UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

CLÁUDIO AFONSO PINHO LOPES

UTILIZAÇÃO DA BIOTÉCNICA DE MANIPULAÇÃO DE OÓCITOS

INCLUSOS EM FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS PARA A AVALIAÇÃO

IN VITRO DO POTENCIAL DE ANTICORPOS ANTI-ZONA

PELÚCIDA PARA A IMUNOESTERILIZAÇÃO DE CADELAS

FORTALEZA-CE

2008

UTILIZAÇÃO DA BIOTÉCNICA DE MANIPULAÇÃO DE OÓCITOS

INCLUSOS EM FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS PARA A AVALIAÇÃO

IN VITRO DO POTENCIAL DE ANTICORPOS ANTI-ZONA

PELÚCIDA PARA A IMUNOESTERILIZAÇÃO DE CADELAS

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da

Faculdade de Veterinária da Universidade

Estadual do Ceará, como requisito parcial para a

obtenção do título de Doutor em Ciências

Veterinárias.

Área de Concentração: Reprodução e Sanidade

Animal.

Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de

carnívoros, onívoros, herbívoros e aves.

Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo

FORTALEZA-CE

2008

UTILIZAÇÃO DA BIOTÉCNICA DE MANIPULAÇÃO DE OÓCITOS

INCLUSOS EM FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS PARA A AVALIAÇÃO

IN VITRO DO POTENCIAL DE ANTICORPOS ANTI-ZONA

PELÚCIDA PARA A IMUNOESTERILIZAÇÃO DE CADELAS

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da

Faculdade de Veterinária da Universidade

Estadual do Ceará, como requisito parcial para a

obtenção do título de Doutor em Ciências

Veterinárias.

Aprovada em: _22_/_12_/_2008_

Conceito: Satisfatório “Com Louvor”

Nota: 10 (Dez)

Banca Examinadora

_________________________________

Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo

Orientador – UECE

_______________________________

_______________________________

Profa. Dra. Maria Denise Lopes Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva

Examinadora-UNESP Examinadora-UECE

________________________________ ______________________________

Prof. Dr. Claudio Cabral Campello

Prof. Dr. José Roberto Viana Silva

Examinador-UECE Examinador-UFC

Aos animais

DEDICO

Agradeço à Universidade Estadual do Ceará (UECE) por toda a formação

profissional de qualidade proporcionada nos últimos doze anos, que culmina neste

momento com a conclusão do curso de doutorado em Ciências Veterinárias.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

pela bolsa de estudos para a realização do curso de doutorado, que foi muito importante

para o êxito deste trabalho.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

bolsa para a realização de treinamento e estudos no exterior, que possibilitaram um

importante aprimoramento desta tese, além do incremento de minha qualificação e

experiência profissionais.

À Universidade de Brasília (UnB, Instituto de Biologia, Laboratório de

Microscopia Eletrônica) e ao Leibniz Institute for Zoo and Wildlife Research (IZW,

Berlim, Alemanha), pela oportunidade de treinamento e de realização de estudos.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

(PPGCV) pelos ensinamentos e apoio prestados. Aos funcionários do PPGCV, e, em

especial, às secretárias Adriana Albuquerque e Cristina Sabóia do Nascimento, por toda

assistência sempre provida com atenção e cordialidade.

Agradeço a Deus pelo amor, força e orientação para prosseguir durante esta

jornada que se encerra e naquelas que estão por vir.

Aos meus amados pais Francisco Heine Maia Lopes e Suely Pinho Lopes por

todo o amor e dedicação sempre fundamentais.

À minha amada irmã Cláudia Valéria Pinho Lopes pelo amor, amizade,

orientação e alegria.

Ao meu querido orientador e amigo Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo por

todos os ensinamentos, pela confiança, pela atenção, pela compreensão, pelo apoio

incondicional, pela amizade, pelo exemplo de pesquisador competente e pessoa íntegra.

Aos Professores Dra. Sônia Nair Báo, Dra. Katarina Jewgenow e Dr. Claudio

Cabral Campello, pelos valiosos ensinamentos, pela confiança, pelo apoio e pela

amizade.

Aos Professores Dra. Maria Denise Lopes, Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva

e Dr. José Roberto Viana Silva, por terem gentilmente aceito o convite para aprimorar

com sua competência este trabalho.

Juliana Jalles de Holanda Celestino, Dra. Maria Helena Tavares de Matos, Márcia

Viviane Alves Saraiva, Ana Kelen Felipe Lima, Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues,

Anelise Maria Costa Vasconcelos Alves, Mônica Aline Parente Melo, Fabrício de Sousa

Martins, Guilherme Ferreira de Sousa Meneses, Karla Daniely dos Santos Bastos, José

Erisvaldo Maia Júnior, Isabel Bezerra Lima-Verde, Dra. Liliam Mara Trevisan Tavares

e Jamily Bezerra Bruno.

Aos companheiros do Laboratório de Microscopia Eletrônica da UnB, Victor

Hugo da Silva Tibúrcio, Bruno Fiorillo, Bruno Arrivabene Cordeiro, Shélida Braz

Vasconcelos, Carolina Aquino Luque, Leonora Tavares Bastos, João Victor, Larissa

Cunha, Suzi, Elaine Porfírio, Débora, Khesller Name e Wellington.

Aos companheiros do IZW, Romy Waurich, Maxi Pöschmann, Birgit Bieber,

Karin Müller, Christiane Franz, Sigrid Holz, Jennifer Ringleb, Mirja Faβbender, Ulrike

Jakop, Sebastian Waldau, Antje Frank, Katrin Paschmionka, Marlies Rohleder, Beate

Braun, Yuyu Niu, Yvonne Meyer-Lucht, Aines Castro-Prieto, Rafael Prieto, Fabiano

Fernandes, Francisca Robles, Jan Axtner, Nina Schwensow, Jennifer Schön, Alexandra

Weyrich, Roland Frey, Simone Sommer, Joseph Saragusty, Heribert Hofer, Silke Ehle,

Beate Peters-Mergner, Wolfgang Richter, Steven Seet, Arne Ludwig, Wolfgang Tauche

e Steffen Berthold.

A todos que não foram aqui mencionados, mas que, direta ou indiretamente,

contribuíram para a realização deste trabalho.

