EFEITO DA L-ARGININA E GLICINA
NA PAREDE DO CÓLON IRRADIADO
– ESTUDO EXPERIMENTAL EM
RATOS
Orientadores: Prof. Dr. Francisco Lopes Paulo
Prof. Dr. Ruy Garcia Marques
Rio de Janeiro, RJ – Brasil
2010
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia e Ciências Cirúrgicas – FISIOCIRURGIA – da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, como requisito final para a obtenção do grau de Mestre
ETIENE DE AGUIAR PICANÇO
EFEITO DA L-ARGININA E GLICINA NA PAREDE
DO CÓLON IRRADIADO – ESTUDO
EXPERIMENTAL EM RATOS
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia e Ciências Cirúrgicas Faculdade de Ciências Médicas
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Rio de Janeiro, 05 de Maio de 2010.
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Waldemar Silva Costa (Presidente) Universidade do Estado do Rio de Janeiro Prof. Dr. Antonio Luiz de Araújo
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro Prof. Dr. Eduardo Haruo Saito
P585 Picanço, Etiene de Aguiar.
Efeito da L-arginina e glicina na parede do cólon irradiado – estudo experimental em ratos / Etiene de Aguiar Picanço. – 2009.
xii, 50f. il.
Orientadores: Francisco Lopes Paulo, Ruy Garcia Marques. Dissertação (Mestrado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas. Pós-graduação em Fisiopatologia e Ciências Cirúrgicas.
Bibliografia: f. 35-43.
1. Aminoácidos na nutrição - Teses. 2. Radioterapia - Teses. 3. Cólon (Anatomia) - Doenças - Teses. 4. Suplementos dietéticos -Teses. 5. Arginina - Teses. 6. Intestinos - Doenças – Radioterapia - Teses. I. Paulo, Francisco Lopes. II. Marques, Ruy Garcia. III. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
Reitor: Prof. Dr. Ricardo Vieiralves de Castro
Vice-reitora: Profª. Maria Christina Paixão Maioli
Sub-reitora de Pós-graduação e pesquisa: Profª. Dra. Mônica da Costa Pereira Lavalle Heilbron
Diretor do Centro Biomédico: Prof. Dr. Paulo Roberto Volpato Dias
Diretor da Faculdade de Ciências Médicas: Prof. Plínio José da Rocha
Coordenador do Programa de Pós-graduação em Fisiopatologia e Ciências Cirúrgicas (PG-FISIOCIRURGIA): Prof. Dr. Francisco José Barcellos Sampaio
Coordenador Adjunto do Programa de Pós-graduação em
Fisiopatologia e Ciências Cirúrgicas (PG-FISIOCIRURGIA): Prof. Dr. Ruy Garcia Marques
Ao meu pai, Aloisio Alves Picanço, e a minha mãe, Alaide de Aguiar Picanço, por estarem sempre ao meu lado, apoiando todas as minhas decisões. Ao meu irmão, Almir de Aguiar Picanço, por seu companheirismo e compreensão. Ao meu marido, Fábio Rabelo Porto, pelo incentivo. Ao meu filho Rafael.
AGRADECIMENTOS
Com a finalização desse trabalho, muitas pessoas merecem ser lembradas, pois de alguma maneira contribuíram para que essa etapa importante da minha vida fosse concluída.
Aos meus orientadores, Prof. Dr. Francisco Lopes-Paulo, pela oportunidade na participação da linha de pesquisa, da qual foi pioneiro, e Prof. Dr. Ruy Garcia Marques, pela atenção, cuidado e paciência em todas as etapas do trabalho, além do incentivo.
À doutoranda Cristina Fajardo Diestel, aluna da PG-FISIOCIRURGIA, por toda a ajuda, amizade e paciência, que me fez admirá-la, ainda mais, por sua força e, principalmente, disposição.
Ao doutorando Carlos Eduardo Rodrigues Caetano, também aluno da PG-FISIOCIRURGIA e médico veterinário do Laboratório de Cirurgia Experimental da Faculdade de Ciências Médicas da UERJ, pela realização dos procedimentos cirúrgicos dos animais.
Ao Sr. Afrânio Akreman e ao Luiz Fernando, físico e técnico em radiologia, respectivamente, do Centro Universitário de Controle do Câncer do Hospital Universitário Pedro Ernesto – UERJ, pelo auxílio na realização da irradiação dos animais.
Ao Prof. Dr. Waldemar Silva Costa, do Departamento de Anatomia Humana do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes – UERJ, pela inestimável ajuda no esclarecimento de dúvidas durante a análise estereológica e por disponibilizar seu laboratório para a realização dessas análises.
À minha família, pais, irmão, marido e filho, pelo incentivo, compreensão e, até mesmo, na tentativa de ajuda nas situações de desespero, em algumas etapas deste longo percurso.
graduação, por toda trajetória, com situações tristes, engraçadas, desesperadoras, satisfatórias, mas, acima de tudo, de plena aprendizagem.
À doutoranda Helena Maria Figueiredo Pazos e à bolsista de iniciação científica Juliane Moraes, pelos ensinamentos técnicos e pela amizade que se construiu diante do tempo que esperávamos corar as lâminas.
Aos amigos Jorge Luiz Medeiros Júnior e Bruno Félix Patrício, mestrando e mestre, respectivamente, também desta pós-graduação, pela paciência com minhas intermináveis perguntas sobre o manejo com o microscópio, com os programas do computador e opinião sobre as fotos, além das dicas sobre o curso do trabalho.
À minha eterna chefe e amiga Abigail Geraisste e às amigas nutricionistas do Hospital Carlos Chagas, que me apoiaram e principalmente torceram por mim quando tudo isso era apenas um sonho.
À minha chefe Marília e às novas amigas do Hospital Cardoso Fontes, pela amizade e companheirismo.
Às amigas nutricionistas Dalila Alves Peçanha, Liliane Cristina da Silva Lobo, Roberta Abreu Côrtes, Tatiana Abirached Junqueira Lopes e Thais Locha Zangali Vargas, que me incentivam, cada uma à sua maneira, desde a graduação.
ÍNDICE
Página LISTA DE TABELA
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS RESUMO ABSTRACT 1 – INTRODUÇÃO 1 2 – OBJETIVO 6 3 – MÉTODO 7 3.1 – Animais e grupos 7
3.2 – Composição da ração oferecida 8
3.3 – Suplementação de aminoácidos 9
3.4 – Ingestão de ração e água e variação do peso 9
3.5 – Irradiação abdominal 10
3.6 – Extração dos segmentos intestinais 10
3.7 – Processamento histológico 11
3.8 – Estudo estereológico 11
3.9 – Análise estatística 13
3.10 – Aspectos éticos nos cuidados com os animais 13
4 – RESULTADOS 14
4.1 – Evolução dos animais 4.1.1 – Peso dos animais 4.1.2 – Ingestão de ração 4.1.3 – Ingestão de água 14 14 15 16
4.2.1 – Volume total da parede do cólon 17 4.2.2 – Volumes parciais das camadas mucosa, muscular
da mucosa, submucosa e muscular própria
18
4.2.3 – Volumes parciais do epitélio e da lâmina própria da mucosa
22
4.2.4 – Superfície epitelial da mucosa 23
5 – DISCUSSÃO 25 6 – CONCLUSÃO 34 7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 35 APÊNDICE ANEXO 44 50
LISTA DE TABELAS
Página Tab. 1. Composição da ração oferecida aos animais. 9 Tab. 2. Análise descritiva do percentual de variação do peso corporal
nos grupos de animais.
15
Tab. 3. Análise descritiva da ingestão total de ração (g) nos grupos. 16 Tab. 4. Análise descritiva da ingestão total de água (ml) nos grupos. 17 Tab. 5. Análise descritiva do volume total da parede do cólon nos
grupos de animais.
