PRODUÇÃO DE BIODIESEL UTILIZANDO LIPASES DE FUNGOS ENDOFÍTICOS

PRODUÇÃO DE BIODIESEL UTILIZANDO LIPASES DE FUNGOS ENDOFÍTICOS

Autores:

VANIA CAROLINE SABINO CASAGRANDE1, MARIA LUIZA FERNANDES RODRIGUES2, CARLOS EDUARDO DELAY3.

1- Acadêmica do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR);

2- Dra. em Química Orgânica, Profa. Co-Orientadora e Adjunto da Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, Paraná, Brasil;

3- Dr. em Química Orgânica, Prof. Orientador e Adjunto da Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, Paraná, Brasil.

Endereço eletrônico para correspondência: Maria Luiza Fernandes Rodrigues, mlmfernandes@hotmail.com

Endereço: Rua Alferes Poli, 271, apto 1505, centro, Curitiba-PR CEP: 80230-090 Telefone: 41 9914-55-43

RESUMO:

Fatores de ordem econômica e ambiental fizeram com que pesquisadores do mundo todo voltassem sua atenção à produção de combustíveis alternativos ao uso do petróleo. O biodiesel é um combustível obtido de fontes renováveis para geração de energia. Seu uso está em ascensão tanto pela escassez do óleo diesel tradicional quanto pelos impactos negativos ao meio ambiente, sendo este o fator determinante para o emprego do biodiesel. Uma das maneiras de se obtê-lo é através da síntese de ésteres via processo enzimático, o qual se utiliza de lipases para seu processo de produção, devido ao seu alto poder catalítico. As lípases são enzimas que catalisam reações de esterificação e transesterificação em meio orgânico, operando em condições suaves de temperatura e pressão com alta especificidade e seletividade. O biodiesel provém da reação de transesterificação, principalmente de óleos vegetais ou gordura animal. Essa reação ocorre reagindo-se um álcool, etanol ou metanol, com óleo na presença de um catalisador para haver a formação de ésteres do biodiesel e glicerina como subproduto. O objetivo deste trabalho foi testar a eficiência de catalisadores biológicos (lipases) produzidos pelo fungo endofítico Penicillium sp., isolado das folhas da erva mate (Ricinus communis L.) para a produção do biodiesel, utilizando o óleo de soja utilizado em frituras como substrato. A reação de transesterificação foi acompanhada através da cromatografia em camada delgada (CCD) com visualização em câmara de UV (254 nm) e revelação em Iodo sublimado. A produção de ésteres do biodiesel foi observada a partir de 24 h de reação

ABSTRACT

Factors of economic and environmental researchers have made the world turn their attention to the production of alternative fuels to the use of oil. Biodiesel is a fuel obtained from renewable sources for power generation. Its use is on the rise because of shortages of both traditional and diesel by the negative impacts to the environment, which is the determining factor for the use of biodiesel. One of the ways to get it is through the synthesis of esters by enzymatic process, which is used for lipase production process due to its high catalytic power. The lipases are enzymes that catalyze esterification and transesterification reactions in organic medium, operating in mild conditions of temperature and pressure with high specificity and selectivity. The Biodiesel comes from the transesterification reaction, mainly from vegetable oils or animal fat. This reaction occurs by reacting an alcohol, ethanol or methanol, with oil in the presence of a catalyst to bring about the formation of esters of biodiesel and glycerin as byproduct. The objective of this study was to test the efficiency of biocatalysts (lipases) produced byendophytes fungus Penicillium sp., isolated from the leves of yerba mate (Ilex paraguariensis St.Hill.) for production of biodiesel using soybean oil used for frying as a substrate.The transesterification reaction was monitored by thin layer chromatography (TLC) visualization chamber with UV (254 nm) and iodine sublime revelation. The production of biodiesel esters was observed after 24 hours of reaction.

1. INTRODUÇÃO

Durante muito tempo os fungos foram considerados como vegetais e, somente a partir de 1969, passaram a ser classificado em um reino à parte denominado reino Fungi. Os fungos são seres vivos eucarióticos, mononucleares ou multinucleares, uni ou pluricelulares, heterotróficos, aclorofilados, nutrem-se através de matéria orgânica morta ou viva, sendo eles fungos saprófitos ou parasitários, podendo ser também insetívoros, o qual libera uma exoenzima ou helmintívoros cujo libera uma substância tranquilizante (Soares & Ribeiro, 2001).

