NELISSA CAMARGO TORREZANI
EFEITOS GENOTÓXICOS DA FRAÇÃO SOLÚVEL DO
BIODIESEL PARA UMA ESPÉCIE DE PEIXE NEOTROPICAL
Londrina 2009
NELISSA CAMARGO TORREZANI
EFEITOS GENOTÓXICOS DA FRAÇÃO SOLÚVEL DO
BIODIESEL PARA UMA ESPÉCIE DE PEIXE NEOTROPICAL
Trabalho de Conclusão de Curso (TCC), apresentado como requisito parcial para obtenção do Título de Licenciada em Ciências Biológicas, pelo Centro Universitário Filadélfia – UNIFIL.
Orientadora: Profª. MsC. Lenice Souza Shibatta
Co-orientadoras: Profª. Drª Cláudia Bueno dos Reis Martinez e MsC. Dalita Gomes Silva Morais Cavalcante – Laboratório de Ecofisiologia Animal da UEL
Londrina 2009
EFEITOS GENOTÓXICOS DA FRAÇÃO SOLÚVEL DO
BIODIESEL PARA UMA ESPÉCIE DE PEIXE NEOTROPICAL
Trabalho de Conclusão de Curso (TCC), apresentado como requisito parcial para obtenção do Título de Licenciada em Ciências Biológicas, banca examinadora do Centro Universitário Filadélfia – UNIFIL e Universidade Estadual de Londrina – UEL .
Aprovada em:____/____/____
____________________________________________ Profa. MsC. Lenice Souza Shibatta Centro Universitário Filadélfia – UNIFIL
____________________________________________ Profa. Dra. Cláudia Bueno dos Reis Martinez
Universidade Estadual Londrina
_____________________________________________ MsC. Dalita Gomes Silva Morais Cavalcante
AGRADECIMENTOS
À Profa. MsC. Lenice Souza Shibatta que me acolheu em seu laboratório para a elaboração de vários trabalhos e coletas, pela sua disponibilidade e ajuda.
À Unifil e todos os professores pelo conhecimento transmitido e pela paciência em nos ajudar durante esses 4 anos de estudo e aprendizado.
À Profa. Dra. Claudia Bueno dos Reis Martinez que me cedeu o estágio em seu laboratório de Ecofisiologia Animal (LEFA) para a elaboração de minha monografia, conhecimento passado e auxílio durante a minha formação acadêmica.
À MsC. Dalita Gomes Silva Morais Cavalcante pela paciência em me ajudar em todas as minhas dúvidas, companheirismo, amizade e atenção oferecida em todos os momentos em que precisei.
Aos cometeiros de plantão e aos amigos do LEFA que sempre estavam dispostos em ajudar nos experimentos para a elaboração desse trabalho.
Aos meu amigos Ju, Poli, Nik, Gabi, , Nat, Harumi e Aline pela amizade e momentos de descontração, discussões, trabalhos, conselhos e festas.
Ao meu namorado Diego pelo incentivo, paciência e carinho nos fins de semana para a elaboração desse trabalho.
À minha grande amiga Clarice que sempre me apoiou e ajudou em todos os momentos que precisei.
Á meus pais Ademir e Rute pelo esforço e apoio durante esse período da graduação para a realização do curso de Ciências Biológicas.
À Deus por todas as bênçãos e proteção concedida em todos os momentos da minha vida.
TORREZANI, NELISSA CAMARGO. EFEITOS GENOTÓXICOS DA FRAÇÃO SOLÚVEL DO BIODIESEL PARA UMA ESPÉCIE DE PEIXE NEOTROPICAL. 2009. Trabalho de Conclusão de Curso em Ciências Biológicas. Centro Universitário Filadélfia.
Resumo: O biodiesel é considerado um combustível menos poluente, pois emite menos gases tóxicos, contribuindo assim para o controle do aquecimento climático global. Entretanto, ainda não se conhece os possíveis efeitos deste biocombustível sobre os organismos aquáticos. Por isso, nesse trabalho foram avaliados os possíveis efeitos genotóxicos da fração solúvel do biodiesel (FSBd) para o peixe neotropical Prochilodus lineatus. Os peixes foram expostos à FSBd ou apenas à água durante 6, 24 e 48h e após a exposição os animais foram amostrados para a coleta de sangue e brânquias. O ensaio do cometa (EC) foi realizado com os eritrócitos e célula das brânquias, para avaliar a ocorrência de danos na molécula de DNA. Para o EC, 100 nucleóides foram analisados por peixe de acordo com a migração de fragmentos do DNA, adotando a seguinte classificação: 0 (sem dano aparente), 1 (dano pequeno), 2 (dano médio) e 3 (dano grande). A ocorrência de micronúcleos (MN) e outras alterações eritrocíticas nucleares (AENs) foi analisada nas hemácias. Para isso, foram feitos esfregaços de sangue em lâminas de vidro, com o auxílio de lamínulas. Após permanecerem secando por 24 h em temperatura ambiente, as lâminas foram fixadas em metanol e coradas com Giemsa a 5%. Foram analisados 3000 eritrócitos por peixe, considerando-se as categorias: micronúcleo (M), núcleo lobulado (L), núcleo segmentado (S) e núcleo em constrição (C). Os resultados mostraram que a exposição à FSBd promoveu aumento significativo na ocorrência de danos no DNA dos eritrócitos e das brânquias, entretanto as análises de MN e AENs não indicaram ocorrência dessas alterações após a exposição à FSBd. Assim, pode-se concluir que o biodiesel promove danos no DNA dos eritrócitos e células das brânquias do peixe P. lineatus. Com base neste estudo foi desenvolvida uma proposta de aula teórica e prática, a ser aplicada no ensino fundamental, enfocando a poluição aquática e suas consequencias para o meio ambiente.
Palavras-chave: biodiesel, genotoxicidade, educação ambiental.
SUMÁRIO
2. OBJETIVO...11
2.1 Objetivos Gerais...11
2.2 Objetivos Específicos...11
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...12
3.1 Biodiesel...12
3.2 Importância da educação ambiental no combate à poluição aquática...14
3.3 Prochilodus lineatus utilizado como organismo bioindicador...16
3.4 Biomarcadores...17
3.5 Testes Genotóxicos...17
3.5.1 Ensaio do Cometa...18
3.5.2 Micronúcleo (MN) e Alterações Eritrocíticas Nucleares (AENs)...20
4. MATERIAL E MÉTODOS...21
4.1 Animal experimental...21
4.2 Obtenção do biodiesel e preparo da fração solúvel do biodiesel (FSBd)...22
4.3 Testes de toxicidade...23
4.4 Amostragem e preparo das suspensões celulares...23
4.5. Viabilidade celular...24
4.6 Ensaio de Cometa...25
4.7 Teste do Micronúcleo e AENs...27
4.8 Análise estatística...28
4.9 Estudo sobre a poluição aquática nas escolas do ensino público...28
5. RESULTADOS...29
5.1 Ensaio Cometa...29
5.2 Teste do Micronúcleo e Outras Alterações Eritrocíticas Nucleares...31
6. DISCUSSÃO...33
6.1 Plano de ensino sobre educação ambiental com enfoque em poluição aquática...38 6.1.1 Plano de ensino sobre educação ambiental, com
enfoque em poluição aquática...38
6.1.2 Educação Ambiental para alunos do ensino fundamental...38
7. CONCLUSÕES...38
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...39
1. INTRODUÇÃO GERAL
A água é um recurso natural e fundamental para a sobrevivência do homem e demais seres vivos. Cerca de 75% da superfície do planeta é coberta por água. A maior parte dessa água, cerca de 97,3%, é salgada e está contida nos oceanos, o restante é água doce. Do volume total de água doce disponível no planeta, 75% está distribuído principalmente nos pólos, na forma de gelo e geleiras, e 23% constitui água subterrânea. Assim, apenasuma pequena quantidade da água doce (2%) está distribuída nos rios e lagos (LLOYD, 1992). É principalmente através dos rios que se obtém a água necessária para as diversas finalidades de uso, como abastecimento de água, geração de energia, irrigação, navegação, aqüicultura, entre outros (MORAES; JORDÃO, 2002).