18
Tab. 6. Análise descritiva do volume parcial da camada mucosa da parede do cólon (%) nos grupos.
20
Tab. 7. Análise descritiva do volume parcial da camada muscular da mucosa da parede do cólon (%) nos grupos.
21
Tab. 8. Análise descritiva do volume parcial da camada submucosa da parede do cólon (%) nos grupos.
21
Tab. 9. Análise descritiva do volume parcial da camada muscular própria (%) da parede do cólon nos grupos.
21
Tab. 10. Análise descritiva do volume parcial do epitélio da mucosa do cólon (%) nos grupos.
22
Tab. 11. Análise descritiva do volume parcial da lâmina própria da camada mucosa do cólon (%) nos grupos de animais.
22
Tab. 12. Análise descritiva da superfície epitelial da mucosa do cólon (mm-1) nos grupos de animais.
Página Fig. 1. Sistema-teste tipo ciclóide, utilizado para a análise estereológica
sob aumento de 100 X e 400 X.
12
Fig. 2. Peso dos animais no início do experimento (A) e percentual de ganho ou alteração de peso nos diversos grupos do estudo (B).
14
Fig. 3. Ingestão de ração dos animais dos diversos grupos durante o estudo.
15
Fig. 4. Ingestão de água dos animais dos diversos grupos durante o estudo.
16
Fig. 5. Comparação do volume total da parede do cólon entre os grupos de animais.
17
Fig. 6. Fotomicrografia da parede do cólon dos grupos Controle (A), Irradiado (B), Arginina (C) e Glicina (D) sob aumento de 100 X.
19
Fig. 7. Comparação dos percentuais dos volumes parciais das camadas mucosa (A), muscular da mucosa (B), submucosa (C) e muscular própria (D) da parede do cólon entre os grupos de animais.
20
Fig. 8. Comparação do volume parcial do epitélio (%) (A) e da lâmina própria (B) da mucosa do cólon entre os grupos de animais.
23
Fig. 9. Comparação da superfície epitelial (mm -1) da mucosa do cólon entre os grupos de animais.
23
Fig. 10. Fotomicrografia da camada mucosa da parede do cólon dos grupos Controle (A), Irradiado (B), Arginina (C) e Glicina (D) sob aumento de 400 X.
LISTAS DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
µg – micrograma µm – micrômetro
ANOVA – análise de variância cGy – centigrays
cNOS – Constitutive Nitric Oxide Synthase (óxido nítrico sintase constitutiva) d – comprimento do arco ciclóide do sistema-teste
DP – desvio padrão
I epi – número total de intercessões
iNOS – Inducible Nitric Oxide Synthase (óxido nítrico sintase indutiva) L – levógero (ex. L-arginina)
máx – máximo
MeV – megaelectron volt mín – mínimo
mm-1 – 1 / milímetro
n – tamanho da amostra
NO – nitric oxide (óxido nitrico)
P epi – número total de pontos da grade que incidem sobre o epitélio UERJ – Universidade do Estado do Rio de Janeiro
A radioterapia é amplamente utilizada no tratamento de tumores pélvicos, incluindo os de bexiga, intestino e reto. Ela apresenta efeitos danosos, notadamente em tecidos que apresentam intensa renovação celular, sendo a mucosa intestinal altamente susceptível. Nesse contexto, a suplementação dietética com aminoácidos tem se mostrado uma terapia promissora para minimizar este dano. O objetivo desse estudo foi determinar o efeito da suplementação dietética com os aminoácidos L-arginina e glicina na estrutura da parede do cólon de ratos submetidos a irradiação abdominal. Quarenta ratos Wistar machos adultos foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos, cada um com dez animais: I – controle não irradiado e sem suplementação de aminoácidos; II – controle irradiado e sem suplementação de aminoácidos; III – irradiado e suplementado com L-arginina; IV – irradiado e suplementado com glicina. O período de suplementação dietética foi de 14 dias, com a irradiação ocorrendo no 8.º dia do experimento. A análise estereológica mostrou que a irradiação provocou diminuição do volume total da parede colônica dos animais dos grupos II e III em relação aos animais saudáveis, mas não dos ratos que receberam suplementação de glicina. A camada mucosa dos animais irradiados de todos os grupos diminuiu quando comparada com os ratos saudáveis não irradiados. Os animais irradiados que não receberam suplementação de aminoácido apresentaram diminuição da camada muscular da mucosa, quando comparados com os grupos I e IV, e o grupo de ratos suplementados com glicina apresentou aumento significativo da camada submucosa em relação aos grupos I e II. Os animais do grupo III mostraram diminuição da camada muscular própria em comparação aos grupos I e IV. A suplementação com L-arginina foi eficaz na manutenção do volume parcial do epitélio da camada mucosa. Nossos resultados
sugerem que a suplementação de glicina apresentou efeitos superiores ao da suplementação com L-arginina na estrutura da parede colônica, haja
vista que foi capaz de manter a espessura da parede e a superfície epitelial
da mucosa, enquanto a L-arginina foi capaz de manter o volume parcial do epitélio e a superfície epitelial, mas não o volume total da parede intestinal.
Radiotherapy is widely used for the treatment of pelvic tumors, including malignancies of the bladder, intestine, and rectum. Radiotherapy has harmful effects, especially on tissues with intense cellular turnover, with the intestinal mucosa being highly susceptible. Within this context, dietary amino acid supplementation has proved to be a promising therapy for the minimization of this damage. The objective of the present study was to determine the effect of dietary supplementation with the amino acids L-arginine and glycine on the structure of the colon wall of rats submitted to abdominal irradiation. Forty male Wistar rats were randomly assigned to four groups of ten animals each: I – non-irradiated control with no amino acid supplementation, II – irradiated control with no amino acid supplementation, III – irradiated group supplemented with L-arginine, and IV – irradiated group supplemented with glycine. The animals received dietary supplementation for 14 days, with irradiation being applied on the
8th day of the experiment. Stereologic analysis showed that irradiation
induced a reduction of the total volume of the colon wall of group II and III animals compared to healthy controls, but not of group IV. The mucosal layer of the irradiated animals of all groups was reduced compared to healthy non-irradiated animals. The irradiated animals that did not receive amino acid supplementation presented reduction of the muscle layer of the mucosa compared to groups I and IV, and the group of rats supplemented with glycine presented a significant increase of the submucosal layer compared to groups I and II. Group III animals showed a reduction of the muscularis propria layer compared to groups I and IV. Supplementation with L-arginine was effective in maintaining the partial volume of the epithelium of the mucosal layer. The present results suggest that glycine supplementation had a superior effect on the structure of the
colon wall of rats submitted to abdominal irradiation compared to L-arginine supplementation since it was able to maintain the thickness of the wall and the epithelial surface of the mucosa, whereas L-arginine maintained the partial volume of the epithelium and the epithelial surface, but not the total volume of the intestinal wall.
1 – INTRODUÇÃO
O câncer é uma enfermidade crônica multifatorial, caracterizada pelo crescimento descontrolado de células. Sua prevenção tem tomado uma dimensão importante no campo da ciência, haja vista que se constitui na primeira causa de mortalidade do mundo [1-3]. Nesse contexto, os tumores
de cólon e reto encontram-se entre os mais incidentes [4-6].
Uma das opções para o tratamento de tumores pélvicos, incluindo os de bexiga, intestino e reto, é a terapia por radiação ou radioterapia [7]. Envolve o uso de raios-X, gerados a partir de aceleradores lineares, e raios gama, gerados a partir de isótopos radioativos de alta energia, para destruir as células cancerosas, com ação local, atingindo as regiões que estão sendo tratadas e tentando preservar as áreas sadias adjacentes [8]. A adequação do tratamento é traduzida pelo prolongamento da expectativa de vida, sendo utilizada, no período pré-operatório, com o objetivo de diminuir a massa tumoral, e, no período pós-operatório, para evitar a recorrência da doença [9-10].
