COMPOSIÇÃO GEOMICROBIOLÓGICA E ORGÂNICA DAS
ESTEIRAS MICROBIANAS DE TRÊS LAGOAS COSTEIRAS DO
SUDESTE DO RIO DE JANEIRO, BRASIL.
Sinda Beatriz Vianna Carvalhal Gomes
V. 1 PPGL IGEO UFRJ 2011 Tese d e Do u to rad o S inda Be a triz V ia nna Carv a lha l Gome s
UFRJ
Rio de Janeiro Julho de 2011
COMPOSIÇÃO GEOMICROBIOLÓGICA E ORGÂNICA DAS ESTEIRAS MICROBIANAS DE TRÊS LAGOAS COSTEIRAS DO SUDESTE DO RIO DE
JANEIRO, BRASIL.
Sinda Beatriz Vianna Carvalhal Gomes
Tese de Doutorado submetida ao
Programa de Pós-graduação em Geologia, Instituto de Geociências, da Universidade
Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como
requisito necessário à obtenção do grau de Doutor em Ciências (Geologia).
Orientador(es):
João Graciano Mendonça Filho Loreine Hermida da Silva e Silva
Rio de Janeiro Julho de 2011
COMPOSIÇÃO GEOMICROBIOLÓGICA E ORGÂNICA DAS ESTEIRAS MICROBIANAS DE TRÊS LAGOAS COSTEIRAS DO SUDESTE DO RIO DE
JANEIRO, BRASIL.
Sinda Beatriz Vianna Carvalhal Gomes Orientador (es): João Graciano Mendonça Filho
e Loreine Hermida da Silva e Silva.
Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Geologia, Instituto de Geociências, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Geologia).
Aprovada por:
_____________________________________
Presidente: Prof. Dra. Maria Dolores Wanderley, UFRJ
_____________________________________ Prof. Dra. Mirian Araújo Carlos Crapez, UFF
_____________________________________ Prof. Dra. Elisamara Sabadini Santos, UFF
_____________________________________ Dra. Norma Maria Costa Cruz (CPRM)
_____________________________________ Prof. Dr. Marcelo Carvalho, UFRJ
Rio de Janeiro Julho de 2011 Carvalhal-Gomes, Sinda Beatriz Vianna.
Composição geomicrobiológica e orgânica das esteiras microbianas de três lagoas costeiras do sudeste do Rio de Janeiro, Brasil. Rio de Janeiro 2011.
xxiii, 186 p. (Instituto de Geociências – UFRJ, D.Sc.,
Programa de Pós-Graduação em Geologia, 2011). Tese – Universidade Federal do Rio de Janeiro, realizada no Instituto de Geociências.
1- Esteiras Microbianas 2- Geomicrobiologia e geoquímica orgânica.
Rio de Janeiro Julho de 2011
A minha família que me apóia, ri e chora (se preciso for) comigo em
todos os momentos da minha vida. Amo todos vocês.
Rio de Janeiro Julho de 2011
AGRADECIMENTOS
A Deus por tornar possível o que parece impossível.
A CAPES pelo auxílio através da bolsa
Ao meu orientador João Graciano Mendonça Filho pela confiança, paciência
e auxílio ao longo de toda execução deste trabalho.
A minha orientadora Loreine Hermida da Silva e Silva pela fé na minha
capacidade, conforto nos momentos de desespero, e auxílio em todas as etapas deste trabalho.
Aos meus amigos Frederico Sobrinho e Elisamara Sabadini Santos, que me
auxiliaram nas análises laboratoriais, nas muitas dúvidas em microbiologia e química e por todo carinho, paciência e companheirismo no decorrer desta minha jornada.
A Dra. Mirian Crapez, por abrir as portas de seu laboratório para as análises
microbiológicas, pela amizade e auxílio nos momentos difíceis.
À técnica e amiga Daniela Pereira Costa do laboratório de Microbiologia
Marinha da UFF (MICROMAR), que pacientemente me ensinou os protocolos das análises e me socorreu em todas as dúvidas.
A família MICROMAR, que mesmo sem me conhecer arregaçou as mangas e
me ajudou nas análises imediatas após campo. Obrigada: Luciana Chequer, José de Oliveira Bittencourt e Bruno Inecco.
A amiga Leonisa Sanches, que me ajudou nas análises trabalhosas de
número mais provável. Obrigada também pelo seu otimismo e incentivo.
Aos amigos Deise Delfino, Fabiane Feder, Fernanda Magina e Frederico
Lopes pela amizade, incentivo e ajuda nas saídas de campo, sem as quais este trabalho seria muito mais doloroso.
A Dra. Joalice Mendonça pelo auxílio na identificação dos componentes
particulados da matéria orgânica, pela paciência em tirar minhas dúvidas sobre os estranhos componentes palinológicos das lâminas.
Rio de Janeiro Julho de 2011
Aos amigos do LAFO: Antônio Donizeti e Jaqueline Torres de Souza pela
ajuda na preparação das amostras e montagem das lâminas
palinofaciológicas.
A Cristina B. Pinto da Secretaria do Programa de Pós-Graduação em
Geologia pela presteza e amizade.
Ao meu querido marido por todo incentivo, paciência e auxílio nas saídas de
campo. Sua compreensão pelas horas de ausência, noites de trabalho e finais de semana sem descanso foram essenciais no desenvolvimento deste trabalho.
A todos que de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho,
minha eterna gratidão.
“O êxito na vida não se mede pelo que você conquistou, mas sim pelas dificuldades que superou no caminho.”
Rio de Janeiro Junho de 2011
RESUMO
COMPOSIÇÃO GEOMICROBIOLÓGICA E ORGÂNICA DAS ESTEIRAS MICROBIANAS DE TRÊS LAGOAS COSTEIRAS DO SUDESTE DO RIO DE
JANEIRO, BRASIL.
Sinda Beatriz Vianna Carvalhal Gomes
Orientadores: João Graciano Mendonça Filho e Loreine Hermida da Silva e Silva.
As esteiras microbianas são estruturas biossedimentares formadas por um consórcio bacteriano de cianobacterias, bactérias autótrofas e heterótrofas. São ecossistemas altamente produtivos, que comportam robustos ciclos biogeoquímicos sendo consideradas ecossistemas auto-suficientes. Este trabalho tem por objetivo caracterizar a composição geomicrobiológica e orgânica das esteiras microbianas das lagoas de Araruama, região de Monte Alto, Pernambuco e Pitanguinha utilizando análises químicas, bioquímicas, microbiológicas e palinofaciológicas. A análise química e bioquímica da coluna d’água das lagoas revelou elevadas concentrações de clorofila-a, nutrientes particulados e dissolvidos, classificando Monte Alto e Pernambuco como sistemas eutróficos e Pitanguinha, hipertrófico. Três morfologias de esteiras microbianas foram encontradas sendo elas Poligonal, Lisa e Filme. Elas apresentaram elevadas concentrações de biopolímeros, COT, S, CIT, elevada densidade populacional bacteriana e um total de 69 espécies de cianobactérias. A coluna d’água e as esteiras microbianas apresentaram, em resposta a sazonalidade regional, um metabolismo autotrófico durante o período chuvoso e heterotrófico durante o período seco, com acentuado acúmulo de lipídios durante o último período. A análise da matéria orgânica particulada ressaltou principalmente as diferenças composicionais da matéria orgânica entre esteiras microbianas e sedimentos revelando 3 palinofácies. Palinofácies 1, influenciada pela ocorrência de fitoclastos não opacos, revelando um ambiente mais estagnado com maior influencia continental. Palinofácies 2, influenciada pela ocorrência de fitoclastos opacos detríticos, indicando um ambiente lagunar salino, óxico não estagnado e por fim Palinofácies 3 influenciada pela ocorrência elevados valores de COT grande quantidade de EPS, indicando um sistema altamente produtivo cujo componente particulado pode gerar querogênios tipo I ou II.
Palavras-chave: Esteiras microbianas, cianobactérias, matéria orgânica,
Rio de Janeiro Junho de 2011
ABSTRACT
Organic composition of microbial mats from three coastal lagoons of
southeastern Rio de Janeiro, Brazil
Sinda Beatriz Vianna Carvalhal Gomes
Orientadores: João Graciano Mendonça Filho e Loreine Hermida da Silva e Silva.