Com o crescimento e desenvolvimento da população e para se obter benefícios materiais, a humanidade promoveu sérias transformações, que trouxeram como conseqüências as degradações ao meio ambiente, em especial ao ecossistema aquático. (MORAES; JORDÃO, 2002). Conservar este ecossistema é de extrema importância para que no futuro este recurso não venha faltar. Assim, a preservação da biota aquática se tornou prioridade, portanto, várias são as pesquisas que buscam mecanismos eficazes para reduzir os impactos ambientais (NEGREIROS, 1997). Além das pesquisas para a manutenção do ambiente hídrico, trabalhos relacionados à conscientização humana sobre as degradações ambientais, provocadas pelo lançamento de compostos tóxicos, são necessários. As áreas voltadas para os estudos desses contaminantes presentes no ambiente e suas conseqüências podem garantir uma melhor qualidade de vida. Segundo Reigota (1998), o trabalho da conscientização busca a melhoria no comportamento dos indivíduos diante dos problemas ambientais. Este aumento de conscientização, mudanças e aperfeiçoamentos básicos são importantes para que o ser humano saiba interagir de uma forma harmoniosa com o ambiente no qual vive (PADUA; TABANEZ, 1998).
O biodiesel é um tipo de combustível proveniente de fontes biológicas renováveis, como óleos vegetais e gorduras animais. No Brasil, várias espécies vegetais podem ser utilizadas para a produção de biodiesel, tais como mamona, soja, algodão, girassol, dendê etc. O biodiesel é um éster alquil de ácidos graxos, produzido pela transesterificação de óleos ou gorduras, com cadeia curta de álcoois, tais como metanol e etanol. É considerado um combustível menos poluente, pois emite menos gases tóxicos, contribuindo potencialmente para o controle do aquecimento climático global (POON et al., 2007). Porém ainda pouco se conhece sobre o efeito deste biocombustível sobre os organismos vivos, presentes tanto no ambiente marinho quanto dulcícola. Eventuais vazamentos de biodiesel, a partir de seu armazenamento ou durante o seu transporte por caminhões-tanque, podem alcançar os lençóis freáticos ou os corpos de água, como rios e lagos, levando à contaminação do ambiente e dos organismos aquáticos. Por ser um composto de recente interesse, poucos são os trabalhos relacionados à toxicidade deste biocombustível para organismos aquáticos. Devido a carência de resultados sobre os efeitos do biodiesel para espécies de peixes dulcícolas neotropicais, estudos experimentais sobre o impacto de concentrações ambientalmente realistas desse biocombustível nos ecossistemas e em peixes dulcícolas se tornam extremamente necessários e urgentes.
Nos últimos 20 anos, tem-se verificado que os testes de toxicidade com organismos aquáticos constituem uma ferramenta efetiva para avaliação de efeitos de poluentes sobre os organismos vivos. Os resultados destes testes são importantes para avaliação de risco e periculosidade de agentes químicos, para o monitoramento da qualidade da água e estabelecimento de limites permissíveis de lançamento de efluentes líquidos nos corpos hídricos (ZAGATTO, 1998).
Antes de atingir níveis superiores de organização biológica como comunidades e ecossistemas, os efeitos dos contaminantes podem ser verificados em níveis de organização biológica inferiores, que ocorrem mais rapidamente e permitem que os efeitos ou alterações sejam observados com certa antecedência, possibilitando a identificação de problemas antes que o ambiente, como um todo, seja afetado (JONSSON; CASTRO, 2005). Qualquer alteração biológica, relacionada à presença de um composto químico no ambiente no nível sub-individual, medida dentro do organismo ou em seus produtos (urina, fezes, pêlos ou penas), que indica um desvio do estado normal e que não pode ser detectada no organismo intacto, é definida como biomarcador (VAN GESTEL; VAN BRUMMELEN, 1996). Desta forma, o biomarcador é utilizado como um sinal prévio refletindo a alteração biológica causada por uma determinada substância (VAN DER OOST et al., 2003).
Diferentes parâmetros biológicos são utilizados como indicadores para sinalizar as mudanças associadas à presença de contaminantes. O grau de integridade do DNA tem sido proposto como um indicador sensível de genotoxicidade e um biomarcador efetivo para monitoramento ambiental. Os danos no DNA dos organismos aquáticos que vivem em ambientes poluídos podem ser usados para estudar a genotoxicidade de agentes tóxicos em organismos, como também para a avaliação de risco ecotoxicológico e ambiental (ZHU et al., 2005). No Brasil, os testes de genotoxicidade têm sido empregados desde a década de 80, para avaliações ambientais (VALENT, 1998).
Compostos que tem o potencial de causar danos no DNA dos organismos são chamados de agentes genotóxicos. Essas substâncias podem agir diretamente no DNA, alterando sua estrutura. Estes danos podem incluir rupturas na cadeia de DNA, modificações nos nucleotídeos, aberrações cromossômicas e mutações de ponto (FRENZILLI et al., 2004). Entretanto, quando os danos atingem células reprodutoras, as mudanças produzidas no DNA poderão ser transmitidas
aos descendentes, comprometendo as futuras gerações (LYONS et al., 1997; THEODORAKIS et al., 1998).
Os recentes avanços na genética toxicológica resultaram em uma variedade de metodologias que podem ser usadas para avaliar o impacto de agentes potencialmente genotóxicos aos organismos (LYONS et al., 1997; BICKHAM et al., 2000; JHA, 2004). Dentre elas pode-se citar o ensaio do cometa e o teste do micronúcleo. O ensaio do cometa é um método rápido, no qual as lesões do DNA podem ser vistas na ausência da atividade mitótica. Essa técnica possui vantagens por necessitar de um pequeno número de células, ter boa reprodutividade e ser aplicável em qualquer organismo eucarioto (CASTRO, 2004). Já no teste do micronúcleo observam-se pequenos corpúsculos, denominados micronúcleos (MN), presentes no citoplasma. Eles aparecem nas células filhas, em decorrência de danos induzidos nas células parentais. Esses micronúcleos podem ser resultantes de quebras cromossômicas ou de perdas de cromossomos inteiros, que podem não ser incorporados ao núcleo principal das células filhas após a mitose, o qual será visível como um pequeno núcleo separado do núcleo principal da célula (RIBEIRO et al., 2003).
Com base no exposto, o objetivo deste estudo foi avaliar os possíveis efeitos genotóxicos da fração solúvel do biodiesel em peixes da espécie Prochilodus lineatus, utilizando o ensaio do cometa, o teste do micronúcleo e a ocorrência de alterações eritrocíticas nucleares. Além disso, é propósito também deste trabalho contribuir para a educação e conscientização ambiental de alunos da rede pública de ensino, chamando a atenção destes para a problemática da poluição aquática devido à emissão de substâncias contaminantes, como os combustíveis.
2. OBJETIVO
2.1 Objetivos Gerais
• Avaliar os possíveis efeitos genotóxicos da fração solúvel do biodiesel para a espécie de peixe neotropical Prochilodus lineatus;
2.2 Objetivos Específicos
• Realizar testes de toxicidade aguda com Prochilodus lineatus expostos à fração solúvel do biodiesel;
• Verificar a ocorrência de danos no DNA em células branquiais e eritrócitos de Prochilodus lineatus, empregando-se o ensaio do cometa;
• Avaliar a ocorrência de micronúcleos e alterações eritrocíticas nucleares em eritrócitos de Prochilodus lineatus;
• A partir deste trabalho, desenvolver uma proposta de aula sobre educação ambiental para ser aplicada para alunos do ensino fundamental.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Biodiesel
O biodiesel é constituído de uma mistura de ésteres etílicos ou metílicos de ácidos graxos. Esse biocombustível pode ser produzido a partir de vegetais, gorduras animais, resíduos industriais e domésticos. Entre os vegetais, os mais usados são: soja, girassol, amendoim, colza (planta da qual se extrai o azeite), canola, palma, algodão e mamona. Já entre as gorduras animais, as principais fontes para a produção do biodiesel são o sebo de boi, gorduras de frango e de suínos (EXPEDITO, 2003).