O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de anticorpos anti-zona pelúcida para a

imunoesterilização de cães, através da análise da capacidade de antisoro produzido por

imunização de coelhos com zona pelúcida porcina (pZP) de promover a atresia de

folículos pré-antrais (FOPA). Para este propósito, utilizou-se a biotécnica de

manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais para se estabelecer um modelo

experimental in vitro, compreendendo métodos de preservação e cultivo in vitro de

FOPA caninos. Na Fase I, avaliaram-se os efeitos da temperatura (4, 20 ou 38°C), meio

(salina fisiológica ou Meio Essencial Mínimo – MEM) e tempo (2, 6, 12 ou 24 h) de

armazenamento sobre a morfologia e viabilidade folicular. As técnicas de histologia

clássica e microscopia eletrônica de transmissão, e a análise de viabilidade utilizando-se

Azul de Tripan e marcadores fluorescentes (calceína-AM e etídio homodímero-1) foram

utilizadas para essa finalidade. O uso de MEM a 4ºC apresentou-se como o método

mais eficiente, possibilitando a preservação de percentuais de folículos viáveis com

ultraestrutura íntegra similares ao controle fresco por até 12 h. Na Fase II, avaliou-se a

eficiência dos crioprotetores dimetil sulfóxido, etileno glicol, glicerol e 1,3-propanodiol

para a criopreservação de FOPA caninos através de congelação lenta. Observou-se que

o dimetil sulfóxido (DMSO) na concentração de 1,5 M possibilitou a preservação dos

maiores percentuais de FOPA viáveis e com ultra-estrutura intacta após a

descongelação. Na fase III, avaliou-se o efeito de soro anti-pZP sobre a viabilidade de

FOPA caninos cultivados in vitro durante 24 h, e também sobre a ligação de

espermatozóides caninos a óocitos homólogos. Utilizaram-se FOPA frescos ou

criopreservados com 1,5 M DMSO, que apresentaram resultados similares. Observou-se

que a adição de 10% de soro anti-pZP ao meio de cultivo não teve efeito sobre folículos

com diâmetro inferior a 100 µm em relação aos controles (ausência de soro ou adição de

10% de soro pré-imune). Entretanto, o soro anti-pZP causou a atresia de FOPA com

diâmetros superiores a 100 µm, conforme avaliado com calceína-AM e etídio

homodímero-1. Este soro a 10% mostrou-se capaz também de inibir a ligação de

espermatozóides à zona pelúcida canina. Desta forma, demonstrou-se in vitro o

potencial do soro anti-pZP para a imunoesterilização (através da eliminação de FOPA) e

para a imunocontracepção (através do bloqueio da ligação de espermatozóides aos

oócitos) de cães.

The aim of this study was do evaluate the potential of anti-zona pellucida antibodies for

immunosterilization in dogs, through analyzing the capability of anti-porcine zona

pellucida (pZP) antibodies to cause atresia of preantral follicles (PF). For this purpose,

the biotechnique of manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles was

employed to establish an in vitro experimental model, comprising preservation and in

vitro culture methods for canine PF. In Phase I, the effects of storage temperature (4, 20

ou 38°C), medium (saline solution or Minimum Essential Medium – MEM) and time (2,

6, 12 ou 24 h) on follicular morphology and viability were evaluated. Classical

Histology and transmission electron microscopy, and viability analysis using Trypan

Blue and fluorescent labels (calcein-AM and ethidium homodimer-1) were used.

Storage in MEM at 4ºC was the most efficient method, which enabled preservation of

the percentages of viable follicles with intact ultrastructure similar to the fresh control

for up to 12 h. In Phase II, the efficiency of the cryoprotectants dimethyl sulfoxide,

ethylene glycol, glycerol and 1,2-propanediol for the cryopreservation of canine PF

through slow freezing was assessed. It was observed that dimethyl sulfoxide (DMSO) at

1.5 M provided the preservation of the highest percentages of viable PF with intact

ultrastructure after thawing. In phase III, the effects of anti-pZP serum on viability of

canine PF cultured in vitro for 24 h, and also on canine sperm binding to homologous

oocytes was evaluated. Fresh PF as well as PF cryopreserved in 1.5 M DMSO were

used and results between then were similar. Supplementation of culture medium with

10% anti-pZP serum had no effect on follicles smaller than 100 µm as compared to

controls (absence of serum or supplementation with pre-immune serum). However,

anti-pZP serum led PF with diameter larger than 100 µm to degenerate, as detected using

calcein-AM and ethidium homodimer-1. Anti-pZP serum also blocked sperm binding to

canine ZP. In conclusion, it was demonstrated in vitro the potential of anti-pZP serum

for immunosterilization (through induction of atresia to PF) and for

immunocontraception (through sperm binding blocking) in dogs.

Keywords: Immunocontraception. Zona pellucida. Preantral follicles. Dogs.

Capítulo I

Figura 1. Esquema representativo do processo reprodutivo.

43

Capítulo II

Figura 1.

Design of experiment I.

63

Figura 2.

Histological features of stored canine ovarian fragments.

67

Figura 3.

Effects of medium, temperature and time of storage on the

percentages of morphologically normal canine preantral

follicles. 68

Figura 4.

Electron micrographs of normal follicles from control group and

stored in MEM at 4°C for 12 h.

70

Figura 5.

Ultrastructure of follicles stored in MEM at 4°C for 24 h.

71

Figura 6.

Electron micrographs of follicles stored in saline solution at 4°C

for 24 h.

72

Figura 7.

Viability assessment of canine preantral follicles using trypan

blue dye exclusion test.

73

Figura

8.

Viability assessment of canine preantral follicles using

fluorescent probes.

76

Figura 9.

Percentages of viable canine preantral follicles in fresh ovaries

and after storage in MEM at 4ºC for 12 h or 24 h as assessed by

trypan blue dye exclusion test and labeling with calcein-AM and

ethidium homodimer.

77

Capítulo III

Figura 1.

Percentages of morphologically normal preantral follicles in

ovarian tissue before (control) and after exposure and

freezing-thawing tests in medium containing 1.5 M EG or GLY.

90

Figura 2.

Electron micrographs of canine preantral follicles from control

Figura 1.

Histological features of canine ovarian fragments before and

after freezing-thawing with 1.5 M DMSO or PROH.

108

Figura 2.

Percentages of morphologically normal preantral follicles in

ovarian tissue before (fresh control) and after exposure and

freezing-thawing tests in medium containing 1.5 M DMSO or

PROH or without cryoprotectants (exposure and freezing

controls). 109

Figura 3.

Electron micrographs of canine preantral follicles from control

and frozen-thawed using 1.5 M DMSO or PROH.

111

Figura

4.

Viability assessment of canine preantral follicles using

fluorescent probes.

113

Figura 5.

Percentages of viable canine preantral follicles in fresh ovaries

and after exposure and freezing-thawing using 1.5 M DMSO as

assessed by trypan blue dye exclusion test and labeling with

calcein-AM and ethidium homodimer.

114

Capítulo V

Figura 1.

Percentages of viable canine preantral follicles before (fresh

control time 0 h) and after in vitro culture for 24 h with in

medium containing no serum or 10% pre-immune serum

(control) or anti-pZP.

128

Figura

2. Viability evaluation of canine preantral follicles using

fluorescent probes.

129

Figura 3.

Assessment of anti-pZP antibodies ability to inhibit canine

oocyte-sperm interaction.

130

Figura 4.

Assessment of the contraceptive efficiency of anti-porcine zona

pellucida (pZP) antibodies in dogs using an in vitro test for

Capítulo II

Tabela 1.

Percentages (viable/total) of viable canine preantral follicles in

control and after storage.

74

Capítulo III

Tabela 1.

Degenerated preantral follicles (%) in control and after exposure

and freezing-thawing tests.

91

Capítulo IV

Tabela 1.