Microbial mats are biossedimentary deposits formed by cyanobacteria, autotrophic and heterotrophic bacteria. Mats are highly productive ecosystems which include robust biogeochemical cycles and are therefore considered self-sufficient. This study aims at enlightening the geomicrobiological and organic matter composition of microbial mats from Araruama, district of Monte Alto, Pernambuco e Pitanguinha lagoons through chemical, biochemical, microbiological and palinofacies analysis. The chemical and biochemical analysis of water lagoons revealed high concentrations of chlorophyll-a, particulate and dissolved nutrients showing Monte Alto and Pernambuco as eutrophic systems and Pitanguinha as hypertrophic system. Three types of microbial mats were found at lagoons: Polygonal, Flat and Film. The mats revealed high concentrations of biopolymers, TOC, S, CIT, high bacterial density and 69 species of cyanobacteria. Both water column and microbial mats presented an autotrophic metabolisms at rain season and heterotrophic metabolisms during the dry season, with marked lipid accumulation during the dry season. The organic matter analyses highlighted three different palinofacies: Palynofacies 1 was influenced by non-opaque phytoclasts, indicating a closed environment with high continental influence; Palynofacies 2 was influenced by detritic phytoclasts, indicating a saline system with high dynamic and oxic condition; Palynofacies 3 was characterized by high TOC and total extracellular polymeric substances, indicating a highly productive system where particulate component may create kerogen types I or II.
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS v
RESUMO vii
ABSTRACT viii
LISTA DE FIGURAS xiv
LISTA DE PRANCHAS xvii
LISTA DE QUADROS xx
LISTA DE TABELAS xxi
LISTA DE ESPÉCIES DE CIANOBACTÉRIAS xxii
1 INTRODUÇÃO 1 1.1 OBJETIVO 3 1.1.1 Objetivo Geral 3 1.1.1.1 Objetivos específicos 3 2 MATERIAL E MÉTODOS 4 2.1 ESTAÇÕES DE COLETA 4 2.2 CAMPO E AMOSTRAGEM 7
2.3 TRIAGEM E DIVISÃO DAS AMOSTRAS 8
2.4 PARÂMETROS QUÍMICOS 9
2.4.1 Nutrientes inorgânicos dissolvidos 10
2.4.2 Nitrogênio (N-total) e Fósforo Total (P-total) 11
2.4.3 Clorofila-a, carotenóides e MPS 11
2.4.4 Determinação dos biopolímeros 12
2.4.5 Análises de carbono orgânico total (COT%) e enxofre total (S%) 13
2.5 Parâmetros Microbiológicos 13
2.5.1 Atividade das enzimas esterases bacterianas (EST) 13
2.5.3 Determinação do número de células por laranja de acridina 15
2.5.4 Análise de Número Mais Provável (NMP) por tubos múltiplos 16
2.5.5 Identificação e contagem das cianobactérias 17
2.6 PARÂMETROS MORFOLÓGICOS 18
2.7 PARÂMETROS GEOQUÍMICOS 18
2.7.1 Tratamento Químico das amostras e montagem das lâminas
organopalinológicas 18 2.7.2 Análise de Palinofácies 20 2.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA 21 3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 22 3.1GEOMICROBIOLOGIA 22 3.1.1 Diversidade Microbiana 24
3.1.2 Versatilidade nutricional e metabólica 27
3.1.2.1 Autótrofos fotossintetizantes 27
3.1.2.2 Autótrofos Quimiolitotróficos 28
3.2.3 Heterótrofos 31
3.2 ESTEIRAS MICROBIANAS 32
3.2.1 Definições 32
3.2.2 Características estruturais e morfológicas 34
3.2.3 Composição Microbiana 35
3.2.4 Implantação e Desenvolvimento 37
3.3 CIANOBACTÉRAIS 39
3.3.1 Características gerais 40
3.3.2 Ecologia e Distribuição 42
3.4 COMPOSIÇÃO DA MATÉRIA ORGÂNICA NOS SEDIMENTOS 45
3.4.1 A matéria orgânica lábil 47
3.4.2.1 Grupo Matéria Orgânica Amorfa (MOA) 51
3.4.2.2 Grupo Fitoclasto 52
3.4.2.3 Grupo Palinomorfos 54
4 ÁREA DE ESTUDO 56
4.1 CONTEXTO GEOLÓGICO,GEOMORFOLÓGICO E FISIOGRÁFICO 56
4.2 CONTEXTO EVOLUCIONÁRIO DO COMPLEXO LAGUNAR DE ARARUAMA DURANTE
O QUATERNÁRIO.
59
4.3 CLIMA 61
4.4 VEGETAÇÃO 62
4.5 CONTEXTO FÍSICO DOS CORPOS LAGUNARES 64
4.5.1 Lagoa de Araruama 64 4.5.2 Lagoa Pernambuco 67 4.5.3 Lagoa Pitanguinha 68 5 RESULTADOS 70 5.1 OAMBIENTE LAGUNAR 70 5.1.1 Clima 70 5.1.2 Parâmetros Físico-Químicos 72 5.1.3 Parâmetros Químicos 76
5.1.3.1 Nutrientes inorgânicos dissolvidos 76
5.1.3.2 Nitrogênio total (N-total) e Fósforo total (P-total). 80
5.1.3.3 MPS, Clorofila-a e carotenóides. 80
5.1.3.4 Biopolímeros e Carbono Biopolimérico (BPC). 84
5.1.4 Parâmetros Bioquímicos e Microbiológicos 88
5.1.4.1Determinação de atividade das enzimas esterases (EST) 88
5.1.4.2Determinação da atividade do sistema transportador de elétrons
(ASTE) 89
5.2 GEOMICROBIOLOGIA DAS ESTEIRAS MICROBIANAS 91
5.2.1 Descrição morfológica das esteiras microbianas 91
5.2.2 Determinação dos parâmetros químicos 98
5.2.4 Determinação dos parâmetros bioquímicos e microbiológicos 103
5.2.4.1Atividade das enzimas Esterases (EST) 103
5.2.4.2 Atividade do sistema transportador de elétrons (ASTE) 104
5.2.4.3 Número de Células Bacterianas (NCB) e Número mais provável
(MPN) de bactérias sulfato-redutoras 104
5.2.4.4 Composição cianobacteriana 107
5.3 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO ORGÂNICA DAS ESTEIRAS MICROBIANAS E
SEDIMENTOS SUPERFICIAIS 110
5.3.1Determinação dos parâmetros químicos 110
5.3.2 Análise de Palinofácies 113 5.3.4.1Análises de Agrupamento 114 6 DISCUSSÃO 121 6.1 O AMBIENTE LAGUNAR 121 6.1.1 Clima 121 6.1.2 Coluna d’água 122
6.2 GEOMICROBIOLOGIA DAS ESTEIRAS MICROBIANAS 135
6.2.1 Aspectos Morfológicos e composição cianobacteriana das esteiras microbianas
135
6.3.1 O Ecossistema Esteira Microbiana 141
6.3 A MATÉRIA ORGÂNICA NAS ESTEIRAS MICROBIANAS E SEDIMENTOS
SUPERFICIAIS 152
6.3.1 Análise de Palinofácies 156
7 CONCLUSÃO 161
8 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 163
d’água entre as lagoas.
Apêndice B – Mann-Whitney, U-teste, dos parâmetros analisados na coluna d’água, entre os períodos seco e chuvoso.
Apêndice C – Mann-Whitney, U-teste, dos parâmetros analisados na
coluna d’água, entre os pontos confinados e abertos
Apêndice D – Correlação de Sperman entre os parâmetros analisados na
coluna d’água.
Apêndice E – Anova Kruskal-Wallis dos parâmetros analisados nas
amostras de esteiras microbianas.
Apêndice F – Anova Kruskal-Wallis dos parâmetros analisados entre os
tipos de esteiras microbianas
Apêndice G - Mann-Whitney, U-teste, dos parâmetros analisados nas esteiras microbianas entre os períodos seco e chuvoso.
Apêndice H - Correlação de Sperman entre os parâmetros analisados na nas esteiras microbianas.
Apêndice I - Descrição dos taxa de cianobactérias encontradas nas esteiras microbianas.