O biodiesel é uma das alternativas mais bem estudadas e pesquisadas para a elaboração de um combustível vantajoso, tanto em questões econômicas, políticas e ambientais. Referindo-se aos aspectos econômicos, essa alternativa proveniente de fontes renováveis, diminui a dependência de derivados de petróleo, recursos que estão cada vez mais escassos e com preços suscetíveis a oscilações políticas. No Brasil, o Plano de Produção de Óleos Vegetais para Fins Energéticos foi proposto em 1975, com o principal objetivo de obter um biodiesel a partir de óleos vegetais, capaz de tornar o seu custo de produção mais competitivo com o do petróleo. O uso de biodiesel em veículos no Brasil passou a ser autorizado pelo governo a partir do dia 13 de janeiro de 2005, sendo obrigatória à adição de 2% de biodiesel ao diesel a partir de 2008. Em 2013, a exigência para adição de biodiesel ao diesel passará a ser de no mínimo 5%, para qualquer área do território nacional, gerando uma demanda de mercado em torno de mais ou menos de 800 milhões de litros/ano, e diminuindo a importação do petróleo (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE ÓLEOS VEGETAIS – ABIOVE, 2007).
Segundo Ferreira et. al (2006), o uso do biodiesel em comparação com o óleo diesel é mais vantajoso, pois contribui com a diminuição de gases lançados no ambiente. Essa substituição resulta em uma diminuição na emissão de 20% de enxofre, 9,8% de dióxido de carbono, 14,2% de hidrocarbonetos queimados, 26,8% de material particulado e 4,6 % de óxido de nitrogênio.
Segundo algumas pesquisas, o incentivo ao uso de biodiesel gera impactos positivos no clima global. Foi constatado que a liberação de CO2 é bem menor com a queima de biodiesel do
que com a de diesel, contribuindo dessa forma para os problemas relacionados ao efeito estufa (HILL et al., 2006; BIODIESEL, 2004; IEA, 2004; BEER et al., 2002; MACLEAN et al., 2000; PETERSON; HUSTRULID, 1998).
Até o momento esta alternativa mostra-se ecologicamente correta, porém, ainda é incerto o risco que este composto pode trazer para o meio ambiente. Algumas pesquisas já testadas com óleos de plantas mostraram resultados negativos em relação ao seu efeito para o ecossistema. Comparado com os combustíveis fósseis, o uso do biodiesel pode ser vantajoso devido a sua baixa emissão de substâncias tóxicas, porém o seu derramamento no meio ambiente pode vir a provocar efeitos contrários como exemplo, efeitos mutagênicos em determinados organismos (BUNGER, 2007).
Portanto, devido à carência de dados relacionados aos efeitos do biodiesel ao ambiente, investigações sistemáticas são urgentementes necessárias para verificar os possíveis impactos que este composto pode trazer ao meio ambiente.
3.2 Importância da educação ambiental no combate à poluição aquática
O ambiente aquático e os impactos gerados sobre o mesmo, podem implicar na qualidade da água. Diversos são os poluentes lançados nesse ambiente e esta irresponsabilidade ocorre devido às atividades errôneas dos humanos. Freqüentemente as águas doces e marinhas são os últimos locais onde os resíduos de contaminantes acabam sendo depositados. Normalmente esses ecossistemas recebem esses agentes químicos indiretamente, pela água das chuvas, ou pelo escoamento superficial do solo (WETZEL, 1993; JHA, 2004).
Os contaminantes que acabam sendo depositados tanto em águas superficiais como subterrâneas, são resultados das ações antrópicas relacionadas às atividades industriais e agrícolas. Diversos são os poluentes, porém os mais importantes são os metais, como chumbo, arsênio, cádmio e mercúrio; os agrotóxicos, como os nitratos, compostos organoclorados, organofosforados ou carbamatos e compostos orgânicos voláteis, como os produtos combustíveis e solventes halogenados (HU; KIM, 1994). Estima-se que de 300 a 500 milhões de toneladas de metais pesados, solventes, lixo tóxico e outros dejetos são acumulados na biota aquática, provindo dos processos industriais (CLARKE; KING, 2005). Esses poluentes possuem alto potencial em alcançar o ambiente como um todo. Moluscos, peixes e outros organismos aquáticos acumulam essas substâncias tóxicas em seu interior levando através do consumo humano problemas de saúde ao homem. (SILVA et al.,2003).
Atualmente são poucos os trabalhos que relatam os perigos do biodiesel para o meio ambiente. Eventuais vazamentos de biodiesel, a partir de seu armazenamento ou durante o seu transporte por caminhões-tanque, podem alcançar os lençóis freáticos ou os corpos de água, como rios e lagos, levando a contaminação do ambiente e dos organismos aquáticos. Já existem alguns
trabalhos que indicam o seu efeito danoso quando presente no meio ambiente (BUNGER et al., 2007).
Devido a todos esses aumentos de descargas de poluentes em rios, lagos e mares, medidas devem ser tomadas para que este recurso, não renovável, não venha faltar no futuro. Para isso, estudos voltados à educação ambiental devem ser desenvolvidos com o intuito de contribuir na formação de cidadãos que busquem a transformação, aprofundem nas questões ambientais e mudem o seu comportamento diante dos seus valores éticos antropocêntricos (VILMAR BERNA, 2004).
A educação ambiental é uma área voltada à sensibilização, orientação e minimização dos problemas ambientais. Esta área possibilita a construção de um conhecimento mais responsável, buscando alternativas que envolvam os seres humanos com o seu próprio meio ambiente (SEARA FILHO, 1987). Todos os indivíduos sejam eles formais (estudantes) ou informais (trabalhadores, políticos, jovens, membros de associações de moradores dentre vários outros públicos) precisam ir à busca de ações que se baseiam na sustentabilidade. Portanto, o principal contribuinte inicial para o desenvolvimento da consciência ambiental é a escola. Projetos ambientais aplicados de forma interdisciplinar nas escolas propiciam ao indivíduo uma visão mais positiva e um comprometimento pessoal maior com a proteção ambiental (DIAS, 1992).
Desta forma, devido aos grandes impactos que alteram os sistemas aquáticos, a educação ambiental vem sendo uma das alternativas que supostamente contribuem na minimização dos problemas ambientais. Essa conscientização formada ajudará na diminuição das implicações ao meio ambiente, fazendo com que esse comportamento diferencial reflita de maneira positiva para as gerações futuras.
3.3 Prochilodus lineatus utilizado como organismo bioindicador
O bioindicador nada mais é que um organismo capaz de passar as informações sobre o seu ambiente, através de sua presença ou não no seu habitat ou através do seu próprio comportamento (VAN GESTEL; VAN BRUMMELEN, 1996). No ambiente aquático, os principais organismos utilizados para informar sobre as alterações provocadas por xenobióticos no meio ambiente são macroinvertebrados bentônicos e os peixes (ROSENBERG; RESH, 1993). Segundo Cerqueira e Fernandez (2002), a utilização de Prochilodus lineatus é potencialmente vantajosa para o monitoramento ambiental, devido a sua sensibilidade na presença de xenobióticos. P. lineatus tem se mostrado adequado para as análises de toxicidade ambiental, pois ele é uma espécie neotropical com grande sensibilidade aos diversos tipos de xenobióticos (MARTINEZ; CÓLUS, 2002; ALMEIDA et al., 2005; CAMARGO; MARTINEZ, 2006). Prochilodus lineatus (Fig. 1) é um peixe de região neotropical, conhecido popularmente como curimba, pertencente à ordem Characiformes, família Prochilodontidae sendo considerado uma espécie abundante e importante da região do Brasil. São organismos, que por serem detritívoros, podem estar em contato com mais freqüência à poluentes presentes tanto no sedimento como na coluna d’água (MARTINEZ et al., 2004).
Figura 1 – Indivíduo juvenil de Prochilodus lineatus.
3.4 Biomarcadores
Para o biomonitoramento, os efeitos dos contaminantes podem ser verificados em níveis de organização biológica inferiores, como: molecular/bioquímico, genético, celular, fisiológico, morfológico, assim como no nível da população, comunidade e ecossistema (ADAMS et al.,1990). As alterações biológicas em fluidos corporais, células ou tecidos são denominados como biomarcadores capazes de sinalizar toda e qualquer alteração bioquímica quando estes organismos se encontram expostos a um ambiente desequilibrado (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003).