Percentages of viable follicles in the fresh control and after

exposure to cryoprotectants and slow freezing-thawing as

A Antro

ANOVA

Analysis of variance (Análise de variância)

ATP

Adenosina

trifosfato

bm

basement membrane (membrana basal)

BrdU

Bromo-deoxiuridina

BSA

Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina)

CAPES

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CCZ

Centro de Controle de Zoonoses

CG

Células da granulosa

CGP

Células germinativas primordiais

CNPq

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

CT

Células

da

teca

DMSO

Dimetilsulfóxido

DNA

Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucléico)

EG

Etilenoglicol

er

endoplasmic reticulum (retículo endoplasmático)

FOPA

Folículo ovariano pré-antral

FSH

Follicle stimulating hormone (Hormônio folículo estimulante)

GC

Granulosa

cells

(Células da granulosa)

GLY

Glycerol

(glicerol)

GnRH

Gonadotrophin releasing hormone

h Horas

HC

Histologia

clássica

HE

Hematoxilina-eosina

ICC

Instituto Central de Ciências

IVM

in vitro maturation (maturação in vitro)

IZW

Institut for Zoo and Wildlife Reseach

l Lipid

droplet

(gota lipídica)

L Litro

LAMOFOPA Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos

Pré-Antrais

MEM

Meio essencial mínimo

mL

Mililitro

mM

Milimolar

MNPF

Morphologically normal preantral follicles (Folículos pré-antrais

morfologicamente

normais)

MOIFOPA Manipulação

de

oócitos inclusos em folículos pré-antrais

mRNA

Ácido ribonucléico mensageiro

n

número de amostras

NUBIS

Núcleo de Biotecnologia de Sobral

PAS

Periodic Acid Schiff (Ácido periódico de Schiff)

PBS

Phosphate-buffered saline (Salina tamponada com fosfato)

PROH

1,2-Propanediol (1,2-Propanodiol)

pZP

Zona pelúcida porcina

OMS

Organização Mundial da Saúde

RT

Room temperature (temperatura ambiente)

sc

stromal cells (células do estroma)

SEM

Standard error of the mean (Erro padrão da média)

SNK

Student-Newman-Keuls

TB

Trypan Blue (Azul de Tripan)

TEM

Transmission

Electron

Microscopy (Microscopia Eletrônica de

Transmissão)

UECE

Universidade Estadual do Ceará

UFC

Universidade Federal do Ceará

UnB

Universidade de Brasília

v Vesicles

(vesículas)

ZP

Zona pellucida (Zona pelúcida)

μg Micrograma

μL

Microlitro

μm

Micrômetro

μM

Micromolar

ºC Graus

Celsius

1. INTRODUÇÃO

16

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 A superpopulação de cães

18

2.2 Contracepção para cadelas

19

2.3 Imunocontracepção

20

2.4 Ovário mamífero

23

2.5 Oogênese e foliculogênese

23

2.6 População folicular ovariana

24

2.7 A biotécnica de MOIFOPA

25

2.8 Preservação de FOPA durante o transporte de ovários

26

2.9 Criopreservação

27

2.10 Cultivo in vitro de folículos ovarianos

32

3. JUSTIFICATIVA

35

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS

37

5. OBJETIVOS

38

6. CAPÍTULO I

39

Imunocontracepção em mamíferos com ênfase no controle populacional de

cães

7. CAPÍTULO II

58

Preservação de folículos pré-antrais caninos por períodos curtos: efeitos da

temperatura, meio e tempo

8. CAPÍTULO III

83

Criopreservação de folículos pré-antrais caninos utilizando-se etilenoglicol e

glicerol

9. CAPÍTULO IV

99

Criopreservação bem-sucedida de folículos pré-antrais caninos utilizando-se

dimetil sulfóxido e 1,3-propanodiol

efeitos sobre folículos pré-antrais in vitro

11. CONCLUSÕES

138

12. PERSPECTIVAS

139

1 INTRODUÇÃO

A superpopulação de cães constitui um grave problema em diversas cidades do

mundo, caracterizado pela existência de grandes conjuntos de animais sem

responsáveis, que podem compor um importante reservatório de zoonoses. Neste

contexto, as autoridades sanitárias realizam a eliminação sistemática destes animais

como estratégia de controle populacional. Todos os anos, esta situação resulta na

eutanásia de milhões de animais sadios, além do dispêndio de um elevado volume de

recursos econômicos estimados na ordem de bilhões de dólares (Frank e Carlisle-Frank,

2007). Esta abordagem, no entanto, é estritamente paliativa, por não atuar sobre a

origem do problema, que consiste em elevadas taxas de natalidade dos cães. Além

disso, a eliminação dos animais sem responsáveis, associada à sua má qualidade de

vida, faz emergirem questões éticas de bem-estar animal, que definem a necessidade de

novas estratégias de ação. Assim, um sistema de controle populacional para cães, para

ser efetivo, racional e humanitário, deve basear-se no controle de natalidade.

Apesar dos esforços despendidos nos últimos anos para o desenvolvimento de

métodos farmacológicos e químicos para a esterilização cães, as técnicas cirúrgicas têm

se mantido como os principais procedimentos para este propósito (Howe, 2006).

Entretanto, estes métodos demandam muito tempo e possuem alto custo financeiro para

aplicação em escala populacional (Kutzler e Wood, 2006), sendo assim logística e

economicamente inviáveis para uso em populações caninas numerosas, como no caso

das metrópoles.

Uma nova abordagem para o desenvolvimento de métodos contraceptivos,

denominada imunocontracepção, surge como uma importante perspectiva para o

controle reprodutivo canino em larga escala. Esta modalidade contraceptiva tem como

princípio induzir o sistema imunológico à síntese de anticorpos específicos para

moléculas bioativas do aparelho reprodutor que, uma vez revestidas por tais anticorpos,

têm sua função cessada, interrompendo-se assim o processo reprodutivo. Em

determinadas situações, pode ocorrer a eliminação da população de células germinativas

e conseqüente esterilidade, denominando-se este processo imunoesterilização.

Estudos têm demonstrado que a vacinação com proteínas da zona pelúcida (ZP),

estrutura que circunda os óocitos, resulta em infertilidade prolongada em diversas

espécies de mamíferos. Sugere-se que este efeito decorre do bloqueio da ZP à ligação de

espermatozóides pelos anticorpos produzidos. A resposta imunológica aos antígenos da

ZP pode ainda causar a eliminação dos oócitos (Ringleb et al., 2004).

Nesta tese, foi avaliado o potencial de anticorpos anti-ZP para a

imunoesterilização de cadelas, através da análise da capacidade de um antisoro

produzido por imunização de coelhos com ZP porcina (pZP) para promover a atresia de

folículos pré-antrais caninos. Para este propósito, a biotécnica de manipulação de

oócitos inclusos em folículos pré-antrais (MOIFOPA) foi utilizada para se estabelecer

um modelo experimental in vitro. Uma vez que os trabalhos relacionados ao uso desta

técnica em cães são bastante escassos e limitados à avaliação de métodos de maturação,

avaliaram-se neste estudo protocolos de preservação de folículos pré-antrais caninos

durante o período compreendido entre a coleta dos ovários e o uso no laboratório, além

da criopreservação utilizando-se diferentes crioprotetores para o armazenamento de

folículos a longo prazo. Por último, os folículos preservados pelos métodos

estabelecidos neste trabalho foram cultivados in vitro para a avaliação dos efeitos dos

anticorpos anti-ZP.