Apêndice J - Quadros das cianobactérias levantadas nas esteiras microbianas Poligonal, Lisa e Filme, e contagem dos indivíduos por amostra.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mapa de localização das lagoas e pontos de amostragem. 4
Figura 2: Reação do diacetato de fluoresceína na análise das atividades
das enzimas esterases. 14
Figura 3: Posicionamento da Geomicrobiologia no contexto da Geobiologia
(Naylor, 2005). 23
Figura 4: Quadro demonstrando as diferentes constituições das paredes
celulares das bactérias Gram-positivas e negativas. 25
Figura 5: Representação das relações fisiológicas entre as populações
microbianas presentes em uma esteira microbiana (Villanueva, 1999). 37
Figura 6: Mapa de localização da área de estudo. 57
Figura 7: Mapa geológico demonstrando o aspecto retilíneo do litoral do Rio
de Janeiro de Cabo Frio à baía de Guanabara (Muehe & Valentini, 1998). 58
Figura 8: Evolução dos cordões litorâneos ao sul da Lagoa de Araruama segundo Coe Neto (1984). 1-Rocha Cristalina (Gnaisses); 2-Depósitos arenosos Pré-flandrianos; 3-Depósitos lagoares; 4-Cordões flandrianos;
5-Lagoas; 6-Cordões Pós-flandrianos. 60
Figura 9: Imagem de satélite demonstrando aspecto geral da lagoa de
Araruama. (www.earth.google.com, em 07 de outubro de 2010). 64
Figura 10: Imagem de satélite demonstrando aspecto geral da Lagoa
Pernambuco (www. earth.google.com, em 07 de outubro de 2010). 67
Figura 11: Imagem de satélite demonstrando aspecto geral da Lagoa
Pernambuco (www. earth.google.com, em 07 de outubro de 2010). 68
Figura 12: Variação dos valores médios de temperatura do ar (°C), umidade relativa (%) e Precipitação (mm). Dados fornecidos pelo INMET-
Estação meteorológica de Iguaba Grande. 71
Figura 13: Variação de temperatura da água e salinidade ao longo do período amostral. A: Monte Alto (P1); B: Monte Alto (P2); C: Lagoa Pernambuco (P3); D: Lagoa Pernambuco (P4); E: Lagoa Pitanguinha (P5);
F: Lagoa Pitanguinha (P6). 73
Figura 14: Variação do pH e Eh ao longo do período amostral. A: Monte Alto (P1); B: Monte Alto (P2); C: Lagoa Pernambuco (P3); D: Lagoa
Pernambuco (P4); E: Lagoa Pitanguinha (P5); F: Lagoa Pitanguinha (P6). 74
Figura 15: Variação do íon amônio e do nitrogênio inorgânico dissolvido
C: Lagoa Pernambuco (P3); D: Lagoa Pernambuco (P4); E: Lagoa Pitanguinha (P5); F: Lagoa Pitanguinha (P6).
Figura 16: Variação dos nutrientes inorgânicos dissolvidos (NID) ao longo do período amostral. A: Monte Alto (P1); B: Monte Alto (P2); C: Lagoa Pernambuco (P3); D: Lagoa Pernambuco (P4); E: Lagoa Pitanguinha (P5);
F: Lagoa Pitanguinha (P6). 78
Figura 17: Variação do Nitrogênio total (N-total) e Fósforo Total (P-total) ao longo do período amostral. A: Monte Alto (P1); B: Monte Alto (P2); C: Lagoa Pernambuco (P3); D: Lagoa Pernambuco (P4); E: Lagoa
Pitanguinha (P5); F: Lagoa Pitanguinha (P6). 81
Figura 18: Variação das concentrações de clorofila-a, carotenóides e material particulado em suspensão (MPS) ao longo do período amostral. A: Monte Alto (P1); B: Monte Alto (P2); C: Lagoa Pernambuco (P3); D: Lagoa
Pernambuco (P4); E: Lagoa Pitanguinha (P5); F: Lagoa Pitanguinha (P6). 83
Figura 19: Variação do carbono biopolimérico (BPC) ao longo do período amostral. A: Monte Alto (P1); B: Monte Alto (P2); C: Lagoa Pernambuco (P3); D: Lagoa Pernambuco (P4); E: Lagoa Pitanguinha (P5); F: Lagoa
Pitanguinha (P6). 87
Figura 20: Variação do biopolímeros (lipídio, proteína e carboidrato) nas esteiras microbianas. No gráfico D os biopolímeros do mês de abril referem-se à esteira lisa, os dos meses de ago, nov, abril/10 a polímeros
do sedimento. A: Esteira Poligonal – Monte Alto (P1); B: Esteira Lisa –
Monte Alto (P2); C: Esteira Poligonal – Pernambuco (P3); D: Esteira Lisa
(Abril) e sedimento – Pernambuco (P4); E: Esteira Poligonal – Pitanguinha
(P5); F: Esteira Lisa – Pitanguinha (P6). 100
Figura 21: Variação do carbono biopolimérico (BPC) nas esteiras microbianas. No gráfico D o carbono biopolimérico do mês de abril refere-se à esteira lisa, os dados dos merefere-ses de ago, nov, abril/10 ao BPC do sedimento. A: Esteira Poligonal – Monte Alto (P1); B: Esteira Lisa – Monte Alto (P2); C: Esteira Poligonal – Pernambuco (P3); D: Esteira Lisa (Abril) e
sedimento – Pernambuco (P4); E: Esteira Poligonal – Pitanguinha (P5); F:
Esteira Lisa – Pitanguinha (P6). 102
Figura 22: Variação da atividade transportadora de elétrons (ASTE) e atividade das enzimas esterases (EST) nas esteiras microbianas. No gráfico D as enzimas do mês de abril referem-se à esteira lisa, os dados dos meses de ago, nov, abril/10 às enzimas do sedimento. A: Esteira
Poligonal – Monte Alto (P1); B: Esteira Lisa – Monte Alto (P2); C: Esteira
Poligonal – Pernambuco (P3); D: Esteira Lisa (Abril) e sedimento –
Pernambuco (P4); E: Esteira Poligonal – Pitanguinha (P5); F: Esteira Lisa –
Pitanguinha (P6). 106
Figura 23: Dendrograma obtido pela análise de agrupamento modo-R para
LIP: Lipídeos; PTN: Proteínas; CHO: Carboidratos; COT: Carbono orgânico total; S: Enxofre; CTI: Carbono inorgânico. FOPT: Fitoclasto opaco; FNBT: Fitoclasto não bioestruturado; FBT: Fitoclasto bioestruturado; CUT: Cutícula; MEM: Membrana; MOA: Matéria orgânica amorfa; EPST: EPS total; ESPOMT: Esporomorfo; PALMT: Palinomorfos marinhos; PALFOR: Palinoforaminífero.
Figura 24: Dendrograma obtido pela análise em modo-Q das amostras. 116
Figura 25: Foto panorâmica demonstrando a alteração e ocupação das
margens da lagoa Pernambuco (Primo & Bizerril, 2000). 124
Figura 26: Ciclo do nitrogênio demonstrando a perda ambiental de N pela
volatilização da amônia. Modificado de Crapez (2009). 128
Figura 27: Variação das concentrações de clorofila-a e P-total. A: Monte
Alto; B: Lagoa Pernambuco e C: Lagoa Pitanguinha. 131
Figura 28: Modelo de alteração metabólica das esteiras microbianas sob
um período de estresse. 151
LISTA DE ESTAMPAS
Estampa I: Imagens da área de estudo. A: Monte Alto, ponto 1(P1); B: Monte Alto, ponto 2 (P2); C: lagoa Pernambuco, ponto 3 (P3); D: lagoa Pernambuco, ponto 4 (P4); E: lagoa Pitanguinha, ponto 5 (P5); F: lagoa
Pitanguinha, ponto 6 (P6). 6
Estampa II: Aspectos gerais das esteiras Poligonais A: Monte Alto (P1). Seta indicando localização das esteiras Poligonais; B: lagoa Pernambuco (P3) em período de seca expondo as esteiras Poligonais. C: Lagoa Pitanguinha (P4) em período de seca expondo as esteiras Poligonais. D: Corte da esteira Poligonal da Lagoa Pitanguinha. Destaque para as laminações internas bem definidas. E: Fotomicrografia da esteira poligonal da lagoa Pernambuco, destacando as laminações internas bem definidas. F: Fotomicrografia revelando aspecto da trama algálica da esteira poligonal. Detalhe para os filamentos de Microcoleus Chthonoplastes e bainhas vazias de Lyngbya aestuarii (Aumento 10x). M: Microcoleus chthonoplastes; L: Lyngbya aestuarii. G: Fotomicrografia mostrando em detalhe o filamento de Microcoleus chthonoplastes, espécie que predomina na trama algálica da esteira poligonal (Aumento 40x). Atenção para presença de espessa
bainha de mucilagem. 95
Estampa III: Esteira Microbiana Lisa. A: Monte Alto, ponto 1(P2); B: Lagoa Pernambuco ponto 3 (P3); C: Esteira Lisa, ponto 2 (P2), mostrando sua estrutura laminada; D: Esteira Lisa, lagoa Pernambuco, ponto 3 (P4), tapete recobrindo o sedimento.; E: Corte Esteira lisa evidenciando sua estruturação interna; F: Fotomicrografia mostrando trama cianobacteriana das esteiras Lisas. G-I: Fotomicrografias mostrando os principais componentes das esteiras lisas, Lyngbya aestuarii, Schizothrix friesii e
Microcoleus Chthonoplastes, respectivamente 96
Estampa IV: Esteira Microbiana Filme. A: Lagoa Pitanguinha (P6); B: Ponto 6, região de mesolitoral. Em destaque ponto de crescimento da esteira Filme; C: Corte da Esteira Filme. Destaque para presença de camadas internas bem desenvolvidas. D: Fotomicrografia da esteira Filme, revelando sua estrutura suportada por grãos quartzosos e uma fina camada de
carbonato de cálcio em sua porção superficial. 97
Estampa V: Cyanobactérias encontradas nas esteiras microbianas. A: Fotomicrografia demonstrando a espécie Chroococcus turgidus (Kützing) Nägeli 1849 (Aumento 20X). B: Fotomicrografia demonstrando a espécie Chroococcus minor (Kützing) Nägeli 1984 (Aumento 100X). C: Fotomicrografia demonstrando a espécie Aphanothece conglomerata Rich 1932. D: Fotomicrografia demonstrando a espécie Aphanothece halophytica Fremy 1933 (Aumento 40X). E: Fotomicrografia demonstrando a espécie Johannesbaptita pellucida (Dickie) Taylor et Drouet 1938 (Aumento 40X). F: Fotomicrografia demonstrando a espécie Phormidium
Estampa VI: Gráfico de colunas demonstrando o percentual de cada grupo da matéria orgânica particulada na Palinofácies 1. Fotomicrografias do grupo matéria orgânica amorfa, fitoclastos e cutículas tiradas sob luz branca transmitida (TL) e azul incidente (FM). A e B: Matéria orgânica amorfa aglutinada; C: Fitoclasto bandado; D: Fitoclasto opaco perfurado; E e F: Cutícula associada a fitoclasto; G e H: Cutícula associada a fitoclasto; I e J: Cutícula; K e L: Cutícula com restos celulares preservados. FOP: Fitoclastos opacos; FBIO: Fitoclastos Bioestruturados; FNB: Fitoclastos não bioestruturados; CUT: Cutículas; MEM: Membranas; MOAT: Matéria orgânica tradicional EPST: EPS total; ESPOM: Esporomorfos; PALMT: Palinomorfos marinhos; PALFOR: Palinoforaminiferos.