3.5 Testes Genotóxicos
Existem diferentes tipos de agentes tóxicos que são classificados conforme a sua influência exercida sobre o organismo. Compostos genotóxicos provocam lesões ao genoma. Os mutagênicos podem ser definidos como sendo agentes que induz em fixação de mutação estável no DNA, sendo esta transmitida futuramente aos descendentes. Já elementos carcinogênicos são todos que influenciam no processo de carcinogênese, iniciação, fixação e promoção (etapas da carcinogênese que participam na formação de tumores). Assim, essas diversas mutações podem participar em todos os processos carcinogênicos, sendo que determinados compostos genotóxicos e mutagênicos também possuem esse potencial carcinogênico (ARNAIZ, 1997).
Os compostos tóxicos presentes no sistema biológico do organismo podem atuar tanto no número, estrutura do cromossomo ou em um único gene (ARNAIZ, 1997; BOURDON, 1999). O DNA lesado faz com que o organismo, de alguma forma, apresente respostas devido à presença da substância tóxica, sendo elas: morte por citotoxicidade ou apoptose, modulação da expressão
gênica controlando o ciclo celular e reparação do material genético. Desta forma pode-se verificar que a combinação desses fatores compõe as respostas aos danos genéticos provocados pela ação dos xenobióticos (MOUSTACCHI, 2000). Por isso, análises genotóxicas são indispensáveis no processo de avaliação em ecossistemas contaminados, visando a melhoria da qualidade e controle do meio aquático.
Testes que avaliam a genotoxicidade e toxicidade em organismos são de suma importância para a obtenção de informações a respeito do desequilíbrio causado por um determinado poluente no ecossistema (MORAES et al 2000). Testes genotóxicos podem ser feitos tanto in vitro quanto in vivo e são responsáveis em detectar a ação de compostos que levam a danos genéticos, quebras na fita de DNA, mutações gênicas, quebra cromossômica e alteração na capacidade de reparo (SILVA; SALVADORI, 2007). Portanto nas análises de genotoxidade ambiental, o componente mais importante para este tipo de estudo é o DNA. Este pode ser usado como um biomarcador em resposta a determinadas substâncias tóxicas (MARTINEZ; CÓLUS, 2002).
3.5.1 Ensaio do Cometa
O ensaio do comenta (Fig. 2) é uma ferramenta de extrema importância para as análises toxicológicas. Esse método auxilia na detecção de quebras nas fitas de DNA (OLIVE et al., 1993; TICE et al., 1990). Essa técnica vem sendo utilizada com muita freqüência por ser aplicável em diferentes tipos de tecidos e células. Pode-se também salientar como vantagens para a realização do ensaio do cometa, as seguintes características: a alta sensibilidade para a detecção de danos no DNA, o uso de um número reduzido de células, facilidade durante a execução, custo acessível e o curto tempo para aplicação desse estudo (TICE et al., 2000). Portando, o ensaio do cometa pode
ser usado como uma ferramenta para avaliações de genotoxicidade, trazendo resultados importantes para o monitoramento ambiental (CASTRO, 2004).
Rydberg e Johanson, em 1978, foram os primeiros pesquisadores a identificarem danos na molécula de DNA de células individualizadas, com um pH em condições levemente alcalinas. Após alguns anos, pesquisadores como Östling e Johanson em 1984 utilizaram pela primeira vez o método do microgel, como denominado naquela época, ou o ensaio do cometa como denominado atualmente, ou ainda o “single-cell gel assay” (SCG) (GONTIJO, 2003), que tem como principal objetivo analisar alterações do material genético em condições de pH neutro (TICE et al., 2000).
Essa técnica para as avaliações de genotoxicidade tem sido empregada desde a década de 1980 (UMBUZEIRO; VALENT, 1998), sendo Singh et. al (1988), o responsável por introduzir este método nos trabalhos de genotoxicidade com ensaios in vitro.
Singh et. al (1988) realizaram ensaios do cometas em condições alcalinas (pH > 13). Nessas condições de pH, ocorria a separação das proteínas histônicas e a desnaturação da molécula de DNA. Com o pH alcalino, a sensibilidade do método foi elevada, sendo possível identificar quebras em fitas simples na molécula de DNA. Nas técnicas com pH neutro só eram observadas quebras em fitas duplas de DNA (LEE; STEINERT, 2003).
A técnica do cometa se baseia na detecção de fragmentos de DNA (FIGURA 2), que após induzidos por eletroforese, migram do centro nuclear com uma velocidade muito maior do que o DNA intacto, formando dessa forma uma estrutura em forma de um cometa com cauda (TICE al.,1990).
3.5.2 Micronúcleo (MN) e Alterações Eritrocíticas Nucleares (AENs)
Micronúcleos são estruturas formadas a partir de fragmentos cromossômicos ou cromossomos inteiros no citoplasma que não foram envolvidos no núcleo principal durante a divisão celular no estágio de anáfase. Essas alterações, portanto, são observáveis somente em células filhas. Quando formados, esses cromossomos separados são envolvidos por uma membrana nuclear resultando em um pequeno núcleo separado do núcleo principal (RIBEIRO et al., 2003).
O teste de micronúcleo foi desenvolvido com algumas espécies de mamíferos. Esse ensaio vem sendo bastante utilizado para detecção das atividades genotóxicas provocadas por substâncias químicas (HEDDLE et al., 1983). A presença de micronúcleos em eritrócitos de organismos aquáticos, como os peixes, são elementos essenciais para a detecção de substâncias clastogênicas, que quebram cromossomos ou aneugênicas, que induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal, presentes no meio aquático. A técnica de micronúcleo tem se mostrado capaz de auxiliar nos estudos in vivo para testar mutagenicidade e in situ para o monitoramento da qualidade da água (AL-SABIT; METCALFE, 1995).
Em organismos aquáticos, além do aparecimento de micronúcleos, outras anormalidades eritrocíticas nucleares (AENs) (Fig. 3) também podem ser observadas quando estes são submetidos a contaminantes com efeitos citotóxicos e genotóxicos (VENIER et al. 1997;
Classe 0 Classe 1 Classe 2 Classe 3
CAVAS; ERGENE-GOZUKARA, 2003; DAILIANIS et al. 2003; BAROIENE et al. 2006). Carrasco et al (1991) foi o primeiro pesquisador a descrever essas anormalidades em eritrócitos de peixes (ERGENE et al., 2007). De acordo com a sua forma, as AENs podem ser classificadas em: núcleo em constrição ou em formato de rim, núcleo lobulado, núcleo segmentado e células binucleadas.
Portanto, o uso em conjunto do teste do micronúcleo e das AENs pode ser uma boa ferramenta para se compreender as causas e os efeitos provocados por produtos químicos em estudos toxicológicos.
4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Animal experimental
A espécie Prochilodus lineatus (STEINDACHNER, 1881), conhecida como curimba, foi escolhido para o presente trabalho por se tratar de uma espécie de peixe neotropical, presente nas regiões Sudeste e Sul do Brasil, sensível a diversos tipos de poluente e por isso apropriada para o monitoramento ambiental (MARTINEZ; SOUZA, 2002; MARTINEZ et al. 2004; ALMEIDA et al. 2005; CAMARGO; MARTINEZ 2006; SIMONATO et al., 2006). Exemplares jovens de P.
Normal Constrição Segmentado Lobulado Micronúcleo
Figura 3 – AENs e micronúcleo em eritrócitos de peixes .P.lineatus
lineatus com um peso médio 12,02 g ± 0,43 (média ± DP) e um comprimento total 10,26 cm ± 0,20 foram cedidos pela Estação de Piscicultura da UEL (EPUEL).
4.2 Obtenção do biodiesel e preparo da fração solúvel do biodiesel (FSBd)
O biodiesel utilizado para os experimentos foi extraído a partir do girassol e produzido por meio de rota etílica. Análises visuais realizadas em amostras deste biocombustível determinaram que seu aspecto era límpido e isento de impurezas. Nas amostras também foram detectados a presença de mono, di e triglicerídeos e glicerina total em quantidades aceitáveis segundo a especificação da Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Para a obtenção da fração solúvel do biodiesel, uma parte de biodiesel foi misturada a uma parte de água destilada (Fig. 4). Esta mistura permaneceu em agitação por 24 horas. A fração superior insolúvel foi descartada e a fração do biodiesel solúvel em água (FSBd) foi coletada e armazenada em recipientes opacos, em câmara fria, até o momento dos experimentos. O tempo de armazenamento da FSBd sobre refrigeração nunca ultrapassou 72 horas. Para cada grupo experimental, a FSBd foi diluída para 5% com água desclorada e distribuída em aquários com capacidade de 100L.
