Utilização de um ensaio de RT-PCR - nested PCR para avaliação da
infecção do Coronavírus Felino
Application of a RT-PCR - nested PCR assay for the evaluation of Feline
Coronavirus infection
Ana Duarte* e Luis Tavares
Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA)
Faculdade de Medicina Veterinária, Avenida da Universidade Técnica 1300-477 Lisboa, Portugal
Resumo: O Coronavírus Felino (FeCoV) e o Vírus da Peritonite Infecciosa Felina (FIPV) são membros da família Coronaviridae, sendo considerados como dois biotipos virais com diferente potencial patogénico embora indistinguíveis pelos actuais meios de diagnóstico. Um dos métodos mais utilizados para confirmar a presença de vírus no animal baseia-se na detecção de ácido nucleico viral através da amplificação de sequências virais por Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction – nested Polymerase Chain Reaction (RT-PCR – nested PCR) em diferentes amostras biológicas. Para confirmar a presença do FeCoV em gatos saudáveis e em animais com suspeita de peritonite infecciosa ou com patologia intestinal foi efectuado um rastreio virológico através da amplificação por RT-PCR – nested PCR de uma região parcial do gene 7b) situado no extremo 3’ do genoma viral, a partir de diferentes materiais biológicos de animais com e sem sintomatologia clínica de infecção por Coronavírus. O ensaio revelou-se eficaz como método complementar no diagnóstico etiológico da Peritonite Infecciosa dos Felinos e na identificação de animais portadores que garantem a persistência viral nas populações felinas. A região genómica amplificada inclui um conjunto de nucleótidos responsáveis por uma estrutura secundária de RNA, que participa na replicação viral. Com base no alinhamento múltiplo das sequências nucleotídicas desta região, foi possível confir-mar a conservação desta estrutura secundária em diferentes elementos do género Coronavírus, potenciando a possibilidade de recombinação viral, característica destes vírus.
Summary: Feline Coronavirus (FeCoV) and Feline Infectious Peritonitis Virus (FIPV) are members of the family Coronaviridae and considered as two biotypes with different pathogenic potential undifferentiated by diagnostic methodolo-gy. One of the appropriate methods to assess the viral infection in the animal is based on viral nucleic acid detection by Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction – nested Poly-merase Chain Reaction (RT-PCR – nested PCR) in different biological materials. In order to confirm FeCoV presence in healthy cats or with Infectious Peritonitis suspicion or with intestinal pathology a virus survey was conducted by RT-PCR – nested PCR with the amplification of a fragment included in the 3’ end of the virus genome, from several biological samples obtained from healthy and clinically ill animals. This assay
revealed its usefulness as a complementary method for the etiological diagnostic of FIPV and for the detection of carrier animals, important to the viral persistence in feline populations. The amplified genomic region includes a nucleotide stretch responsible for a secondary structure in the viral RNA, implicated in viral replication. Based on the multiple alignments of viral nucleotide sequences it was possible to confirm the conservation of this structure in different virus from the Coronavirus genus, increasing their recombination potential.
Introdução
Os Coronavirus Felinos (FeCoV) são membros da família Coronaviridae, um grupo de vírus de RNA de cadeia simples com invólucro. Esta família taxonómica inclui dois Géneros, Coronavirus e Togavirus. O seu genoma codifica as proteínas enzimáticas (Pol) e as proteínas estruturais (S, M e N) do virião para além de possuir um número variável de grelhas de leitura não caracterizadas.
O género Coronavirus está dividido em três grupos antigénicos. O Grupo I inclui o vírus da Gastroenterite porcina (TGEV), os Coronavírus caninos (CCoV), o Coronavírus humano 229E (HCoV-229E), o Coronavirus dos coelhos (RbCoV) e os Coronavírus Felinos (FeCoV/FIPV). O grupo II inclui o Coronavírus Humano OC43 (HCoV-OC43), o Coronavirus do rato (MCoV e SDAV), o Vírus da encefalomielite hemaglutinante dos suínos (HEV) e o Coronavirus dos bovinos (BCoV). O grupo III é constituído por dois Coronavírus das aves (IBV e TCoV).
