pic+Cl− - Cloreto de 3-n-propil(4-metilpiridínio)silsesquioxano;
SWCNTs - Nanotubos de carbono de parede simples (do inglês, single-walled carbon
nanotubes);
SUMÁRIO
1 Introdução ... 12
2 Revisão da Literatura ... 13
2.1 A importância da detecção e quantificação de ácido fólico em matrizes alimentícias ... 13
2.2 Métodos e técnicas analíticas utilizados na determinação de vitaminas ... 14
2.2.1 Voltametria ________________________________________________ 15 2.3 Eletrodos quimicamente modificados e nanomateriais aplicados na eletroquímica e eletroanalítica ... 16 2.3.1 Silsesquioxanos na Eletroanalítica ______________________________ 17 2.3.2 Nanotubos de Carbono _______________________________________ 18 3 Objetivos ... 20 3.1 Objetivo Geral ... 20 3.2 Objetivos específicos ... 20 4 Materiais e Métodos ... 21 4.1 Instrumentação... 21 4.1.1 Célula eletroquímica _________________________________________ 21 4.1.2 Equipamentos ______________________________________________ 21 4.2 Reagentes e soluções ... 21 4.2.1 Soluções __________________________________________________ 21 4.2.2 Reagentes _________________________________________________ 22 4.2.2.1 Solução tampão e de eletrólito suporte ... 22
4.3 Procedimentos e Metodologia ... 23
4.3.1 Síntese do Dispersante Silsesquioxano___________________________ 23 4.3.2 Modificação Superficial do Eletrodo de Trabalho __________________ 24 4.3.3 Desenvolvimento do método __________________________________ 24 4.3.4 Preparo das Amostras Alimentícias _____________________________ 25 4.3.4.1 Abertura da Amostra de Comprimidos ... 25
4.3.4.2 Abertura da Amostra de Fortificante ... 25
4.3.4.3 Preparo da Amostra de Farinha de Trigo... 26
5 Resultados e Discussões ... 27
5.1 Caracterização das Diferentes Arquiteturas Eletródicas do Eletrodo de Trabalho ... 27
5.2 Estudo Eletroquímico e Eletroanalítico do Ácido Fólico ... 28 5.2.1 Comportamento Eletroquímico do Ácido Fólico ___________________ 28 5.2.2 Estudo do pH ______________________________________________ 29
5.2.3 Escolha do Eletrólito Suporte __________________________________ 32 5.2.4 Efeito da Velocidade de Varredura _____________________________ 33 5.2.5 Seleção da Técnica Voltamétrica e Otimização dos Parâmetros
Experimentais ____________________________________________________ 35 5.2.6 Curva de Calibração _________________________________________ 37 5.3 Aplicação à Análise de Amostras Alimentícias ... 39 5 Conclusões ... 41 6 Referências ... 42
12 1 Introdução
O ácido fólico é uma vitamina de alto valor biológico, utilizada na forma de suplemento durante o período de gestação para a prevenção de disfunções neurais em fetos. Também, se emprega o ácido fólico como estratégia de saúde pública quando administrado na forma de fortificante de farinhas para a prevenção de diversas doenças.
Desta forma, faz-se necessário o estudo e aprimoramento de técnicas para identificar e quantificar esse analito de relevância clínica, sendo notável no meio cientifico o interesse pelo desenvolvimento de ferramentas mais eficientes e acessíveis para obtenção de dados promovendo avanço em pesquisas. Esses avanços se dão através do estudo de materiais e métodos promissores.
A exemplificar, os eletrodos quimicamente modificados (CMEs, do inglês
chemically modified electrodes) são dispositivos de grande interesse analítico e
econômico devido a sua efetividade, aliados às técnicas de análise de baixo custo e alta sensibilidade. Dentre tais técnicas de análise, destacam-se as técnicas voltamétricas como a voltametria cíclica, a voltametria de onda quadrada e a voltametria de pulso diferencial, que protagonizam ampla e crescente utilização.
Entretanto, os CMEs devem conferir melhor resposta e maior sensibilidade quando comparados aos eletrodos sem modificação, devido as suas características físico-químicas aprimoradas. Para este fim, alguns nanomateriais podem ser empregados como agentes modificadores, podendo ser materiais carbonáceos, tais como: grafeno, fulereno, nanotubos de carbono, carbon black, dentre outros; e também, nanopartículas metálicas, hidróxidos metálicos e dispersantes para estes materiais. Pelo emprego de agentes modificadores, pode-se observar um aumento da seletividade e a obtenção de uma maior área interfacial eletrodo-solução, com aprimoramento do compromisso entre sensibilidade e qualidade do sinal analítico.
A utilização de nanomateriais e compósitos em conjunto a técnicas voltamétricas apresenta vantajoso desempenho sobre diversos métodos existentes, tornando-se possível investigar de forma cada vez mais rápida, sensível e seletiva inúmeros compostos de interesse clínico e biológico.
Portanto, o emprego de materiais compósitos e nanoestruturados para a determinação voltamétrica de ácido fólico é de extremo interesse cientifico e econômico.
13 2 Revisão da Literatura
2.1 A importância da detecção e quantificação de ácido fólico em matrizes alimentícias
A descoberta do papel dos radicais livres em doenças como o câncer, diabetes, bem como doenças cardiovasculares e autoimunes, distúrbios neurodegenerativos, hipertensão, Parkinson e Alzheimer produziu uma revolução na pesquisa, a fim de identificar compostos sintéticos ou moléculas presentes em alimentos que podem combater a atividade dos radicais livres e prevenir patologias.1
O ácido fólico (FA, do inglês, Folic Acid), ou vitamina B9, é um composto de
origem biológica, que ajuda o corpo humano a produzir e manter células saudáveis,2
reduzindo significativamente a ocorrência de defeitos do tubo neural 3,4 e igualmente
reduzindo o risco de doenças cardiovasculares.5 Avanços em estudos de testes genéticos
evidenciam que o consumo diário de 400 microgramas de ácido fólico para gestantes 6
diminui o risco de cardiopatia, justificando o aconselhamento preventivo.7
Como o FA não pode ser armazenado no corpo humano, caracteriza uma das deficiências de vitaminas mais comuns dentre os complexos vitamínicos. A ingestão regular de FA é essencial para uma vida saudável;8 assim, uma estratégia de saúde pública
no combate de doenças relacionadas à carência de vitaminas na dieta é a ingestão diária de alimentos ou suplementos enriquecidos com nutrientes, vitaminas ou componentes bioativos não nutritivos. Os alimentos fortificados podem ser usados para corrigir ou prevenir deficiências de ingestão de nutrientes e falhas associadas, para equilibrar o perfil nutricional total de uma dieta e restaurar os nutrientes perdidos no processo de preparo do alimento.9
Visto isto, regulamentações para a fortificação obrigatória na farinha de trigo com ácido fólico estão em vigor em 53 países, embora em muitos casos estas regulamentações não tenham sido implementadas.10 Em 2006, a Organização Mundial de Saúde e a
Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura publicaram diretrizes e orientações para o estabelecimento do nível de fortificação de ácido fólico a ser utilizado em farinhas.11 Nos Estados Unidos, a fortificação obrigatória de cereais enriquecidos com
FA foi autorizada em 1996 e totalmente implementada em 1998.12 Outros países também
14
ANVISA regulamentou a fortificação de cereais em 2002; porém alterações foram feitas e a documentação foi revigorada em 2017,com previsão de implementação até 2019.13
Tabela 01: Níveis de fortificação de farinhas com FA em países com programas de fortificação.