118
ESTAMPA VII: Gráfico de colunas demonstrando o percentual de cada grupo da matéria orgânica particulada na Palinofácies 2. Fotomicrografias do grupo matéria orgânica amorfa, fitoclastos e cutículas tiradas sob luz branca transmitida (TL) e azul incidente (FM). A e B: Matéria orgânica amorfa aglutinada; C-F: Fitoclasto opacos alongados; G e H: Grão de pólen bissacado; I e J: Grãos de pólen; K: Esporo trilete; L: Palinoforaminifero . FOP: Fitoclastos opacos; FBIO: Fitoclastos Bioestruturados; FNB: Fitoclastos não bioestruturados; CUT: Cutículas; MEM: Membranas; MOAT: Matéria orgânica tradicional EPST: EPS total; ESPOM: Esporomorfos;
PALMT: Palinomorfos marinhos; PALFOR: Palinoforaminiferos. 119
ESTAMPA VIII: Gráfico de colunas demonstrando o percentual de cada grupo da matéria orgânica particulada na Palinofácies 3. Fotomicrografias, grupo matéria orgânica amorfa e EPS, sob luz branca transmitida (TL) e azul incidente (FM). A-C: EPS capsular filamentoso (EPSC) com remanescentes celulares; D e E: EPS capsular esférico (EPSCE) com remanescentes celulares; F e G: EPS capsular esférico (EPSCE) com remanescentes celulares envoltos em EPS amorfo; H-M: EPS capsular filamentoso (EPSC) com e sem remanescentes celulares; N-O: Matéria orgânica amorfa; P-S: EPS amorfo colonizado por bactérias. FOP: Fitoclastos opacos; FBIO: Fitoclastos Bioestruturados; FNB: Fitoclastos não bioestruturados; CUT: Cutículas; MEM: Membranas; MOAT: Matéria orgânica tradicional EPST: EPS total; ESPOM: Esporomorfos; PALMT:
Palinomorfos marinhos; PALFOR: Palinoforaminíferos. 120
Estampa IX - A e B: Monte Alto (P1) período chuvoso; C: Esteira Poligonal revelando as três camadas internas; D: Monte Alto (P2); E e F: Esteira Poligonal, mostrando sua estrutura laminada; G e H: Lagoa Pernambuco (P3) em período de chuva. I: Esteira Poligonal demonstrando suas camadas internas; J: lagoa Pernambuco (P4); K: Esteiras Lisas submersas; L: Esteira Lisa em detalhe mostrando suas camadas internas; M: Margem da lagoa Pitanguinha (P5) em período de chuva; N: Margem da lagoa Pitanguinha. Seta indicando posicionamento da esteira Filme; O: Esteira Filme em detalhe, mostrando suas camadas internas; P: Lagoa Pitanguinha (P6); Q: Esteiras Poligonais submersas e R: Esteira Poligonal em detalhe,
Estampa X: A e B: Monte Alto (P1), redução do corpo d‟água e exposição das esteiras Poligonais; C: Corte da esteira Poligonal mostrando a perda da estratificação interna; D: Margem do P2; E: Redução da lâmina d‟água que encobre a esteira Lisa no P2; F: Corte da esteira lisa P2 mostrando perda das camadas internas; G e H: Redução do corpo d‟água expondo as margens da lagoa Pernambuco e esteiras Poligonais no P3; I: Escurecimento das camadas internas da esteira Poligonal no P3.
Manutenção da camada verde; J: Redução do corpo d‟água na lagoa
Pitanguinha ponto P5, expondo as esteiras microbianas Poligonais; K: Esteiras poligonais em destaque; L: Corte da esteira Poligonal mostrando perda da camada vermelha e escurecimento das camadas internas; M: Margem da lagoa Pitanguinha, P6; N: Exposição da esteira Filme; O: Corte
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Localização e descrição das estações amostrais. 5
Quadro 2: Representação dos meses de amostragem, amostras retiradas e
total de amostras trabalhadas. 7
Quadro 3: Análises aplicadas em cada tipo de amostra. 9
Quadro 4: Resumo da diversidade metabólica das bactérias 31
Quadro 5: Classificação do estado trófico baseado na composição bioquímica dos sedimentos proposta por Dell’Anno et al. (2002) e Vezzuli &
Fabiano (2006). 50
Quadro 6: Resumo das características físicas da lagoa de Araruama (Primo
& Bizerril, 2002). 65
Quadro 7: Resumo da composição dos sedimentos da lagoa de Araruama
(Kjerfve et al., 1996). 66
Quadro 8: Descrição dos pontos amostrais e amostras de esteiras
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Dados meteorológicos, fornecidos pelo INMT – Estação
Meteorológica de Cabo Frio, dos meses de abril de 2009 a abril de 2010. 71
Tabela 2: Parâmetros físico-químicos aferidos durante o período amostral. 75
Tabela 3: Nutrientes inorgânicos dissolvidos: nitrogênio total (N-total) e fósforo total (P-total), razão nitrogênio e fósforo dissolvidos e razão
nitrogênio e fósforo total para os pontos amostrados. 79
Tabela 4: Concentrações de material particulado em suspensão (MPS),
clorofila-a e carotenóides. 82
Tabela 5: Concentrações dos biopolímeros convertidos para equivalentes
em carbono e o carbono biopolimérico (BPC). 86
Tabela 6: Parâmetros microbiológicos dosados na coluna d’água ao longo
do período amostral. 90
Tabela 7: Parâmetros químicos determinados nas esteiras microbianas: Biopolímeros (Lipídios, Proteínas e Carboidratos), carbono biopolimérico (BPC), carbono orgânico total (COT) e enxofre (S); Parâmetro estimado:
carbono inorgânico total (CIT). 99
Tabela 8: Parâmetros bioquímicos e microbiológicos determinados nas esteiras microbianas. ASTE: Atividade do sistema transportador e elétrons; EST: Atividade das enzimas esterases; NBC: Número de células bacterianas; MPN: Número mais provável; MPN-SR: Número mais provável
de células bacterianas sulfato-redutoras e CIANO: cianobactérias. 105
Tabela 9: Parâmetros químicos dosados nas esteiras microbianas e
sedimentos superficiais. 112
Tabela 10: Componentes particulados da matéria orgânica. 113
Tabela 11: Comparação das médias obtidas para salinidade em anos
anteriores nas lagoas de Araruama, Pernambuco e Pitanguinha. 123
Tabela 12: Comparação das médias obtidas dos nutrientes inorgânicos
dissolvidos com estudos prévios na lagoa de Araruama – RJ. PO43-, NO2-,
NO3
-, NH4
+
em µmol -1. 128
Tabela 13: classificação do estado trófico em Monte Alto, Pernambuco e
LISTA DE ESPÉCIES DE CIANOBACTÉRIAS
Aphanocapsa litoralis (Hansgirg) Komárek et Anagnostidis 1995. Aphanocapsa litoralis var. macrococca Hansgirg 1892.