A resposta dos tecidos à radiação depende de inúmeros fatores, como a sensibilidade do tumor, sua localização e oxigenação, assim como a qualidade, a quantidade e o tempo de administração da radiação [11]. A radioterapia ocasiona dano variável ao tecido sadio, podendo causar enterite e/ou proctite [12], evidenciadas pela diminuição da atividade proliferativa nas criptas [13], diminuição da renovação das células nas vilosidades e de sua espessura, e, conseqüentemente, limitação da superfície absortiva da mucosa [11,14].
O dano tecidual causado pela radiação é cumulativo e progressivo e
certas enfermidades associadas, que influenciam diretamente na perfusão
sanguínea, como o diabetes mellitus e hipertensão arterial, assim como procedimentos cirúrgicos abdominais prévios, podem aumentar a
2
predisposição do paciente à enterite actínica [15-17].
A radiação tem efeitos mais danosos em tecidos que possuem intensa renovação celular, sendo a mucosa intestinal bastante susceptível aos danos causados por essa terapia [18]. O íleo terminal, cólon e o reto são os locais que mais frequentemente sofrem danos causados pela radioterapia pélvica, enquanto o jejuno e íleo proximal raramente são envolvidos [19].
Ela acarreta danos à mucosa intestinal, o que pode limitar a eficácia
do tratamento, comprometendo a qualidade de vida do paciente, por
provocar uma série de sintomas, como vômitos, dor abdominal e diarreia [20-22]. Além disso, também determina mudanças histológicas agudas, aumento do infiltrado inflamatório da lâmina própria e, mesmo, ulcerações [19]. Um dos resultados desses acometimentos é a translocação bacteriana, decorrente do aumento da permeabilidade intestinal e do crescimento bacteriano, e diminuição dos movimentos peristálticos [23], tendo como consequências o advento de lesão da mucosa intestinal e sepse [24].
Os sintomas decorrentes das lesões actínicas colorretais podem ser classificados em agudos e crônicos. A fase aguda é caracterizada por náuseas, vômitos e diarreia, com intensidade diretamente relacionada à dose de irradiação, ao tempo (frequência e duração) de tratamento e ao
volume de massa corpórea irradiada [11,25]. A fase crônica pode ocorrer
após alguns meses ou até mesmo após vários anos, e se manifesta pela
ocorrência de estenoses, hemorragias, perfurações agudas e fístulas [25], sendo que, geralmente, os efeitos crônicos adversos são proporcionais à gravidade da lesão aguda [10,11,15].
Os efeitos colaterais precoces e tardios da radioterapia sobre os órgãos pélvicos próximos ao órgão alvo são fatores que comprometem a qualidade de vida do paciente. Portanto, os cuidados para diminuir estes efeitos e proteger o intestino dos acometimentos da fase aguda são tão relevantes quanto a sua indicação e utilização precisas [10,11].
A profilaxia medicamentosa não vem se mostrando eficaz na
prevenção da enterite por irradiação e, por vezes, pode determinar piora no
quadro de diarreia [15]. Muitos tipos de dietas têm sido testadas para
minimizar as complicações da irradiação e, dessa forma, diminuir a carga
de bactérias patogênicas, pelo estímulo do sistema imune e pelo reparo
tecidual [23,26,27]. Nesse aspecto, a suplementação dietética com
nutrientes específicos, como o aminoácido L-arginina, tem sido estudada como uma terapia promissora [11,23].
A L-arginina é um aminoácido dibásico, não-essencial, isto é, que pode ser sintetizado por indivíduos adultos em condições fisiológicas de homeostase [28]. Este aminoácido exerce importantes ações metabólicas, notadamente no sistema imune, sendo classificado como condicionalmente essencial em situações de trauma e estresse [23,29-31]. Isto pode ocorrer devido a uma série de fatores, incluindo uma taxa aumentada de degradação de L-arginina, redução na ingestão alimentar e, mesmo, na
diminuição da sua absorção intestinal [32].
Constitui-se em um metabólito intermediário do ciclo da ureia, sendo a citrulina, sintetizada pelos rins, sua principal fonte endógena. O fato do metabolismo da glutamina no tubo digestório também originar a citrulina pode explicar algumas respostas semelhantes desses dois aminoácidos [30]. Ela age como um potente estimulador do sistema endócrino, ao aumentar a secreção de hormônio do crescimento, prolactina, insulina e glucagon. Pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos, porém essa função pode explicar os efeitos metabólicos positivos da L-arginina após trauma e infecção, e, particularmente, a sua função na cicatrização [30,33,34].
A L-arginina encontra-se envolvida na síntese protéica, na biossíntese de aminoácidos e de seus derivados, e no metabolismo da ureia, sendo essencial a detoxicação da amônia [28,30,33,35]. Também se constitui em um precursor biológico de óxido nítrico, que desempenha papel importante
4
no controle da hipertensão, disfunção miocárdica, inflamação, morte celular e na proteção contra danos oxidativos [36].
Pesquisas vêm sendo desenvolvidas com o óxido nítrico, notadamente por seu efeito no sistema imune e por proporcionar proteção a tecidos após isquemia e reperfusão, diminuindo a lesão e o acúmulo de neutrófilos [37]. Em inúmeros órgãos, a L-arginina vem sendo utilizada, com sucesso, para aumentar a síntese basal de óxido nítrico, reduzindo, dessa forma, a lesão causada pela isquemia [33,35].
O efeito imunomodulador da L-arginina vem sendo amplamente pesquisado e descrito por muitos autores [11,23,34,35,38]. Tem sido sugerido que a sua suplementação oral ou enteral poderia determinar a ocorrência de efeitos protetores na mucosa intestinal no período pós-irradiação, acelerando a cicatrização, prevenindo a translocação bacteriana e a perda de peso, podendo, dessa forma, amenizar a enterite decorrente de irradiação [11,23].
Até recentemente, outro aminoácido, a glicina, vinha sendo utilizado como aminoácido controle em experimentos com aminoácidos específicos, como a L-glutamina e a L-arginina, com o objetivo de isonitrogenar as dietas [29,39-41]. Contudo, tem-se verificado que a glicina apresenta
propriedade anti-inflamatória, imunomodulatória e citoproterora
[39,40,42].
Ela consiste no menor e mais simples aminoácido, classificado como não-essencial, e é composta por uma molécula de carbono ligada a um grupo amina e a um grupo carboxila [39,40,42]. O efeito protetor da glicina foi demonstrado em modelos experimentais de algumas doenças, como hepatite alcoólica [43], artrite [44], isquemia [40,45], transplante hepático e
tumores em geral [46]. Os mecanismos pelo qual esse aminoácido age
ainda não são inteiramente conhecidos, mas a inibição da ativação de células inflamatórias e imunes [47-48], diminuição da formação de radicais
livres e de outros mediadores tóxicos, assim como o bloqueio da permeabilidade da membrana plasmática, são algumas das possibilidades que podem justificar os seus benefícios [40].
O papel dos aminoácidos L-arginina e glicina na proteção e no reparo da enterite actínica aguda vem sendo pesquisado por inúmeros autores [11,23,29,41]. Contudo, os dados acerca de sua atuação ainda são insuficientes e inconclusivos, notadamente no que se refere a sua função no reparo da parede colônica após radioterapia.
6
2 – OBJETIVO
2.1 – Objetivo geral
Determinar o efeito da suplementação dietética com os aminoácidos L-arginina e glicina na estrutura da parede do cólon de ratos adultos submetidos à irradiação abdominal.