Até ao momento foram descritos dois biotipos virais do FeCoV, nomeadamente o FeCoV entérico e o Vírus da Peritonite Infecciosa dos Felinos (FIPV). Estes vírus embora exibam diferentes propriedades biológi-cas não são diferenciáveis através de nenhum teste imunológico ou morfológico (Herrewegh et al., 1995a, 1995b; Vennema et al., 1992).
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
*Correspondência: anaduarte@fmv.utl.pt Tel: +351 213652800; Fax: +351 213652882
O FeCoV entérico induz uma enteropatia primária enquanto que o FIPV é o agente etiológico da Peritonite Infecciosa Felina (PIF), uma doença imuno-mediada cuja patogénese não se encontra completa-mente esclarecida e que é frequentecompleta-mente fatal para os felídeos domésticos e selvagens.
O desenvolvimento da Peritonite Infecciosa está relacionado com a ocorrência de mutações no genoma do FeCoV, em gatos com infecção activa (Herrewegh
et al., 1997; Poland et al., 1996; Vennema, 1999).
Esta observação é consistente com o potencial de recombinação descrito para os Coronavirus (Herrewegh et al., 1998; Rottier, 1999; Vennema et
al., 1998; Wu et al., 2003), responsáveis por variadas
viroses graves em diferentes espécies animais. Considerando a importância da PIF como entidade nosológica e a necessidade de desenvolvimento de uma prova que permita um diagnóstico etiológico para além da detecção de anticorpos específicos contra o vírus, foi objectivo deste trabalho determinar a prevalência do FeCoV na área da Grande Lisboa, utilizando um ensaio de RT-PCR – nested PCR que permite a detecção de ácido nucleico viral em diferentes amostras biológicas e testar a sua utilidade como meio complementar de diagnóstico (Herrewegh
et al., 1995a).
Material e métodos
População e preparação das amostras
Foram obtidas do Hospital Escolar da Faculdade de Medicina Veterinária 96 amostras e 40 amostras da União Zoófila num total de 136 amostras, colhidas de animais com patologias intestinais ou com suspeita clínica de infecção pelo FeCoV ou FIPV. Os materiais biológicos testados incluíram zaragatoas rectais, fezes, plasma e líquidos de efusão torácica e ascítica.
O plasma e os líquidos de efusão torácica e ascítica foram centrifugados a 13.000 g x 10 min e o sobrena-dante armazenado a -20 ºC até processamento. As amos-tras fecais foram diluídas em PBS (1:1), e clarificadas por centrifugação nas condições atrás referidas e armazenadas a -20 ºC, até utilização directa nos ensaios de RT-PCR nested PCR, sem extracção de RNA viral. Ensaio de RT-PCR – nested PCR
Para efectuar o ensaio de RT-PCR – nested PCR foram utilizados os oligómeros PIFA For (nt 1-23) 5’ GGCAACCCGATGTTTAAAACTGG 3’; PIFB Rev (nt 213-192) 5’ CACTAGAATCCAGACGTTAGCTC 3’; PIFC For (nt 29-51) 5’ CCGAGGAATTACTGGT-CATCGCG 3’ e PIFD Rev (nt 205-184) 5’ GCTCTTCCATTGTTGGCTCGTC 3’ escolhidos com base na sequência da região conservada do extremo 3’ do genoma do FeCoV (Herrewegh et al., 1995a). A posição dos oligómeros foi determinada
com base no isolado FIPV 76-1146 (Herrewegh et al., 1995a). Um fragmento de 177pb, incluído na região genómica da UTR-3’, foi amplificado por RT-PCR, seguido por uma reacção de PCR.
