ÓLEO DE FÍGADO DE BACALHAU OU COLESTEROL SOLÚVEL EM ÁGUA NO DILUIDOR DE CONGELAÇÃO AUMENTAM A CRIORESISTÊNCIA DO
ESPERMATOZOIDE EQUINO?
Breno Fernandes Barreto Sampaio1, Edjalma Rodrigues da Silva-Junior2,Letícia Pelisari Bortoletto2, Eliane Vianna da Costa e Silva3, Carmem Estefânia Serra Neto
Zúccari3
1 Doutorando do Programa de Pós Graduação em Ciência Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul
2 Acadêmico da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul
3 Professora Doutora da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (carmem.zuccari@ufms.br) Campo
Grande - Brasil
Recebido em: 31/03/2015 – Aprovado em: 15/05/2015 – Publicado em: 01/06/2015
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da adição, ao diluidor de congelação, do óleo de fígado de bacalhau (OFB; Experimento 1) ou do colesterol solúvel em água (COL; Experimento 2), sobre a resistência do espermatozoide equino à congelação. As variáveis estudadas foram motilidade, vigor, integridade das membranas plasmática e acrossomais, atividade mitocondrial e nível de peroxidação lipídica, analisadas nos momentos pós-colheita (PC) e pós-descongelação (PD). O OFB foi testado nas concentrações de 25 µg / mL e 50 µg / mL. Os valores de motilidade, vigor e viáveis foram significativamente superiores no momento PC quando comparados àqueles PD e, após a descongelação, houve aumento do percentual de espermatozoides mortos (p < 0,05). Não houve efeito dos tratamentos, nem dos momentos avaliados sobre a peroxidação lipídica. No experimento 2 foi testada a adição de COL nas concentrações de 1,5 mg/mL e 3,0 mg/mL. A motilidade foi significativamente maior PC, não havendo diferença entre os tratamentos após a descongelação. O percentual de espermatozoides vivos no grupo tratado com 1,5 mg/mL foi similar aos valores obtidos PC, contudo não houve diferença entre os grupos PD. O nível de lipoperoxidação foi menor (p<0,05) no sêmen fresco, não diferindo entre os tratamentos, após a descongelação. Ao se considerar apenas os valores PD, não houve diferença significativa entre os tratamentos, para todas as variáveis analisadas. Conclui-se que nas concentrações testadas o óleo de fígado de bacalhau e o colesterol solúvel em água não foram eficazes em proporcionar maior crioresistência ao sêmen de garanhões.
PALAVRAS-CHAVE: criopreservação, estresse oxidativo, garanhão, lipídeos, sêmen
ADDITION OF COD LIVER OIL AND WATER SOLUBLE CHOLESTEROL TO FREEZING EXTENDER ON EQUINE SPERM CRYORESISTANCE
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the effect of the addition, to the freezing extender, of cod liver oil (CLO; Experiment 1) or water-soluble cholesterol (WSC; Experiment 2) on the resistance of equine sperm to the freezing. The variables studied were motility, vigor, integrity of plasmatic and acrosomal membranes, mitochondrial activity and lipid peroxidation, analyzed in post-collection moment (PC) and post-thawing (PT). The CLO was tested at concentrations of 25 mg/ml and 50 mg/ml. Motility, vigor and viable were significantly higher in PC time when compared to those PT and, after thawing, there was an increase in the percentage of dead sperm (p <0.05). No effects of treatments or of the times assessed on lipid peroxidation. In experiment 2 was tested adding WSC at concentrations of 1.5 mg/ml and 3.0 mg/ml. The motility was significantly higher PC, with no difference between treatments after thawing. The percentage of live sperm in the group treated with 1.5 mg/ml was similar to the values obtained PC, however there was no difference between the PT groups. The level of lipid peroxidation was lower (p <0.05) in fresh semen and did not differ between treatments after thawing. When considering only the PT values, there was no significant difference between treatments for all variables. It was concluded that at the tested concentrations of cod liver oil and the water soluble cholesterol there was no improving in cryoresistance of stallion semen. KEYWORDS: cryopreservation, lipids, oxidative stress, semen, stallion
INTRODUÇÃO
As biotécnicas da reprodução contribuem para o melhoramento genético dos plantéis e permitem o maior aproveitamento de reprodutores elite (CANCIMANSI et al., 2010). Algumas biotecnologias como a inseminação artificial (IA) e a transferência de embriões fazem parte da rotina de diversos haras, o que coloca o Brasil em destaque no cenário mundial (ALVARENGA, 2010).