2.2 – Objetivos específicos
Avaliar se a suplementação com L-arginina e glicina interfere no ritmo de ganho ponderal e na ingestão de água e de ração de ratos submetidos a irradiação abdominal;
Comparar a eficácia da suplementação dos aminoácidos L-arginina e glicina na prevenção ou redução das alterações estruturais na parede do intestino dos ratos submetidos à irradiação abdominal.
3 – MÉTODO
Foi utilizado um modelo experimental com ratos Wistar submetidos à irradiação abdominal, com ou sem suplementação nutricional com os aminoácidos L-arginina e/ou glicina. A avaliação foi realizada por estereologia, a partir de um segmento colônico, sendo verificados o volume total e os volumes parciais de cada camada, assim como os volumes parciais do epitélio, da lâmina própria e a superfície epitelial da camada mucosa.
A experimentação ocorreu no Laboratório de Cirurgia Experimental da Faculdade de Ciências Médicas, com a colaboração de docentes do Departamento de Anatomia Humana do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes e do Setor de Radioterapia do Centro Universitário de Controle do Câncer do Hospital Universitário Pedro Ernesto – Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ).
3.1 – Animais e grupos
Foram utilizados 40 ratos Wistar machos albinos adultos (Rattus
novergicus), com peso inicial entre 270 e 330 gramas. Os animais foram
distribuídos, aleatoriamente, em quatro grupos de estudo, cada um com dez animais:
Grupo I – Controle – animais saudáveis, não submetidos à irradiação abdominal;
Grupo II – Controle – animais submetidos à irradiação abdominal; Grupo III – animais submetidos à irradiação abdominal e a suplementação dietética com L-arginina;
Grupo IV – animais submetidos à irradiação abdominal e a suplementação dietética com glicina.
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O experimento teve duração de 14 dias e os animais do grupo I, utilizados como controle para a análise estereológica da parede colônica normal, foram mantidos em condições-padrão de laboratório, enquanto os animais dos grupos II, III e IV sofreram irradiação abdominal no 8.° dia do experimento. Os animais dos grupos III e IV receberam suplementação nutricional de L-arginina ou glicina durante os 14 dias do experimento. No 15.º dia, os animais de todos os grupos foram submetidos à laparotomia para ressecção de segmento colônico, visando à realização da estereologia.
Todos os animais foram oriundos do Biotério do Laboratório de Cirurgia Experimental da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade do Estado do Rio de Janeiro e receberão ração apropriada para ratos
(Focus®, Focus 1722 Roedores Ltda) e água ad libitum.
Os ratos foram alojados em gaiolas apropriadas, cada uma com cinco
animais, em biotério climatizado, com fotoperíodos diários (claro-escuro)
de 12 horas.
3.2 – Composição da ração oferecida
Todos os grupos de animais receberam a ração Focus® (Focus 1722
Roedores Ltda), de acordo com as recomendações do American Institute of
Nutrition Rodents Diets (1993) [49]. Esta ração é composta por cloreto de sódio, milho integral moído (8% de proteína bruta), farelo de soja (47% de proteína bruta), farelo de trigo (14% de proteína bruta), fosfato bicálcico (19% de fosfato e 23% de cálcio), carbonato de cálcio (39% de cálcio), DL-metionina, L-lisina, HCL (Tab.1), aditivo antioxidante e premix mineral vitamínico (vitamina A, vitamina E, vitamina K, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, vitamina B12, niacina, ácido pantotênico, ácido fólico, biotina, colina, ferro, zinco, cobre, iodo, manganês, selênio e cobalto). A quantidade exata utilizada dos ingredientes não é fornecida pelo fabricante, somente os seus percentuais máximo ou mínimo. (Tab. 1)
Tab. 1. Composição da ração oferecida aos animais. Característica / ingredientes Percentuais (%) Umidade (máx) 13 Proteína bruta (mín) 22,0 Extrato etéreo (mín) 4,0 Matéria mineral (máx) 9,0 Matéria fibrosa (máx) 8,0 Cálcio (máx) 1,4 Fósforo (mín) 0,8 * máx – máximo; mín – mínimo 3.3 – Suplementação de aminoácidos
Os animais do grupo III e IV receberam suplementação dietética de
L-arginina (L-arginine® – Sigma Aldrich) e/ou glicina (Glicina® – Vetec
Química Fina Ltda), na dose de 0,65 g/kg/dia. A dose diária foi preparada em solução aquosa, em concentração de 4%, perfazendo volume final de 5 ml, administrados por via intragástrica, em bolus, com a utilização de um cateter orogástrico, uma vez ao dia, sempre no mesmo horário.
Os animais dos grupos I (saudáveis) e II (submetidos à irradiação
abdominal, sem suplementação com aminoácidos), receberam 5 ml de água
filtrada, por via intragástrica, durante os 14 dias da experimentação, administrados da mesma forma descrita anteriormente, sempre no mesmo horário.
3.4 – Ingestão de ração e água e variação do peso
O peso dos ratos, bem como a ingestão de ração e água, foram verificados diariamente, sempre no mesmo horário.
10
AdventureTM – Ohaus®). O consumo de ração foi aferido pelo controle do
resto-ingestão da ração fornecida. A água foi ofertada em recipientes graduados em mililitros, sendo o consumo também aferido pelo controle do resto-ingestão.
3.5 – Irradiação abdominal
Os animais dos grupos II, III, IV e V foram imobilizados em
recipientes plásticos e submetidos a dose única de irradiação de 1.164 cGy, no 8.° dia da experimentação. A irradiação foi liberada a partir de um
acelerador linear de 6 MeV (modelo Clinac 2100® – Varian®), a uma
velocidade de liberação de 240 cGy/minuto, aplicados sobre o abdome, em um campo de 6 x 4 cm, com distância fonte-pele de 100 cm. A dose foi ajustada para 1.164 cGy, a 3 cm da pele (normalização da dose), e liberada no sentido dorsal. Os ratos foram irradiados com o tórax, cabeça e extremidades situando-se fora da área de irradiação.
3.6 – Extração dos segmentos intestinais
No 15.º dia do experimento, os animais foram operados, sob
anestesia geral com tiopental sódico (Tiopental® – Abbott®), na dose de 50
mg/kg de peso corporal, por via intraperitoneal.
O acesso à cavidade abdominal foi realizado por laparotomia mediana, com cerca de 3 cm de extensão. Em seguida, realizou-se a ressecção do segmento colônico, com cerca de 2 cm, distando entre 6 e 8 cm da margem anal, distância esta demarcada pela introdução, através do
orifício anal, de um cateter 20G (Becton-Dickinson®), com graduação em
centímetros.
Seguiu-se a morte dos animais, por sobredose anestésica (tiopental sódico). Procedeu-se a laparorrafia, em dois planos (peritônio-aponeurótico e pele), com suturas contínuas, utilizando fio cirúrgico de polipropileno 2-0
(Prolene® – Ethicon®).
3.7 – Processamento histológico
Os segmentos intestinais foram abertos no sentido longitudinal,
lavados em soro fisiológico para a retirada de detritos fecais, e distendidos sobre cortiça. A fixação foi realizada em solução de formol tamponado a 10%, por um período de 24 horas, sendo o material, em seguida, desidratado em uma série crescente de álcoois e incluído em parafina. Durante a inclusão, as peças, com formato plano e regular, foram posicionadas perpendicularmente ao plano da microtomia. Dessa forma, obteve-se cortes aproximadamente perpendiculares à parede intestinal.
De cada segmento intestinal, foram realizados 16 cortes, com 4 μm cada. Em seguida, oito cortes foram submetidos à coloração tricrômica de Gomori, sendo montados entre lâmina e lamínula, com resina sintética.