Para uma melhor compreensão dos estudos realizados nesta tese, segue-se uma

revisão de literatura abordando diversos temas relacionados à superpopulação de cães, à

imunocontracepção e à biotécnica de MOIFOPA.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 A superpopulação de cães

A domesticação do cão ocorreu, segundo estudos arqueológicos, na Eurásia, há

cerca de 14.000 anos. Canídeos selvagens passaram a adentrar a área dos acampamentos

humanos, para se alimentarem com sobras de comida, o que fez com que

estabelecessem, paulatinamente, um convívio harmonioso com o homem. Em

contrapartida, esses animais passaram a auxiliar na defesa dessas comunidades e na

caça. Este vínculo de lealdade fora rompido unilateralmente pelo homem quando, tendo

adotado o padrão urbano de assentamento, passou a permitir a reprodução deliberada de

seus cães, não assumindo a responsabilidade pela vida dos animais das numerosas

ninhadas, que são abandonados nas ruas (World Society for the Protection of the

Animals, 1999).

2.1.1 Dinâmica da população de cães

O conjunto de cães sem responsáveis que vivem nos espaços públicos constitui

um importante reservatório de zoonoses, o que leva as autoridades de saúde a realizarem

a eliminação sistemática destes animais. Entretanto, de acordo com a Organização

Mundial da Saúde (OMS), não existe nenhuma prova de que a eliminação de cães possa

gerar um impacto significativo sobre as densidades populacionais desses animais

(World Health Organization, 1992). Assim, os sistemas de controle populacional de

cães baseados em apreensão sistemática e eutanásia em grande escala têm sido adotados

em várias partes do mundo erroneamente, em função do desconhecimento sobre a

composição e a dinâmica da população canina (World Health Organization, 1990).

Qualquer redução no tamanho da população canina, resultante do aumento da

taxa de mortalidade, é rapidamente compensada pelo aumento da taxa de sobrevivência

das frações remanescentes, que terão melhor acesso aos recursos ambientais disponíveis

(Wandeler et al., 1988). Além disso, a taxa de reposição de animais sobrepõe facilmente

a taxa de eliminação, sendo que, em relação a esta, a mais elevada registrada até hoje é

de aproximadamente 15% da população canina (World Health Organization, 1992).

As populações de cães errantes são mantidas a partir dos filhotes em excesso dos

animais domiciliados (que possuem elevadas taxas de sobrevivência, por receberem

abrigo e alimento antes de serem abandonados às ruas), e não pelas proles dos próprios

animais errantes, que apresentam taxas de sobrevivência muito reduzidas (Wandeler et

al., 1988). Desta forma, um sistema de controle populacional de cães, para ser efetivo,

deve basear-se na contenção da natalidade, através de programas de controle

reprodutivo.

Modelos matemáticos de dinâmica populacional demonstram que, para espécies

que se reproduzem através de sistemas poligâmicos de acasalamento, como a canina e a

felina, o controle da reprodução de 65% das fêmeas pode permitir a estabilização de

uma determinada população. Por outro lado, a contracepção direcionada aos machos

deve abranger mais de 95% desses animais para que se obtenha o mesmo efeito, o que é

inviável em termos práticos (Jewgenow et al., 2006). Neste contexto, sistemas de

manejo demográfico para cães devem ter como foco o controle reprodutivo das fêmeas.

2.2 Contracepção para cadelas

Os métodos contraceptivos atualmente disponíveis para o controle reprodutivo

canino não são adequados para utilização em escala populacional por razões

econômicas, operacionais, culturais e/ou de segurança.

O confinamento de cadelas durante o estro é considerado um método bastante

satisfatório, por sua simplicidade e por não envolver custo algum. Contudo, em várias

localidades, sua aplicação é dificultada por questões culturais, não se podendo contar

com a cooperação efetiva das comunidades, sobretudo as de baixa renda (World Health

Organization, 1992). Durante a execução de um programa de controle populacional de

cães e gatos realizado em vilas rurais do noroeste do Estado do Paraná, observou-se a

existência de um contigente substancial de pessoas que demonstraram pouca

preocupação com o controle reprodutivo de seus animais. Cerca de um terço dos

proprietários de animais de companhia dessas localidades não aderiu ao projeto, o que

sugere que a consciência acerca da importância da posse responsável depende do nível

educacional da comunidade (Molento et al., 2005).

O controle reprodutivo de cadelas pode ser realizado também através de métodos

farmacológicos. O uso de progestágenos, dentre os quais se destacam o megestrol, a

medroxiprogesterona e a proligestona, é o recurso mais utilizado. Estes compostos

consistem em esteróides sintéticos, que atuam através de retroalimentação negativa

sobre a secreção do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) e controle da

liberação das gonadotrofinas pela hipófise, com supressão da esteroidogênese e da

gametogênese (Rodrigues e Rodrigues, 2005). Diversos efeitos adversos têm sido

associados à utilização prolongada de progestágenos. A ocorrência de neoplasias

mamárias, alterações clínico-patológicas características de diabetes mellitus e letargia

foi reportada em cadelas após o uso de megestrol. Por sua vez, uma elevada incidência

de hiperplasia endometrial cística e supressão adrenocortical têm sido relatada em

conseqüência do tratamento com medroxiprogesterona (Kutzler e Wood, 2006). Selman

et al. (1995) descreveram alterações histopatológicas em diversos órgãos de cadelas

tratadas com proligestona, sendo notáveis a atrofia do córtex da glândula adrenal,

tumores mamários e vacuolização das células das ilhotas de Langerhans. Além disso,

Selman et al. (1996) demonstraram a afinidade da proligestona com receptores de

glicocorticóides, o que pode resultar em supressão do eixo

hipotalâmico-hiposifário-adrenocortical e resistência à insulina.

A esterilização cirúrgica de cadelas, comumente realizada através de

ovariohisterectomia, possui um custo financeiro elevado e demanda muito tempo, sendo

assim inadequada em termos operacionais para a aplicação em populações caninas

muito numerosas (Kutzler e Wood, 2006). Ademais, complicações pós-operatórias

como hemorragia, piometra e/ou granuloma do coto, fistulações, adesões peritoniais e

incontinência urinária têm sido relatadas, embora sejam facilmente prevenidas por uma

técnica cirúrgica realizada com rigor (Howe, 2006). Apesar de seu limitado potencial

para a redução das taxas de natalidade caninas, este método ainda se constitui na melhor

alternativa para o controle da reprodução de cães.

Neste contexto, faz-se urgente o desenvolvimento de agentes esterilizantes

inócuos injetáveis, para que seja possível o controle reprodutivo de cães de modo

efetivo (World Health Organization, 1992).

2.3 Imunocontracepção

A imunocontracepção consiste em induzir o sistema imunológico a neutralizar

elementos de importância estrutural e funcional envolvidos na reprodução. Antígenos

presentes na superfície dos espermatozóides, as proteínas da ZP, as gonadotrofinas

(FSH e LH), seus receptores específicos e seu hormônio liberador (GnRH) têm sido

utilizados como alvos para a elaboração de vacinas contraceptivas para carnívoros.