A IA de éguas com sêmen congelado apresenta alguns entraves, como o maior custo por prenhez e a baixa resistência do espermatozoide equino ao processo de congelação (MURPHY et al., 2014). Desta forma, a busca por novos diluentes ou o aprimoramento daqueles já existentes se mostram promissores, pois a adição de substâncias que protejam a integridade estrutural e funcional do espermatozoide, terá reflexos positivos sobre as taxas de gestação.
O choque térmico pelo frio pode ocasionar queda da motilidade espermática (MORAN et al., 1992) devido à modificação na organização da membrana plasmática (MP), quando o espermatozoide é exposto à baixas temperaturas (HAMMERSTEDT et al., 1990). O grau de fluidez da MP é influenciado por sua composição lipídica, pelo comprimento e grau de insaturação dos ácidos graxos, pela concentração de colesterol e pela relação colesterol:fosfolipídeos (COL:FFL) (GIRAUD et al., 2000). Portanto, a presença de ácidos graxos poli-insaturados (poliunsaturated fatty acids – PUFA) pode tornar a MP mais fluida, protegendo a célula durante o processo de congelação (DARNELL et al., 1990). Em contrapartida, o alto conteúdo de PUFAs na MP do espermatozoide pode torná-lo vulnerável às mudanças peroxidativas.
Os óleos de peixes de águas geladas são ricos em PUFAs e, o óleo de fígado de bacalhau (OFB) se destaca por possuir em sua composição concentrações
expressivas dos ácidos eicosapentaenoico, docosapentaenoico e docosahexaenoico (PAULENZ et al., 1995).
Em algumas espécies, a suplementação in vitro com PUFAs protege o espermatozoide contra os efeitos deletérios do choque térmico pelo frio. Em ovinos foram observados maiores valores de motilidade e viabilidade espermática após a descongelação do sêmen acrescido de ácido oleico-linoleico (PÉREZ-PÉ et al., 2001) e, em bovinos, a adição de ácido linoleico resultou em maior motilidade após a descongelação (TAKAHASHI et al., 2012).
A MP do espermatozoide equino inicia a transição de fase dos lipídeos, do estado líquido cristalino para o estado gel, à temperatura de 19°C e a finaliza aos 8°C. Nesta faixa de temperatura o espermatozoide se torna bastante susceptível às lesões, porém a adição de colesterol confere maior resistência à célula, por aumentar a proporção COL:FFL (HARTWIG et al., 2014) e reduzir a temperatura na qual os FFL passam pela transição de fase (KIRK et al., 2001), portanto, tendo um efeito estabilizador.
O colesterol é uma molécula hidrofóbica que necessita de um complexo de inclusão para sua incorporação na MP, que proporciona maior tolerância osmótica e permeabilidade aos crioprotetores, aumentando, assim, a longevidade do espermatozoide (MOCÉ et al., 2010). Porém, a obtenção do complexo de inclusão com açúcares cíclicos é bastante trabalhosa, portanto, o colesterol solúvel em água pode vir a ser uma alternativa vantajosa.
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da adição do óleo de fígado de bacalhau ou do colesterol solúvel em água (COL) ao diluente de congelação, sobre a motilidade/vigor, integridade das membranas plasmática e acrossomais, a atividade mitocondrial e o nível de peroxidação lipídica do espermatozoide equino submetido à criopreservação.
MATERIAL E MÉTODOS Colheita de sêmen
Foram utilizados seis garanhões Quarto de Milha adultos e de fertilidade conhecida. Os animais foram submetidos ao manejo adotado nas propriedades onde se encontravam, localizadas no município de Campo Grande – MS (20º 26' 34" S; 54º 38' 47" W) e, a colheita de sêmen foi realizada em manequim, com o auxílio da vagina artificial Modelo Botucatu® (Botupharma Biotecnologia Animal, Botucatu/SP, Brasil), sendo colhido um ejaculado de cada garanhão.
Após a colheita do sêmen foram avaliadas as seguintes variáveis espermáticas: motilidade/vigor, concentração, integridade das membranas plasmática e acrossomais, atividade mitocondrial, nível de lipoperoxidação e morfologia espermática, tendo sido utilizados apenas ejaculados que apresentavam motilidade ≥ 70%, vigor ≥ 3 e ≥ 70% de espermatozoides com morfologia normal. Experimento 1 - Adição de óleo de fígado de bacalhau ao sêmen equino submetido à criopreservação
Após a colheita o sêmen foi diluído em meio à base de leite desnatado na concentração de 50 x 106 espermatozoides / mL e as amostras centrifugadas a 600 G / 13 min. Após a centrifugação o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido com diluente à base de gema de ovo na concentração de 200 x 106 células / mL.