Embora, popularmente os fungos sejam considerados prejudiciais tanto a saúde vegetal quanto animal, são extremamente importantes para que processos biotecnológicos ocorram, dentre eles a produção do biodiesel. O biodiesel nada mais é do que um combustível renovável e biodegradável obtido a partir da reação química de lipídios, de origem animal através de sebo bovino, suíno, de aves e de vegetais tais como mamona, soja, canola, palma, girassol, amendoim entre outros. Também podem ser utilizados óleos de frituras (Urgel et al., 2001).

Umas das vantagens desse combustível é que a queima do biodiesel não contribui para o aumento de dióxido de carbono na atmosfera, proporcionando assim um equilíbrio entre a emissão dos gases pelos automóveis e a absorção das plantas, e também possui propriedades de combustão muito semelhantes as do óleo diesel de petróleo (Knothe et al., 2006).

Os fatores ambientais, geográficos e políticos juntamente com a elevação dos preços do petróleo favorecem a expansão do mercado de produtos combustíveis derivados de biomassa em âmbito mundial, predominando o etanol para uso em automóveis, e biodiesel para caminhões, ônibus, tratores, transportes marítimos, aquaviários e em motores estacionários para a produção de energia elétrica (Suarez & Meneghetti, 2007).

Esse movimento foi empreendido mais fortemente pela Europa, EUA e Brasil, que apostaram em fontes renováveis para assegurar insumos energéticos com autonomia e regularidade de fornecimento associados a menores custos. A introdução do Biodiesel no Brasil iniciou-se timidamente em 2005, e se expande ao longo dos anos com previsão otimista, desde que superados os desafios impostos para a consolidação do mercado (SUAREZ & MENEGHETTI, 2007).

O objetivo deste trabalho é qualificar a produção dos ésteres de biodisel, tendo como substratro o óleo de soja utilizado em frituras, produzidos através de reação de biocatálise realizada pela atividade enzimática de fungos endofíticos.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

O presente trabalho foi desenvolvido no laboratório de fermentação da Universidade Tuiuti do Paraná, na Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde – Campus Barigui.

2.1. Micro-organismos

O micro-organismo utilizado neste trabalho foi o fungo endofítico isolado das folhas da erva-mate (Ilex paraguariensis St.Hill), caracterizado por microcultivo como Penicillium sp., que foi gentilmente cedido pelas Professoras Pesquisadoras Msc. Roseli Mello e Dra. Maria Luiza M. Fernandes, do laboratório de Microbiologia da Universidade Tuiuti do Paraná.

2.2. Esterilização de meios e equipamentos

Para garantir o crescimento dos micro organismos em condições estéreis, os meios sólidos de propagação do inóculo e de produção, assim como todos os materiais utilizados foram esterilizados em autoclave a 121 ºC por um período de 15 min.

2.3. Estoque e manutenção de cepas

As cepas foram inoculadas em meio BDA e incubadas por 7 dias a 28 ºC, fazendo-se repiques mensais, sendo após o crescimento mantidas sob refrigeração a temperatura de 4 ºC.

2.4. Fermentação no estado sólido

2.4.1. Preparação dos Substratos

Nestes estudos foram utilizados como substratos as sementes de girassol (Helianthus nnuus L.) que possuem alto valor lipídico. Este substrato foi utilizado na FES para a produção de lipases, cujo qual foi seco a temperatura de 55-60 ºC em estufa por 24h. Após a secagem do substrato, foi moído, tamisado e embalado em sacos plásticos, sendo utilizadas as frações do substrato com granulometria de 1mm de diâmetro para os estudos de FES.

Todos os experimentos de produção da enzima foram realizados pelos alunos de graduação do 4

º

2.4.2. Condições de cultivo no meio sólido

Os experimentos foram realizados nas condições otimizadas previamente pela ex-aluna de graduação, da turma de 2010/02 do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia, Renata Amorim.

Os ensaios de FES foram realizados conforme metodologia descrita por Fernandes (2006). Após crescimento do fungo em ágar BDA por 7 dias, os esporos foram suspensos em solução de tween 80 (0,001% v/v) e submetidas a agitação, até a obtenção de uma solução homogênea. A concentração de esporos foi determinada por contagem em câmara de Neubauer.

