BROTOS EM REPOLHO
CLÓVIS MAURÍLIO DE SOUZA
1JOSÉ EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO
2BENEDITA MARIA RODRIGUES
3AUGUSTO RAMALHO DE MORAIS
4MARIA DE FÁTIMA ARRIGONI-BLANK
5 RESUMO - Os fatores físicos, meio de cultura e tipode tampa, foram utilizados para regeneração de brotos de repolho (Brassica oleracea L. var. capitata L.). Os explantes foram inoculados em meio sólido e líquido de Murashige e Skoog (MS) modificado. No segundo
ex-perimento, foram utilizados três tipos de tampas: metal, vitafilme e plástica. Independentemente da consistência do meio sólido ou liquido, ocorreu regeneração de bro-tos. Não houve efeito significativo do tipo de tampa na regeneração de brotos.
TERMOS PARA INDEXAÇÃO: Tipo de tampa, meio de cultura, Brassica oleracea, repolho
INFLUENCE OF PHYSICAL FACTORS ON SHOOT
REGENERATION OF CABBAGE
ABSTRACT - The physical factors as mediumconsistency and cap type were used to optimize shoot regeneration of cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata L.). The explants were cultured on modified Murashige and Skoog (MS) solid and
liquid mediums. In another assay, three types of caps (metal, vitafilm and plastic) were used. Independent of medium consistency type shoot regeneration occurred. The cap type had no significant effect on shoot regeneration.
INEDX TERMS: Cap type, medium consistency, Brassica oleracea.
INTRODUÇÃO
O estabelecimento e a multiplicação de uma de-terminada espécie vegetal in vitro estão sujeitos à influ-ência de diversos fatores, e a combinação adequada de todos esses fatores proporciona o sucesso da propaga-ção para cada espécie.
As concentrações dos sais e dos reguladores de crescimento nos meios de cultura, bem como a tempe-ratura e fotoperíodo, são os fatores que mais variam entre as espécies micropropagadas. Outros fatores, como a utilização de agentes geleificantes dos meios de cultura e os tipos de tampas empregadas no fechamento dos frascos, podem influenciar o desenvolvimento de algumas culturas.
A iniciação da cultura in vitro de bromélias ocorre mais facilmente quando se utiliza meio de cultu-ra líquido, isso tem sido verificado, também, pacultu-ra a or-quídea. A cultura de brotos apicais de aspargos e
gérbe-ra requerem pagérbe-ra sua iniciação meio semi-sólido (Mu-rashige, 1974).
O ágar, além do efeito no potencial mátrico do meio de cultivo, alterando a disponibilidade de água, nutrientes e fitoreguladores, pode modificar a composi-ção química do meio, conforme o teor de impurezas (Grattapaglia e Machado, 1990). Romberger e Tabor (1971) relataram que o crescimento de brotos de Picea abies Link foi significativamente influenciado pela qualidade do ágar. Da mesma forma, Singha (1982) relata que a presença de inibidores no ágar afeta a pro-liferação de brotos.
É possível que as concentrações ótimas de sais, num meio sólido, sejam mais elevadas do que as con-centrações ótimas para o crescimento em meio líquido, devido às restrições na velocidade de difusão de nutri-entes que o meio sólido impõe (Caldas, Haridasan e Ferreira, 1990).
1. Engenheiro Agrônomo, MS, Departamento de Agricultura, UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS/UFLA 2. Engenheiro Agrônomo, PhD, Departamento de Agricultura/ UFLA, Caixa Postal 37, 37.200-000 - Lavras – MG. 3. Bióloga, MS, Seção de Genética do IAC, Caixa Postal 28 – 13. 001-970 – Campinas – SP.
4. Engenheiro Agrônomo, Dr., Departamento de Ciências Exatas/ UFLA. 5. Bióloga, MS, Bolsista RHAE/CNPq. DAG/UFLA.
Embora economicamente interessante, a utiliza-ção de meio líquido apresenta, freqüentemente, plantas com aspecto vitrificado. Snir e Erez (1980) atribuem esse fato possivelmente a maior absorção de nutrientes e hormônios do meio, não apenas através da base corta-da do explante, mas de tocorta-da sua superfície. Grattapaglia e Machado (1990) afirmam que uma das medidas ado-tadas para conter esse processo degenerativo é justa-mente o incremento na concentração de ágar no meio de cultura.
Pasqualeto, Zimmerman e Fordham (1986) ve-rificaram decréscimo significativo na percentagem de plantas vitrificadas de macieira, com o aumento na concentração de ágar no meio. Entretanto, a elevação na concentração de ágar pode resultar em um meio muito consistente que, embora seja útil para evitar a vitrificação, provoca inibição no desenvolvimento da planta, reduzindo a taxa de multiplicação (Murashige, 1974; Grattapaglia e Machado,1990).