País Nível de Fortificação (µg/100 g) Data de Implementação
Estados Unidos 140 1998 Canadá 150 1998 Africa do Sul 150 2003 Chile 220 2000 Costa Rica 180 1998 Brasil 140 2002
Fonte: Crieder et al, 2011.
Portanto, a determinação de FA de forma sensível, específica e reprodutível é considerada de extrema importância tanto na área biológica quanto na área alimentícia. Dessa forma, métodos e técnicas mais adequados à determinação deste analito apresentam-se como uma demanda cada vez mais necessária.8
2.2 Métodos e técnicas analíticas utilizados na determinação de vitaminas
Várias técnicas analíticas têm sido empregadas para a determinação de FA em fontes naturais, alimentos fortificados com FA e em amostras farmacêuticas. Pode-se citar: termogravimetria,14 espectrometria de absorção molecular,15 cromatografia líquida
de alta eficiência (HPLC, do inglês, High Performance Liquid Chromatography),16–18
colorimetria,19 quimioluminescência por injeção de fluxo,20,21 fluorimetria22 e
eletroforese.23
Nesse sentido, Nagaraja et al. utilizando a técnica de espectrometria de absorção molecular, a partir da redução do FA, seguido da adição de p-aminobenzoilglutâmico diazotado e acoplado com iminodibenzila, observaram o limite de detecção ( LoD do inglês, limit of detection) de 0,0469 µg mL‒1, no intervalo de 0,1 – 8,0 µg mL‒1.15
Rie, et al. utilizando a técnica de HPLC combinada com quimioluminescência, numa faixa de trabalho de 10 – 100 μmol∙L‒1, observaram o LoD de 1,34 μmol L‒1 para
15
Em contrapartida Zhao et al. utilizando a técnica de eletroforese capilar combinada com quimioluminescência, numa faixa de trabalho de 5,0 × 10‒8 – 1,0 × 10‒5
mol L‒1, observaram o LoD de 2,0 × 10‒8 mol L‒1 para a determinação de FA em
comprimidos.25
No entanto, as técnicas eletroanalíticas tem atraído a atenção nas últimas décadas, em função de diversas vantagens de portabilidade, baixo custo atrelado ao processo de análise e manutenção dos equipamentos e rapidez na coleta dos dados.8
2.2.1 Voltametria
De uma maneira geral, as técnicas eletroanalíticas fazem uso das propriedades elétricas mensuráveis (corrente, potencial e carga) de um analito quando este é submetido a uma diferença de potencial entre eletrodos em uma cela eletroquímica. Elas oferecem uma série de vantagens tais como (i) seletividade e especificidade das determinações resultantes da oxirredução das espécies eletroativas em um potencial específico aplicado; (ii) seletividade decorrente dos processos de oxirredução do analito no eletrodo de trabalho feito com um material específico; (iii) alta sensibilidade e baixos limites de detecção resultantes das técnicas de pré-concentração e/ou modos de aquisição de sinal que proporciona medições com baixa contribuição de corrente capacitiva.26,27
Variadas técnicas eletroanalíticas têm sido utilizadas para a determinação de vitaminas em produtos farmacêuticos28 e em alimentos.29 Dentre elas, a voltametria, uma
técnica eletroanalítica baseada nos fenômenos que ocorrem na interface entre a superfície do eletrodo de trabalho e a camada de solução adjacente a essa superfície. Essa técnica é classificada como dinâmica, pois a cela eletroquímica é operada na presença de corrente elétrica (i > 0) que, por sua vez, é medida em função da aplicação controlada de um potencial por um determinado tempo sobre um conjunto de três eletrodos. O objetivo é causar uma completa polarização do meio, no qual a velocidade de oxidação ou de redução do analito é limitada pela velocidade de transferência de massa do analito para a superfície do eletrodo. Os eletrodos constituintes são o de trabalho (onde ocorre a reação
redox), o contra-eletrodo (ex. fios de Ag, Au ou Pt) que mede a corrente elétrica
produzida, e o de referência, como o de calomelano saturado ou Ag/AgCl, que fornecem um potencial elétrico conhecido e constante sem sofrer polarização. À célula eletroquímica também é adicionada uma solução de eletrólito suporte, a qual deve apresentar alta solubilidade, alto grau de dissociação e ser estável química e
16
eletroquimicamente no solvente a ser empregado. Basicamente, o eletrólito suporte serve para reduzir a resistência do meio, eliminar a contribuição do efeito de migração, manter a viscosidade da solução, aumentar a sua condutividade e, até mesmo, atuar como solução tampão.30,31
Assim, nas técnicas voltamétricas, o parâmetro ajustado é o potencial (E) e o parâmetro medido é a corrente resultante (i). O registro da corrente em função do potencial, é denominado voltamograma, e a magnitude da corrente obtida pela transferência de elétrons durante um processo de oxirredução, pode ser relacionada com a quantidade de analito presente na interface do eletrodo de trabalho, ou seja, relacionado à concentração do mesmo na solução em análise.26
Ao alterar o eletrodo de trabalho, ou modificar sua arquitetura eletródica altera-se a sua reatividade. Portanto é de grande interesse analítico explorar agentes modificadores com a finalidade de melhorar o desempenho do eletrodo de trabalho.
2.3 Eletrodos quimicamente modificados e nanomateriais aplicados na eletroquímica e eletroanalítica
CMEs são dispositivos resultantes da imobilização de agentes modificadores na superfície do eletrodo de trabalho, por adsorção,32 ligação covalente,33 recobrimento com
filmes poliméricos,34 materiais compósitos 35 ou, ainda, pelo preparo de eletrodos à base
de pasta de carbono.36–38 Essa modificação tem o intuito de aumentar a resposta
eletroquímica, uma vez que são transferidas propriedades químicas, físicas, elétricas, óticas, e de transporte do modificador ao eletrodo, de forma a preestabelecer e controlar a natureza físico-química da interface eletrodo-solução, como uma forma de alterar a seletividade e reatividade do eletrodo base.39,40
Algumas técnicas de modificação de eletrodos são Layer-by-Layer,41 spin-coating 42 e drop-coating.43 Uma das mais utilizadas para a modificação de eletrodos é a técnica
de drop-coating, ou seja, o recobrimento com filmes poliméricos na superfície de um eletrodo sólido de trabalho. Nessa técnica, o polímero que geralmente atua como estabilizante para nanopartículas metálicas ou serve como dispersante de algum material de interesse, a exemplificar, nanotubos de carbono. Alguns polímeros utilizados para esse fim são a quitosana,44 o nafion45 e os silsesquioxanos.46
17 2.3.1 Silsesquioxanos na Eletroanalítica
Os materiais do tipo silsesquioxanos são uma classe de materiais híbridos orgânico-inorgânicos que tem uma matriz de sílica modificada com grupos orgânicos ligados covalentemente e são obtidos através do processo sol-gel. Estes materiais fornecem propriedades notáveis e complementares que não podem ser obtidas num único material, como o planejamento estrutural molecular e propriedades químicas do material resultante,47 sendo a catálise,48 a adsorção49 e a eletroanálise50 as principais áreas de
interesse de aplicação destes materiais.