Atualmente, os melhores resultados têm sido obtidos através de imunização com ZP,

que tem se mostrado capaz de promover contracepção por longos períodos em diversas

espécies (Jewgenow et al., 2006).

A ZP consiste em uma matriz glicoprotéica extracelular que circunda os oócitos

de mamíferos e desempenha funções fundamentais no processo de fecundação através

da regulação da ligação de espermatozóides, indução da reação acrossômica e do

bloqueio à polispermia (Wassarman, 2008). Ao microscópio eletrônico, a ZP é vista

como uma rede entrelaçada com fenestrações, apresentando uma camada interna

compacta com pequenos poros, e uma camada externa frouxamente arranjada com

grandes poros (Greve e Wassarman, 1989).

A vacinação ativa com proteínas da ZP suprime a fertilidade em diversas

espécies por interferência na interação oócito-espermatozóides durante a fecundação,

além de afetar a população de folículos ovarianos em crescimento (Ringleb et al., 2004).

Diversos estudos têm demonstrado a ocorrência de alterações patológicas em folículos

após a vacinação com antígenos da ZP, sendo encontradas evidências que indicam o

envolvimento da resposta imunológica celular nesses processos (Millar et al., 1989;

Rhim et al.,1992; Lou and Tung, 1993; Jackson et al., 1998; Lou et al. 2000). Millar et

al. (1989), utilizando um anticorpo monoclonal para a ZP3 murina (mZP3) com

reconhecida capacidade de bloquear a fecundação, identificou uma seqüência de sete

aminoácidos na referida proteína, que consistiria de um epítopo para linfócitos B, e o

testou como antígeno imunocontraceptivo. Um peptídeo de 16 aminoácidos

incorporando a referida seqüência foi sintetizado e utilizado para imunizar ativamente

fêmeas de camundongo. Os anticorpos produzidos determinaram contracepção

duradoura na ausência de histopatologia do ovário e citotoxicidade celular. Estes autores

sugeriram que tais resultados deviam-se à ausência de epítopos para linfócitos T na

referida seqüência.

A redução do número de folículos primordiais após imunização ativa contra uma

das glicoproteínas zonárias (ZP3) é uma consequência comum (Aitken, 2002). Apesar

dos diversos indícios de mecanismos imunológicos celulares para a patogênese das

alterações de folículos ovarianos, em nenhum dos estudos em que foi verificada

depleção de folículos primordiais, observou-se a infiltração de linfócitos T (Kerr et al.,

1998). Uma explicação para esse fenômeno consiste no recrutamento acelerado de tais

folículos para compor a população de folículos em crescimento que é eliminada devido

à ação de anticorpos anti-ZP (Skinner et al., 1984). Alternativamente, sugere-se que

uma proporção significativa de folículos primordiais expressa a proteína ZP3, sendo

destruídos por anticorpos anti-ZP por fixação de complemento (Grootenhuis et al.,

1996). Gwatkin et al. (1977) localizaram anticorpos e complemento na ZP de oócitos de

camundongo inférteis imunizados com ZP de hamster. Outro possível mecanismo pode

consistir da interrupção da comunicação entre oócitos e células da granulosa via junções

do tipo ‘gap’ obstruídas por grandes quantidades de anticorpos anti-ZP aderidos (

Mahi-Brown et al., 1988).

Barber et al. (2001) demonstraram através de imunohistoquímica ultra-estrutural

que anticorpos anti-ZP são capazes de se ligar a proteínas zonárias presentes no

aparelho de golgi de oócitos caninos em folículos pré-antrais. Além disso, a expressão

da proteína codificada pelo gene ZPA foi detectada no citoplasma de oócitos caninos

inclusos em folículos primordiais, enquanto em folículos primários e secundários foi

observada a transcrição de mRNA a partir dos genes ZPA, ZPB e ZPC (Blackmore et

al., 2004). Um padrão semelhante de expressão de proteínas da ZP foi descrito por

Jewgenow e Fickel (1999) em felinos. Assim, nestas duas espécies de carnívoros, os

mecanismos descritos acima para eliminação de folículos primordiais podem se

processar, estabelecendo-se assim o potencial de anticorpos anti-ZP para a

imunoesterilização desses animais.

Na maioria dos estudos sobre imunocontracepção baseada na ZP, as

glicoproteínas da pZP têm sido utilizadas devido à sua alta disponibilidade em

matadouros e ao elevado grau de homologia com as proteínas da ZP de diversas

espécies mamíferas, o que garante a reatividade cruzada dos anticorpos produzidas com

a ZP nativa (Niu et al., 2006).

Até o presente, o estudo da ação de anticorpos anti-ZP sobre oócitos tem sido

realizado utilizando-se apenas modelos experimentais in vivo. Entretanto, o uso de um

sistema de cultivo in vitro de folículos ovarianos pode proporcionar uma análise mais

precisa do processo de eliminação dos referidos gametas. Neste contexto, a biotécnica

MOIFOPA pode prover os métodos necessários ao desenvolvimento de um modelo

experimental in vitro para este propósito.

No capítulo I, constituído por um artigo de revisão de literatura sobre métodos

imunocontraceptivos, mais informações detalhadas acerca desta estratégia de

contracepção podem ser obtidas.

2.4 Ovário mamífero

O ovário mamífero é composto

por muitos tipos de células diferenciadas, que

trabalham em conjunto promovendo um ambiente ideal para o desempenho de suas

funções endócrinas e gametogênica (Bristol-Gould e Woodruff, 2006). O ovário é

constituído por duas regiões: cortical e medular. O córtex ovariano, localizado na parte

mais externa, é circundado pelo epitélio germinal e corresponde à região funcional do

órgão, sendo formado por tecido conectivo (fibroblastos, colágeno e fibras reticulares),

folículos ovarianos e corpos lúteos em vários estádios de desenvolvimento ou em

regressão (Liu et al., 2006). A região medular, localizada mais internamente, é

constituída por tecido conjuntivo, células musculares lisas, nervos, vasos sanguíneos e

linfáticos responsáveis pela nutrição e estruturação do ovário (Hafez, 1996).

2.5 Oogênese e foliculogênese

A oogênese consiste na formação e diferenciação do gameta feminino que se

desenvolve em várias fases e tem início na vida fetal com as células germinativas

primordiais (CGP) e culmina com a formação do oócito haplóide fecundado

(Bristol-Gould e Woodruff, 2006). Em mamíferos, nos estádios iniciais do desenvolvimento

ovariano, ocorre a migração das células germinativas primordiais (CGP) do saco

vitelínico para a gônada primitiva com sua posterior colonização (Eppig et al., 2004).