Aphanocapsa concharum Hansgirg 1890.
Aphanocapsa rivularis (Carmichael) Rabenhorst 1865. Aphanocapsa salina Voronichin 1929.
Aphanothece clathrata W et West 1906. Aphanothece conglomerata Rich 1932. Aphanothece halophytica Frémy 1933.
Aphanothece marina (Ercegovic) Komárek et Anagnostidis 1995. Aphanothece pallida (Kützing) Rabenhorst, 1863.
Aphanothece salina Elenkin et Danilov 1915. Aphanothece saxicola Nägeli, 1849.
Aphanothece stagnina (Sprengel) A. Braum, 1865. Chlorogoea tuberculosa (Hansgirg) Wille 1900.
Chroococcus dispersus (Keissler) Lemmermann, 1904. Chroococcus giganteus W. West, 1892.
Chroococcus membraninus (Meneghini) Nägeli 1849.
Chroococcus microscopicus Komarová Legnerová et Cromberg 1994. Chroococcus minimus (Kützing) Lemmermann 1904.
Chroococcus minor (Kützing) Nägeli 1984. Chroococcus minutus (Kützing)Nägeli 1849. Chroococcus obliteratus Richer 1886.
Chroococcus quaternarius Zalesky 1926. Chroococcus turgidus (Kützing) Nägeli 1849.
Cyanosarcina thalassia Anagnostidis et Pantazidar 1991. Entophysalis conferta (Kützing) Drouet et Daily 1948. Entophysalis granulosa Kutzing, 1843
Gloeocapsopsis crepidinum (Thuret) Geitler ex Komárek 1993. Gloeocapsopsis cyanea (Krieger) Komárek et Anagnostidis 1994. Gloeothece confluens Nägeli, 1849.
Gomphosphaeria aponina Kützing 1836. Gomphosphaeria salina Hansgirg 1892.
Hormatonema sphaericum Ercegović 1932.
Johannesbaptita pellucida (Dickie) Taylor et Drouet 1938.
Jaaginema subtilissimun (Kützing ex De Toni) Anagnostidis et Komárek 1988.
Leptolyngbya komarovii (Anissimava) Anagnostidis & Komárek, 1988. Leptolyngbya tenuis (Gomont) Anagnostidis et Komárek 1988.
Lyngbya aestuarii (Liebmann) ex Gomont 1892. Lyngbya fragilis (Meneghini) Compère 1974.
Microcoleus chthonoplastes Thuret ex Gomont 1892. Microcoleus tenerrimus Gomont 1892.
Microcoleus vaginatus (Vaucher) Gomont, 1892. Oscillatoria limnetica Lemmermann 1900.
Oscillatoria princeps Vaucher ex Gomont 1892. Oscillatoria subbrevis Schimidle 1901.
Phormidium acuminatum Gomont, 1892.
Phormidium acutum (Bhühl & Bisw.) Anagnostidis & Komárek, 1988.
Phormidium aerugineo-caeruleum (Gomont) Anagnostidis et Komárek 1988.
Phormidium breve (Gomont) Anagnostidis & Komárek, 1988. Phormidium cf. alorgei (Frémy) Anagnostidis et Komárek 1985
Phormidium chalybeum (Mert. ex Gomont) Anagnostidis et Komárek 1988. Phormidium formosum (Bory ex Gomont) Anagnostidis et Komárek 1988.
Phormidium hamelii Frémy, 1930.
Phormidium jasorvensis Anagnostidis et Komárek 1988.
Phormidium okeni (Ag. ex Gom.) Anagnostidis et Komárek 1988. Phormidium terebriforme (Gomont) Anagnostidis & Komárek, 1988. Porphyrosiphon martensianus (Meneghini ex Gomont) Anagnostidis et Komárek 1988.
Planktothrix Geitleri (Kisel.) Anagnostidis et Komárek 1988. Pleurocapsa crepidinum Collins 1901.
Schizothrix arenaria (Berkeley) Gomont 1892. Schizothrix friesii Gomont 1892.
Spirulina meneghiniana Zanardini ex Gomont 1892. Spirulina subsalsa Oersted ex Gomont 1892.
Spirulina subtilissima Küttzing 1843. Synechococcus elongatus Nägeli, 1849. Synechococcus salinarum Komárek 1956.
1 INTRODUÇÃO
Esteiras microbianas são comunidades laminadas formadas por populações coesas de microorganismos, que crescem na interface sedimento-água e ocasionalmente, na interface sedimento-ar. Variam muito em espessura indo de alguns milímetros a poucos centímetros e se desenvolvem ao longo de uma variedade de microgradientes físico-químicos (luminosidade, Ph e temperatura) estabelecidos entre a água e o sedimento (Guerrero et al., 2002).
Na literatura são conhecidas como microbialitos (Spracha et al., 2001),
biolaminóides calcários (Silva e Silva & Carvalhal, 2005), esteiras
cianobacterianas (Kühl & Fenchel, 2000), laminitos microbianos (Iespa & Silva e Silva, 2005), tapetes microbianos (Feder, 2010) e outros. Esta pluralidade de terminologias dificulta o reconhecimento do assunto e é motivo de dúvida entre os estudantes e pesquisadores iniciantes no tema.
Foram tradicionalmente definidas como um depósito organossedimentar composto por uma comunidade microbiana taxonomicamente e fisiologicamente diversa, de crescimento ativo, dominada por cianobactérias, bactérias heterotróficas e quimiolitotróficas (Pearl et al., 2001), sendo as cianobactérias consideradas como a força motriz do sistema (Dupraz et al., 2008).
As esteiras são consideradas um dos ecossistemas mais produtivos do planeta (Álvarez, 2005) e sob certas condições de preservação, seus constituintes microbianos são considerados importantes fontes de matéria orgânica amorfa (Tyson, 1993), como ocorre com os depósitos de Kukersitas de diferentes idades (Comas-Renfigo et al., 2010; Fowler et al., 2004) e excelentes precursores de querogênio tipo I e II (Tyson, 1995; Alsharhan & Kendall, 2003).
Atualmente as esteiras são encontradas em diversos ambientes, mas se desenvolvem melhor naqueles cujas condições restritivas limitem a ocorrência de metazoários pastadores. Dentre esses ambientes encontram-se os hipersalinos e fontes termais (Arp et al., 1998; Belkova et al., 2004; Silva e Silva et al., 2006a e 2006b). No Brasil, a ocorrência de esteiras microbianas, até o presente momento,
predominou nos ambientes hipersalinos mais especificamente nas lagoas costeiras do estado do Rio de Janeiro.
Estudos em esteiras microbianas modernas incluem: identificação e isolamento dos componentes microbianos; estudo das necessidades fisiológicas e variação ecológica dos microorganismos; distribuição de microorganismos, parâmetros e gradientes físico-químicos; associações microbianas e estudos de comunidade; ecologia das esteiras; e a compreensão global das esteiras microbianas como um ecossistema em miniatura.
Para o Brasil inúmeros trabalhos já foram desenvolvidos nas esteiras microbianas das lagoas Salgada (Silva e Silva, 2002), Vermelha (Silva e Silva & Carvalhal, 2005; Carvalhal, 2007), Pitanguinha (Damazio, 2004; Silva e Silva & Damazio, 2006), Pernambuco (Iespa & Silva e Silva, 2005; Iespa, 2006), Azul (Silva e Silva et al., 2004), além dos brejos Espinho (Delfino, 2009), Pau Fincado (Lopes, 2009) e em ambientes artificiais como as salina Julieta (Feder, 2010). No entanto, os estudos realizados nestas áreas se restringiram predominantemente a levantamentos da flora cianobacteriana e caracterizações sedimentológicas. Apenas recentemente dois trabalhos abordaram as características ecológicas e tratamento quantitativo de espécies e determinação de índices de riqueza, abundância relativa, diversidade e dominância (Delfino, 2009; Feder, 2010).
Trabalhos de cunho geoquímico e geomicrobiológico complexos em esteiras modernas, apesar de amplamente realizados no exterior, são ainda incipientes no Brasil. Neste contexto, este trabalho se propõe caracterizar qualitativamente e quantitativamente o conteúdo geomicrobiológico e orgânico das esteiras microbianas das lagoas de Araruama, região de Monte Alto, Pernambuco e Pitanguinha.
1.1 OBJETIVO
1.1.1 Objetivo Geral
Caracterizar as esteiras microbianas das lagoas de Araruama, região de Monte Alto, Pernambuco e Pitanguinha quanto à composição geomicrobiológica e orgânica.