3.8 – Estudo estereológico
Os cortes histológicos foram analisados em sistema de microscópio
computadorizado, composto por microscópio óptico biológico (BH-2® –
Olympus®) dotado de objetivas planas acromáticas. A ocular foi acoplada a
uma câmera de vídeo (Olympus® DP70), que transmitia as imagens a um
microcomputador, com exibição das imagens em um monitor de 22 polegadas, com dot pitch 0,23 e aumento final entre 100 e 400 vezes. A análise estereológica foi realizada em campos aleatórios, em um total de oito campos por animal.
Sob aumento de 100 vezes, foram analisados o volume total da parede do cólon e os volumes parciais das camadas mucosa, muscular da mucosa, submucosa e muscular própria. Sob aumento de 400 vezes, foram analisados os volumes parciais ocupados na mucosa pelo epitélio e pela lâmina própria, e também foi determinada a superfície epitelial, por mm³ de
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mucosa. Essas análises foram praticadas por superposição de um sistema-teste tipo ciclóide (Fig. 1), composto por 35 arcos ciclóides e 70 pontos, as imagens dos cortes da parede colônica.
Fig. 1. Sistema-teste tipo ciclóide, utilizado para a análise estereológica, sob aumento de 100 X e 400 X [51].
Na análise do segmento colônico, considerou-se como “plano horizontal” o limite entre as camadas mucosa e submucosa, para a compensação da anisotropia. Os volumes parciais do epitélio e da lâmina própria foram calculados pela razão entre o número de pontos da grade que incidiam sobre cada um deles e o número total de pontos da grade. Para o cálculo da área de superfície epitelial, foi utilizado o número de pontos de intercessão entre os arcos ciclóide deste sistema-teste e as criptas de Lieberkühn, de acordo com a fórmula de Weibel (1979) [50], onde I epi corresponde ao número total de intercessões, P epi ao número total de pontos da grade que incidem sobre o epitélio e d ao comprimento do arco ciclóide da grade utilizada:
4 I epi Sv =_______________
3.9 – Análise estatística
As análises estatísticas visaram à comparação do grau de manutenção das características estruturais da parede do cólon dos ratos (volume total da parede do cólon, volumes parciais das camadas mucosa, muscular da mucosa, submucosa e muscular própria, volume parcial do epitélio e lâmina própria da mucosa e superfície epitelial) dos diferentes grupos de animais em estudo.
A comparação dos grupos, considerando as variáveis acima citadas, foi realizada pelo teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pelo pós-teste de Dunn (usado para comparação dos grupos, dois a dois); a variação do peso e ingestão de água e ração foi realizada por análise de variância (ANOVA) – teste paramétrico – e pelo pós-teste de Tukey (usado para comparação dos grupos, dois a dois).
As análises foram realizadas com a utilização do programa estatístico
GraphPad Prism 4® – 2003 [52]. Em todas as análises, um valor de p≤0,05 foi estabelecido para a rejeição da hipótese nula de similaridade entre os grupos.
3.10 – Aspectos éticos nos cuidados com animais
O projeto desta pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
Todos os procedimentos seguiram, rigorosamente, a regulamentação existente sobre experimentação com animais [53,54].
14
4 – RESULTADOS
4.1 – Evolução dos animais
Após a irradiação, um animal do grupo III (submetido à irradiação e suplementado com L-arginina) evoluiu para óbito. Nesse grupo, a análise foi realizada com nove animais.
4.1.1 – Peso dos animais
No início do experimento (D=0), os animais de todos os grupos não
apresentaram diferença quanto ao seu peso corporal (p>0,05).(Fig. 2A)
Fig. 2. Peso dos animais no início do experimento (A) e percentual de ganho ou alteração de peso nos diversos grupos do estudo (B).
Ao final do experimento, os animais dos grupos II (submetidos à irradiação e sem suplementação de aminoácidos), III (submetidos à irradiação e suplementados com L-arginina) e IV (submetidos à irradiação e suplementados com glicina) apresentaram perda de peso significante quando comparados aos ratos do grupo I – saudáveis (p<0,001 para todos) (Fig. 2B e Tab. 2) -20 -10 0 10 p<0,001 p<0,001 p<0,001 Controle Irradiado (I) I + Arginina I + Glicina % 0 50 100 150 200 250 300 350 p>0.05 Controle Irradiado (I) I + Arginina I + Glicina g A B
Tab. 2. Análise descritiva do percentual de variação do peso corporal nos grupos de animais.
Grupos n Média DP Mínimo Mediana Máximo
I 10 7,07 2,13 3,84 6,54 10,66
II 10 -12,36 9,47 -26,85 -9,71 -1,83
III 09 -9,54 10,47 -26,11 -10,36 3,48
IV 10 -9,49 9,05 -22,51 -7,51 6,28
n – tamanho da amostra; DP – desvio padrão
4.1.2 – Ingestão de ração
Após a irradiação abdominal, observou-se uma diminuição do consumo de ração nos ratos dos grupos submetidos a esse procedimento, o que se refletiu numa ingestão total de ração menor nos animais dos grupos II, III e IV em comparação aos do grupo I (p<0,001 para todos os casos). Os animais do grupo IV também ingeriram menor quantidade de ração em relação aos ratos do grupo II (p<0,001). (Fig. 3 e Tab. 3)
0 50 100 150 200 250 300 350 p<0,001 p<0,001 p<0,001 p<0,001 Controle Irradiado (I) I + Arginina I + Glicina g
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Tab. 3. Análise descritiva da ingestão total de ração (g) nos grupos de animais.
Grupos n Média DP Mínimo Mediana Máximo
I 10 339,58 12,50 327,72 339,58 351,43
II 10 267,17 18,94 249,20 267,17 285,13
III 09 249,60 23,16 234,12 234,24 280,48
IV 10 229,35 22,51 201,61 222,23 259,72
n – tamanho da amostra; DP – desvio padrão
4.1.3. Ingestão de água
Os animais do grupo II ingeriram quantidade significantemente menor de água que os animais do grupo III (p<0,01), não observando diferença
entre os ratos dosdemais grupos. (Fig. 4 e Tab. 4)
0 100 200 300 400 500 600 700 mL p<0,01 Controle Irradiado (I) I + Arginina I + Glicina
Tab. 4. Análise descritiva da ingestão total de água (ml) nos diferentes grupos de animais.
n- tamanho da amostra; DP – desvio padrão
4.2 – Estudo estereológico
4.2.1 – Volume total da parede do cólon
A radioterapia promoveu a diminuição do volume total da parede do cólon nos ratos dos grupos II e III em relação ao grupo I – controle (p< 0,01 e p<0,001, respectivamente). Os animais do grupo IV (submetidos à irradiação abdominal e a suplementação com glicina) apresentaram volume total da parede do cólon maior que os animais do grupo III (submetidos à irradiação abdominal e a suplementação com arginina) (p<0,05), porém sem diferença quando comparados aos ratos do grupo I (saudáveis). (Figs. 5 e 6 e Tab. 5) 0 10 20 30 40 50 60 70 p<0,01 p<0,001 p<0,05 Controle Irradiado (I) I + Arginina I + Glicina
Fig. 5. Comparação do volume total da parede do cólon entre os grupos de animais
Grupos n Média DP Mínimo Mediana Máximo
I 10 542,00 9,49 533,00 542,00 551,00
II 10 456,00 28,46 429,00 456,00 483,00
III 09 608,00 171,41 446,00 620,00 816,00
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Tab. 5. Análise descritiva do volume total da parede do cólon nos diferentes grupos de animais.