Imediatamente após a diferenciação das gônadas, ocorre a transformação das CGP em

oogônias mitoticamente ativas e, então, em oócitos primários (Suh et al., 2002). Em

seguida, uma camada de células somáticas planas conhecidas como células da

pré-granulosa, originárias do epitélio celômico, circundam os oócitos primários formando

os folículos primordiais (Magoffin, 2005), iniciando assim a foliculogênese. Após a

formação dos folículos primordiais, as células da pré-granulosa param de se multiplicar

e entram num período de quiescência. Os oócitos primários inclusos nesses folículos

encontram-se na fase de prófase I da meiose. A progressão da divisão meiótica ocorre

somente na puberdade, com a liberação do pico pré-ovulatório de FSH e LH, formação

dos oócitos secundários e outra parada da meiose na fase de metáfase II (Gordon, 1994).

A meiose será retomada novamente somente após a fecundação do oócito pelo

espermatozóide, originando o oócito haplóide fecundado e marcando o fim da oogênese

(Figueiredo et al., 2008).

Desta forma, aos processos de formação, crescimento e maturação folicular

dá-se o nome de foliculogênedá-se, que é iniciado com a formação do folículo primordial

culminando com o estádio de folículo pré-ovulatório (van den Hurk e Zhao, 2005). O

folículo ovariano é considerado a unidade funcional do ovário mamífero, cuja principal

função é proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e maturação do oócito

(Cortvrindt e Smitz, 2001). Durante a foliculogênese, a morfologia folicular é alterada,

uma vez que o oócito cresce e as células circundantes se diferenciam (Bristol-Gould e

Woodruff, 2006). De acordo com o grau de evolução, os folículos podem ser

classificados em folículos pré-antrais (primordiais, em transição, primários e

secundários) e antrais (terciários e pré-ovulatórios) (Silva et al., 2004). Vale ressaltar

que os folículos pré-antrais (FOPA) representam 90% da população folicular e são

responsáveis pela renovação contínua de folículos antrais no ovário

(Katska-Ksiazkiewicz, 2006).

2.6 População folicular ovariana

Em muitos mamíferos, a população folicular ovariana é estabelecida ainda na

vida intra-uterina (primatas e ruminantes – Knight e Glister, 2006) ou em um curto

período de tempo após o nascimento (roedores – Ojeda et al., 2000). Por outro lado,

recentes trabalhos têm demonstrado mecanismos envolvidos na formação de novas

células germinativas e folículos em mulheres (Bukovsky et al., 2004) e camundongas

adultas (Johnson et al., 2004). Esses autores demonstraram indícios da continuidade da

oogênese e foliculogênese no período pós-natal, pela atuação de células-tronco. Para

Bukovsky et al. (2004), a renovação folicular pós-natal ocorre regularmente em

mulheres, mas a origem das células-tronco para tal não seria a medula óssea, e sim

células germinativas presentes na superfície do epitélio ovariano. No entanto, devido

aos resultados controversos até o momento, mais trabalhos sobre esse assunto são

necessários para esclarecer esse fenômeno.

A população folicular difere entre as espécies, além de ser observada uma

grande variação individual (Katska-Ksiazkiewicz, 2006), sendo de aproximadamente

1.500 na camundonga (Shaw et al., 2000); 35.000 na cabra (Lucci et al., 1999); 114.000

na gata (Lima, 2006); 160.000 na ovelha (Amorim et al., 2000); 235.000 na vaca

(Betteridge et al., 1989) e aproximadamente 2.000.000 na mulher (Erickson, 1986). Ao

longo da vida do animal, ocorre uma redução ordenada do número de FOPA (Shaw et

al., 2000). Essa redução deve-se a dois fenômenos que ocorrem naturalmente no ovário,

a ovulação e a atresia ou morte folicular. Somente uma pequena parte (0,1%) dos

folículos primordiais chega à ovulação (Nuttinck et al., 1993), enquanto os demais

tornam-se atrésicos durante as fases de crescimento e maturação oocitária (Otala et al.,

2002).

2.7 A biotécnica de MOIFOPA

A disponibilidade de oócitos é um fator limitante no desenvolvimento de novas

técnicas reprodutivas (Smitz e Cortvrindt, 2002). Os métodos atuais para a produção in

vitro de embriões dependem de uma oferta escassa de oócitos competentes de grandes

folículos antrais ou pré-ovulatórios, que estão presentes no ovário em número

relativamente reduzido (Telfer, 1998). Sabe-se que os FOPA representam cerca de 90%

de toda a população folicular, armazenando assim a grande maioria dos oócitos

presentes em ovários mamíferos (Silva et al., 2003). Dessa forma, a possibilidade de

desenvolver sistemas in vitro que explorem o grande número de oócitos provenientes de

folículos imaturos de ovários mamíferos deve ser considerada, destacando-se portanto a

biotécnica de MOIFOPA.

A MOIFOPA é uma biotécnica da reprodução que vem sendo aprimorada nos

últimos tempos e consiste em uma das principais ferramentas utilizadas atualmente para

a elucidação da foliculogênese inicial. Tal biotécnica consiste no isolamento,

conservação (resfriamento e criopreservação) e/ou cultivo in vitro de FOPA, visando a

estocagem, ativação, crescimento e maturação in vitro do folículo primordial até o

estádio pré-ovulatório (Figueiredo et al., 2008), prevenindo-se, assim, a ocorrência da

atresia. Assim, no futuro, será possível obter, de um único ovário, milhares de FOPA

que, cultivados e submetidos a outras biotécnicas da reprodução como a fecundação in

vitro e a clonagem, viabilizarão a produção in vitro de um grande número de embriões.

Destes, um número de crias saudáveis significativamente maior do que aquele obtido

através da reprodução natural também poderá ser alcançado. Na medicina veterinária, o

principal objetivo é aumentar a produtividade de animais de alto valor genético, ou

mesmo a preservação de espécies ameaçadas de extinção.

A biotécnica de MOIFOPA também representa uma excelente alternativa para

incrementar e auxiliar no desenvolvimento de pesquisas relacionadas à indústria

farmacêutica (Figueiredo et al., 2008) e à imunoesterilização utilizando-se anticorpos

anti-ZP.

2.8 Preservação de FOPA durante o transporte de ovários

A preservação da viabilidade e da capacidade de desenvolvimento dos FOPA

durante o período compreendido entre a coleta dos ovários e seu uso no laboratório é

um fator crítico em decorrência da condição de isquemia. Para que isto seja possível,

mesmo após longos períodos de transporte, como ocorre nos casos em que os animais

doadores se encontram em regiões bastante afastadas dos laboratórios de manipulação,

alguns fatores essenciais para a sobrevivência das células devem ser levados em

consideração, tais como o meio, a temperatura e o tempo de preservação (Santos et al.,

2004).