1.1.2 Objetivos específicos
1. Quantificar parâmetros elementares como nutrientes
inorgânicos dissolvidos, P-total e N-total em amostras de água;
2. Quantificar a taxa de clorofila-a e carotenóides em amostras
de água;
3. Quantificar a quantidade de material particulado em
suspensão (MPS) em amostras de água;
4. Caracterizar as esteiras microbianas quanto aos seus
aspectos morfológicos;
5. Dosar a concentração de biopolímeros em amostras de
água, esteiras microbianas e sedimentos superficiais;
6. Quantificar as atividades enzimáticas bacterianas em
amostras de água e esteiras microbianas;
7. Quantificar as bactérias viáveis em amostras de água e
esteiras microbianas;
8. Quantificar as bactérias sulfato-redutoras através da técnica
de número mais provável (NMP);
9. Identificar e quantificar as espécies de cianobactérias nas
amostras de esteiras microbianas;
10. Quantificar o carbono orgânico total e o enxofre total das amostras de esteiras microbianas e sedimentos superficiais;
11. Aplicar a técnica de palinofácies nas esteiras microbianas e sedimentos superficiais.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 ESTAÇÕES DE COLETA
Para realização deste trabalho foram demarcadas seis estações amostrais, duas em cada lagoa, denominadas P1, P2, P3, P4, P5 e P6, sendo os pontos P1 e P2 localizados na lagoa de Araruama, região de Monte Alto, P3 e P4 na lagoa Pernambuco e P5 e P6 lagoa Pitanguinha (Quadro 1). Estas estações foram marcadas de maneira criteriosa seguindo dois parâmetros principais:
- áreas previamente conhecidas na literatura com ocorrência de esteiras microbianas perenes de morfologia ampla.
- posicionamento na região litorânea das lagoas, para que um dos pontos fosse em área confinada e o outro em área aberta (Figura 1).
Quadro 1: Localização e descrição das estações amostrais.
Lagoa Ponto Localização Descrição Tipo de
Esteira Latitude Longitude A raruama – Mo nte A lto P1 22°56’36” S 42°06’02” W Piscina temporária
Bolsão d’água de difícil acesso, ligado à lagoa por um pequeno canal. Vegetação de entorno composta principalmente por gramíneas (Estampa I, Figura 1).
Lisa P2 22°56’38” S 42°06’37” W Lagoa
Ponto de difícil acesso com pequena faixa de areia e vegetação densa composta de árvores, arbustos e gramíneas (Estampa I, Figura 2). Lisa P ernamb uc o P3 22°55’50” S 42°18’86” W
Piscina confinada por marnéis de salina
Área de acesso moderadamente fácil com vegetação composta quase que exclusivamente por gramíneas (Estampa I, Figura 3).
Poligonal P4 22°55’49” S 42°19’00” W Lagoa
Área de fácil acesso localizada em faixa arenosa artificial que serve como via para automóveis. Dentre os pontos amostrais este é o que sofre maior influência antropogênica. Margem muito alterada pela ocupação residencial e acúmulo de lixo (Estampa I, Figura 4). Lisa P itan gu inh a P5 22°55’39” S 42°21’20” W Piscina temporária
Estação de difícil acesso ao lado de salina abandonada. Pouca vegetação de entorno (Estampa I, Figura 5) Poligonal P6 22°55’36” S 42°20’10” W Lagoa
Estação de acesso fácil, localizada em frente à via de entrada na lagoa. Local com moderada influência antrópica sendo frequente o acúmulo de lixo na margem (Estampa I, Figura 6).
Estampa I: Imagens da área de estudo. A: Monte Alto, ponto 1(P1); B: Monte Alto, ponto 2 (P2); C: lagoa Pernambuco, ponto 3 (P3); D: lagoa Pernambuco, ponto 4 (P4); E: lagoa Pitanguinha, ponto 5 (P5); F: lagoa Pitanguinha, ponto 6 (P6).
2.2 CAMPO E AMOSTRAGEM
Este trabalho envolveu a realização de 14 amostragens de esteiras microbianas, sedimentos superficiais e água durante os anos de 2008, 2009 e 2010 com diferentes finalidades.
Foi realizada uma amostragem, novembro de 2008, com retirada de seis amostras de esteiras microbianas e seis de sedimentos superficiais das lagoas, perfazendo um total de 12 amostras para caracterização da composição da matéria orgânica.
No período de abril de 2009 a abril de 2010 foram realizadas quatro amostragens, com retirada de um total de 24 amostras de esteiras microbianas para a caracterização da composição geomicrobiológica e orgânica. Neste mesmo período, 13 amostragens de água foram realizadas, compondo um total de 78 amostras, para acompanhar as variações ambientais a que foram submetidas estas estruturas. Uma descrição detalhada da amostragem está resumida no Quadro 2.
Quadro 2: Representação dos meses de amostragem, amostras retiradas e total de
amostras trabalhadas.
Os sedimentos superficiais e esteiras microbianas foram amostrados manualmente com tubo de PVC de 10 cm de diâmetro e comprimento. Após coletadas, as amostras foram acondicionadas em sacos de polipropileno, devidamente identificadas e armazenadas em geladeira de isopor com gelo fundente (Silva et al., 2008) para posterior triagem no laboratório. A água foi
Amostras Período Amostral Número de amostras 2008 2009 2010
Nov Abr Mai Jun Jul Ago etS Out Nov Dez Jan Fev Mar Abr
Sedimento X 6 Esteira Microbiana X X X X X 30 Água X X X X X X X X X X X X X 78 Total de amostras 114
amostrada em garrafas plásticas de 1,5 L nos mesmos pontos das esteiras ou o mais próximo possível delas. As garrafas foram transportadas em geladeira de isopor com gelo fundente.
No ato da coleta foram realizadas aferições de parâmetros físico-químicos da água utilizando-se: (1) microprocessador-pH meter CG 837 para o pH; (2) digital meter CG 867 para temperatura da água; (3) digital meter WTW 330i para Eh e (4) salinômetro (refratômetro) com escala de 0 a 100% para a salinidade.
2.3 TRIAGEM E DIVISÃO DAS AMOSTRAS
O desenvolvimento deste trabalho contou com uma série de análises químicas, morfológicas, palinofaciológicas e microbiológicas de esteiras microbianas, sedimentos superficiais e água (Quadro 3). Por isso, no laboratório as amostras recém chegadas do campo foram cuidadosamente triadas, as esteiras microbianas separadas por tipos e fracionadas de acordo com a necessidade e objetivo de cada análise.
As amostras de água, recém chegadas do campo, foram divididas em subamostras de volume conhecido, filtradas sob vácuo através de filtro de fibra de vidro Whatman GF/F (porosidade de 0,7µm) previamente calcinados, em mufla à 450º C e pesados, para análise de material particulado em suspensão (MPS) e não calcinados para análise de pigmentos. As subamostras filtradas e brutas foram armazenadas em frascos plásticos e mantidas congeladas para análises de nutrientes inorgânicos dissolvidos e de nitrogênio e fósforo total.
Após a triagem, alíquotas de sedimentos e esteiras microbianas destinadas às análises de carbono orgânico total (COT), enxofre total (S) e palinofácies foram secas em estufa a 50°C por cerca de três dias e armazenadas em sacos plásticos devidamente identificados.
Alíquotas frescas das esteiras microbianas foram separadas para análises enzimáticas e de número mais provável (NMP); congeladas para análises biopoliméricas; armazenadas em frascos opacos, fixadas em formol a 4%, para as análises de identificação cianobacteriana e de epifluorescência.
Quadro 3: Análises aplicadas em cada tipo de amostra.
N-Total: Nitrogênio Total; P-Total: Fósforo Total; MPS: Material Particulado em Suspensão; COT: Carbono Orgânico Total; S: Enxofre Total; ASTE: Atividade do Sistema Transportador de Elétrons; EST: Enzimas Esterases; NMP: Número Mais Provável; SR: Sulfato-redução.
2.4 PARÂMETROS QUÍMICOS
As análises químicas foram executadas no Laboratório de Microbiologia Marinha - MICROMAR- na Universidade Federal Fluminense, UFF e no
Laboratório de Fácies Orgânicas – LAFO – no departamento de geologia da
Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Parâmetros Análise Amostras Água Esteira microbiana Sedimento Químicos Nutrientes Inorgânicos Dissolvidos X N total, F total X Clorofila-a e Carotenóides X MPS X COT, S X X Proteínas, Lipídios e Carboidratos X X X Morfológico Tipificação X Palinofaciológico Palinofácies X X Microbiológicos
Enzimas: ASTE e EST X X X
N° de células bacterianas X X X
NMP - SR X X
Identificação e contagem
2.4.1 Nutrientes inorgânicos dissolvidos
As análises se detiveram na quantificação dos seguintes nutrientes
inorgânicos dissolvidos: nitrato (NO3-), nitrito (NO2-), fosfato (PO4-) e amônio
(NH4+). As concentrações dos nutrientes inorgânicos dissolvidos foram
determinadas por espectrofotometria de absorção molecular, através dos métodos descritos por Grasshoff et al. (1983). A quantificação baseou-se nas curvas de calibração confeccionadas com soluções padrões.