A fermentação foi conduzida em frascos erlenmeyers de 125 mL, com 10 g de substrato sólido e umidade de 60 %, mantida por tampão fosfato 0,1 M pH 7,0. Neste meio foi inoculado assepticamente a solução de células na concentração de 107 esporos/gSS. Os erlenmeyers foram incubados em shaker a 30 ºC e retirados após 72 horas de fermentação (Fernandes, 2006).

A produção de lipase foi acompanhada pela dosagem da atividade lipolítica no material fermentado. A atividade lipolítica foi expressa como unidades de atividade enzimática por grama de sólido fermentado (U/gSS).

2.4.3. Secagem do sólido fermentado

O sólido fermentado foi congelado a 0°C por 24 horas para interromper o crescimento fúngico. Após a secagem do sólido em estufa a 30 ºC por 48 horas e acondicionado em sacos plásticos, cujos quais foram armazenados em temperatura ambiente.

2.5. Biocatálise: Estudo da reação de síntese de ésteres de biodiesel

Os estudos de síntese foram realizados utilizando-se o sólido fermentado (adição direta). A biocatálise ocorreu com o material fermentado contendo a enzima lipase. A fermentação em estado sólido (FES) ocorreu a 30 ºC, mistura de 10 g de farelo de semente de girassol, contendo 60% de umidade. No pico máximo de produção da enzima, que é relativo ao período de 72 horas, a fermentação foi interrompida e o material fermentado foi seco em estufa a 30 ºC. Estudos cinéticos foram realizados para a verificação de síntese dos ésteres de biodiesel.

Ensaios foram realizados adicionando-se quantidade fixa do material fermentado e seco (3 g), em 30 mL de n-hexano, a 30 ºC, com razão molar (álcool-óleo) 6:1 e da atividade.

2.5.1. Óleo de soja

O óleo de soja (Glycine max L. Merr.), utilizado para a realização da fritura de alimentos, foi o substrato de escolha para os experimentos.

2.6. Adição Direta do Material Fermentado

Estudos cinéticos utilizando-se a lipase como catalisador da reação foram realizados para a verificação de síntese dos ésteres de biocombustível.

O substrato utilizado foi o óleo de soja (70 mM) utilizado no processo de fritura de alimentos e o álcool etílico (420 mM).

As reações foram realizadas em Shaker nas seguintes condições: 30°C, 180 rpm, em n-hexano como solvente. O monitoramento da reação foi acompanhado durante 120 h, sendo retiradas alíquotas do meio reacional nos intervalos de tempo zero até 120 h. A transesterificação do óleo de soja para síntese de ésteres foi avaliada qualitativamente por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) (AMORIM, 2010).

2.7. MÉTODOS ANALÍTICOS

2.7.1. Ensaio Enzimático

Método Titulométrico

Os ensaios de atividade frente à triacilgliceróis foram realizados utilizando-se o óleo de oliva como substrato. A dosagem da atividade enzimática foi determinada pelo método titulométrico descrito por Franken (2007), com adaptações. Para as dosagens foi preparada uma emulsão contendo óleo de oliva (7,15 % m/v) emulsificada em goma arábica (10 % m/v) em tampão fosfato pH 7,0.

O ensaio foi realizado em erlenmeyers de 125 mL, adicionando-se 20 mL da emulsão e 3 g do sólido fermentado, obtido conforme item 2.4.2. As amostras foram incubadas em Shaker, sob agitação, por 15 min a 30°C. A reação foi paralisada adicionando-se 15 mL de solução de etanol/acetona (1:1 v/v). Os ácidos graxos liberados foram titulados em solução de NaOH (0,05 N) até pH 10.

Os brancos reacionais foram preparados adicionando-se no início da reação, a solução etanol/acetona (1:1 v/v) ao meio reacional contendo 3 g do material sólido fermentado.

Uma unidade de atividade lipolítica foi definida como a quantidade de enzima que libera 1 mM de ácido graxo por minuto nas condições descritas acima, sendo o resultado expresso em unidades por grama de substrato sólido (U/gSS).