Diferentes meios têm sido utilizados para a preservação de FOPA, podendo ser

citados: TCM 199 (Costa et al., 2005), solução salina 0,9% (Matos et al., 2004;

Celestino et al., 2008), solução salina tamponada com fosfato (PBS) - (Santos et al.,

2002), solução Braun-Collins (Carvalho et al., 2001), solução à base de água de coco

(Lucci et al., 2004a) e Meio Essencial Mínimo (MEM) – (Chaves et al., 2008). Métodos

para armazenamento de ovários por curtos períodos já foram desenvolvidos para

caprinos (Silva et al., 2000), ovinos (Andrade et al., 2002a,b; Matos et al., 2004) e

bovinos (Lucci et al., 2004a; Celestino et al., 2007). Nesses estudos, as temperaturas de

4, 20 e 39°C foram testadas para a preservação de FOPA. Em geral, a temperatura mais

eficiente é a de 4°C, permitindo a preservação da morfologia e capacidade de FOPA

suínos de crescer in vitro após períodos de armazenamento de até 18 h, enquanto a

20°C, isto foi possível por apenas 6 h (Lucci et al., 2007). Em caprinos, apenas

temperatura de 4ºC permitiu preservar, após 4 h de armazenamento, a qualidade de

FOPA inclusos em fragmentos de córtex ovariano, que, após cultivo in vitro por sete

dias, apresentaram percentuais de folículos morfologicamente normais similares ao

controle fresco (Chaves et al., 2008).

Durante o transporte dos ovários para o laboratório, a privação de oxigênio do

tecido resulta em uma mudança do metabolismo aeróbico para anaeróbico, sendo o

produto principal, o ácido láctico, acumulado dentro da célula causando redução do pH

(Wongsrikeao et al., 2005). Com a intenção de se minimizarem os efeitos deletérios da

isquemia, o estabelecimento de hipotermia provoca uma redução do metabolismo

celular e, assim, dos requerimentos de energia e nutrientes, aumentando a resistência de

folículos durante a preservação in vitro (Silva et al., 2003). A preservação de FOPA por

períodos indeterminados pode ser obtida, por sua vez, através da utilização de técnicas

eficientes de criopreservação (Santos, 2005).

2.9 Criopreservação

2.9.1 Princípios básicos

A criopreservação consiste em um método de preservação de material biológico

a baixas temperaturas, geralmente em nitrogênio líquido a –196°C, ou em sua fase de

vapor a -150°C. Os únicos estados físicos existentes abaixo de aproximadamente

-130°C são o cristalino e o vítreo e, em ambos, a viscosidade é muito elevada, a difusão

é considerada insignificante (dependendo do tempo de armazenamento), a energia

cinética molecular é muito baixa e reações metabólicas impulsionadas por energia

térmica ocorrem muito lentamente ou são paralisadas completamente (Kartha, 1985).

Portanto, à temperatura do nitrogênio líquido, a viabilidade durante o armazenamento

pode ser estendida por longos períodos de tempo, com manutenção da estabilidade do

material genético (Stushnoff e Seufferheld, 1995). Para a criopreservação, faz-se

necessária a utilização de um ou mais componentes que confiram proteção às células

durante a congelação, conhecidos como agentes crioprotetores (Mullen, 2007). A

capacidade do material biológico de sobreviver ao processo de criopreservação depende

de sua tolerância aos agentes crioprotetores, à desidratação, ao resfriamento e ao

re-aquecimento.

2.9.2 Agentes crioprotetores

Os agentes crioprotetores são componentes utilizados durante a congelação para

proteger as células contra os efeitos deletérios da desidratação, resfriamento e da

redução extrema de temperatura. O modo de ação dos agentes crioprotetores na célula

não é plenamente conhecido e isso se dá provavelmente devido aos inúmeros efeitos

deles na célula. Em geral, esses agentes podem agir (i) penetrando nas células

(crioprotetores intracelulares) e substituindo as moléculas de água, (ii) reduzindo o

ponto de congelação, (iii) protegendo membranas celulares por meio da sua ligação às

cabeças dos grupos fosfolipídicos, (iv) aumentando a viscosidade do meio, e/ou (v)

diminuindo a concentração de eletrólitos durante a criopreservação, e, assim, o risco de

danos osmóticos. Contudo, agentes crioprotetores podem ser tóxicos, bem como podem

facilitar a entrada de agentes tóxicos nas células (Mullen, 2007; Santos, 2007c).

Os agentes crioprotetores podem ser alcoóis, açúcares, amidas e grandes

polímeros, que atuam por diferentes mecanismos (Fuller, 2004; Acker, 2007), sendo

classificados como intra ou extracelulares. Crioprotetores intracelulares ou penetrantes

possuem baixo peso molecular e a capacidade de substituir a água intracelular. Como

exemplos, podem ser citados o glicerol (GLI), etilenoglicol (EG), dimetilsulfóxido

(DMSO) e propanodiol (PROH). Quando os crioprotetores são adicionados, a água

intracelular (solvente) deixa a célula e os crioprotetores penetrantes (soluto) a penetram,

interagindo com a membrana celular, estabilizando as proteínas intracelulares e

reduzindo o ponto de congelação. Estudos recentes demonstraram que o GLI, DMSO,

PROH e EG nas concentrações de 1,5 e 3,0 M foram utilizados com sucesso para a

criopreservação de tecido ovariano de caprinos (Rodrigues et al., 2004a,b) e ovinos

(Santos et al., 2006) previamente exposto a esses compostos a uma temperatura de 20°C

por um período de 20 minutos (período de equilíbrio).

O GLI tem sido usado largamente para a congelação de embriões bovinos devido

à sua baixa citotoxicidade. Entretanto, o GLI induz a severos danos no citoplasma

devido à baixa permeabilidade da membrana plasmática a esta substância (Széll et al.,

1986). Oócitos de camundongos isolados são menos permeáveis ao glicerol que ao

DMSO, PROH e EG (Paynter et al., 1997). A baixa permeabilidade das células ao GLI

aumenta o risco do estresse osmótico durante a descongelação e diluição, pois a entrada

de água na célula ocorre mais rapidamente do que a saída do GLI. Isso explica as baixas

taxas de sobrevivência e de maturação de oócitos criopreservados em GLI (Wani et al.,

2004).

Crioprotetores extracelulares ou não-penetrantes, entre eles os açúcares como a

sacarose e a trealose, e polissacarídeos como o ficol, agem otimizando o efeito dos

crioprotetores penetrantes. Utilizada com freqüência, a sacarose age como um tampão

osmótico contra o estresse causado durante a remoção dos crioprotetores intracelulares

(Mandelbaum et al., 1988). A sacarose pode ser utilizada com sucesso como

crioprotetor extracelular para folículos pré-antrais murinos, especialmente quando

combinada com EG (Salehnia et al., 2002). Ainda, a sacarose (0,1 M) associada ao

DMSO ou PROH mostrou-se eficiente para criopreservar o tecido ovariano bovino, fato

demonstrado pela integridade ultra-estrutural dos folículos pré-antrais criopreservados

(Lucci et al., 2004b).

Crioprotetores extracelulares, também conhecidos como agentes de alto peso

molecular, aumentam a viscosidade da solução (por exemplo, o polivinil álcool) ou se

ligam às cabeças dos grupos fosfolipídicos (açúcares, tais como sacarose e trealose),

protegendo as membranas celulares contra as injúrias do frio. Outra substância

comumente adicionada para melhorar a eficiência do meio de criopreservação consiste

no soro fetal bovino. Contudo, a importância do soro na criopreservação não é

cientificamente comprovada, além do risco de conter agentes infecciosos que não são

destruídos durante os procedimentos de criopreservação (Santos, 2007c).