Uma vantagem associada a alguns desses materiais do tipo silsesquioxanos iônicos é a solubilidade em solventes de alta constante dielétrica, o que permite muitas aplicações, dentre elas a estabilização de nanopartículas metálicas 36 e a formação de
filmes estáveis.51. Um material dessa classe que é bastante estudado em nosso grupo de
pesquisa é o cloreto de 3-n-propil(4-metilpiridínio) silsesquioxano (Si4Pic+Cl‒), cuja
estrutura encontra-se na Figura 01. Esse polímero, por possuir grupamentos com cargas positivas rodeadas pela matriz silsesquioxano, possui solubilidade em água e etanol, o que facilita variadas aplicações. Recentemente, em nosso grupo de pesquisa, verificou-se que o Si4Pic+Cl‒ também pode atuar como agente dispersante de nanotubos de carbono
funcionalizados, o que confere novas possibilidades em aplicações em eletroanalítica, catálise e adsorção, devido às novas características do material híbrido resultante.
Figura 01: Estrutura química do cloreto de 3-n-propil(4-metilpiridínio) silsesquioxano.
Si O O O Si O Si O O OH Si O Si O O Si Si O Si O O O Si O OH Si O Si OH H H O O H O O O Si O O Si O H O H H H Si OH O H H H H H Si H O H N+ N+ N+ N+ N+ N+ N+ N+ C H3 C H3 C H3 C H3 CH3 CH3 CH3 CH3 N+ C H3 N+ C H3 Cl -Cl -Cl -Cl -Cl -Cl -Cl -Cl -Cl -Cl -Fonte: O autor
18 2.3.2 Nanotubos de Carbono
Diversificados materiais têm sido empregados na modificação de eletrodos eletroquímicos. Merecem destaque os materiais de diversos alótropos de carbono, que aumentam a área de superfície eletroativa, bem como a taxa de transferência de elétrons e promovem a adsorção de moléculas em comparação a muitos materiais de sensores eletroquímicos tradicionais. Os nanotubos de carbono (CNTs, do inglês carbon
nanotubes) são camadas laminadas de grafeno que se apresentam na forma de tubos ocos.
Há dois principais tipos de CNT: de parede simples (SWCNT, do inglês single-walled
carbon nanotubes); e de paredes múltiplas (MWCNT, do inglês multi-walled carbon nanotubes), como demonstrado na Figura 02. Os mesmos apresentam variação de
espessura, bem como de propriedades condutoras e semicondutoras.52
Figura 02: Classificação dos tipos de CNTs.
Fonte: Adaptado de S. Grupta et al (2018).53
Os CNTs são geralmente tratados com ácidos fortes para incorporação de grupos funcionais carboxílicos, o que favorece a adsorção de compostos e a transferência de elétrons54 formando, assim, os nanotubos de carbono funcionalizados,. A adsorção de
nanopartículas, óxidos e hidróxidos metálicos na superfície dos CNTs conferem variações nas propriedades dos mesmos, contudo não configuram um tipo de funcionalização, pois não estão quimicamente ligados aos nanotubos. Essas modificações estão demonstradas na Figura 03.
Figura 03: Esquema de Funcionalização e decoração de CNTs.
19
Também tem sido amplamente reportado na literatura o uso de nanopartículas metálicas e óxidos metálicos como agentes modificadores em diferentes eletrodos de trabalho. Destacam-se os óxidos metálicos que oferecem melhora de sinal analítico e aumento de sensibilidade a diversificados analitos de interesse biológico e alimentício. As principais funções dos óxidos metálicos na eletroanalítica envolvem o aprimoramento da interface condutora e as propriedades eletrocatalíticas dos óxidos que permitem a comunicação entre os centros redox de moléculas com a superfície do eletrodo.56
Neste sentido, Kumar et al. empregaram MWCNTs funcionalizados com óxido de zinco na modificação superficial do eletrodo de trabalho, utilizado para a determinação de FA através da técnica de voltametria cíclica (CV, do inglês, cyclic voltammetry), observando LoD de 1,3 μmol L‒1 em uma faixa de trabalho de 5 – 20 μmol L‒1.57
E A. Barbaei et al. desenvolveram um CME e MWCNTs decorados com hidróxido de níquel(II) (Ni(OH)2) para a determinação de epinefrina na faixa de
concentração de 1 - 200 µmol L‒1, e piroxicam na faixa de 0,7 – 75 µmol L‒1, aplicando
a técnica de pulso diferencial (DPV, do inglês differential pulse voltammetry) observando um LoD de 0,29 µmol L‒1 e 0,11 µmol L‒1 para epinefrina e piroxicam, respectivamente.
O objetivo deste trabalho foi a combinação de nanotubos de carbono de múltiplas paredes funcionalizados (f-MWCNT, do inglês, Functionalized Multi Walled Carbon
Nanotubes) e decorados com hidróxido de níquel II (Ni(OH)2), dispersos no polímero
Si4Pic+Cl‒, para o desenvolvimento de uma nova plataforma eletródica útil à
determinação de ácido fólico em matrizes alimentícias, sendo o primeiro registro do emprego de um compósito de f-MWCNT-Ni(OH)2disperso em um silsesquioxano iônico.
20 3 Objetivos
3.1 Objetivo Geral
Estudar o efeito da modificação superficial de um eletrodo de carbono vítreo (GCE do inglês, glassy carbon electrode) com f-MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl‒ no que
diz respeito ao comportamento eletroquímico do FA e sua determinação em matrizes alimentícias.
3.2 Objetivos específicos
• Estudar o comportamento eletroquímico de FA frente as diversas estruturas eletródicas por meio de técnicas voltamétricas;
• Construir CMEs com f-MWCNT-Ni(OH)2 dispersos em polímero do tipo
silsesquioxano;
• Investigar os parâmetros de análise tais como pH, eletrólito suporte e tipo de técnica voltamétrica para a determinação de FA;
• Estudar a variação de parâmetros voltamétricos em técnicas de pulso; • Construir curvas de calibração para o analito;
• Avaliar as características analíticas para o método proposto;
• Quantificar o FA em amostras de suplemento vitamínico, fortificante de farinhas e farinha de trigo.