A solução mãe de OFB (Cod Liver Oil - Sigma Aldrich do Brasil) foi obtida pela diluição em etanol e a partir dela preparada a solução de trabalho (10x), contendo 2 mg de DHA. Os grupos experimentais foram: C – controle, sem adição do OFB; OFB-25 - 25 µg / mL de DHA e; OFB-50 - 50 µg / mL de DHA. A solução de trabalho foi depositada em tubos cônicos, os quais foram mantidos a 60ºC, até a completa evaporação do etanol e a adsorção do OFB à parede dos tubos.
O ejaculado foi fracionado em três alíquotas, contendo 500 x 106 espermatozoides, sendo cada uma delas depositada em tubo cônico previamente preparado de acordo com os grupos experimentais e, a seguir, procedeu-se com a incubação das amostras, em banho-seco, durante 30 min. à temperatura de 37°C.
Após o período de incubação foi realizado o envase do sêmen em palhetas de 0,5 mL, contendo 100 x 106 espermatozoides. As palhetas foram submetidas à refrigeração a 5°C por 20 min., a seguir mantidas n o vapor de nitrogênio por 20 min. e então mergulhadas no nitrogênio líquido. A avaliação das variáveis seminais foi realizada após a descongelação em banho-maria a 38ºC / 30 seg.
Experimento 2 - Adição de colesterol solúvel em água ao sêmen equino submetido à criopreservação
Após a colheita separou-se três alíquotas de sêmen, cada uma contendo 120 x 106 espermatozoides, ajustando-se o volume final para 1 mL, pela adição de sp-TALP. Cada alíquota foi destinada a um dos seguintes grupos experimentais: C – controle, sem adição de COL; COL-1,5 - adição de 1,5 mg/mL de COL e; COL-3,0 - adição de 3 mg/mL de COL. Os grupos foram submetidos a incubação à 22ºC durante 15 min.
Após o período de incubação as amostras foram diluídas em meio de centrifugação a base de leite desnatado. A seguir o sêmen diluído foi centrifugado a 600 G / 13 min., o sobrenadante descartado e o pellet ressuspendido com diluente a base de gema de ovo.
Foi realizado o envase do sêmen em palhetas de 0,5 mL, contendo 24 x 106 espermatozoides. As palhetas foram submetidas à refrigeração a 5°C por 20 min., a seguir mantidas no vapor de nitrogênio por 20 min. e então mergulhadas no nitrogênio líquido. A avaliação das variáveis seminais foi realizada após descongelação em banho-maria a 38ºC / 30 seg.
Motilidade e vigor
A avaliação da motilidade e vigor foi do tipo cega e realizada pelo mesmo técnico, depositando-se 10 µl de sêmen entre lâmina e lamínula, mantidas sobre placa e platina aquecedora, sob a microscopia de campo claro, com objetivas de 10 e 40x. O resultado foi expresso em percentagem, conforme a proporção total de espermatozoides móveis, e, o vigor, segundo escala padronizada de zero a cinco (0-5).
Concentração espermática
A concentração foi estimada em Câmara de Neubauer, usando-se taxa de diluição de 1:100. Após a colheita do sêmen realizou-se a contagem do número de espermatozoides, sob a microscopia de campo claro, com objetiva de 40x, sendo os valores expressos em x 106 de espermatozoides / mL.
Viabilidade espermática
A viabilidade espermática e o status acrossomal foram avaliados empregando-se a técnica de dupla coloração (trypan blue/ Giemsa - TBG) descrita por DIDION et al., (1989). Foram contadas 200 células em microscopia de campo
claro, em objetiva de 100x e os espermatozoides classificados como: vivos (V); mortos (M); reação do acrossomo verdadeira (RAV) - espermatozoides vivos, sem acrossomo e; reação do acrossomo falsa (RAF) - espermatozoides mortos, sem acrossomo.
Atividade mitocondrial
A atividade mitocondrial foi avaliada pela coloração com 3,3’- diaminobenzidina (DAB), conforme descrito por HRUDKA (1987). Foram contadas 200 células, em microscopia de contraste de fase, com objetiva de 100x. As células foram classificadas de acordo com a deposição de DAB na peça intermediária: DAB I - 100% da peça intermediária corada; DAB II - > 50% da peça intermediária corada; DAB III - < 50% da peça intermediária corada; DAB IV - peça intermediária não corada.