Os nitritos (NO2-) foram determinados em uma reação que envolve duas
etapas. Primeiro o nitrito reage com a sulfanilamida em meio ácido, formando um composto diazóico, posteriormente este composto reage com o n-naftil etilenodiamina formando um corante púrpura avermelhado, cuja densidade ótica foi medida a 540nm.
Os nitratos (NO3-) foram determinados em uma reação que envolve sua
redução a nitrito em coluna redutora de amálgama de cádmio, com grãos tratados com solução cúprica, sob pH controlado ou tamponado. Após a redução, a análise procedeu-se conforme a determinação do nitrito.
Os fosfatos (PO4-) foram determinados pela reação do ácido ascórbico que
reduz todas as espécies de fósforo inorgânico dissolvidos a fosfatos. A reação deste íon com o molibidato de amônio em meio ácido forma o complexo fósforo-molibidato, catalisada pelo tartarato de antimônio e potássio, resultando em um composto azul, cuja densidade ótica foi medida a 880nm.
A dosagem do íon amônio (NH4+) baseou-se na reação deste com o fenol,
em meio alcalino, e em presença de ácido dicloroisocianuro (trione) e nitroprussiato de sódio (catalisador) para formar o complexo azul que apresenta máxima absorbância à 630nm. Adicionou-se também citrato trissódico (complexante) durante a reação para evitar turbidez. As concentrações dos
2.4.2 Nitrogênio total (N-total) e Fósforo total (P-total)
Subamostras brutas da água foram separadas para estas duas análises, que foram realizadas pela oxidação simultânea das espécies presentes por persulfatos. Sendo assim, todo nitrogênio é transformado em nitrato e todo fósforo em fosfato. A partir desta reação seguiu-se a análise de nitratos e fosfatos anteriormente descrita (Grasshof et al., 1983). As concentrações destes
nutrientes foram expressas em µmol L-1.
2.4.3 Clorofila-a, carotenóides e Material Particulado em Suspensão (MPS)
Após a filtragem das subamostras destinadas à análise de pigmentos, os filtros de fibra de vidro foram conservados congelados até o momento da análise. Após descongelamento, os filtros foram transferidos para tubos de centrífuga, onde foi adicionada acetona 90% para extração, e em seguida macerados. Estes permaneceram refrigerados durante 20 horas para completa extração dos pigmentos. Após esse período, o material foi centrifugado e a absorbância do sobrenadante determinada em espectrofotômetro nos comprimentos de onda 630, 645, 665 e 750nm.
Para o cálculo da concentração de clorofila-a e carotenóides (μg L-1
), foi utilizada a equação de Jeffrey & Humphrey (1975).
Para análise do material particulado em suspensão (MPS), os filtros após descongelamento, foram secos em estufa à 50ºC por aproximadamente 18 horas. Após secagem, foram pesados e a quantidade de MPS foi obtida pela diferença gravimétrica entre o peso do filtro antes e após filtração. Os valores foram
2.4.4 Determinação dos biopolímeros
As análises de biopolímeros foram realizadas em triplicata nas amostras de água, esteiras microbianas e sedimentos. Todas as análises foram realizadas por
método espectrofotométrico. Os resultados foram expressos em mg g-1 de peso
úmido ou por μg ml-1
de esteiras microbianas e água, respectivamente. Nas amostras destinadas à caracterização da matéria orgânica, a análise de biopolímeros foi realizada em amostras secas e os resultados foram expressos em mg/g de peso seco.
Os lipídios (LIP) foram obtidos após extração com clorofórmio – metanol
segundo método de Marsh & Wenstein (1966) por espectrofotometria molecular e lidos à 375nm. Sua concentração calculada através de calibração de uma curva
padrão de tripalmitina e convertida em equivalentes de carbono (µgC ml-1 e mgC
g-1), multiplicando-se a concentração pelo fator 0,75.
A análise de proteína (PTN) foi realizada após extração com NaOH e foi determinada de acordo com Hartree (1972) modificado por Rice (1982), para compensar a interferência com fenol. A concentração de proteínas extraídas foi determinada por espectrofotometria molecular (650nm) estabelecendo-se uma curva de calibração com padrões de albumina bovina. A concentração foi
expressa em equivalentes de carbono (µgC ml-1 e mgC g-1), multiplicando-se a
concentração pelo fator 0,49.
Os carboidratos (CHO) foram analisados segundo método de Gerchacov & Hatcher (1972), que adaptou o método de Dubois (1958) para utilização
especifica em sedimentos. As concentrações foram obtidas por
espectrofotometria molecular (485 nm) e calculadas por obtenção de curva de calibração em padrões de glicose. As concentrações foram expressas em
equivalentes de carbono (µgC ml-1 ou mgC g-1), multiplicando-se as
O carbono orgânico biopolimérico (BPC) foi obtido pela soma do equivalente em carbono do total de carboidratos, proteínas e lipídios (Fabiano et al., 1995).
2.4.5 Análises de carbono orgânico total (COT%) e enxofre total (S%)
As análises do teor de COT% e S% foram realizadas nas amostras de esteiras microbianas e sedimentos, no aparelho SC 144 (LECO) após acidificação para remoção de carbonatos. Os métodos adotados foram os ASTM D 4239 (American Society for Testing and Materials-ASTM, 2008) e NCEA-C-1282 (United States Environmental Protection Agency-US EPA, 2002).
O teor de carbono inorgânico total (CIT) foi obtido indiretamente pela diferença gravimétrica entre massas da amostra insolúvel e a massa da amostra descarbonatada.
2.5 PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS
2.5.1 Atividade das enzimas esterases bacterianas (EST)
A quantificação da atividade das enzimas esterases (EST) foi realizada em triplicata por método espectrofotométrico, de acordo com Stubberfield e Shaw (1990).
O método é baseado na estimativa da hidrólise da solução de diacetato de fluoresceína por enzimas esterases (lipases, amilases e proteases). O produto desta reação é a fluoresceína, um composto fluorescente, produzido em amostras de diversos tipos, dentre elas sedimento e água, que pode ser quantificado através de espectrofotometria.
Figura 2: Reação do diacetato de fluoresceína na análise das atividades das enzimas esterases.
Para a quantificação da atividade enzimática, as alíquotas das amostras foram inicialmente tratadas com tampão fosfato (pH 7,6) e incubadas com diacetato de fluoresceína em temperatura ambiente por 75 minutos. A reação foi interrompida em gelo fundente. Uma alíquota da solução foi retirada, colocada em tubo de ensaio e centrifugada a 3200 rotações/min durante 5 minutos. A última etapa consistiu na medição da densidade óptica do sobrenadante límpido a 490 nm e a concentração determinada em relação a uma curva de calibração, com
padrões de fluoresceína e expressos em µg de fluoresceína h-1 ml-1 ou µg de
fluoresceína h-1 g-1 de peso úmido.
2.5.2 Atividade do sistema transportador de elétrons bacteriano (ASTE)
A determinação da ASTE foi baseada no método de Trevors (1984) e Houri- Davignon & Relexans (1989), que consiste na mudança de coloração do INT, que é o 2-[(p-iodofenil)-3-(p-nitrofenil)-5-fenil tetrazolium], quando utilizado como aceptor artificial de elétrons. O produto da reação é o INTF (cloreto de iodonitrotetrazolium formazan).
A determinação foi realizada em triplicata em amostras de água e esteiras microbianas, através da incubação com a solução de INT 8 mM (a solução estoque de INT foi preparada com água deionizada, armazenada em frasco âmbar e mantida refrigerada).
Alíquotas de 1,0ml ou 1,0g das amostras foram incubadas à temperatura ambiente e ao abrigo da luz por 35 minutos. Após o tempo de reação, a extração foi realizada adicionando-se metanol (P.A.). Após homogeneização vigorosa deixou-se extrair por 10 minutos e em seguida homogeneizou-se novamente. A parte líquida de cada frasco foi centrifugada em tubos de ensaio por 5 min a 3200 rotações/minutos. A quantificação foi realizada através de espectrofotometria molecular (475 nm), realizada na ausência de luz, por se tratar de material fotolábil, através da obtenção de uma curva de calibração com padrões expressos em µl O2 h-1 ml-1 ou µl O2 h-1 g-1.