21 4 Materiais e Métodos
4.1 Instrumentação
4.1.1 Célula eletroquímica
Todos os experimentos foram realizados em uma célula eletroquímica com volume total de 10 mL e possibilidade de inserção de três eletrodos. O eletrodo de referência foi do tipo Ag/AgCl, KCl (3 mol L‒1). Como contra-eletrodo foi utilizado um
fio de platina (Pt). Como eletrodo de trabalho, foi utilizado um GCE modificado com diferentes arquiteturas eletródicas contendo f-MWCNT e f-MWCNT-Ni(OH)2 dispersos
no polímero silsesquioxano iônico Si4Pic+Cl‒. 4.1.2 Equipamentos
As medidas voltamétricas foram realizadas com o auxílio de um potenciostato/galvanostato PalmSens (Palm Instruments BV – Holanda) conectado a um computador com o software PSTrace (versão 5.4). A partir deste sistema conectado por fios aos eletrodos da célula eletroquímica foi possível obter os respectivos voltamogramas do FA. Os eletrodos utilizados foram: de referência Ag/AgCl; auxiliar de Pt e de trabalho GCE modificado com f-MWCNT-Si4Pic+Cl‒ e f-MWCNT-Ni(OH)
2-SiPic+Cl‒
As análises por espectrometria de absorção molecular foram realizadas em um Espectrômetro UV-1800 (Shimadzu, Japão) conectado a um software UVProbe (versão 2.50) para aquisição e processamento de dados. Utilizou-se uma cubeta de quartzo com caminho óptico de 1,0 cm na faixa de 200 a 800 nm.
4.2 Reagentes e soluções 4.2.1 Soluções
Todas as soluções foram preparadas a partir dos reagentes sem etapas prévias de purificação, pelo emprego de água do tipo ultrapura, obtida em sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA), com resistividade de 18,2 MΩ cm.
22 4.2.2 Reagentes
Todos os reagentes utilizados neste trabalho estão listados no Quadro 01. Quadro 01: Reagentes utilizados
REAGENTES FÓRMULA MARCA PUREZA
Ácido acético C2H4O2 Vetec > 99,7%
Ácido bórico H3BO3 Synth > 99,5%
Ácido fosfórico H3PO4 Grupo Química > 85%
Borohidreto de sódio NaBH4 Vetec > 98%
Ácido Fólico C19H19N7O6 Vetec > 99%
Hidróxido de sódio NaOH Vetec > 99%
Fosfato de Sódio Monobásico NaH2PO4 Vetec > 98%
Fosfato de Sódio Dibásico Na2HPO4 Vetec > 99%
Ferricianeto de potássio K3[Fe(CN)6] Sigma-Aldrich 99%
Ferrocianeto de potássio K4[Fe(CN)6] Sigma-Aldrich 98%
Cloreto de Potássio KCl Merck >99%
Nanotubos de Carbono de Múltiplas
Paredes Funcionalizados * f-MWCNT
Nanotubos de Carbono de Múltiplas Paredes Funcionalizados Decorados com Hidróxido de Níquel (II) *
f-MWCNT-Ni(OH)2 * Os f-MWCNT e f-MWCNT-Ni(OH)
2 foram cedidos pela professora Dr. Daniela Mezalira e pelo estudante de iniciação cientifica Jean Bassani do Departamento de Química da UFSC. Os detalhes da síntese e caracterizações dos f-MWCNT e f-MWCNT-Ni(OH)2 estão sendo compilados na escrita de um artigo cientifico em parceria com a prof.a Dr. Daniela e pelo graduando Jean
4.2.2.1 Solução tampão e de eletrólito suporte
A solução tampão fosfato (PBS, do inglês, Phophate Buffer Solution) foi preparada a partir da mistura de fosfato de sódio monobásico e fosfato de sódio dibásico nas concentrações 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mol L‒1 e o valor de pH foi ajustado com solução
de NaOH 6,0 mol L‒1.
A solução tampão Britton-Robinson (BR) foi preparada a partir da mistura de ácidos acético, bórico e fosfórico (0,1 mol L‒1) e o valor de pH foi ajustado com solução
23 4.3 Procedimentos e Metodologia
4.3.1 Síntese do Dispersante Silsesquioxano
Em um balão de 500 mL contendo 150 mL de etanol, foram adicionados 80 mL de tetraetilortossilicato sendo o conteúdo agitado por dez minutos. Em seguida, adicionou-se 15,0 mL de uma solução de ácido clorídrico 1,0 mol L‒1 para a pré-hidrólise
do precursor. Esta mistura foi mantida à temperatura ambiente por duas horas e trinta minutos, sob agitação constante. Posteriormente, 104 mL de (3-cloropropil)trimetoxissilano foram adicionados e o conteúdo deixado sob agitação à temperatura ambiente por mais 2 h.
A mistura foi transferida para um béquer e aquecida a 55°C em banho de glicerina por mais 60 h. Após este período, houve a formação de um gel duro. O mesmo foi quebrado em um almofariz com pistilo e levado à estufa à temperatura de 110 °C por mais 52 h. Formou-se o xerogel em pedaços com aspecto vítreo. O material final foi macerado e passado em peneira de 60 e 250 mesh.
Em um balão de 250 mL contendo 100 mL de tolueno foram adicionados 10 g de xerogel. A mistura foi agitada por 10 min em temperatura ambiente e, em seguida, foram adicionados 20 mL de 4-metilpiridina, sendo o conteúdo final refluxado por 24 horas sob agitação mecânica. O solvente foi, então, removido por decantação e o sólido, após ser lavado com 500 mL de etanol, foi seco em um rotaevaporador em uma temperatura de 50 °C. Desta forma, obteve-se o cloreto de 3-n-propil(4-metilpiridinio)silsesquioxano (Si4Pic+Cl‒) para uso como dispersante dos f-MWCNT-Ni(OH)
2.
24 4.3.2 Modificação Superficial do Eletrodo de Trabalho
A dispersão dos f-MWCNT e f-MWCNT-Ni(OH)2, foi feita em solução de
Si4Pic+Cl‒ (4 mg mL‒1), pelo emprego de ultrassom, durante 10 minutos.
A superfície do GCE foi cuidadosamente polida com alumina (0,5 µm), lavada com água destilada e ultrasonificada por 3 minutos para total remoção de impurezas da superfície do eletrodo. Após isto, uma alíquota da dispersão foi gotejada na superfície do GCE, como ilustrado na Figura 04, e seco em estufa a 40° C por 10 minutos.
Figura 04: Esquema de dispersão dos nanotubos de carbono em silsesquioxano e o gotejamento da dispersão no eletrodo de carbono vítreo.
Fonte: O autor.
4.3.3 Desenvolvimento do método
A resposta eletroquímica para o analito FA foi estudada por comparação entre o eletrodo de carbono vítreo não modificado e os CMEs, aplicando-se as técnicas de CV, de varredura linear (LSV, do inglês linear sweep voltammetry), de onda quadrada (SWV, do inglês, square wave voltammetry) e de DPV. O perfil voltamétrico do FA foi estudado em diferentes valores de pH e natureza do eletrólito suporte afim de escolher o meio mais adequado para a determinação.