Peroxidação lipídica
A avaliação da peroxidação lipídica foi feita através da mensuração da concentração de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), de acordo com o protocolo descrito por NICHI et al., (2007). A leitura foi feita por espectrofotometria, em comprimento de onda de 532 nm e os resultados foram comparados com uma curva padrão, previamente estabelecida, de malondialdeído. A concentração do TBARS foi determinada utilizando um coeficiente de extinção molar do malondialdeído (1,56 x105 x M / mL), e expressa em nanogramas de malondialdeído (MDA) por 1x108 de espermatozoides.
Morfologia espermática
Para a análise da morfologia espermática utilizou-se a microscopia de contraste de fase, em aumento de 100x, sendo contadas 200 células/lâmina e classificadas em defeitos maiores, defeitos menores e defeitos totais.
Análise estatística
À análise estatística as variáveis expressas em porcentagem foram transformadas em arcoseno (X/100) de acordo com o sugerido por SAMPAIO (2007). A variável TBARS foi transformada em log10. Os dados foram submetidos à análise de variância, pelo procedimento GLM do Programa Estatístico SAS (2001), considerando os efeitos fixos dos tratamentos e momentos de avaliação. As médias foram comparadas pelo teste de Duncan, em nível de 5% de significância.
RESULTADOS
Os valores médios das variáveis espermáticas pós-colheita (PC), foram: motilidade - 70,0 ± 0,0%; vigor - 3,3 ± 0,5; vivos - 71,6 ± 10,8%; mortos - 27,9 ± 10,9%; RAV - 0,2 ± 0,3%; RAF - 0,3 ± 0,8%; alta atividade mitocondrial (DAB I) - 48,5 ± 31,3% e peroxidação lipídica 1.099,6 ± 763,2 ng de MDA/108 espermatozoides.
Experimento 1
Na Tabela 1 são apresentados os valores médios das variáveis espermáticas pós-descongelação (PD), não sendo observada diferença significativa entre os tratamentos.
Na comparação entre os momentos houve diminuição da motilidade e da porcentagem de espermatozoides vivos, com consequente aumento de
espermatozoides mortos (p < 0,05). Os grupos do OFB apresentaram queda do vigor, em relação ao momento PC, no entanto essa diferença não foi observada na comparação com o grupo controle, que, por sua vez, não diferiu dos outros tratamentos PD. As variáveis RAV, RAF, alta atividade mitocondrial e peroxidação lipídica não apresentaram diferença significativa entre os momentos estudados. A morfologia espermática não diferiu entre os momentos nem entre os tratamentos, quando comparada ao grupo controle.
TABELA 1. Média (± desvio padrão) das variáveis seminais de garanhões Quarto de Milha (n=6), após a descongelação, de acordo com as concentrações de óleo de fígado de bacalhau (OFB) adicionadas ao diluidor de congelação.
Variáveis Espermáticas
Trypan Blue / Giemsa (%)
Tratamentos Motilidade (%)
Vigor
(0-5) Vivo Morto RAV RAF DAB I (%)
TBARS (ng MDA x 108 sptz) Controle 43,3 ± 12,1 3,0 ± 0,0 51,3 ± 10,9 46,2 ± 10,6 0,8 ± 0,5 1,7 ± 1,8 53,5 ± 5,4 1.384,3 ± 841,0 OFB 25 µg/mL 41,7 ± 11,7 2,3 ± 0,5 54,9 ± 13,2 44,0 ± 13,1 0,3 ± 0,4 0,8 ± 1,1 52,5 ± 13,9 1.338,4 ± 735,6 OFB 50 µg/mL 41,7 ± 14,7 2,2 ± 0,8 50,8 ± 15,9 47,6 ± 15,7 0,6 ± 0,6 1,0 ± 1,1 55,6 ± 14,4 1.759,8 ± 955,9
RAV = reação do acrossomo verdadeira; RAF = reação do acrossomo falsa; TBARS = espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico; sptz = espermatozoide
Experimento 2
Os valores médios pós-descongelação das variáveis do sêmen acrescido de COL constam na Tabela 2. Após a colheita do sêmen as variáveis motilidade e peroxidação lipídica foram superiores aos valores encontrados PD. O percentual de espermatozoides vivos PC foi superior aos grupos controle e COL-3,0 após a descongelação, no entanto, foi semelhante ao grupo COL-1,5; que por sua vez não diferiu dos demais tratamentos. No momento PD não foi observada diferença significativa entre os tratamentos para nenhuma das variáveis analisadas. Não houve diferença entre momentos e entre tratamentos (p > 0,05), para a variável morfologia espermática, quando comparada ao grupo controle.