Quanto às tampas utilizadas para vedar os fras-cos, sabe-se que também exercem efeito no desenvolvi-mento de alguns explantes. Esse efeito é devido, princi-palmente, à formação de microclima dentro do frasco (Grattapaglia e Machado,1990). As tampas de plástico (polipropileno) são as mais utilizadas nos laboratórios, porque são desenvolvidas especialmente para trabalhos em cultura de tecidos e resistem a elevadas temperatu-ras, podendo ser autoclavadas sem deformação. Porém, o elevado custo contribui para utilização de outros tipos de tampas, como: papel de alumínio, algodão, metal e vitafilmeR (PVC) (Pierik, 1987)
A utilização de vitafilmeR permite maior pene-tração da luz quando comparada aos outros tipos de tampas. Além disso, ocorre mais rapidamente perda de água no interior do frasco, causando menor disponibili-dade de água na forma gasosa, prevenindo a vitrifica-ção e estimulando a transpiravitrifica-ção nas plantas, e evitan-do as necroses apicais por deficiência de elementos pouco translocáveis como o cálcio.
Os frascos devem ser bem fechados para evitar o ressecamento e a contaminação por agentes externos; por outro lado, as tampas devem permitir a troca gasosa com o ambiente externo, evitando que ocorra deficiên-cia de O2 e acúmulo de gases como CO2 e etileno
(Pie-rik, 1987).
Neste sentido, o objetivo do trabalho foi avaliar a influência da consistência do meio de cultura e os três tipos de tampas sobre o desenvolvimento de segmentos nodais de repolho (Brassica oleracea L. var. capitata L.) in vitro.
MATERIAL E MÉTODOS
Os explantes utilizados foram microestacas de repolho do clone 400 e da família clonal-800 obtidas do
cultivo in vitro, que foram seccionadas em segmentos de 2,5 cm de comprimento com 4 a 5 gemas axilares.
Para o experimento 1, foram colocados em tubos de ensaio (25 x 150 mm) contendo 15 ml de meio de cultura MS, suplementado com adenina (27 mg/L), AIA (5 mg/L), fosfato monobásico de sódio (161,5 mg/L) e Cinetina (4 mg/L). Utilizaram-se meio líquido e meio semi-sólido (0,7% de ágar Merck).
O pH do meio foi ajustado para 5,8 ± 1 antes da autoclavagem a 121 ± 1oC por 20 minutos. Foi empre-gado o delineamento experimental inteiramente casua-lizado composto de 10 repetições, sendo cada parcela constituída por 4 tubos e 1 microestaca por tubo, o qual foi fechado com tampa plástica e seus bordos protegi-dos com vitafilmeR.
No experimento 2, as microestacas foram colo-cados em frascos de 250 ml contendo 30 ml de meio de cultura MS, suplementado com adenina (27 mg/L), AIA (5 mg/L), fosfato monobásico de sódio(161,5 mg/L) e Cinetina (4 mg/L), solidificado com 0,7% de ágar (Merck), variando os tipos de tampas entre Metal, Vitafilme e Plástica. O pH do meio foi ajustado para 5,8 ± 1 antes da autoclavagem a 121 ± 1oC por 20 mi-nutos
Aos 30 dias após a repicagem, foram avaliados: número de brotos, comprimento de brotos, número de folhas por broto, peso da matéria fresca e peso da maté-ria seca.
Foi empregado o delineamento experimental in-teiramente casualizado com 5 repetições, sendo cada parcela constituída por 4 frascos e 2 microestacas por frasco.
Os experimentos foram instalados em sala de crescimento com temperatura controlada de 26 ± 1oC e fotoperíodo de 16/8 horas (luz/escuro) e 2500 lux de luminosidade fornecida por lâmpadas fluorescentes branca-fria.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados com a consistência do meio per-mitiram concluir que o estado físico do meio nutritivo não influenciou a micropropagação do clone 400 de re-polho cultivado tanto em meio de cultura semi-sólido como em meio de cultura líquido, com utilização de ponte de papel de filtro.
Já Steward (1958), citado por Murashige (1974), relata que o desenvolvimento in vitro de algumas espé-cies vegetais, como Dacus carota L., Asparagus offici-nalis L., como também orquídea, gérbera e bromélias, segundo Murashige (1974), são bastante influenciadas pelas consistência do meio de cultura. Veramendi e Na-varro (1996) mostraram que as condições físicas do meio teve uma influência importante na embriogênese
somática de palmeira (Phoenix datylifera L.). O meio líquido foi superior ao meio sólido no número de em-briões somáticos formados.