Em uma etapa posterior, foram conduzidos estudos de velocidade de varredura (entre 10 mVs‒1 a 200 mVs‒1) a fim de verificar qual tipo de processo ocorre na interface
da superfície do eletrodo – solução, ou seja, se a etapa determinante do processo eletroquímico é controlada por difusão, adsorção ou transferência de carga. A partir dos resultados obtidos, foi escolhida a técnica eletroanalítica que gerou melhor perfil entre corrente e qualidade do sinal analítico.
25
Posteriormente, realizou-se otimização dos parâmetros voltamétricos de acordo com a técnica escolhida. Após a otimização de parâmetros voltamétricos, o método foi empregado para a construção de curvas de calibração para posterior quantificação de FA em suplemento vitamínico, fortificante de farinhas e farinha de trigo.
4.3.4 Preparo das Amostras Alimentícias
4.3.4.1 Abertura da Amostra de Comprimidos
De acordo com literatura especializada, 59–61 dez comprimidos da amostra
contendo o FA foram macerados, utilizando um gral e pistilo, formando um pó amarelado. Uma massa de 0,250 g dessa amostra foi transferida para um béquer e misturada a um volume de 30 mL de água ultrapura. Foi então ajustado o pH dessa mistura para 8,0 utilizando uma solução de NaOH 0,1 mol L‒1 até total dissolução do FA. A mesma
foilevada para o ultrassom por 15 min. A dispersão foi filtrada em sistema de vácuo, para separar o FA do excipiente, utilizando papel filtro, funil de Buchner e kitassato. O filtrado foi lavado por duas vezes com solução de NaOH (pH 8,0). O conteúdo do kitassato foi transferido para um balão volumétrico de 200 mL e avolumado até o menisco utilizando água ultrapura.
4.3.4.2 Abertura da Amostra de Fortificante
Nenhum protocolo para o fortificante composto de ácido fólico e ferro foi encontrado na literatura. Por se tratar de uma amostra utilizada na indústria de farinhas de trigo que contém somente os dois principais ingredientes para a fortificação, seguiu-se o mesmo protocolo de abertura de amostra do item 3.3.5.1. Em 1,0 g do fortificante, foram adicionados 20 mL de NaOH 1 mol L‒1. Verificou-se instantaneamente um
precipitado de coloração verde, indicando que o ferro presente na amostra se apresentava na forma de Fe(OH)2. O sobrenadante, de coloração amarelada, indicava a presença do
ácido fólico. Dessa maneira, o sobrenadante foi filtrado e transferido a um balão de 25 mL e avolumado até o menisco com água ultrapura.
26 4.3.4.3 Preparo da Amostra de Farinha de Trigo
O preparo da amostra de farinha de trigo seguiu protocolos já estabelecidos na literatura para análises por HPLC 62 com algumas modificações. Em um tubo Falcon, uma
massa de 5,0 g de farinha de trigo foi adicionada a um volume de 80 mL de acetato de amônio 75 mmol L-1 (pH 7,0). O tubo foi sonicado durante 15 min e agitado em um
agitador orbital por 120 min. Após a extração, as amostras foram centrifugadas durante 20 min a 4000 rpm e o sobrenadante, de coloração amarelo claro (indicando a presença de ácido fólico), foi utilizado para as análises.
27 5 Resultados e Discussões
5.1 Caracterização das Diferentes Arquiteturas Eletródicas do Eletrodo de Trabalho
Para investigar as propriedades elétricas da interface eletrodo-solução nas diferentes arquiteturas eletródicas desenvolvidas, foi utilizado a técnica de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS, do inglês, Electrochemical Impedance Spectroscopy) aplicada ao par redox K3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(CN)6].
Todas as arquiteturas eletródicas exibiram um formato típico do diagrama de Nyquist, conforme mostrado na Figura 05, com um único semicírculo grande na região de alta frequência relacionada ao processo de transferência de carga e uma região linear na região de menor frequência, atribuída ao processo de difusão. Comparando-se a modificação superficial do GCE somente com o filme de Si4Pic+Cl‒ ao GCE não
modificado, verificou-se uma diminuição da resistência à transferência de carga de aproximadamente de 300 Ω. Uma menor resistência a transferência de cargas foi observada com a modificação superficial do GCE com o emprego de 3μL da dispersão f- MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl‒. Observa-se que, após a incorporação do
silsesquioxano, a resistência a transferência de cargas diminui, o que pode estar associado às cargas positivas presentes no material, tornando o eletrodo mais condutor. Na presença de f- MWCNT-Ni(OH)2, a diminuição da resistência é ainda maior, devido às
propriedades condutoras dos nanotubos de carbono e do hidróxido de níquel II que, em conjunto com o polímero, fazem que o eletrodo se torne ainda menos resistivo.
Entretanto, verifica-se com o aumento da quantidade de dispersão de nanocompósito empregada, 4 μL e 5 μL, a resistência à transferência de carga aumentou. Portanto, a maior quantidade de filme formado na superfície do GCE dificulta a transferência eletrônica pela interface eletrodo-solução, bloqueando todos os sítios ativos disponíveis. Portanto, em estudos posteriores utilizou-se uma alíquota de 3 μL do nanocompósito para a modificação superficial do GCE.
Os circuitos elétricos equivalentes foram fitados a partir de espectros de impedância. Para o GCE/f-MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl-, um circuito equivalente de
Randles foi empregado (inset da Fig. 05). Este circuito inclui a resistência da solução (Rsol) em série com a combinação paralela da resistência a transferência de cargas e com
28
para as diferentes resistências, ajustando a resposta dos circuitos elétricos equivalentes aos espectros, são apresentados no circuito mostrado na Figura 05.
Figura 05: Espectroscopia de impedância eletroquímica para: ● GCE eletrodo não modificado,
►GCE/Si4Pic+Cl-; ◄ GCE/f-MWCNT-Ni(OH)2-Si4Pic+Cl- (3 µL); ▲ GCE/f-MWCNT-Ni(OH)2 -Si4Pic+Cl- (4 µL); ▼ GCE/f-MWCNT-Ni(OH)
2-Si4Pic+Cl- (5 µL) em solução de KCl 0.1 mol L-1 contendo 5.0 mmol L-1 [Fe(CN)6]4-/3-. O potencial aplicado foi de 0.245 V vs. Ag/AgCl.
0 750 1500 2250 3000 3750 4500 0 750 1500 2250 3000 3750 4500 -Z'' / Z' / 0 500 1000 1500 2000 0 200 400 600 800 1000 -Z'' / Z' / Fonte: O autor.