TABELA 2. Média (± desvio padrão) das variáveis seminais de garanhões Quarto de Milha (n=6), após a descongelação, de acordo com as concentrações de colesterol solúvel em água (COL) adicionadas ao diluidor de congelação
Variáveis Espermáticas
Trypan Blue / Giemsa (%)
Tratamentos Motilidade (%)
Vigor
(0-5) Vivo Morto RAV RAF DAB I (%)
TBARS (ng MDA x 108 sptz) Controle 48,3 ± 14,7 2,8 ± 0,4 49,8 ± 15,6 47,6 ± 15,0 1,3 ± 0,8 1,3 ± 2,0 59,2 ± 14,3 2.828,0 ± 869,3 COL 1,5 mg/mL 38,3 ± 14,7 2,5 ± 0,5 55,9 ± 9,5 41,3 ± 9,0 1,6 ± 2,3 1,3 ± 1,0 59,0 ± 8,2 3.792,3 ± 1.795,1 COL 3,0 mg/mL 41,7 ± 23,2 2,2 ± 1,2 39,9 ± 22,7 56,8 ± 24,9 1,8 ± 2,0 1,5 ± 1,4 56,0 ± 17,0 3.598,8 ± 1.261,7 RAV = reação do acrossomo verdadeira; RAF = reação do acrossomo falsa; TBARS = espécies
DISCUSSÃO
O processo de congelação leva a uma perda de aproximadamente 50% da viabilidade espermática (VISHWANATH & SHANNON, 2000), devido a danos celulares decorrentes de mudanças morfológicas na organização, fluidez, permeabilidade, composição lipídica e até mesmo a ruptura das membranas espermáticas (HOLT, 2000). Essas lesões, associadas a danos correspondentes na capacidade funcional dos espermatozoides sobreviventes são responsáveis pelo decréscimo da fertilidade do sêmen congelado (WATSON, 2000).
Os danos causados pela congelação podem ser reduzidos por modificações nos protocolos rotineiramente usados, em geral, pela adição de substâncias ao meio diluidor, dentre elas, PUFAs (PÉREZ-PÉ et al., 2001) e lipídeos exógenos selecionados (HE et al., 2001).
Em ovinos, a adição de ácido oleico-linoleico conferiu maior resistência à célula espermática frente os efeitos deletérios do choque térmico, mostrando um número maior de células viáveis após a incubação com essa associação de PUFAs (PÉREZ-PÉ et al., 2001). O acréscimo de DHA no diluidor de congelação do sêmen suíno demonstrou que esse PUFA conferiu maior integridade à membrana plasmática e aumento da motilidade progressiva na avaliação pós-descongelação (KAEOKET et al., 2010).
A suplementação in vitro com PUFAs no meio diluidor de sêmen bovino com baixa resistência à congelação resultou em melhora da motilidade progressiva após a descongelação (TAKAHASHI et al., 2012). No entanto, existem diferenças quanto ao protocolo de congelação entre as espécies equina e bovina, e o período de equilíbrio utilizado pelos pesquisadores foi de 30 horas a 4°C, o que os levou a supor que a melhora da qualidade seminal foi devida à incorporação do ácido linoleico na MP. Contudo, no presente estudo, a porcentagem de células vivas não diferiu, portanto os resultados demonstraram que os lipídeos testados em ambos os experimentos não foram eficazes em manter a integridade estrutural da membrana plasmática.
A congelação promove perdas de aproximadamente 28% do conteúdo de colesterol presente na membrana plasmática do espermatozoide. Tal fato contribui para a ocorrência de reação acrossomal prematura e, consequentemente, diminuição da viabilidade espermática pós-descongelação (MOORE et al., 2005). O efeito estabilizador do colesterol sobre a membrana plasmática melhora a congelabilidade do sêmen de bovinos (MOCÉ & GRAHAM, 2006), equinos (SPIZZIRI et al., 2010) e caprinos (KONYALI et al., 2013). Além disso, PAMORNSAKDA et al. (2011) constataram que a adição de 1,5 mg de colesterol em 120 x 106 espermatozoides recuperados do epidídimo resultou em maior motilidade e viabilidade após a descongelação.