Para a realização da prova de RT-PCR utilizou-se o Kit One-step RT-PCR (Superscript, Invitrogen/Gibco BRL) de acordo com as instruções do fabricante, no volume final de 50 µl, utilizando 10 µl de amostra e 0,5 µM de cada oligómero. As condições de síntese de cDNA e amplificação foram 37 ºC durante 60 min seguidas de um passo de desnaturação a 94 ºC por 5 min e 35 ciclos de 94 ºC / 30 seg, 47 ºC / 1 min e 72 ºC / 1 min. O passo de extensão foi realizado a 72 ºC durante 5 min.
O PCR foi efectuado utilizando 5 µl da reacção anterior em 50 µl da mistura de PCR com 10 mM Tris HCl, pH 7,5, 0,01 mM EDTA 0,5 mM DTT, 1,5 mM MgCl2, 2,5 U Taq DNA Polymerase (Pharmacia), 200 mM de cada dNTP e 50 pmol de cada oligómero. As condições de amplificação incluíram um conjunto de 5 ciclos a 94 ºC / 1 min, 47 ºC / 1min e 72 ºC / 1 min, seguidas por um passo de extensão a 72 ºC por 5 min e um segundo conjunto de 30 ciclos a 94 ºC / 30 seg, 51 ºC / 45 seg e 72 ºC / 1 min. O passo de exten-são final foi realizado a 72 ºC durante 5 min.
Os produtos de 177pb obtidos no segundo PCR foram analisados por electroforese em gel de agarose a 2%, com 0,5 µg/ml de EtBr.
Hidrólise dos produtos amplificados
Os fragmentos amplificados no segundo PCR foram sujeitos a hidrólise com a enzima de restrição Dra I (Amersham Pharmacia Biotech) segundo as instruções do fabricante, utilizando 20 µl da reacção de PCR (Herrewegh et al., 1995 a). A reacção deu origem a dois fragmentos de 35 pb e 142 pb, visualizados num gel de agarose a 2,5% com 0,5 µg/ml de EtBr.
Clonagem e alinhamento das sequências nucleotídicas
Os produtos obtidos foram clonados em pGEM®-T Easy Vector System (Promega) de acordo com as instruções do fabricante e sequenciados.
A sequência nucleotídica dos vários clones recombi-nantes foi comparada com as sequências homólogas de diferentes Coronavírus animais (Tabela 1) utilizando o programa informático PILEUP (GCG Wisconsin Package v. 10.0).
Resultados
Ensaio de RT-PCR – nested PCR
Foi utilizado um ensaio de RT-PCR – nested PCR para detectar a presença de ácido nucleico viral em 136 amostras biológicas provenientes de animais saudáveis (66%) ou com suspeita clínica de Peritonite
Infecciosa Felina ou patologia intestinal (33%) (Tabela 2).
No grupo dos animais saudáveis, 25,5 % foram positivos para a presença de ácido nucleico viral com uma maior incidência nas fêmeas embora o ratio fêmeas/machos se encontrasse equilibrado. Neste grupo estavam incluídas 40 amostras obtidas de gatos errantes, representando 18,8% (17) dos animais positivos.
Nos animais suspeitos verificou-se 67,4% de positividade. A idade destes animais oscilava entre os 4 meses e os 6 anos. Dos 15 animais negativos (32,6%) com suspeita clínica, 6 apresentavam doença entérica e 9 animais exibiam sinais relacionados com Peritonite infecciosa, nomeadamente efusão pleural e abdominal, dispneia e anorexia.
O material biológico mais frequentemente utilizado na detecção do RNA viral foi a zaragatoa rectal / fezes demonstrando ser eficaz para o efeito. A presença de RNA viral foi efectuada igualmente nos líquidos derrame pleural ou ascítico, nos animais com suspeita clínica de PIF, com elevada percentagem de positividade. De forma a confirmar a especificidade da reacção de RT-PCR – nested PCR, todos os produtos amplifi-cados foram sujeitos a hidrólise com a enzima de
restrição DraI, dando origem a dois fragmentos de 35 pb e 142 pb (Figura 1) (Herrewegh et al., 1995a). Coronavírus Grupo I
Identificação Número de acesso
PRCV 86/137004 X60056 PRCV RM4 Z24675 TGEV FS772/70 Y00542 CCV BGF10 AY342160 CCV K378 X66717 CCV INSAVC-1 D13096 FIPV UCD4 X90578 FIPV UCD1 X90575 FIPV M23694 FIPV TN406 X90570 FECV UCD X90574
Tabela 2 - Animais testados por RT-PCR – nested PCR para detecção de RNA viral nas diferentes amostras biológicas.