5.2 Estudo Eletroquímico e Eletroanalítico do Ácido Fólico 5.2.1 Comportamento Eletroquímico do Ácido Fólico
A Figura 06 mostra o comportamento eletroquímico do padrão de FA em diferentes arquiteturas eletródicas: GCE, GCE/f-MWCNT/Si4Pic+Cl− e
GCE/f – MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl−. Na presença de 30 µmol L-1 de FA, observou-se
que, quando se aplica o compósito f-MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl−sobre o eletrodo de
trabalho, observa-se um sinal de oxidação mais definido para o FA em comparação àquele obtido com o GCE e o GCE/f-MWCNT/Si4Pic+Cl-, sendo que o GCE apresenta o menor
pico de oxidação de FA em ca. +0,8 V. O filme da dispersão de f-MWCNTs em Si4Pic+Cl− aumenta a intensidade da corrente; no entanto, apresentou um potencial de
oxidação maior comparado ao GCE. Quando o GCE é modificado com o compósito f- MWCNT - Ni(OH)2/Si4Pic+Cl−, a intensidade da corrente aumenta em cerca de três
vezes quando comparado ao GCE e em um potencial de oxidação mais negativo que as outras arquiteturas eletródicas. Dessa maneira, para os estudos posteriores, foi escolhida
29
a arquitetura eletródica GCE/f-MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl− para a aplicação analítica e
estudo eletroquímico.
Figura 06: Voltamogramas cíclicos para 30 µmol L-1 de padrão de FA utilizando diferentes arquiteturas eletródicas. 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 branco GCE GCE/f-MWCNT-Si4Pic+Cl GCE/f-MWCNT-Ni(OH)2-Si4Pic+Cl
-i /
A
(E vs. Ag/AgCl) / V
Fonte: O autor. 5.2.2 Estudo do pHPara avaliar o efeito do pH e propor um mecanismo para a reação que ocorre entre o GCE/f - MWCNT/Ni(OH)2-Si4Pic+Cl− e o analito, variou-se o pH de 6,0 a 9,0, pois o
FA é insolúvel em meio aquoso em condições de pH menores que 5,0. Além disso, não se observa nenhuma resposta eletroquímica do FA em valores de pH acima de 9,0. A espécie predominante nesta condição de pH é uma espécie com centros não-eletroativos para a reação de oxidação (Figura 07(A)), conforme pode-se observar no diagrama de distribuição de espécies (Figura 07(B)) 63 juntamente com as estruturas químicas e seus
respectivos valores de pKa (Figura 07(C)).
O efeito da variação de pH no comportamento eletroquímico do FA foi investigado por CV utilizando o tampão BR. Os voltamogramas correspondentes são mostrados na Figura 07(A). A relação entre a corrente de pico de oxidação e o pH é mostrada no inset da Figura 07(A). De acordo com o diagrama de espécies mostrado na Figura 07(B), a espécie predominante na faixa de pH de 6 a 9 é a FAH.63 Dessa maneira,
30
envolvidos no processo de oxidação do FA. A equação de Ep versus pH é expressa por:
𝐸𝑝(𝑉) = −0,054 𝑝𝐻 + 1,17. A inclinação, próxima a 0,059 V pH-1 e expressa pela equação de Nernst, representa que o mesmo número de prótons e elétrons está envolvido no mecanismo de oxidação do ácido fólico sobre a superfície do GCE/f - MWCNT - Ni(OH)2/Si4Pic+Cl−.
Figura 07: (A) Efeito do pH no comportamento eletroquímico do FA 5 mol L-1 (B) Distribuição das diferentes espécies no meio e (C) Estruturas químicas referentes às espécies verificadas no diagrama de espécies. (A) 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 -1 0 1 2 3 4 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 0.68 0.72 0.76 0.80 0.84 (E vs. A g/A gCl) / V pH Equation y = a + b*x Weight No Weighting Residual Sum of Squares 1.44E-4 Pearson's r -0.9951 Adj. R-Square 0.98533
ValueStandard Error
B Intercept 1.17 0.02877 B Slope -0.054 0.00379 6 7 8 9
i /
A
(E vs. Ag/AgCl) / V
(B) (C)31
Fonte: O autor
Devido ao compromisso entre sinal analítico e estabilidade da espécie em solução, escolheu-se a condição de pH 7,0 para a condução de todas as medidas sequentes.
32 5.2.3 Escolha do Eletrólito Suporte
Como a natureza e a concentração do eletrólito de suporte afeta a intensidade do sinal analítico em uma medida eletroquímica, testes foram conduzidos para a escolha do eletrólito suporte. Verificou-se que o PBS é o eletrólito suporte que oferece o sinal analítico mais intenso quando comparado ao tampão BR. Dessa maneira fez-se um estudo da concentração de tampão. Ao aumentar a concentração de eletrólito suporte, a intensidade do sinal de corrente diminui.
Quando a concentração do PBS diminui, a intensidade de corrente aumenta, e na concentração de 0,1 mol L-1, pH 7,0, o maior sinal de corrente é obtido (Figura 08). Isso
pode ser explicado pela espessura da dupla camada elétrica na adjacência do eletrodo de trabalho. De acordo com o aumento da concentração de eletrólito, menor é a espessura da dupla camada elétrica. No entanto, considerando que FA é uma molécula volumosa, a difusão do analito para a superfície do eletrodo é dificultada e há um decréscimo do sinal de corrente. Exemplos contrários, para moléculas menores, são encontradas na literatura.64 Este comportamento pode, também, estar associado à viscosidade da solução
tampão PBS e ao raio da molécula do analito. Esses fatores afetam a difusão do FA à superfície do eletrodo, de acordo com o modelo de Stokes-Einstein65 e, portanto, afetam
a intensidade de corrente.
Figura 08: Efeito da concentração do eletrólito de suporte sobre o comportamento eletroquímico do FA.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
i /
A
(E vs. Ag/AgCl) / V
0,1 mol L-1 PBS 0,2 mol L-1 PBS 0,3 mol L-1 PBS Fonte: O autor.33 5.2.4 Efeito da Velocidade de Varredura
Diferentes velocidades de varredura foram estudadas a fim de avaliar o processo
de transporte de massa do FA para a superfície do
GCE/f – MWCNT - Ni(OH)2/Si4Pic+Cl−. Os voltamogramas correspondentes são
mostrados na Figura 09A. A corrente dos picos de oxidação aumentou linearmente com a velocidade de varredura na faixa de 0,2 - 2 V s−1. De acordo com a literatura64, uma
curva do logaritmo da corrente de pico (log i) versus o logaritmo da velocidade de varredura (log v), com coeficiente angular de 0,5 ou próximo a esse valor, indica que a reação é controlada por difusão. O gráfico de log i versus log v (Figura 09B) foi linear com a equação log i = 0,5088 log v - 0,1581 (r = 0,989).
Figura 9: (A) Variação da corrente com a velocidade de varredura para o FA. (B) Gráfico do log i versus log v. 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 i / A (E vs. Ag/AgCl) / V
A
-2,2 -2,0 -1,8 -1,6 -1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 log i log vB
Fonte: O autor.Portanto, conclui-se que a reação de oxidação do FA no eletrodo modificado caracteriza-se por um processo controlado por difusão. Além disso, a relação entre o potencial de pico de oxidação (Ep) e o logaritmo da velocidade de varredura é mostrada
na Figura 10. O Ep mudou linearmente com log v e, de acordo com a equação de Laviron66,
para uma reação eletroquímica irreversível, a relação entre Ep e log v pode ser expressa
da seguinte forma: 𝐸𝑝 = 𝐸0+ (2.303𝑅𝑇 𝛼𝑛𝐹 ) log ( 𝑅𝑇𝑘0 𝛼𝑛𝐹) + ( 2.303𝑅𝑇 𝛼𝑛𝐹 ) log 𝜈
34
Onde, E° é o potencial redox formal, k° é a constante de taxa padrão da reação, é o coeficiente de transferência de elétrons, n é o número de mol de elétrons transferidos na etapa determinante da velocidade e R, T e F são notações padrão (R = 8,314J mol- 1 K−1, T = 298 K, F = 96485 C mol−1).