4.3 Testes de toxicidade
Os animais trazidos da EPUEL foram aclimatados durante, no mínimo, sete dias em tanque de 300L, contendo água desclorada, com aeração constante. Os peixes foram alimentados com ração apropriada a cada 48 h. Após o período de aclimatação, os peixes foram submetidos a testes de toxicidade estáticos agudos, de acordo com a metodologia padronizada no Manual de Testes para Avaliação da Ecotoxicidade de Agentes Químicos (SEMA, 1988). Os testes foram realizados em aquários de vidro de 100L, contendo de 6 a 8 peixes cada, para manter a densidade de 1g de peixe para cada litro de água. Nos testes, os peixes foram expostos FSBd e amostrados após 6, 24 e 48 horas de exposição. Um grupo controle, constituído de animais expostos apenas à água desclorada, foi amostrado em cada intervalo experimental, simultaneamente aos grupos expostos à água contaminada. Durante os testes, a água foi monitorada para temperatura, pH, oxigênio dissolvido (OD) e condutividade. Nas análises fisico-químicas para todos os tempos de exposição os valores médios (média ± DP) para o grupo controle e experimental foram respectivamente: temperatura 25,67 ± 0,52 e 25 ± 0 oC; pH 7,37 ± 0,17 e 7,39 ± 0,10; OD 6,98 ± 0,81 e 7,02 ± 0,84 O2. L-1;condutividade 53,67 ± 10,40 62, 83 ± 4,35 µS.cm -1.
4.4 Amostragem e preparo das suspensões celulares
Imediatamente após serem retirados dos aquários, os peixes foram anestesiados com benzocaína e, então, sacrificados por secção medular. A retirada do sangue, para os ensaios do cometa, micronúcleo e avaliações das alterações eritrocíticas nucleares (AENs), foi feita por meio da veia caudal, utilizando-se uma seringa heparinizada. Um volume de 10 µL do sangue coletado
dos peixes foi transferido para um tubo de microcentrífuga contendo 700µL de salina tamponada com fosfato ou PBS (NaCl 126,6mM, KCL 4,8mM, CaCl 1,5mM, NaHCO3 3,7mM, Na2HPO4
8,9mM, NaH2PO4 2,9 mM) e mantido em gelo até o momento para realização do ensaio do
cometa.
As brânquias dos peixes também foram removidas para o ensaio do cometa. Imediatamente após a remoção, os filamentos branquiais foram separados e limpos, com o auxílio de pincel e solução salina, para a retirada da maior quantidade possível de sangue. Em seguida, o arco branquial foi cortado e descartado e os filamentos branquiais foram armazenados em 700µL de solução salina e mantidos em gelo até o momento da preparação da suspensão celular. Os filamentos foram colocados em béquer, onde foram adicionados 2,5 mL de tripsina a 0,05%. Estes foram seccionados com o auxilio de tesoura e mantidos sob agitação branda durante 15 minutos. Após esse período, a solução resultante foi coletada com auxílio de uma pipeta Pasteur e filtrada através de filtro com malha de 30µm em um béquer contendo 2,5 mL de soro bovino. Este procedimento foi repetido mais uma vez. A solução resultante da filtração foi centrifugada a 1000 rpm por 10 minutos e o “pellet” foi ressuspendido em 50µL de PBS. Um volume de 20µL foi retirado para contagem do número de células em câmara de Neubauer e 10µL foi utilizado para o ensaio do cometa.
4.5. Viabilidade celular
Antes da realização do ensaio do cometa, a análise de viabilidade celular a partir da exclusão do corante azul de Trypan foi realizada em amostras tanto das células sanguíneas quanto de células branquiais, para verificar a integridade dessas células. No protocolo utilizado, 10µL de
sangue dos peixes foram misturados a 700µL de solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Dessa suspensão celular, 20µL foram misturados a 20µL do corante azul de Trypan e em seguida alíquotas destas misturas foram colocadas em câmara de Neubauer e analisadas em um microscópio de luz para a diferenciação de células brancas (célula viável) e das células azuis (inviáveis). A mudança de coloração da célula para azul indica que a célula não possui mais a sua membrana íntegra, permitindo a passagem do corante por esta. Foram consideradas viáveis amostras com células sanguíneas ou branquiais com, pelo menos, 80% de viabilidade.
4.6 Ensaio do Cometa
A metodologia empregada no ensaio alcalino do cometa foi baseada no protocolo de Singh et al.(1988) e Speit e Hartmann (1999), com algumas modificações. Para as análises do sangue e das células das brânquias, respectivamente, 10µL e 15µL das soluções contendo as células destes tecidos foram misturadas com 120 µL de agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% (100 mg em 20 mL PBS) e mantidas em banho-maria a 37ºC. Em ambos os casos, da suspensão celular obtida dessa mistura com agarose, 130µl foram divididos e pipetados sobre duas laminas de vidro previamente cobertas com uma película de agarose normal 1,5% (300mg em 20ml PBS). Após serem cobertas com lamínula, as lâminas foram colocadas no refrigerador por 30 minutos para permitir a completa solidificação da agarose com as células.
Após a solidificação da agarose, a lamínula foi removida e a lâmina foi colocada em uma solução de lise recém preparada (2,5 m NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris,10% DMSO, 1 mL Triton X-100, pH 10,0) por, no mínimo, 1 hora. Após a lise, a lâmina foi colocada em uma cuba de eletroforese horizontalmente e uma solução tampão recém preparada (0,3 N NaOH/1 mM
EDTA, pH= 13) foi adicionada a cuba, permanecendo por 30 minutos, em gelo dentro de um recipiente escuro, para evitar a entrada de luz. A seguir, a lâmina foi exposta por 20 minutos, a 4ºC, as condições de eletroforese: 25 V, com a corrente elétrica ajustada para 300mA. Terminado a corrida as amostras foram submetidas ao tampão de neutralização (0,4 M Tris, pH 7,5) por 5 minutos. Esse passo foi repetido por mais de 2 vezes. Após a terceira neutralização, a lâmina foi seca em posição inclinada e fixada com etanol durante 10 minutos. As lâminas foram estocadas na geladeira por, no máximo, 30 dias.
Para a coloração foram adicionados 50µl de brometo de etídeo (20µg/ml) a cada lâmina, depois foram examinadas ao microscópio de fluorescência em objetiva de 100X, sendo confeccionadas duas lâminas por animal. Foram contabilizadas 100 células por lâmina. Para cada célula analisada os danos ao DNA foram classificados em 4 categorias: classe 0= sem dano aparente; classe 1 = dano mínimo; classe 2 = dano médio e classe 3 = dano máximo, de acordo com o tamanho da cauda do cometa e a dispersão dos fragmentos de DNA. Com base nesta análise, as células receberam escores de 0 ( dano mínimo = nenhuma célula danificada) a 3 (dano máximo). Para o cálculo do escore de dano, o número de células em cada classe (0,1,2 ou 3) foi multiplicado pelo valor de cada classe e o escore foi calculado pela fórmula: (0xA) + (1xB) + (2xC) + (3xD), onde: A,B, C e D correspondem ao número de células em cada uma das classes. Assim, o valor de escore pode variar de um mínimo de 0 e um valor máximo de 300. Para o cálculo dos nucleóides danificados foi somado o número de células das classes 1, 2 e 3 de cada indivíduo. Com os valores encontrados para cada individuo, foi obtido uma média para o grupo controle e para o experimental.