Grupos n Média DP Mínimo Mediana Máximo
I 10 61,52 3,55 55,13 62,82 65,25
II 10 54,12 4,80 46,88 53,38 63,25
III 09 50,07 3,22 45,88 50,50 54,88
IV 10 57,53 2,00 54,50 57,69 60,88
n – tamanho da amostra; DP – desvio padrão
4.2.2 – Volumes parciais das camadas mucosa, muscular da mucosa, submucosa e muscular própria
A análise do volume parcial das diversas camadas histológicas da parede colônica evidenciou diminuição da camada mucosa nos animais dos
grupos II (p<0,05),III (p<0,01) e IV (p<0,001), quando comparados aos do
Fig. 6. Fotomicrografias da parede do cólon, submetidas à coloração tricrômica de Gomori, dos grupos Controle (A), Irradiado (B), L-arginina (C) e Glicina (D), sob aumento de 100 X.
No tocante ao volume da camada muscular da mucosa, ele se mostrou significantemente menos nos ratos do grupo II, quando comparados aos animais dos grupos I (p<0, 001) e IV (p<0,01). (Fig. 7B e Tab. 7)
A análise estereológica da camada submucosa dos animais do grupo IV evidenciou um aumento no volume em comparação aos grupos I (p<0,01) e II (p<0,05). (Fig. 7C e Tab. 8)
No que se refere ao volume da camada muscular própria, ele se revelou significantemente menor nos animais do grupo III quando comparados aos grupos I e IV (p<0,001 e p<0,01, respectivamente). (Fig. 7D e Tab. 9)
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Fig. 7. Comparação dos percentuais dos volumes parciais das camadas mucosa (A), muscular da mucosa (B), submucosa (C) e muscular própria (D) da parede do
cólon entre os grupos de animais.
Tab. 6. Análise descritiva do volume parcial da camada mucosa da parede do cólon (%) nos diferentes grupos de animais.
Grupos n Média DP Mínimo Mediana Máximo
I 10 39,04 2,31 36,13 39,07 44,13
II 10 34,77 3,65 27,88 35,57 39,88
III 09 32,36 3,59 26,63 34,00 37,13
IV 10 32,47 2,89 27,38 31,82 38,25
n – tamanho da amostra; DP – desvio padrão
0 10 20 30 40 Controle Irradiado (I) I + Arginina I + Glicina p<0,05 p<0,01 p<0,001 % 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Controle Irradiado (I) I + Arginina I + Glicina p<0,001 p<0,01 % 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 p<0,01 p<0,05 Controle Irradiado (I) I + Arginina I + Glicina % 0 5 10 15 p<0,001 Controle Irradiado (I) I + Arginina I + Glicina p<0,01 % A B C D
Tab. 7. Análise descritiva do volume parcial da camada muscular da mucosa da parede do cólon (%) nos diferentes grupos de animais.
Grupos n Média DP Mínimo Mediana Máximo
I 10 3,14 0,27 2,63 3,19 3,38
II 10 2,04 0,58 1,25 2,25 2,75
III 09 2,53 0,47 2,00 2,63 3,50
IV 10 3,08 0,40 2,25 3,13 3,50
n – tamanho da amostra; DP – desvio padrão
Tab. 8. Análise descritiva do volume parcial da camada submucosa da parede do cólon (%) nos diferentes grupos de animais.
Grupos N Média DP Mínimo Mediana Máximo
I 10 6,17 2,23 3,75 5,88 9,88
II 10 6,65 1,64 4,00 7,07 8,75
III 09 8,59 1,34 6,50 8,38 11,25
IV 10 10,08 3,04 5,00 10,57 14,75
n – tamanho da amostra; DP – desvio padrão
Tab. 9. Análise descritiva do volume parcial da camada muscular própria (%) da parede do cólon nos diferentes grupos de animais.
Grupos N Média DP Mínimo Mediana Máximo
I 10 13,18 2,50 8,25 13,38 16,63
II 10 10,67 2,32 6,75 11,00 13,88
III 09 6,60 1,48 4,25 6,75 8,38
IV 10 11,92 2,20 8,50 11,26 15,25
22
4.2.3 – Volumes parciais do epitélio e da lâmina própria da mucosa
Na avaliação do volume parcial do epitélio da camada mucosa observou-se que os animais dos grupos II e IV apresentaram redução desse parâmetro em comparação aos ratos do grupo I (p<0,001 e p<0,01; respectivamente). Essa redução também foi observada nos animais do grupo II em relação ao grupo III (p<0,05). (Fig.8A e Tab.10)
O volume parcial da lâmina própria nos ratos dos grupos II e IV mostrou-se aumentado em comparação aos animais do grupo controle (grupo I) (p<0,001 e p<0,01, respectivamente). O aumento da lâmina própria também foi evidenciado nos animais dos grupos II, em relação ao grupo III (p<0,05). (Fig. 8B e Tab. 11)
Tab. 10. Análise descritiva do volume parcial do epitélio (%) da
mucosa do cólon nos diferentes grupos de animais.
Grupos n Média DP Mínimo Mediana Máximo
I 10 54,65 1,52 52,63 54,94 56,38
II 10 41,58 2,02 39,00 41,44 46,38
III 09 45,74 2,07 42,38 45,88 49,25
IV 10 43,52 1,96 40,88 43,57 47,38
n – tamanho da amostra; DP – desvio padrão
Tab. 11. Análise descritiva do volume parcial da lâmina própria (%) da camada mucosa do cólon nos diferentes grupos de animais.
Grupos n Média DP Mínimo Mediana Máximo
I 10 13,45 1,31 11,13 13,63 14,88
II 10 25,01 2,74 19,50 24,50 29,00
III 09 20,70 2,15 17,25 22,00 22,88
IV 10 22,09 1,69 19,25 22,00 24,25
Fig. 8. Comparação do volume parcial do epitélio (%) (A) e da lâmina própria (B) da mucosa do cólon entre os grupos de animais.
4.2.4 – Superfície epitelial da mucosa
A superfície epitelial da mucosa colônica dos animais do grupo II (irradiados, sem suplementação dietética) apresentou-se significantemente diminuída em relação a dos animais dos grupos I (controle) e III (p<0,01, para ambos), não sendo observada nenhuma outra diferença entre os animais dos demais grupos. (Figs. 9 e 10 e Tab.12)
0 25 50 75 100 125 Controle Irradiado I + Arginina I + Glicina p<0,001 p<0,001 mm -1
Fig. 9. Comparação da superfície epitelial (mm-1) da mucosa do cólon entre os grupos de animais. 0 10 20 30 40 50 60 p<0,001 p<0,01 Controle Irradiado (I) I + Arginina I + Glicina p<0,05 % 0 10 20 30 p<0,001 Controle Irradiado (I) I + Arginina I + Glicina p<0,01 p<0,05 % A B
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Tab. 12. Análise descritiva da superfície epitelial (mm-1) da mucosa do
cólon nos diferentes grupos de animais.
Grupos n Média DP Mínimo Mediana Máximo
I 10 120,39 9,81 107,31 118,34 141,70
II 10 83,26 12,78 62,06 83,73 98,86
III 09 118,70 6,54 108,35 119,62 126,20
IV 10 107,98 8,37 94,45 111,02 117,19
n – tamanho da amostra; DP – desvio padrão
Fig. 10. Fotomicrografias da camada mucosa da parede do cólon, submetidas à coloração tricrômica de Gomori, dos grupos Controle (A), Irradiado (B),
5 – DISCUSSÃO
A utilização de nutracêuticos (nutrientes com propriedades farmacológicas) na prevenção e/ou reparo de alterações estruturais e histológicas eventualmente ocasionadas nos tecidos sadios adjacentes às áreas submetidas à irradiação abdominal, como o intestino, tem sido foco de amplo debate [11,23,29,58,59].