Animais saudáveis Positivos Negativos
Fêmeas Machos Fêmeas Machos Fêmeas Machos
44 46 14 9 30 37
90 23 (25,5%) 67 (74,5%)
Materiais biológicos Positivos Negativos
Zaragatoa rectal/Fezes 23 67
Coronavírus Grupo II
Identificação Número de acesso
HuCoV OC43 AY391777
EqCoV NC99 AF523848
BCoV Mebus U00735
MHV AF208066
MoHV M35255
Animais suspeitos Positivos Negativos
Fêmeas Machos Fêmeas Machos Fêmeas Machos
24 22 15 16 9 6
46 31 (67,4%) 15 (32,6%)
Materiais biológicos Positivos Negativos
Zaragatoa rectal/Fezes 21 14
Liquido pleural 5 1
Liquido ascítico 4 0
Plasma 1 0
Tabela 1 - Identificação das várias sequências virais utilizadas no alinhamento, através do seu número de acesso nas bases de dados de sequências nucleotídicas EMBL, GeneBank e DDBJ.
Figura 1 - Amplificação e hidrólise com a endonuclease DraI, dos
produtos da reacção de RT-PCR – nested PCR a partir de diferentes materiais biológicos.
Figura 2A - Alinhamento nucleotídico das 177 pb incluídos na UTR 3’ dos produtos amplificados com as sequências homólogas dos Coronavirus do
Grupo I (PRCV 86/137004, PRCV RM4, TGEV FS772/70, CCV BGF10, CCV K378, CCV INSAVC-1, FIPV UCD4, FIPV UCD1, FIPV, FIPV estirpe TN406, FECV UCD).
Clonagem, sequenciação e análise da sequência nucleotídica
Foram escolhidas vinte e umas amostras para clonagem e sequenciação, com base no rendimento da reacção de amplificação. A região amplificada situa-se na UTR 3´do genoma viral, presente em todos os mRNA virais. No alinhamento múltiplo com sequências homólogas dos Coronavírus animais do Grupo I foram identificadas 13 posições variáveis em diferentes sequências. Na estirpe RM4 do PRCV foi detectada uma deleção de 5 nucleótidos e no CCV INSAVC-1 onze nucleótidos discordantes.
A 3’ UTR inclui uma sequência de 52 nucleótidos que participam no processo de replicação e tradução do RNA viral (Williams et al., 1999; Wu et al., 2003). Esta região permite a formação de uma estrutura secundária de pseudo-nó conservada nos Coronaviridae. A sequência consenso do Grupo I foi alinhada com a sequência consenso correspondente do Grupo II. Apesar da variabilidade detectada ao longo do alinha-mento, os nucleótidos responsáveis pela estrutura secundária estavam conservados (Figura 2).
Discussão
A persistência do FeCov na população felina com risco de desenvolvimento de PIF é assegurada pela presença de animais portadores (Addie et al., 2003). Em Portugal a epidemiologia desta infecção permanece desconhecida não havendo informação sobre o impacto patogénico da infecção nas várias populações felinas.
Para caracterizar a infecção pelo FeCoV foi utiliza-do um ensaio de RT-PCR – nested PCR para detectar animais portadores e para confirmar o diagnóstico clínico de PIF. Este método permitiu a detecção de sequências virais em diferentes materiais biológicos, revelando-se como um instrumento útil para o diagnóstico etiológico.