4.7 Teste do Micronúcleo e ocorrência de Alterações eritrocíticas nucleares (AENs)
O teste de micronúcleo foi realizado de acordo com a metodologia de Hooftman e Raat (1982). Para o teste do micronúcleo e análise de ocorrência de AENs foram feitos esfregaços sanguíneos, a partir de uma alíquota de 5µL de sangue de peixes para a confecção de duas lâminas por animal. Após a secagem por 24 horas em temperatura ambiente, as lâminas foram fixadas em metanol absoluto por 10 min e, coradas com Giemsa 5% diluído em tampão fosfato pH 6,8 (0,06M Na2 HPO4, 0,06M KH2PO4), durante 20 minutos. Por fim, após a lavagem com
água destilada e secagem a temperatura ambiente, as lâminas foram preparadas para o uso permanente. As análises citológicas das lâminas foram realizadas em microscópio de luz (Olympus), sob a objetiva de 100x. Para cada animal, foram analisados 3000 eritrócitos, anotando-se as freqüências de micronúcleo e também a presença de alterações nos núcleos das células. Ambas as lâminas foram codificadas para se evitar uma análise tendenciosa.
Para ser considerado um micronúcleo, as características observadas foram: 1) ser morfologicamente semelhante ao núcleo principal; 2) ter diâmetro entre 1/16 até 1/3 do núcleo; 3) não ser refringente; 4) não estar ligado ou conectado ao núcleo principal; 5) possuir a mesma intensidade de coloração do núcleo principal, embora às vezes possa apresentar uma coloração um pouco mais intensa. A classificação das alterações eritrocíticas nucleares foram baseadas em Carrasco et al. (1990) sendo: 1) núcleo segmentado (NS); 2) núcleo lobulado (NL) e 3) núcleo com constrição ou em “forma de rim” (NR). Os resultados referentes a ocorrência de MN, NS, NL e NR foram apresentados como número de eritrócitos micronucleados ou com alterações a cada 1000 células analisadas (em %). As análises comparativas foram feitas separadamente para os resultados de micronúcleo e para AENs.
4.8 Análise estatística
Os resultados obtidos para cada um dos parâmetros analisados (escore de cometa, número de células danificadas, freqüência de MN e ocorrência de AENs), para cada tipo celular (eritrócitos e brânquias) foram comparados entre os diferentes tratamentos (CN X FSBd), para cada tempo experimental, utilizando-se o teste t de Student. Os resultados de escore de cometa, obtidos nos diferentes tempos experimentais, dos grupos CN e FSBb foram comparados entre si (6h X 24h X 96h) pela Análise de Variância (ANOVA). Foram considerados significativos valores de P ≤ 0,05.
4.9 Estudos sobre a poluição aquática no ensino fundamental
Para o desenvolvimento deste trabalho, foi elaborado um plano de aula enfocando a questão ambiental, utilizando a ferramenta da problematização.
Em um primeiro momento, os alunos seriam instigados a levantar problemas ambientais que já presenciaram ou tiveram notícias. Após essa etapa de discussões, seria ministrada uma aula sobre os tipos de poluentes, suas conseqüências para o meio ambiente e possíveis soluções.
Em um segundo momento, os alunos fariam uma visita a locais poluídos para o levantamento dos problemas encontrados. Após as observações, os alunos, já em sala de aula, iriam propor e discutir possíveis soluções para a resolução dos problemas encontrados, e por fim, iriam elaborar um plano de despoluição daquele ambiente contaminado, bem como sua manutenção.
5. RESULTADOS 5.1 Ensaio Cometa
Os resultados de escores médio de danos encontrados para o ensaio do cometa com eritrócitos de P. lineatus expostos a 5% de FSBd são mostrados na figura 5. Em todos os tempos experimentais, os escores de danos dos grupos experimentais foram significativamente maiores quando comparados com seus respectivos controles negativos. A análise estatística, comparando os escores de danos dos 3 grupos expostos a FSBd entre si, mostrou que somente existe diferença significativa entre os tempos de exposição de 6 e 48h. Para o número de nucleóides danificados, também foram encontradas diferenças significativas em todos os tempos de exposição, quando comparados os grupos experimentais com seus respectivos controles negativos (tabela 1). Entre os nucleóides analisados dos animais expostos a FSBd, no tempo de exposição de 6h, os danos mais freqüentemente encontrados foram os de classe 1 (pouco dano) e de classe 2 (médio dano). Já para os tempos de exposição de 24 e 48 horas, as classes de cometa mais evidenciadas no mesmo grupo foram as de nenhum (classe 0) e pouco dano (classe 1). Desse modo é possível observar que conforme os peixes são mantidos por um maior do tempo de exposição a FSBd, os danos de classe 2 e 3 tendem a diminuir, enquanto que os nucleóides da classe 0 e 1 aparecem com uma maior freqüência.
Nas análises do ensaio do cometa com células brânquias para o peixe P. lineatus exposto a 5% da FSBd mostrados na figura 6, demonstram que, os resultados obtidos no tempo de 6 horas de exposição, não causou diferença significativa na média de escore de danos entre o grupo experimental com seu respectivo controle negativo. Já para os tempos de 24 horas e 48 horas de exposição, os escores de danos para o grupo experimental, mostraram-se se superiores em relação ao seu respectivo controle negativo, ocorrendo dessa forma, diferenças significativas elevadas
entre os grupos quando comparados. Para o número de nucleóides danificados, também foram encontradas diferenças significativas somente nos tempos de 24 horas e 48 horas de exposição, quando comparados os grupos experimentais com seus respectivos controles negativos (tabela 2). Entre os nucleóides analisados, nos 3 tempos de exposição, os danos mais freqüentemente encontrados foram os de classe 0 (nenhum dano) e classe 1 (pouco dano).
Figura. 5 – Valores de escore de dano no DNA obtidos com eritrócitos de Prochilodus lineatus após exposições agudas (6, 24 e 48 h) à fração solúvel do biodiesel (EXP) ou apenas a água (CTR). As barras representam as médias e as linhas verticais o erro padrão. * indica diferenças significativas em relação ao respectivo CTR. Médias marcadas com a mesma letra não diferem significativamente entre si. As letras maiúsculas indicam comparações entre os grupos EXP e as minúsculas comparações entre os grupos CTR.
Tabela 1 – Número de nucleóides danificados em eritrócitos de P. lineatus expostos à FSBd ou apenas à água (controle) por 6, 24 ou 48h. N = número de animais analisados.
* indica diferenças significativas em relação ao respectivo controle negativo
Tempo Grupo N
Classes de Cometas (%) Nº de Nucleóides Danificados
Média ±±±±desvio padrão
0 1 2 3 6 h Controle 8 77,1 22,6 0,25 0,0 22,8 ± 4,3 FSBd 7 18,7 41,6 32,3 7,4 81,2 ± 7,5* 24h Controle 5 71,6 27,8 0,60 0,0 28,4 ± 5,7 FSBd 5 20,2 62,4 14,6 1,8 78,8 ± 5,0* 48h Controle 8 48,4 44,5 0,30 0,0 44,75 ± 4,3 FSBd 8 33,1 61,1 5,60 0,0 66,75 ± 4,5*
Figura. 6 – Valores de escore de dano no DNA obtidos com células das brânquias de Prochilodus lineatus após exposições agudas (6, 24 e 48 h) à fração solúvel do biodiesel (EXP) ou apenas a água (CTR). As barras representam as médias e as linhas verticais o erro padrão. * indica diferenças significativas em relação ao respectivo CTR. Médias marcadas com a mesma letra não diferem significativamente entre si. As letras maiúsculas indicam comparações entre os grupos EXP e as minúsculas comparações entre os grupos CTR.
Tabela 2 - Número de nucleóides danificados em células branquiais de P. lineatus expostos à FSBd ou apenas à água (controle) por 6, 24 ou 48h. N = número de animais analisados.
* indica diferenças significativas em relação ao respectivo controle negativo.