2.5.3 Determinação do número de células por laranja de acridina.
Para a determinação do número de células bacterianas, uma alíquota de 1 ml das amostras de água ou 1g das amostras de esteiras microbianas foram fixadas em formol a 4% e estocadas para contagem em microscópio de epifluorescência.
Para a produção das lâminas, as amostras foram inicialmente homogeneizadas em vórtex e uma alíquota de 0,5 ml foi retirada e diluída oito vezes. Uma nova alíquota foi retirada e diluída em 1,45 ml de água deionizada e adicionou-se 75 μl de laranja de acridina. Dessa nova solução obtida, 2 ml foram filtrados em membrana Nuclepore de policarbonato preta, 0,22 mm de porosidade e diâmetro de 25 mm. As células foram contadas em 30 campos através do microscópio Axioskop, modelo 50 da Zeiss e com aumento de 1000 vezes. O número de bactérias foi calculado segundo Kepner et al. (1994).
Para amostras de esteiras microbianas uma alíquota de 1 ml, da amostra homogeneizada no formol, foi diluída inicialmente em 9 ml de água deionizada e homogeneizada em vórtex. Após esta primeira diluição seguiu-se o procedimento padrão anteriormente descrito. Novas diluições foram realizadas para as esteiras
microbianas, quando as concentrações das células foram muito elevadas, a fim de possibilitar a leitura.
2.5.4 Análise de número mais provável (NMP) por tubos múltiplos
A análise de número mais provável (NMP) pela técnica de tubos múltiplos (APHA, 1995) é uma análise laboriosa que consiste na estimativa da densidade média de um microorganismo em uma amostra, sem a necessidade de uma contagem direta. Consiste das seguintes etapas: diluições sucessivas, amostragem de cada diluição, incubação em meio apropriado e avaliação quanto ao crescimento dos organismos desejados. A estimativa da densidade é baseada na combinação de resultados positivos e negativos aplicados em teorias de probabilidade estatística relacionada com a frequência da ocorrência de resultados positivos mais prováveis em função do número real de organismos.
Para obtenção do NMP de bactérias sulfato-redutoras nas amostras de
esteiras microbianas foi utilizado meio de cultura específico contendo 4 g L-1 de
lactato de sódio; 0,1 g L-1 de ácido ascórbico; 0,2 g L-1 de sulfato de magnésio;
0,01 g L-1 de fosfato dipotássico; 0,2 g L-1 de sulfato ferroso amoniacal; 10 g L-1
de cloreto de sódio; 0,001 g L-1 de resarzurina sódica; 0,4906 g L-1de cisteína
para 1 L água deionizada (Alef & Nannipieri, 1995).
A análise foi realizada em triplicata e consistiu na diluição inicial de 5g de cada amostra de esteira microbiana em 50 ml de solução salina. Diluições sucessivas e inoculações foram realizadas de modo a se obter tubos inoculados com as seguintes concentrações 101, 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Os tubos foram incubados por até 72h a 30°C. Após esse período foram considerados positivos os tubos cujo meio de cultura apresentou mudança da coloração do meio de rosa para preto. A densidade bacteriana é expressa como NMP da
2.5.5 Identificação e contagem das cianobactérias
A análise das cianobactérias foi executada no Laboratório de Biologia e Taxonomia Algal (LABIOTAL) da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro e se baseou no método descrito por Silva e Silva (2002).
A caracterização da composição cianobacteriana, dos tipos de esteiras, foi realizada através da confecção de lâminas biológicas a fresco e semi-permanentes. Usou-se tinta nanquim para evidenciar a bainha de mucilagem dos exemplares cianobacterianos. Para as lâminas semi-permanentes foi utilizado formol glicerinado a 25% objetivando a conservação das cianobactérias e para a selagem, Bálsamo do Canadá. As lâminas foram observadas por microscopia óptica, Olympus CX40, nos aumentos de 50x, 100x, 400x e 1000x, sendo que para objetiva de imersão foi utilizado óleo de cedro, para minimizar a refração.
A identificação das cianobactérias foi realizada observando-se as características morfológicas clássicas e através de cinco medições, feitas com o auxílio de uma ocular micrometrada, sendo estas: diâmetro dos filamentos, diâmetro das colônias, diâmetro dos tricomas, espessura das bainhas, comprimento e largura das células, obtendo-se além da média os valores mínimos e máximos.
O enquadramento taxonômico das formas esféricas seguiu a classificação de Komárek & Anagnostidis (1999) e para as formas filamentosas foi utilizada a classificação segundo Anagnostidis & Komárek (1988) e Prescott (1975). Bibliografias específicas de ambientes salinos e tropicais foram utilizadas para auxiliar a identificação como: Azevedo (1991); Baeta Neves (1983; 1991; 1992; 1993); Baeta Neves & Casarin (1990); Baeta Neves & Tribuzi (1992); Bicudo (1988); Branco et al. (1963); Garcia-Baptista & Baptista (1992); Sant’Anna et al. (1991); Sant’Anna & Simoneti (1992); Senna (1992); Werner & Rosa (1992).
A contagem das cianobactérias baseou-se no método descrito por Nubel et al. (1999) modificado por Delfino (2007), adaptado para este trabalho.
Em cada amostra foram retiradas subamostras através de um punch
dermatológico de 10 mm3 para elaboração das lâminas permanentes. De cada
amostra foram retiras três subamostras sendo confeccionadas 3 lâminas. Foi realizada leitura de lâmina inteira por microscopia óptica de luz branca, Olympus CX40, nos aumentos de 40 e 100 vezes.
2.6 PARÂMETROS MORFOLÓGICOS
As esteiras microbianas foram identificadas em campo por tipos segundo sua geometria e localização. No laboratório foram caracterizadas quanto à coloração, coesão e presença ou ausência de laminações internas, através de microscopia estereoscópica (Silva e Silva, 2002; Carvalhal, 2007).
2.7 PARÂMETROS GEOQUÍMICOS
2.7.1 Tratamento químico das amostras e montagem das lâminas organopalinológicas
O processo de separação da matéria orgânica particulada das esteiras microbianas e sedimentos superficiais iniciou-se com a lavagem das amostras com solventes orgânicos como n-hexano, diclorometano e metanol para extração de possíveis contaminantes e excesso de EPS (substância polimérica extracelular). Após a limpeza, seguiu-se o procedimento padrão não-oxidativo descrito por Tyson (1995) e Mendonça Filho et al. (1999; 2002; 2010b) para o isolamento da fração particulada da matéria orgânica nas amostras.
As amostras foram tratadas com ácido clorídrico a 37% por 18 horas para remoção dos carbonatos, seguido do tratamento com ácido fluorídrico a 40% por 24 horas para remoção dos silicatos e novamente tratadas com ácido fluorídrico a 37% por 3 horas para remoção dos cristais de fluoretos recém formados. Entre cada passo da acidificação, as amostras foram lavadas com água filtrada até que o pH da água da lavagem fosse neutro (pH= 7,0). Após estes passos, acidificação-neutralização, os resíduos foram transferidos para tubos de centrífuga e deu-se início a etapa de separação dos componentes orgânicos dos inorgânicos por flotação, utilizando-se um líquido de densidade intermediária, ZnCl2 (ρ=1,9 a 2 g/cm3).
Após a obtenção do sobrenadante (componentes orgânicos), este foi transferido para outro tubo de centrífuga. Foram adicionas neste tubo algumas gotas de HCl (10%) e o volume foi completado com água destilada. Centrifugou-se por 3 minutos (a 1500 rpm) e descartou-Centrifugou-se o sobrenadante. Este procedimento foi repetido até que o material estivesse completamente neutralizado.
Completada a etapa de neutralização, o resíduo orgânico foi transferido para um frasco com tampa, devidamente identificado e seguiu para preparação das lâminas organopalinológicas utilizando-se lâminas de vidro (24x76 mm), lamínulas (24x24 mm) e Entellan-Merck (resina a base de xileno). A montagem das lâminas iniciou-se com a colocação de lamínulas sobre uma chapa aquecida entre 40ºC e 50ºC. Colocou-se sobre uma das lamínulas uma gota do resíduo orgânico e na outra uma gota do resíduo orgânico previamente peneirado em peneira de malha de poliéster de 10μm juntamente com algumas gotas de água destilada para espalhar o material em ambas as lamínulas. Após a secagem as duas lamínulas foram coladas em uma mesma lâmina com Entellan-Merck.
Finalmente, após o processo de confecção das lâminas, estas seguiram para análise de luz branca transmitida e luz azul incidente (fluorescência), com a contagem dos componentes orgânicos particulados feita no material peneirado.