Entretanto, a utilização do meio líquido é con-siderado economicamente mais viável para uma propa-gação em massa (Tautorus e Dunstan, 1995).
Após 30 dias da repicagem, obteve-se a média de 2,9 brotos por explante, sendo que o meio semi-sólido apresentou a média de 3,2 brotos, enquanto o meio líquido 2,6 brotos. Os brotos apresentaram cor verde-escuro característico do clone, não sendo, por-tanto, verificado nenhum aspecto que pudesse ser rela-cionado com vitrificação. Lee, Wetzstein e Mutschler (1986) mostraram que a utilização de meio líquido apresenta condição mais favorável ao surgimento de plantas vitrificadas.
Não houve diferença significativa entre os dois tratamentos quanto ao número de folhas produzidas. O número de folhas é presumivelmente relacionado à taxa potencial de multiplicação, uma vez que indica o núme-ro de gemas laterais (pnúme-roduzidas nas axilas foliares) disponíveis como explantes.
Quanto aos tipos de tampas empregadas, os re-sultados mostraram que as microestacas da família clo-nal 800, cultivadas em frasco de 250 ml fechados com tampas de metal, vitafilmeR e plástico, não apresenta-ram diferenças significativas no número de brotos e comprimento médio de brotos, produzindo, em mé-dia, 4,7 brotos com 2,6 cm de comprimento, após 30 dias de cultivo. Esses resultados são semelhantes aos encontrados por Lentini, Mussell, Mutschler.et al (1988), utilizando tampas porosas no cultivo de Brassica.campestris L.. Carvalho, Favaretto e Pinto (1995), estudando a influência do tipo de tampa no crescimento e desenvolvimento de batata-doce, nota-ram que houve diferença no peso da matéria fresca e seca da plântula.
O sistema radicular formado no meio de culti-vo líquido foi mais abundante do que em meio semi-sólido, concordando com Grattapaglia e Machado (1990), os quais relataram que o sistema radicular tende a ser mais desenvolvido em meio líquido. Entretanto, essas raízes eram finas e compridas, ao contrário das obtidas no cultivo em meio semi-sólido, que eram mais curtas, com diâmetro maior. O maior crescimento das raízes em meio líquido foi em virtude da maior facili-dade de trocas gasosas que ocorrem entre as raízes e o meio de cultura, favorecidas pela utilização das “pon-tes” de papel de filtro.
Os pesos de matéria fresca e de matéria seca de brotos não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos. Esses resultados foram diferentes da-queles encontrado por Heller et al.(1968) citado por Caldas, Haridasan e Ferreira (1990), ao relatarem que
tecidos de cenoura cultivados em meio líquido absorve-ram maiores quantidade de água do que em meio semi-sólido.
Segundo Caldas, Haridasan e Ferreira (1990), o meio semi-sólido tem a propriedade de impor restri-ções à velocidade de difusão de nutrientes em relação ao meio líquido, causando deficiência nutricional das plantas, principalmente nas espécies mais sensíveis. No entanto, não foi verificado nenhum sintoma de defici-ência nutricional entre as brotações obtidas a partir das microestacas.
Embora não tenha sido verificada, estatistica-mente, nenhuma diferença significativa entre os dois tipos de tratamentos, observou-se que os brotos obtidos no cultivo em meio semi-sólido exibiam aspecto mais lignificado do que aqueles produzidos em meio líquido. Bhagyalakshni e Singh (1995) trabalhando com bana-nas, mostraram que o meio líquido foi melhor para a multiplicação. Eentretanto, o meio com agar apresentou maior sobrevivência da plântula ex-vitro.
Foi observado em repicagens anteriores que, quando se apertava a rosca das tampas de metal no frasco, impedindo as trocas gasosas com o meio exter-no, ocorriam superbrotamento e estiolamento dos bro-tos, em virtude do acúmulo de compostos voláteis, (provavelmente o etileno),no interior dos frascos; en-tretanto, essas brotações eram fracas e com aspecto vi-trificado, tornando-se inviáveis para a multiplicação, pois o aumento de compostos voláteis (CO2 e etileno)
no interior dos frascos pode conduzir a desordens fisi-ológicas, como redução da respiração, baixas atividades metabólicas, além de acúmulo de alguns metabólitos, tais como aminoácidos e oxolatos.(Pierik, (1987). Ma-rino, Berardi e Ancherani (1995) também observaram um acúmulo de CO2 e etileno quando utilizaram
dife-rentes tampas de plástico e alumínio.
Na avaliação do peso de materia fresca dos brotos houve diferença significativa entre tampas de metal e vitafilmeR, sendo que o peso médio de maté-ria fresca obtido com o cultivo com tampa de metal foi superior ao peso médio obtido com a tampa de vitafilmeR, conforme pode ser visualizado na Figu-ra 01.