2.7.2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Cada alíquota foi retirada do meio reacional nas reações de síntese de ésteres do biodiesel, nos intervalos de zero até 120 h, a cada 24 h e aplicada em uma cromatoplaca contendo fluoresceína (Merck), com auxílio de um tubo capilar. Após este processo, as cromatoplacas foram transferidas para uma cuba de vidro hermeticamente fechada contendo hexano, éter etílico e ácido acético na proporção 7:3:0,1 (v/v/v) respectivamente, como fase móvel. As cromatoplacas foram retiradas da cuba de vidro e evaporadas a temperatura ambiente para posterior visualização das manchas.

As placas foram primeiramente visualizadas em câmera UV a 254 nm. Em seguida, foram reveladas com iodo sublimado (I2). As manchas apareceram gradativamente em decorrência da interação do iodo com os componentes das amostras.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. BIOCATÁLISE: REAÇÃO DA SÍNTESE DE ÉSTERES DE BIODIESEL

Estudos cinéticos foram realizados para a verificação de síntese dos ésteres de biodiesel, como oleatos, palmitatos e linolenatos.

Ensaios foram realizados com proporções fixas do material fermentado e seco, em n-hexano, a 30 ºC.

As lipases são enzimas que atuam na quebra de lipídeos e óleos, liberando ácidos graxos, monoacilgliceróis, digliceróis e glicerol (MENONCIN et al, 2010).

A Transesterificação é um termo usado para descrever uma importante classe de reações orgânicas onde um éster é transformado em outro através de uma reação química com um álcool, e tendo como subproduto a glicerina (Figura 1). O álcool a ser utilizado geralmente é escolhido pelo menor preço. A maioria dos países usa o metanol, porém, existem exceções como o Brasil, que utiliza o etanol obtido pela fermentação da cana-de-açúcar (IEL, 2008).

Atualmente essa reação tem sido bastante estudada, pois o seu principal produto (éster) possui características muito semelhantes ao diesel do petróleo, podendo então ser utilizado puro ou misturado ao diesel fóssil, o comumente conhecido Biodiesel. Essa reação também é conhecida como alcoolize.

Na transesterificação de óleos vegetais, um triacilglicerídeo reage com um álcool na presença de uma base ou ácido forte, produzindo uma mistura de ésteres de ácidos graxos e glicerol. O processo geral é uma seqüência de três reações consecutivas, na qual mono e diacilglicerídeos são formados como intermediários (GERIS et al., 2007).

Os ésteres de cadeia longa são componentes de muitos produtos industriais como cosméticos, lubrificantes e flavorizantes. Além disto, estes compostos são encontrados em combustíveis fósseis e em atmosferas poluídas, e, portanto, desempenham uma função importante nos estudos do meio ambiente. Fernandes et al. (2007) realizou reações de síntese do éster oleato de etila (éster do biodiesel) e transesterificação de óleos vegetais (produção de biodiesel) catalisadas por uma lipase bacteriana produzida por FES.

Durante o processo foram coletadas alíquotas nos seguintes tempos: 0, 24, 48, 72, 96 e 120 h. As reações de síntese foram acompanhadas por CCD.

Foi possível observar que a lipase catalisou as reações de síntese do éster do biodiesel, a partir de 24 h de reação, conforme pode ser visualizado na Figura 02 e 03.

Os ésteres do biodiesel, sendo pouco polares, interagem mais com a fase móvel e pouco com a fase estacionária (sílica). As manchas correspondentes aos ésteres podem ser visualizadas no topo da cromatoplaca.

4. CONCLUSÃO

A partir dos resultados obtidos nas cromatoplacas conclui-se qualitativamente que a transesterificação do óleo de soja catalisada pela enzima do fungo endofítico Penicillium sp. foi eficaz, havendo formação dos ésteres do biodiesel a partir das primeiras 24 horas de reação. Os resultados obtidos foram significativos no que diz respeito à formação dos produtos desejados devido à alta seletividade e especificidade dessa rota sintética.

Embora os dados obtidos em laboratório revelem uma grande versatilidade e potencial de utilização deste sólido fermentado, contendo lipases, em reações de transesterificação, sugere-se a continuidade dos experimentos, com intuito de quantificar os ésteres do Biodiesel. Poderão ser realizados experimentos com cromatografia preparativa para isolar os ésteres e em seguida quantificá-los por cromatografia de alta eficiência (CLAE) ou cromatografia gasosa (CG).

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AMORIM, R. Síntese de Biocombustíveis Catalisada pela lipase fúngica de Penicillium sp. 2010. 10f. Trabalho de Conclusão de Curso – Setor de Ciências Biológicas e da Saúde, Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia, Universidade Tuiuti do Paraná, Curitiba, 2010.