Alguns estudos vêm descrevendo as importantes propriedades fisiológicas da L-arginina, notadamente em situações de trauma e estresse
[11,23,34,35,60]. Ela age estimulando a secreção de hormônio do
crescimento e a síntese de colágeno [30,33,34], caracterizando a sua
participação no processo de cicatrização, além de atuar na modulação do sistema imune, ao estimular as funções de macrófagos e neutrófilos [61]. Contudo, na maioria dos casos, descrevem e avaliam a sua ação imunomoduladora em situações críticas [30,34,35,38], sendo poucos os que abordam a sua função na cicatrização tecidual [62] e, particularmente, no intestino [11,23,29].
A glicina vem sendo muito utilizada com o objetivo de isonitrogenar as dietas (aminoácido controle), em estudos cujo foco principal é a
suplementação com outros aminoácidos [29,41,63,64]. Porém,
recentemente, alguns autores descreveram possíveis benefícios que podem ser obtidos com a sua suplementação [39,40,42,65], além da sua atuação já conhecida na inibição da formação de radicais livres [40,66], fatores que poderiam, eventualmente, prevenir ou reparar os danos causados pela radioterapia.
Ainda não existe consenso acerca da dose ideal para a suplementação dietética com esses aminoácidos em animais. A L-arginina foi utilizada em diferentes dosagens numa série de estudos similares que avaliaram ratos submetidos a irradiação abdominal [11,23,29]. Gurbuz et al (1998) a
26
utilizaram nas dosagens de 2% e 4% do valor energético total ingerido, durante sete dias após a aplicação de dose única de 1.100 cGy de radiação [29]; Hwang et al (2003,) [11] estudaram animais suplementados com a dose de 2% da água ingerida três dias antes da irradiação, e com dose de radiação semelhante à utilizada por Gurbuz et al (1998) [29] e Ersin et al (2000) [23]. Em humanos, a recomendação para a sua suplementação se situa em torno de 4% a 6% do valor energético total [67].
Também não existe padronização de dose para o uso da glicina, tanto em humanos quanto em ensaios experimentais, mas ela vem sendo continuamente empregada, em diferentes doses e, muitas vezes, sem se constituir no objetivo principal de estudo [29,41]. Jacob et al (2003) e Kallakuri et al (2003) utilizaram esse aminoácido com doses de 0,5-1,0 g/kg de peso corporal, enquanto Lee et al (2002) a utilizaram na dose de 5% da dieta oferecida em estudos dos danos causados por isquemia e reperfusão [45,68,69].
Em uma linha de pesquisa em desenvolvimento no Laboratório de Cirurgia Experimental da Faculdade de Ciências Médicas – UERJ, desde 2004 vimos utilizando esses e outros aminoácidos, nas doses de 0,65 a 1 g/kg/dia. A dose única de radiação, correspondente a 1.164 cGy, também utilizada em outros estudos de nosso grupo, deve-se à observância do relato de diversos autores que a caracterizam como sendo capaz de provocar enterite actínica e translocação bacteriana em ratos [11,23,29].
Os animais começaram a apresentar diarreia, em média, no terceiro dia após a irradiação, período semelhante ao descrito por outros autores
[41,70,71]. Sugere-se que esse efeito possa decorrer da perda da
integridade epitelial, associada a alterações na motilidade e no aumento das secreções intestinais [70]. Ademais, por volta do terceiro dia após a irradiação, são evidenciados sinais de inflamação e de ulceração da mucosa intestinal [29], que também podem contribuir para o advento desse efeito
colateral.
Todos os animais submetidos à irradiação abdominal, com ou sem suplementação de aminoácidos, ingeriram quantidade menor de ração ao longo do experimento quando comparados com os animais saudáveis, confirmando o que também foi observado por Klimberg et al. (1990) e Diestel et al. (2007) [41,63]. Essa diminuição pode ser atribuída à anorexia e a efeitos colaterais (diarreia e dor abdominal), comumente observados na enterite actínica [20]. Os animais suplementados com glicina, não somente ingeriram quantidade menor de ração em comparação aos animais do grupo controle (saudáveis), como também em relação ao grupo irradiado sem suplementação. Porém, essa ingestão diminuída não foi suficiente para modificar o percentual de perda de peso dos ratos, haja vista que ela foi similar e significante em todos os animais dos grupos irradiados, em comparação aos ratos do grupo não irradiado, que apresentaram ganho de peso, o que também foi observado por Diestel et al (2007) [41].
A L-arginina regula a absorção de água e eletrólitos, pois participa do ciclo da ureia [72], e age como um importante vasodilatador, além de inibir a enzima conversora de angiotensina, um potente vasopressor [73]. Essas funções metabólicas, possivelmente, poderiam justificar o aumento significante na ingestão de água observada nos animais que receberam a sua suplementação, quando comparados aos dos demais grupos, incluindo os saudáveis não irradiados.
A quantificação de elementos estruturais nos diversos tecidos é de grande relevância, pois em estudos anátomo-patológicos é frequente o uso de critérios subjetivos, como, por exemplo, a classificação de determinadas alterações em “leves, moderadas ou intensas”, o que torna difícil a comparação de resultados e a reprodução de experimentos. Para solucionar estas falhas, e a partir de trabalho desenvolvido pelo geólogo francês Delesse (1848), que desenvolveu um modelo para quantificar os elementos
28
contidos em rochas homogêneas, a estereologia tem sido usada com frequência crescente, permitindo a quantificação numérica das mais variadas estruturas, sejam elas macro ou microscópicas [74]. Essa técnica fundamenta-se em fórmulas matemáticas e geométricas, que permitem a análise tridimensional de um elemento em estudo [51,75,76].
Alguns autores ressaltam que, para ser utilizado o método estereológico, os elementos em estudo devem ser distribuídos ao acaso e homogeneamente no espaço. Dessa forma, qualquer corte bidimensional, aleatório e uniformemente isotrópico, passa a ser representativo de um todo tridimensional, independente da direção em que o corte seja realizado [50].
A mucosa intestinal não é um meio isotrópico, pois possui estruturas de orientação definida, como é o caso das criptas de Lieberkühn, que apresentam disposição paralela entre si e perpendiculares à superfície mucosa. Para contornar o problema dessas estruturas, Baddeley et al (1986) propuseram o método da estereologia de cortes verticais, no qual os cortes são perpendiculares a uma superfície “horizontal”, representada por um plano existente na estrutura em estudo ou criada arbitrariamente pelo pesquisador [50,77].
Avaliou-se o volume total da parede do cólon, assim como as características estruturais das camadas mucosa, muscular da mucosa, submucosa e muscular própria. A camada serosa não foi avaliada isoladamente, por ser muito delgada e de difícil visualização nos cortes histológicos, notadamente após a irradiação.
Observou-se diminuição significante do volume total da parede do cólon nos animais submetidos à irradiação que não receberam suplementação de aminoácidos, em comparação com os ratos saudáveis do grupo controle, o que é corroborado por estudos similares [11,41]. Também em humanos, Luccichenti et al (2005) observaram diminuição da espessura da parede do cólon, por meio de estudo com tomografia computadorizada,
após radioterapia para tratamento de câncer de colón [78]. Esse achado pode ser atribuído ao fato da irradiação induzir o aumento da apoptose
celular e da liberação e atuação de radicais livres[79].
No grupo de animais irradiados que não receberam suplementação de aminoácidos, ao avaliarmos cada camada, separadamente, observou-se que os volumes das camadas mucosa e muscular da mucosa diminuíram significantemente em relação aos ratos saudáveis, o que pode se dever ao fato dos efeitos tóxicos agudos da radioterapia serem observados com mais frequência em tecidos que contenham células de replicação rápida, como as da mucosa gastrointestinal [18]. Essa diminuição do volume na camada mucosa do cólon contribui para a atrofia do epitélio intestinal [80], aqui observada pela diminuição do volume parcial do epitélio da mucosa, e não da lâmina própria, que se mostrou significantemente aumentada devido, provavelmente, ao processo inflamatório agudo decorrente da radioterapia.