Essa diferença pode estar relacionada ao fato de que as tampas de metal impedem a passagem de luz para o interior do frasco, fazendo com que toda luz seja recebida através da parede lateral do frasco, o que di-minui a quantidade de luz recebida pelo explante, re-duzindo sua capacidade de transpiração; isso foi obser-vado pelo excesso de condensação nas paredes dos cos, indicando que a umidade do ar no interior do fras-co tornou-se mais elevada, diminuindo a transpiração e colaborando para que os tecidos armazenassem maior quantidade de água.
Metal Plástica Vitafilme Tipos de tampas 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
Peso de matéria fresca (g)
ab a
b
FIGURA 1 - Valores médios de peso de matéria fresca dos brotos produzidos através de segmentos nodais da
fa-mília clonal 800, em função dos tipos de tampas, ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de F. Os frascos tampados com vitafilmeR permitem
maior penetração de luz; com isso, a transpiração é mais elevada, como foi observado pela ausência de condensação nas paredes internas dos frascos; o ambi-ente interno tornou-se, assim, mais seco e os brotos não armazenaram água nos seus tecidos. Foi observado, também, a redução de até 50% no volume inicial de meio de cultura 30 dias após a instalação do experi-mento. Esses resultados diferem daqueles obtidos por Sha, MacCown e Peterson (1985), nos quais o uso de vitafilmeR para vedar os frascos de batata (Solanum tu-berosum L.) resultou em morte do ápice, diminuição de peso e aumento de brotações.
Na análise do peso da matéria seca, não foi ve-rificada nenhuma diferença significativa entre os trata-mentos.
Na avaliação do sistema radicular, não houve diferença significativa entre os tratamentos quanto ao número de raízes; mas o comprimento médio das raízes produzidas no cultivo com tampas de metal e plástica foi superior às raízes produzidas com o vita-filmeR.
O vitafilmeR por permitir maior evaporação e reduzir o volume inicial do meio de cultura em até 50%, prejudicou o desenvolvimento das raízes. Esse crescimento pode ter sido afetado pela maior
concentra-ção de sais devido à evaporaconcentra-ção de água do meio de cultura. Por outro lado, a tampa de metal que tem maior resistência à perda de água, conservou volume maior de meio, o que permitiu o desenvolvimento normal das raízes, não causando toxidez às raízes para o seu cres-cimento (Figura 2).
O peso da matéria fresca das raízes não apre-sentou diferenças significativas entre os tratamentos, embora o tamanho das raízes tenha sido menor quando cultivadas com tampas de vitafilmeR. Entretanto, foi observado que estas raízes tiveram diâmetro maior, acumulando maiores quantidades de água nos seus te-cidos, compensando o peso de matéria fresca quando comparadas as raízes finas e compridas obtidas com tampas de metal e plástica. Entre as tampas de metal e plástica, não houve diferença no peso de matéria fresca e matéria seca (Figura 3). Comparando as tampas de plástico e vitafilmeR, o peso de matéria seca de raízes cultivadas com tampas de plástico foi inferior, pois apesar de serem maiores em comprimento, elas eram muito finas.
CONCLUSÕES
a) A utilização de meios de cultura líquido ou semi-sólido não apresentou diferenças na multiplicação de repolho in vitro. Entretanto, a qualidade dos brotos obtidos em meio semi-sólido geralmente foi melhor do
Metal Plástica Vitafilme Tipos de tampas 0 1 2 3 4 5 Comprimento de raiz (cm) a b a
FIGURA 2 - Valores médios de comprimento de raiz produzidas através de segmentos nodais da família clonal
800, em função dos tipos de tampas, ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de F.
Metal Plástica Vitafilme Tipos de tampas 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04
Peso de materia seca (g)
ab
a b
FIGURA 3 - Valores médios de peso de matéria seca de raiz produzida através de segmentos nodais da família
que no meio líquido, pois a ‘ponte’ de papel de filtro utilizada para sustentar e permitir maior aeração da mi-croestaca impediu o crescimento de alguns brotos que surgiram sob o papel de filtro. Dessa forma, considera-se a utilização de meios considera-semi-sólidos mais apropriada para a propagação do repolho in vitro.
b) Na multiplicação do repolho, pode-se utilizar tanto tampas de metal, vitafilmeR e plástico, sem afetar a qualidade dos brotos produzidos. No entanto, as tam-pas de metal não deverão ser hermeticamente fechadas, sob pena de evitarem as trocas gasosas necessárias ao bom desenvolvimento dos explantes. No caso de se uti-lizar o vitafilmeR, a adição de um volume maior de meio de cultura por frasco é necessária para evitar o ressecamento do meio.
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