De acordo com a correlação linear de Ep versus log v, a inclinação (0,0591) a partir
da regressão linear é igual a 2,303RT / nF. Portanto, o valor de n calculado é 2,11. Assim, pode-se afirmar que o número de mol de elétrons transferidos (n) na reação de oxidação de FA é igual a 2.
Figura 10: Relação entre potencial de pico de oxidação e o logaritmo da velocidade de varredura.
-2,2 -2,0 -1,8 -1,6 -1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 0,82 0,84 0,86 0,88 (E vs. A g/A gCl) / V log v Fonte: O autor.
O pico de oxidação pode estar relacionado à oxidação do CH2-NH do FA,
destacado na Figura 11, via reação de oxidação eletroquímica irreversível de 2e- / 2H+ .O
mesmo mecanismo foi observado por Maiyalagan et al.67 para a oxidação do FA
utilizando uma plataforma eletroquímica composta pela modificação do GCE com - Fe2O3.
Figura 11: Reação de oxidação do FA no GCE/f-MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl−.
35 5.2.5 Seleção da Técnica Voltamétrica e Otimização dos Parâmetros
Experimentais
Três diferentes técnicas voltamétricas foram estudadas a fim de se obter o sinal analítico para a oxidação do FA. Foram avaliadas as respostas das técnicas de LSV, DPV e SWV. A fim de comparação, os parâmetros de cada técnica foram ajustados de modo a se obter a mesma velocidade de varredura durante as medidas, nesse caso de 50 mV s-1.
Na Figura 12 são apresentados os voltamogramas obtidos utilizando as três técnicas propostas. Verificou-se que a LSV é a técnica que apresenta menor sinal e seletividade frente ao analito devido ao pico de oxidação alargado. Quando se utiliza a SWV obtêm-se um sinal analítico de maior intensidade quando comparado à LSV e com maior definição do pico. Entretanto, a DPV apresenta a intensidade de corrente mais pronunciada e com um pico de oxidação do FA mais definido, como esperado, pois a reação de oxidação do FA é irreversível, e a DPV quando operada em velocidades mais baixas possibilita acompanhar melhor reações de cinética lenta.67
Figura 12: Voltamogramas de FA 10 mol L-1 sobre GCE/f-MWCNT/Ni(OH)
2-Si4Pic+Cl- em tampão PBS 0,1 mol L-1 pH 7,0 em diferentes técnicas eletroanalíticas.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 0 1 2 3 4 branco LSV DPV SWV i / A (E vs. Ag/AgCl) / V Fonte: O autor.
Desta forma, escolheu-se a DPV como técnica voltamétrica para a determinação do FA. Essa técnica de pulso é caracterizada pela aplicação de potenciais de mesma amplitude sobrepostos a uma rampa linear de potencial que é medida antes e após a aplicação do pulso. As correntes resultantes são subtraídas e resultam na minimização da
36
contribuição da corrente capacitiva no sinal resultante. Os parâmetros foram otimizados com o objetivo de se obter o melhor compromisso entre a intensidade de corrente resultante e a qualidade do sinal analítico para a oxidação do FA. Os parâmetros experimentais da DPV foram variados nos seguintes intervalos: velocidade de variação de potencial (v: 10 – 100 mV s-1), tempo de pulso (t
pulso: 5 – 10 ms) e amplitude de pulso (Epulso: 1 – 150 mV). Na Figura 13, são apresentados os voltamogramas com os resultados obtidos. Os voltamogramas com as linhas sólidas referem-se às condições ideais, escolhidas em cada etapa (v = 90 mV s-1; t
pulso = 5 ms e Epulso = 90 mV). Figura 13: Voltamogramas de FA 10 µmol L-1 sobre GCE/f-MWCNT/Ni(OH)
2-Si4Pic+Cl- em tampão PBS 0,1 mol L-1 pH 7,0 variando os parâmetros de (A) velocidade de variação do potencial; (B) tempo de pulso e (C) amplitude de pulso. Fonte: O autor 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 i / A (E vs. Ag/AgCl) / V 5 ms 10 ms
B
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 i / A (E vs. Ag/AgCl) / V 10 mV s-1 100 mV s-1A
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 0 1 2 3 4 5 6 i / A E vs. Ag/AgCl / V 10 mV 150 mVC
37 5.2.6 Curva de Calibração
Empregando as condições experimentais da DPV descritas na seção anterior, obteve-se a curva de calibração mediante a adição de alíquotas de solução padrão de FA sobre a amostra. A Figura 14(A) mostra os voltamogramas de pulso diferencial para diferentes concentrações de FA e a curva de calibração (Figura 14(B)) utilizando o eletrodo GCE/f - MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl-. Observam-se picos bem definidos no
potencial de + 0,76 V cuja intensidade de corrente aumenta proporcionalmente com a concentração de FA em dois intervalos de concentração, um de 0,5 – 2,5 µmol L-1 e outro
de 7,3 – 26 µmol L-1. As equações obtidas a partir de regressão linear são expressas por i
/ µA = 0,47 [FA] + 0,56 (r = 0,999) e i / µA = 0,66 [FA] + 1,68 (r = 0,998) com n = 3. O LoD e LoQ foram calculados utilizando as seguintes expressões, de acordo com a ANVISA:69
𝐿𝑜𝐷 =3 𝑆𝑏 𝑏 𝐿𝑜𝑄 = 10 𝑆𝑏
𝑏
onde Sb é o desvio padrão (n=3) do coeficiente linear da equação da reta obtida e b é o
coeficiente angular da reta. Os valores obtidos foram de LoD = 0,095 µmol L-1 e LoQ =
0,3 µmol L-1 para a primeira faixa linear e LoD = 1,81 µmol L-1 e LoQ = 6,1 µmol L-1
para a segunda faixa linear. As características analíticas estão compiladas na Tabela 02. Figura 14: (A) Voltamogramas de pulso diferencial para diferentes concentrações de FA e a (B) curva de calibração obtida em tampão PBS 0,1 mol L-1 (pH = 7,0)
0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1 2 3 4 5 6 i / A (E vs. Ag/AgCl) / V
A
0 5 10 15 20 25 30 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 i / A [FA] / (mol L-1)B
Fonte: O autor38
Tabela 02: Parâmetros analíticos da curva de calibração para o FA utilizando o GCE/f - MWCNT - Ni(OH)2/Si4Pic+Cl-
Parâmetro Valor
Potencial do pico/V +0,76
Faixas lineares/µmol L-1 0,5 – 2,5 e 7,3 – 26
Coeficiente de correlação (r2) 0,999 e 0,998
Coeficiente angular/µA L µmol-1 0,47 e 0,066
Desvio padrão do coeficiente angular/ µA L µmol-1 0,0071 e 0,0017
Coeficiente linear/µA 0,5 e 1,68
Desvio padrão do coeficiente linear/µA 0,0151 e 0,0402
LoD/µmol L-1 0,095 e 1,8
LoQ/µmol L-1 0,3 e 6,1
n = 3
O valor de LoD encontrado é bastante promissor para aplicações em amostras reais. Este valor pode ser comparado com outros eletrodos modificados, que utilizam tanto o processo de redução ou oxidação do FA, como mostrado na Tabela 03.