A suplementação de L-arginina não se mostrou eficaz na manutenção do volume total da parede do cólon após a irradiação, levando a valores similares aos encontrados nos animais irradiados e que não receberam suplementação de aminoácidos. No que se refere às camadas da parede colônica, no grupo suplementado com esse mesmo aminoácido observou-se a diminuição no volume da camada mucosa quando comparado aos animais saudáveis, semelhante ao observado nos animais do grupo II. Similarmente, a L-arginina não se revelou capaz de manter a espessura da camada mucosa, possivelmente por não se constituir em substrato preponderante para o epitélio intestinal, ratificando os resultados observados por Ersin et
al (2000), em estudo similar [23].
Grande parte das funções da L-arginina advém da ação de seus metabólitos, principalmente NO, que é produzido por uma família de enzimas denominadas óxido nítrico-sintases (NOS), existentes nas isoformas indutiva (iNOS) e constitutiva (cNOS) [81]. A isoforma indutiva,
30
como o nome revela, deve ser induzida, e geralmente é ativada por citocinas e endotoxinas em situações de estresse, como, por exemplo na radioterapia, e produz grandes quantidades de NO por períodos prolongados de tempo, o que pode gerar desarranjos na mucosa intestinal, por inibir a proliferação celular [38] e aumentar a apoptose [82]. A iNOS aumenta a expressão do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) que também contribui para a morte celular programada [21]. A isoforma constitutiva está sempre presente no organismo em níveis basais, não tendo a sua expressão induzida e sendo capaz de reduzir a sequela da inflamação intestinal aguda [83]. Assim, pode-se especular que, além da irradiação, a suplementação de L-arginina estimulou a produção exacerbada de NO pela atividade da iNOS, prejudicando a recuperação estrutural da mucosa colônica irradiada. MacNaughton et al (1998) mostraram que ratos submetidos à irradiação abdominal com 1.000 cGy, sem suplementação dietética com aminoácidos, não tiveram expressão aumentada significante de iNOS no cólon, mas apenas no íleo, embora a sua observação tenha se dado em menor período de tempo (até 48 horas) [84].
As óxido nítrico-sintases também atuam como reguladoras da ação da enzima arginase, haja vista que competem pelo mesmo substrato, a L-arginina [33,85]. Essa enzima metaboliza a L-L-arginina em ornitina [86], que é precursora de prolina, um importante aminoácido da molécula de colágeno. A arginase atua nas células musculares lisas, induzindo a produção dessa proteína. Poder-se-ia supor que, pelo aumento da produção de óxido nítrico (pela ação da iNOS) ocorreu inibição da sua ação, levando a diminuição significante do volume da camada muscular própria nos ratos do grupo III, quando comparados aos animais não irradiados.
Em ratos submetidos à laparotomia, sem suplementação dietética com aminoácidos, a atividade máxima da arginase ocorre entre 10 e 14 dias após o procedimento cirúrgico (trauma), intervalo de tempo superior ao utilizado
para análise das alterações observadas neste estudo (sete dias) [87]. A ausência de suplementação com L-arginina pode, pois, ter estimulado a produção de NO, retardando a ação da arginase.
A camada mucosa é a mais afetada pela irradiação ionizante [88], ensejando a avaliação pormenorizada do volume parcial do epitélio e lâmina própria. A L-arginina, particularmente pela ação do NO, possui papel essencial na regulação da inflamação e imunidade [86]. A suplementação exógena com esse aminoácido induz o aumento da proliferação de linfócitos e monócitos, a melhora da formação das células
T-helper e da atividade das células natural killer, da citotoxicidade de
macrófagos e da atividade fagocítica e da produção de citocinas [38], propriedades que tornaram esse aminoácido objeto de inúmeros estudos envolvendo imunomodulação [11,23,34,35,38]. Estes mecanismos auxiliam a compreensão dos motivos pelos quais os animais suplementados com L-arginina (grupo III) apresentaram volume parcial do epitélio e lâmina própria semelhante aos ratos saudáveis (grupo I), com manutenção da superfície epitelial. Entretanto, quando esses animais são comparados aos do grupo II (irradiados sem suplementação), verifica-se a presença de volume parcial de epitélio e da superfície epitelial significantemente maiores e de lâmina própria significantemente menor, possivelmente pelo
efeito antiinflamatório proporcionado pela suplementação desse
aminoácido.
A glicina se mostrou eficaz em manter o volume total da parede colônica irradiada, corroborando estudos anteriormente realizados por nosso grupo [41]. Em similaridade aos animais dos outros grupos submetidos à irradiação abdominal (II e III), a suplementação com glicina também não foi capaz de manter o volume da camada mucosa, o que pode se dever ao fato de sua ação ser mais sistêmica [39,40,42] e por não se constituir em substrato preponderante para o epitélio intestinal (o que
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também ocorre com a L-arginina). Outro fator que pode ter influenciado este resultado, foi a dose de suplementação, já que Diestel et al (2007) utilizaram dose maior desse aminoácido (1 g/kg/dia), nesse mesmo modelo de irradiação, e observaram a manutenção desse parâmetro quando comparado ao grupo de ratos saudáveis [41].
A glicina faz parte da estrutura do colágeno [39] e é sintetizada pelas células musculares lisas que depositarão essa proteína na submucosa [89]. Com sua disponibilidade aumentada, decorrente da suplementação, houve um provável aumento na produção de colágeno após a irradiação e, possivelmente, a isso se deveu a manutenção da espessura da camada muscular desses ratos e o aumento expressivo da camada submucosa, em comparação ao grupo I (animais saudáveis) [90].
Na camada mucosa, o volume epitelial apresentou-se diminuído e o volume da lâmina própria aumentado, em relação aos ratos não irradiados (grupo I), ratificando os resultados de Diestel et al (2007), porém com manutenção da superfície epitelial [41]. Apesar de serem descritas na literatura as propriedades imunomoduladoras da glicina [39,40,42], não se demonstrou tais benefícios neste experimento. Devido à escassez de estudos e modelos experimentais que utilizam esse aminoácido como objeto principal da pesquisa, ainda não estão estabelecidos a dose e o tempo necessários para a sua plena atuação.
A arquitetura da camada mucosa foi mantida nos animais dos grupos em que houve suplementação com aminoácidos (glicina ou L-arginina), ainda que com menor volume parcial que o observado nos animais saudáveis. Apesar disso, os resultados desta pesquisa sugerem que a suplementação de glicina apresentou efeitos superiores ao da suplementação com L-arginina, haja vista que foi capaz de manter a espessura da parede colônica e a superfície epitelial da mucosa, enquanto que, com a L-arginina, apesar de mantidos o volume parcial do epitélio e
da superfície epitelial, ocorreu diminuição do volume total da parede intestinal.
A continuação desta linha de pesquisa se faz necessária, no intuito de se determinar a eficácia da utilização de diferentes doses destes e de outros aminoácidos, por períodos diversos, na prevenção e/ou reparo de lesões intestinais em animais submetidos à irradiação abdominal, assim como o emprego de doses maiores e fracionadas de irradiação.
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6 – CONCLUSÃO
A suplementação dietética com glicina apresentou efeitos superiores ao da suplementação com L-arginina, haja vista que foi capaz de manter a espessura da parede colônica e a superfície epitelial da mucosa, enquanto a L-arginina foi capaz de manter o volume parcial do epitélio e a superfície epitelial, mas não o volume total da parede intestinal.
A suplementação dietética com L-arginina e glicina não foi capaz de reverter a perda ponderal e a diminuição da ingestão de ração dos animais causada pela irradiação.