BON, E. P. S; PEREIRA Jr, N. Tecnologia Enzimática, Rio de Janeiro, 113p, 1999.

FERNANDES, M. L. M. Produção de lipases por fermentação no estado sólido e sua utilização em biocatálise. 2006. 130f. Dissertação (Doutorado em Química) - Setor de Ciências Exatas – Universidade Federal do Paraná. Curitiba, 2006.

FERNANDES, M. L. M. Hidrólise de triglicerídeos e síntese de éster de ácido graxo em sistemas de micelas reversas. Curitiba, 2002. 107 f. Tese (Mestrado em Química Orgânica) – Setor de Ciências Exatas, Universidade Federal do Paraná.

FERNANDES, M. L. M.; SAAD, E. B.; MEIRA, J. A.; RAMOS, L. P.; MITCHELL, D. A.; KRIEGER, N. Esterification and transesterification reactions catalysed by addition of fermented solids to organic reaction media. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 44 (2007) 8-13.

FRANKEN, L. P. G. Avaliação da atividade hidrolítica de lipases em propano pressurizado. 2007. 80f. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Alimentos) – Departamento de Ciências Agrárias - Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões. Erechim, 2007.

GERIS, R. et al. Biodiesel de soja – reação de transesterificação para aulas praticas de química orgânica. Química Nova, v.30 n.5 São Paulo set./out. 2007.

INSTITUTO EUVALDO LODI. Núcleo Central. Álcool Combustível – Série Indústria em perspectiva. Brasília: IEL/NC, 2008.

KNOTHE, G; GERPEN, J. V.; KRAHL, J.; RAMOS, L. P. Manual do Biodiesel. São Paulo: Blucher, 2006.

MENONCIN, S.; DOMINGUES, N. M.; FREIRE, D. M. G.; OLIVEIRA, J. V.; DI LUCCIO, M.; TREICHEL, H.; OLIVEIRA, D. Imobilização de lípases produzidas por fermentação em estado sólido utilizando Penicillium verrucosum em suportes hidrofóbicos. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, p. 440-443, abr-jun. 2009. Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/cta/v29n2/33.pdf. Acesso: 29 mar. 2010.

SOARES, M. M.; RIBEIRO, M. C. Microbiologia Prática Roteiro e manual Bactérias e fungos. 1 ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2001, 238 pág.

SUAREZ, P. A. Z., MENEGHETTI, S. M., 70º Aniversario do biodiesel em 2007: Evolução histórica e situação atual no Brasil. Química Nova, v.30, p. 2068-2071, 2007.

SUAREZ, P. A. Z.; RUBIM, J. C.; MUNDIM, K. C. Sistema de Conversão de Óleos Vegetais, Óleos Usados e Gorduras Animais em Óleos Combustíveis. PI B0204019-0, 2002.

SUAREZ, P. A. Z.; MENEGHETTI, PLENTZ, S. M.; MENEGHETTI, M. R.; WOLF, C. R. Transformação de triglicerídeos em combustíveis, materiais poliméricos e insumos químicos: algumas aplicações da catálise na oleoquímica. Química Nova. V. 30, n. 3, São Paulo. Mai/Jun 2007.

URGEL, A. L; AQUARONE., E; BORZANI, W., Biotecnologia Industrial – Processos Fermentativos e Enzimáticos, vol. 3. São Paulo: Edgard Blucher. p.p.391-403, 2001

ANEXOS:

Figura 1. Reação de transesterificação de triglicerídeos com álcool. FONTE: LÔBO, 2009.

Figura 02: Manchas visualizadas em Câmara de UV. Condições experimentais: Razão molar álcool/óleo 6:1,100 U (atividade enzimática), após 24 h de reação.

Figura 03: Manchas reveladas em Iodo sublimado (I2). Condições experimentais: Razão molar álcool/óleo 6:1,100 U (atividade enzimática), após 24 h de reação.

Figura 04: Manchas visualizadas em Câmara de UV. Condições experimentais: Razão molar álcool/óleo 6:1,100 U (atividade enzimática), após 120 h de reação.

Figura 05: Manchas reveladas em Iodo sublimado (I2). Condições experimentais: Razão molar álcool/óleo 6:1,100 U (atividade enzimática), após 120 h de reação.