5.2 Teste do Micronúcleo e Outras Alterações Eritrocíticas Nucleares
Na Tabela 3 estão discriminados os tipos de alterações nucleares encontradas e as freqüências em que estas ocorreram. As análises mostraram que nem as freqüências absolutas de MN e outras alterações eritrocíticas nucleares obtidas nos diferentes tempos experimentais
Tempo Grupo N
Classes de Cometas (%) Nº de Nucleóides Danificados média ±±±± desvio padrão
0 1 2 3 6 h Controle 8 64,3 30,0 5,90 0,0 35,8 ± 4,0 FSBd 7 54,6 35,7 9,40 0,3 45,4 ± 4,9 24h Controle 6 58,7 28,5 1,50 0,0 30,0 ± 3,4 FSBd 7 48,3 49,1 2,10 0,4 51,7 ± 3,6* 48h Controle 8 74,0 24,5 0,25 0,0 24,7 ± 4,6 FSBd 7 56,3 37,1 6,40 0,1 43,7 ± 5,0*
(Tabela 3), e nem os valores de freqüência de ocorrência de alterações eritrocíticas obtidas (sem contabilizar os micronúcleos) deferiram estatisticamente entre os grupos FSBd e seus respectivos controles-negativos (Figura 3). Entre os tipos de anormalidades nucleares, a mais freqüentemente encontrada foi o núcleo em constrição, seguido pelo núcleo segmentado. Entre as lâminas analisadas, somente foi verificada presença de micronúcleo em eritrócitos de animais no tempo de exposição de 6h.
Tabela 3 – Freqüência média de ocorrência (FMO) de anormalidades em eritrócitos de P. lineatus expostos à FSBd ou apenas à água (controle) por 6, 24 ou 48 h. Nº = número de animais analisados.
Anormalidade Tempo Grupo Nº Total de
alterações FMO (‰) (média ±±±± DP) 6h Controle 7 1 0,14± 0,14 FSBd 8 1 0,12± 0,12 Micronúcleo 24h Controle 6 0 0,00± 0,00 FSBd 6 0 0,00± 0,00 48h Controle 6 0 0,00± 0,00 FSBd 5 0 0,00± 0,00 6h Controle 7 99 14,1± 2,00 FSBd 8 164 17,7± 4,60 Núcleo em constrição 24h Controle 6 93 15,5± 1,60 FSBd 6 134 22,3± 5,40 48h Controle 6 116 19,3± 3,00 FSBd 5 87 17,4± 3,30 6h Controle 7 36 5,10± 1,00 FSBd 8 32 4,00± 0,70 Núcleo Segmentado 24h Controle 6 34 5,70± 1,40 FSBd 6 55 8,10± 2,70 48h Controle 6 15 2,50± 0,90 FSBd 5 10 2,00± 1,50 6h Controle 7 8 1,10± 0,40 FSBd 8 4 0,50± 0,30 Núcleo Lobulado 24h Controle 6 1 0,20± 0,10 FSBd 6 6 1,00± 0,30 48h Controle 6 2 0,30± 0,30 FSBd 5 2 0,40± 0,20
Figura 7 – Valores da freqüência de ocorrência de alterações eritrocíticas em eritrócitos de P. lineatus após exposição aguda (6; 24 e 48 h) à FSBd(EXP) ou somente a água (CTR). As barras representam as médias e as linhas verticais o desvio padrão.
6. DISCUSSÃO
O biodiesel é considerado um combustível menos poluente quando comparando com os derivados de petróleo, pois emite menos gases tóxicos, contribuindo potencialmente para o controle do aquecimento climático global (POON et al., 2007). Porém pouco se conhece sobre o efeito deste biocombustível sobre os organismos vivos, que potencialmente podem entrar em contato com o biodiesel por várias rotas de exposição.
Entre os vários meios de exposição, eventuais vazamentos de biodiesel, a partir de seu armazenamento ou durante o seu transporte por caminhões-tanque, podem alcançar os lençóis freáticos ou os corpos de água, como rios e lagos, levando à contaminação do ambiente aquático. Até o presente momento, não há estudos que quantifique se possíveis compostos derivados do biodiesel podem ser solúveis em água. É provável que, devido a sua natureza altamente não
polar, os alquil ésteres de ácidos graxos não façam parte dos possíveis compostos que se solubilizam na água (POON et al., 2007). Porém, na presença de luz, oxigênio e água, esses ésteres podem sofrer oxidação e formar hidroperóxidos, que podem, por sua vez, produzir ácidos graxos de cadeia curta, aldeídos e cetonas, podendo se dissolver em água (VAN GERPEN et al., s/data). Além disso, não é sabido, se diversos aditivos incluídos no combustível, impurezas presentes na matéria- prima e subprodutos produzidos durante o processamento poderiam ser solúveis na água (POON et al., 2007). É possivel que os compostos encontrados nesta fração solúvel sejam praticamente os mesmos que saem na 3a lavagem aquosa do biodiesel durante o processo produtivo, como glicerina livre, álcool residual, sabões de ácidos graxos, resíduos de catalisador alcalino e outras impurezas menores. Sendo assim, neste estudo se considerou que num derrame de biodiesel, além da camada espessa de óleo que fica sobre a água, pode haver compostos que se solubilizam na água ficando disponíveis para o contato com a biota aquática.
Ainda há poucos estudos encontrados na literatura, tentando elucidar possíveis efeitos biológicos gerados pela contaminação de biodiesel (FINCH et al, 2002; BUNGER et al, 2000a,b, 2007; VARSHO, 1996a,b e POON et al., 2007). Desse modo, trabalhos investigando à toxicidade e os possíveis efeitos biológicos do biodiesel tanto para organismos aquáticos marinhos quanto dulcícolas são extremamente necessários e urgentes. Neste trabalho, a genotoxicidade da FSBd para P. lineatus, foi avaliada com base no ensaio do cometa, aplicado à análise de eritrócitos de sangue periférico e de células de brânquias desta espécie de peixe e com base no teste do micronúcleo e alterações eritrocíticas nucleares (AENs), ambos empregados às análises de possíveis danos aos eritrócitos dos animais.
O Ensaio do cometa em eritrócitos de P. lineatus mostrou que os peixes expostos a concentração de 5% de FSBd apresentaram uma maior freqüência de escores de danos e
nucleóides danificados quando comparado aos seus respectivos controles em todos os tempos de exposição. Com esses resultados é possível inferir que a FSBd se mostrou genotóxica para os peixes expostos nessas condições experimentais. O teste do cometa revelou uma maior quantidade de danos presentes no DNA dos eritrócitos dos animais expostos a FSBd em 6h quando comparado aos demais tempos de exposição. Após 24h de exposição, os danos no DNA dos eritrócitos de P. lineatus expostos ao FSBd foram ficando menores, e no tempo de 48h esses danos se aproximam do escore médio encontrado no seu respectivo grupo controle. Porém, essa diminuição de danos no DNA dos peixes expostos a FSBd no tempo de 48h não foi suficientemente o bastante para que não houvesse diferença estatística com seu respectivo controle negativo. Isso provavelmente se deve ao fato de ter sido encontrado uma maior freqüência de classes de cometa 2 e 3 no grupo exposto ao FSBd quando comparado com seu controle negativo. É possível inferir que a diminuição de danos no DNA dos peixes expostos a FSBd ao longo dos tempos de exposição ocorreu devido a ação do sistema de reparo dos peixes, que atuaram no DNA dos eritrócitos. Outra explicação para essa diminuição é que as células danificadas tenham sido removidas pelo baço (UDROIU, 2006). Cavalcante e colaboradores, também encontraram que danos no DNA de eritrócitos de P. lineatus expostos ao Roundup® diminuíram, retornando ao escore médio encontrado no grupo controle respectivo após 24h de exposição. Outro estudo realizado com eritrócitos de Tilapia mossambica também mostrou uma redução de danos no DNA após 48h de exposição ao agrotóxico monocrotophos (BANU et al., 2001).
Para o ensaio do cometa envolvendo células branquiais, somente foi encontrado diferenças significativas no escore de danos e de nucleóides danificados, entre os grupos experimentais com seus respectivos controles negativos, nos tempos 24 e 48 horas. Porém, é
preciso destacar que somente não houve diferença estatística dos escores de danos dos peixes expostos a FSBd em relação ao seu controle negativo no tempo de 6h porque o valor de escore de dano encontrado para esse controle negativo foi consideravelmente maior quando comparado com os controles negativos de 24 e 48 horas. Observando e comparando as classes de nucleóides encontradas entre os 3 controles negativos, é possível notar que em 6 horas foi encontrado uma maior quantidade de cometas de classe 2 do que nos outros 2 tempos de exposição. Isso pode ter ocorrido devido a excessos de danos mecânicos e químicos no DNA durante as etapas de isolamento das células branquiais.