A maior quantidade de colesterol no diluente modifica a proporção molar de colesterol:fosfolipídeos da MP do espermatozoide, podendo chegar próximo ao encontrado em espécies que possuem maior resistência ao choque térmico pelo frio, como coelho e humano (MOCÉ et al., 2010). No experimento 2 não houve diferença entre o grupo tratado com 1,5 mg de colesterol solúvel em água após a descongelação e a amostra avaliada após a colheita para o porcentual de vivos, o que leva a constatação de que este composto não exerceu efeito protetor sobre o espermatozoide equino.
Apesar da melhora na congelabilidade do espermatozoide, o uso do complexo de inclusão colesterol:ciclodextrina pode reduzir a taxa de gestação, requerendo um tempo maior no trato reprodutivo feminino para que ocorra a reação do acrossomo (MOCÉ et al., 2010). Quando o sêmen suplementado com colesterol é exposto a um meio rico em ciclodextrina, ocorre uma redução da quantidade de colesterol na MP (OLIVEIRA et al., 2010), permitindo a ocorrência da capacitação espermática e aumentando a habilidade de ligação do espermatozoide à zona pelúcida (BROMFIELD et al., 2014). Contudo, as doses testadas no presente experimento não alteraram a taxa de espermatozoides apresentando reação do acrossomo verdadeira ou falsa após a congelação, ratificando a hipótese da falta de incorporação do colesterol solúvel em água à membrana plasmática.
A análise da atividade mitocondrial através da coloração com 3,3´-diaminobenzidina, tem como função avaliar a capacidade de produção de ATP e está correlacionada positivamente com a motilidade e a viabilidade celular (GARNER et al., 1997). Além disso, a atividade mitocondrial está relacionada com a produção de espécies reativas de oxigênio (reactive oxigen species - ROS) que em níveis fisiológicos participam de eventos associados à fecundação como a capacitação espermática, reação do acrossomo e interação entre o espermatozoide e o ovócito (AMARAL et al., 2013). No presente trabalho a adição de lipídeos não aumentou a porcentagem de espermatozoides com alta atividade mitocondrial.
Quando a produção de ROS excede a capacidade antioxidante do sêmen, ocorre o fenômeno denominado estresse oxidativo, que se mostra deletério à membrana plasmática e resulta na produção de metabólitos tais como o malondialdeído (AITKEN et al., 2012). O processo de criopreservação aumenta a peroxidação lipídica e pode causar um rearranjo irreversível dos lipídeos da membrana, fatores que comprometem a capacidade fecundante do espermatozoide (RICKER et al., 2006). A incorporação de ácidos graxos poli-insaturados na MP, apesar de aumentar sua flexibilidade, pode torná-la mais susceptível à peroxidação lipídica, diminuindo a viabilidade espermática (TOWHIDI & PARKS, 2012). No entanto, esse efeito deletério não foi observado neste experimento à adição do OFB, não havendo diferença significativa entre os níveis de peroxidação lipídica PC e PD, no experimento 1. O OFB é um composto rico em DHA, que possui 22 átomos de carbono e seis duplas ligações, sendo rapidamente incorporado pela MP (WASSALL & STILLWELL, 2009), com grande afinidade pela fosfatidiletanolamina, acumulando-se, preferencialmente, no folheto interno da bicamada lipídica (STILLWELL & WASSAL, 2003). Esse PUFA pode atuar tanto como pró-oxidante, através da predisposição em perder um elétron para os radicais livres nas duplas ligações entre carbonos, ou como antioxidante (YAVIN, 2006), apesar desse efeito não estar totalmente elucidado quanto a sua forma de atuação (GREEN et al., 2001).
No experimento 2, o nível de peroxidação lipídica diferiu entre os momentos PC e PD (p < 0,05), porém, os valores encontrados parecem não ter atingido o limiar do estresse oxidativo, visto que não houve diferença significativa para as variáveis mortos, RAV, RAF e DAB I.
Mais pesquisas são necessárias para avaliar diferentes períodos e temperaturas de incubação do sêmen equino com lipídeos exógenos, assim como realizar a quantificação dos lipídeos para constatar se os mesmos foram ou não incorporados à MP do espermatozoide. Além disso, diferentes concentrações do óleo de fígado de bacalhau e do colesterol solúvel em água devem ser testadas,
bem como devem ser avaliados seus efeitos sobre a fertilidade in vivo. CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos conclui-se que o óleo de fígado de bacalhau e o colesterol solúvel em água, nas concentrações testadas, não foram eficazes em proporcionar maior crioresistência ao sêmen equino.
REFERÊNCIAS
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