Tabela 03: Comparação das diferentes arquiteturas eletródicas para determinação de FA. Técnica
Voltamétrica
Plataforma eletródica LOD / µmol L-1 Referência DPV GCE/Mn-SnO2 0,079 70 DPV CPE/ZrO2-NPs 0,089 71 LSV CPE/POMANS-MWCNT 0,113 72 CV CPE/Ni-POA 91 73 SWV GCE/MWCNT 0,134 74 DPV GCE/POMA-Au 0,090 75 SWV CPE/GNPs 0,32 76
DPV GCE/f-MWCNT-Ni(OH)2 0,095 Este trabalho
GCE/Mn-SnO2– Eletrodo de carbono vítreo modificado com SnO2 dopados com Mn; CPE/ZrO2-NPs – Eletrodo de pasta de carbono modificado com nanopartículas de ZrO2;
CPE/POMA-MWCNT – Eletrodo de pasta de carbono modificado com poli(o-metoxianilina) e nanotubos de carbono;
CPE/Ni-POA – Eletrodo de pasta de carbono modificado com íons níquel(II) dispersos em poli(o- anisidina);
GCE/MWCNT – Eletrodo de carbono vítreo modificado com nanotubos de carbono;
GCE/POMA-Au – Eletrodo de carbono vítreo modificado com nanocompósito de poli(o-metoxianilina) e ouro;
39 5.3 Aplicação à Análise de Amostras Alimentícias
Com o objetivo de testar a aplicabilidade do eletrodo modificado, empregou-se a nova plataforma eletródica GCE/f-MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl- para a determinação de
FA em três diferentes amostras. A determinação voltamétrica de FA foi realizada pelo método da adição de padrão em célula eletroquímica contendo o eletrólito PBS 0,1 mol L-1 (pH = 7,0) e a amostra. Os voltamogramas e as respectivas curvas de adição de padrão
obtidas são apresentados na Figura 15. Sinais característicos do processo de oxidação para o analito são verificados, sendo que a intensidade de corrente de pico aumenta linearmente com o aumento da concentração de FA para cada adição de padrão.
Figura 15: Voltamogramas de pulso diferencial e curvas de adição de padrão para as amostras de (A) suplemento de FA; (B) fortificante de farinha de trigo e (C) farinha de trigo
(A) 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 i / A (E vs. Ag/AgCl) / V -1,2 -0,8 -0,40,00,0 0,4 0,8 1,2 1,6 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 i / [FA] / mol L-1 1,1 mol L-1 (B) 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 i / A (E vs. Ag/AgCl) / V -4 -2 00 2 4 6 8 10 1 2 3 4 i / A [FA] / mol L-1 2,98 mol L-1
40 (C) 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 i / A (E vs. Ag/AgCl) / V -0,9 -0,6 -0,3 0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,80,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 i / A [FA] / mol L-1 0,78 mol L-1 Fonte: O autor
A determinação foi feita em triplicata. Verificou-se que, na amostra de suplemento de FA, obteve-se uma concentração de 5,18 ± 0,21 mg por comprimido. Para as amostras de fortificante puro, composto por FA e Fe2+, e da farinha de trigo fortificada, os valores
de concentração encontrados foram de 0,32 ± 0,0011 g por 100 g de fortificante e 247 ± 22 g por 100 g de farinha de trigo, respectivamente.
Para fins comparativos e verificação da exatidão do método proposto, compararam-se os resultados obtidos àqueles gerados pela técnica de espectrometria de absorção molecular77. A Tabela 4 mostra os valores obtidos a partir das duas diferentes
técnicas bem como o erro relativo (ER%).
Tabela 04: Determinação de FA em três diferentes matrizes utilizando o método voltamétrico e o método espectrométrico.
Amostra Método voltamétrico* Método espectrométrico* ER(%)#
Suplemento de FA (mg/comprimido) 5,18 ± 0,21 4,85 ± 0,14 6,8 Fortificante de farinha (g por 100 g) 0,32 ± 0,0011 0,34 ± 0,0004 5,9 Farinha de trigo (g por 100 g) 247 ± 22 229 ± 45 7,8 *n = 3
#ER% = [(método voltamétrico – método espectrométrico) / método espectrométrico] x 100.78
Pelo emprego de duas técnicas baseadas em fundamentos diferentes, foram identificados baixos valores para o erro relativo. Ainda, é válido destacar que os resultados são concordantes, indicando que o método proposto e com base na nova plataforma eletródica GCE/f-MWCNT/Ni(OH)2-Si4Pic+Cl- é promissor para emprego
41 5 Conclusões
A síntese dos nanotubos de carbono de múltiplas paredes, funcionalizados e decorados com hidróxido de níquel, e dispersos em uma solução de polímero do tipo silsesquioxano apresentou ótimos resultados, permitindo que o nanocompósito fosse aplicado para a construção de eletrodos modificados.
Verificou-se que o eletrodo modificado com f-MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl
-apresentou a menor resistência à transferência de carga tornando-o mais condutor e mais suscetível à aplicação analítica. O eletrodo GCE/ f-MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl- foi
utilizado para a determinação de ácido fólico em amostras alimentícias por um processo oxidativo, sendo que o mecanismo proposto para a oxidação do FA na superfície eletródica do GCE/f-MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl- foi de uma reação irreversível,
difusional e com a transferência de dois mol de elétrons e dois mol de prótons.
A aplicação eletroanalítica foi feita através de voltametria de pulso diferencial e, com os parâmetros otimizados, construiu-se curva de calibração que apresentou resposta de corrente linear em duas faixas de trabalho: de 0,5 - 2,5 μmol L−1 e 7,3 - 26 μmol L−1.de
FA. Os limites de detecção e quantificação calculados foram adequados para a determinação de FA em alimentos fortificados.
O eletrodo apresentou características tais como alta sensibilidade, simplicidade e estabilidade de modificação, faixa linear de trabalho e baixos valores de limite de detecção. Pela obtenção de resultados concordantes entre o método voltamétrico e o método espectrométrico, o novo eletrodo demonstrou desempenho analítico satisfatório para a determinação de FA em amostras alimentícias.
Desta maneira, a nova plataforma eletródica proposta GCE/f-MWCNT-Ni(OH)2/Si4Pic+Cl- é promissora para emprego em protocolos de análise de rotina para
42 6 Referências
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