As lesões no material genético dos peixes induzidas pela ação genotóxica da FSBd podem ser resultado de danos oxidativos causados por espécies reativas de oxigênio geradas durante a metabolização dos compostos presente no biodiesel. Vanzella et al. (2007) também relacionaram os danos genéticos observados em P. lineatus após 96h e 15 dias de exposição à fração solúvel do óleo diesel, aos processos oxidativos resultantes da metabolização de hidrocarbonetos presentes nesta fração do óleo, considerando-se que neste caso os animais também apresentaram ativação das defesas antioxidantes (SIMONATO; GUEDES; MARTINEZ, 2007).
O Teste do Micronúcleo (MN) é uma metodologia que tem sido amplamente empregada por um grande número de autores para avaliar alterações mutagênicas em diferentes organismos, incluindo peixes (AL-SABIT; METCALFE, 1995). A ausência de indução de micronúcleos nos três tempos experimentais testados neste trabalho indica que a concentração subletal de 5% de FSBd utilizada, não se mostrou mutagênica para a espécie P. lineatus. Então, é possível sugerir que a FSBd não induz a perda de fragmentos cromossômicos (ação clastogênica) ou de cromossomos inteiros por segregação cromossômica anormal (ação aneugênica) e com isso não há formação de micronúcleos.
Nas análises de freqüência de ocorrência de AENs realizadas neste trabalho, nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os grupos experimentais e seus respectivos controles após os três tempos de exposição. Essa metodologia foi empregada neste estudo, pois a ocorrência dessas alterações nucleares está sendo relacionada como indicador de dano citogenético em espécies de peixes. Ayllon e Garcia-Vazquez (2001) encontraram, além de micronúcleos, a ocorrência de alterações nucleares em eritrócitos periféricos de truta induzidos por ciclofosfamida e mitomicina-c, dois produtos com forte ação clastogênica. Alta incidência de micronúcleos e alterações nucleares também foi observada por Souza e Fontanetti (2006) em eritrócitos de tilápias de um rio contaminado por efluentes de uma fábrica de transformação de xisto. Os resultados apresentados por Ventura et al. (2008) também mostraram uma diferença significativa na taxa de alterações eritrocíticas nucleares em tilápias expostas a várias concentrações do herbicida atrazina.
Como principais conclusões deste estudo, pode-se afirmar que nas condições utilizadas, a FSBd provocou alterações genotóxicas em células branquiais e em eritrócitos de P. lineatus, detectadas neste trabalho pelo ensaio do cometa. Com base nesses resultados, a afirmação de que o biodiesel é um biocombustivel ecologicamente correto precisa ser feita com cautela. Por ser um composto relativamente novo no mercado pouco se sabe sobre a ação deste combustível sobre o meio ambiente e quanto ele é realmente inofensivo para os seres vivos, em especial para os organismos aquáticos. Sendo assim, mais estudos são necessários para se conhecer os prováveis efeitos biológicos provocados pelos possíveis compostos solúveis presentes no biodiesel, caso este alcance o ecossistema aquático por meio de vazamentos durante a sua produção ou transporte.
6.1 Plano de ensino sobre educação ambiental com enfoque em poluição aquática
Com base nos resultados obtidos, e pela importância de se preservar o meio ambiente, este plano de ensino tem como proposta o desenvolvimento de aulas sobre educação ambiental, voltadas à poluição aquática. Estas aulas têm como intuito abranger os conhecimentos dos alunos a respeito dos efeitos provocados no ambiente pelos poluentes, quando estes alcançam todo o sistema.
6.1.1 Plano de ensino sobre educação ambiental, com enfoque em poluição aquática
Com base nos resultados obtidos, e pela importância de se preservar o meio ambiente, este plano de ensino tem como proposta o desenvolvimento de aulas sobre educação ambiental, voltadas à poluição aquática. Estas aulas têm como intuito abranger os conhecimentos dos alunos a respeito dos efeitos provocados no ambiente pelos poluentes, quando estes alcançam todo o sistema.
6.1.2 Educação Ambiental para alunos do ensino fundamental
Segue a baixo uma proposta de aula, sobre educação ambiental, com enfoque em poluição aquática, para ser aplicada no ensino fundamental.
DISCIPLINA: Ciências SÉRIE: 5º á 8º TEMA
• Educação Ambiental com enfoque em poluição aquática
OBJETIVOS
• Identificar os principais poluentes e contaminantes aquáticos e suas consequências para o meio ambiente
• Verificar quais as medidas necessárias para a preservação do meioaquático
CONCEITOS A SEREM TRABALHADOS 1. POLUIÇÃO HÍDRICA
• Poluentes aquáticos e suas conseqüências para o homem e a natureza • Tipos de fontes poluidoras que afetam o meio aquático
• Possíveis soluções para a poluição hídrica
RECURSOS DIDÁTCOS
• Livros sobre poluição aquática
• Jornais com notícias enfocando os desastres aquáticos ocorridos na região • Figuras de ambientes aquáticos afetado
• Retro projetor • Quadro e giz • Aula prática • Campo • Blocos de anotações METODOLOGIA
Após aula teórica, abordando a questão da importância da Educação Ambiental, alunos do ensino fundamental seriam levados a um rio, ou lagoa, ou riacho ou ribeirão, que estivessem visivelmente poluídos, para então trabalharem
com a problematização. Após a chegada ao ambiente, os alunos iriam realizar levantamentos da área verificando os seguintes itens:
• Reconhecimento da área
• Verificação de lixos aos arredores
• Levantamento dos tipos de lixos encontrados
• Presença de lixões, indústrias, hospitais, áreas de agricultura e domésticos próximos ao corpo hídrico
• Informativos alertando sobre a preservação • Presença de animais mortos no local
• Fiscalização
• Existência de conscientização dos moradores próximos
Após as análises feitas do sistema hídrico, os alunos iriam procurar possíveis soluções para resolver os problemas encontrados no local, como formas adequadas de tratamento dos efluentes, tais como despejos domésticos e industriais, destino adequado para as embalagens de agrotóxicos e fertilizantes agrícolas e elaboração de informativos a respeito da preservação ambiental no local e a solicitação de uma maior fiscalização.
AVALIAÇÃO
• Os alunos iriam realizar discussões em sala e iriam elaborar informativos e cartazes para serem apresentados na a sala e possivelmente à comunidade.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS SUGERIDAS
• Linhares, Sérgio – Biologia Hoje – Editora Ática, vol.3, 2003.
• Cheida, Luiz Eduardo – Biologia Integrada – Editora FTD, vol.3, 1954. • Silva Junior, César – Biologia – Editora Atual, 4º edição, 1934
Portanto esse modelo de plano de aula pode ser uma alternativa de trabalho a ser feito para intensificar o exercício de conscientização entre alunos iniciais e um estudo para forçar os conhecimentos dos alunos na busca de soluções para o problema encontrado utilizando a problematização como ferramenta. Este método busca estudar os conteúdos abordados a partir dos problemas propostos, tendo um caráter formativo no momento em que o aluno participa ativamente na busca de conhecimentos e não simplesmente informativa, como é o caso da prática tradicional (SAKAI E LIMA, 1996)
7. CONCLUSÕES
• A fração solúvel do biodiesel se mostrou genotóxica para a espécie de peixe P. lineatus, em testes de toxicidade aguda, empregando o ensaio do cometa com células sanguíneas e branquiais;
• O biodiesel não parece exercer efeitos aneugênicos e/ou clastogênicos, visto que não houve incidência significativa de micronúcleos nos eritrócitos dos peixes expostos ao biocombustível;
• A ocorrência de alterações eritrocíticas nucleares não se mostrou um bom biomarcador de genotoxicidade em peixes da espécie P. lineatus;
• Dos testes de genotoxicidade empregados o ensaio do cometa se mostrou a ferramenta mais adequada para se detectar a ocorrência de possíveis danos genéticos em organismos vivos causados pelo biodiesel;
• O uso da ferramenta da problematização no ensino da educação ambiental é de fundamental importância para exercitar os conhecimentos dos alunos na elaboração de soluções para problemas aquáticos;
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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