A região genómica escolhida como alvo consistiu numa região conservada de forma a facilitar a detecção de todas as variantes virais de FeCov circu-lantes na população felina em estudo (Herrewegh et
al., 1995a). A escolha de uma região genómica
variável no RNA viral, sujeita a processos distintos de selecção (Kiss et al., 2000a, 2000b) poderia dificultar a reacção de amplificação devido a variação nucleotídica de diferentes estirpes virais.
Embora um resultado negativo na reacção de RT-PCR – nested RT-PCR possa ser inconclusivo, uma amplificação positiva indica a presença e a libertação do vírus para o ambiente (Foley et al., 1997a; Addie e Jarrett, 2001) aumentando a possibilidade de desen-volvimento de PIF, devido a um aumento da carga viral em espaços limitados tais como gatarias ou abrigos para animais (Addie et al., 1995).
Neste estudo foi determinada uma prevalência de infecção de 25,5% nos 90 animais sem sintomatologia clínica testados, com uma maior incidência nas fêmeas. A presença de 40 gatos errantes (44,4% do total) neste grupo poderá justificar a elevada prevalência viral. Ambientes sobrelotados favorecem a transmissão oro-fecal e uma alta incidência de animais portadores detectada no grupo de gatos errantes poderá reflectir más condições de alojamento, assim como a deficiente condição física destes ani-mais, devida a má nutrição, parasitismo e eventual co-infecção com outros agentes infecciosos.
Enquanto método complementar de diagnóstico de PIF esta prova demonstrou a sua utilidade, confirman-do a presença de áciconfirman-do nucleico viral em 67,4% confirman-dos animais suspeitos. Os materiais biológicos que se revelaram mais adequados para detecção de ácido nucleico viral foram fezes ou zaragatoas rectais como já confirmado por outros autores (Foley et al., 1997b; Addie et al., 2001), devido à facilidade da colheita, embora o plasma ou o líquido de derrames pleurais ou abdominais tenha sido igualmente conclusivo.
Incluída na região amplificada dos diferentes isolados encontra-se uma sequência de 52 nucleótidos,
Figura 2B - Alinhamento nucleotídico da sequência consenso responsável pelo pseudo-nó, conservado filogeneticamente entre os Grupos I e II dos
Coronavírus, presente na UTR 3’.
Figura 2C - Alinhamento nucleotidíco dos 52 resíduos incluídos no pseudo-nó dos Coronavirus do Grupo II. (HuCoV OC43; EqCoV NC99, BCoV
responsável por uma estrutura secundária envolvida na replicação do RNA viral, conservada em todos os grupos do género Coronavirus (Williams et al., 1999; Wu et al., 2003).
O alinhamento da sequência consenso representativa dos nossos isolados, com sequências pertencentes ao Grupo II dos Coronavirus, revelou a manutenção dos nucleótidos responsáveis pela estrutura secundária. A variação nucleotídica observada na restante sequência pode reflectir as particularidades de cada grupo. A partilha de sinais similares envolvidos na replicação viral pode indicar uma maior possibilidade de recom-binação entre membros de cada grupo, potenciando a capacidade de recombinação referida nos Coronaviridae (Wu et al., 2003).
A utilização de um ensaio de RT-PCR – nested PCR para detecção de ácido nucleico viral em diferentes materiais biológicos demonstrou a sua utilidade enquanto método de diagnóstico etiológico, permitindo igualmente a identificação de animais portadores sem sintomatologia clínica. Em Portugal a prevalência da infecção por FeCoV é pouco conhecida. A disponibi-lidade deste ensaio permitirá aferir o impacto patogénico desta infecção viral, assim como a possi-bilidade de identificação de animais portadores em populações controladas de felinos.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo CIISA/FMV no âmbito do projecto "Prevalência e Caracterização Genética das Principais Viroses Felinas".
Agradecemos a colaboração de todos os Médicos Veterinários do Hospital Escolar da FMV e da União Zoófila na obtenção de todas as amostras biológicas.
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