2.9.3 Criopreservação: métodos e danos

O processo de criopreservação envolve basicamente as seguintes etapas: (1)

adição de agente crioprotetor (período de equilíbrio); (2) resfriamento e indução da

formação de gelo, seguidos por congelação ou vitrificação; (3) estocagem em nitrogênio

líquido; (4) descongelação ou aquecimento e (5) remoção ou diluição do agente

crioprotetor. A criopreservação pode ser realizada por dois métodos básicos: congelação

convencional (lenta) e vitrificação.

A congelação lenta é caracterizada pela exposição das células ou tecidos a baixas

concentrações de agente crioprotetor (∼1,5 M) - (Paynter et al., 2000), por um período

que pode variar de 20 (Rodrigues et al., 2004a,b) a 60 minutos (Candy et al., 1997).

Nesse método, é utilizado um freezer programável, em que o material é resfriado

lentamente a uma velocidade de 2ºC/min até –4 a –9ºC, mantendo-se esta temperatura

por um curto período (10 a 15 min) para a estabilização térmica e indução da

cristalização da solução crioprotetora (seeding) através do contato de um elemento

metálico pré-resfriado em nitrogênio líquido com a parede do recipiente que contém o

as amostras. Este procedimento visa prevenir a ocorrência da cristalização do meio em

temperaturas inferiores ao seu ponto de solidificação, que resulta na liberação de

energia sob forma de calor e elevação da temperatura da solução, seguida de redução

brusca durante o equilíbrio térmico com o freezer (Reichenbach et al., 2008). Em

seguida, o sistema continua sendo resfriado lentamente a uma velocidade de 0,3ºC/min.

Uma vez que a desidratação celular é suficientemente atingida (entre –30 a –140ºC), o

material é estocado em nitrogênio líquido (-196°C). Este é o método mais utilizado para

a criopreservação de tecido ovariano (Cox et al., 1996; Candy et al., 1997; Newton et

al., 1998; Liu et al., 2008; Qi et al., 2008; Tsuribe et al., 2008). Utilizando este método,

já foi possível a restauração da fertilidade após transplante em ovinos (Salle et al., 1999;

Almodim et al., 2004) e murinos (Liu et al., 2008), bem como já foram obtidos

nascimentos a partir de tecido ovariano criopreservado de murino (Guenasena et al.,

1997), ovino (Gosden et al., 1994; Salle et al., 2003) e humano (Oktay, 2001; Donnez et

al., 2004; Meirow et al., 2005).

O método de vitrificação consiste em utilizar uma taxa de congelação

extremamente rápida, que leva à formação de um estado vítreo do material

criopreservado, protegendo-se as células da formação de cristais de gelo (Huang et al.,

2008). A vitrificação foi idealizada por Luyet em 1937, e, depois de quase 50 anos, Rall

e Fahy descreveram este método como uma alternativa ao processo de congelação lenta

(Rall e Fahy, 1985). Ao contrário da congelação lenta, a vitrificação envolve a

exposição do material biológico a altas concentrações de agente crioprotetor

(geralmente entre 4 e 6 M) por um curto período de tempo (25 segundos a 5 minutos),

geralmente à temperatura ambiente, seguido de um resfriamento ultra-rápido em

nitrogênio líquido, não sendo necessária a utilização de equipamentos sofisticados e de

alto custo. De acordo com Stachecki e Cohen (2004), a vitrificação possui dois aspectos

básicos a serem levados em consideração. O primeiro consiste no fato de que as altas

concentrações de agentes crioprotetores utilizadas na exposição aumentam os efeitos

tóxicos e, em segundo lugar, apesar desse efeito durante o período de equilíbrio, a

vitrificação, por ser uma congelação altamente rápida, aumenta as taxas de

sobrevivência. Este método de congelação já foi reportado para oócitos maturos (Chian

et al., 2004), embriões (Isachenko et al., 2005) e tecido ovariano de diferentes espécies

como camundongas (Kagabu e Umezu, 2000), ratas (Sugimoto et al., 2000) e ovelhas

(Al-aghbari e Menino, 2002). Assim como na congelação lenta, resultados satisfatórios

com nascimentos foram obtidos após vitrificação de ovários inteiros ou FOPA de

camundongas (Liu et al., 2001; de la Peña et al., 2002; Migishima et al., 2003),

entretanto os resultados, principalmente em outras espécies, ainda são controversos.

Existem dois fatores que podem levar à morte celular durante o processo de

congelação/descongelação: a formação de gelo intracelular e o choque osmótico. Esses

efeitos negativos podem ser reduzidos ou evitados com a utilização de agentes

crioprotetores (de la Vega e Wilde, 1991), bem como modificando-se o processo de

criopreservação. De acordo com Stachecki e Cohen (2004), os efeitos do gelo

intracelular e do choque osmótico são fatores letais se as células não são tratadas

apropriadamente.

A prevenção da formação de gelo intracelular é considerada um dos fatores mais

importantes quando se deseja realizar um eficiente protocolo de criopreservação. Na

congelação clássica (lenta), essa formação pode ser evitada com um resfriamento celular

lento, permitindo a progressiva desidratação celular (Mazur et al., 2005). Existem duas

hipóteses para a formação de gelo intracelular. A primeira, postulada por Muldrey e

McGann (1990), sugere que o gelo intracelular seja formado como conseqüência de

danos ou defeitos na membrana plasmática, que permitiriam a passagem do gelo

extracelular através da membrana (teoria do fluxo osmótico). Com o super-resfriamento

celular durante a congelação, a força de efluxo da água para o meio extracelular

atingiria um valor crítico e, consequentemente, causaria danos à membrana, permitindo

a entrada do gelo extracelular para o meio intracelular. Uma outra hipótese é a de que o

gelo extracelular em contato (direto ou indireto) com a membrana plasmática, causaria a

formação de gelo intracelular, levando injúria ao conteúdo celular. Há duas versões para

essa segunda hipótese. Na primeira, Toner et al. (1990) sugerem que o gelo extracelular

provocaria uma mudança conformacional na membrana, que se transformaria em um

nucleador heterogêneo dos conteúdos celulares (contato indireto). Na segunda,

postulada por Mazur (2004), o gelo extracelular cresceria através de poros preexistentes

na membrana, onde tal contato direto levaria à formação de gelo intracelular.

Outra causa de morte celular consiste no efeito solução, que envolve alterações

citoplasmáticas como resultado da desidratação, aumento da concentração e

precipitação de solutos e alterações de pH (Mazur et al., 1984). Por muito tempo,

acreditou-se que a morte celular poderia ser causada pelo aumento da concentração de

soluto fora da célula devido ao resfriamento e a congelação da água extracelular

(Lovelock, 1953). Contudo, estudos mais recentes têm reportado uma alta tolerância

celular ao estresse osmótico. Agca et al. (2000) expuseram oócitos bovinos a crescentes

concentrações de cloreto de sódio para elevar a osmolaridade a concentrações

supravitais (até 4800 mOsm) e observaram que até 2400 mOsm, posteriormente os

oócitos foram capazes de ser fecundados e foram obtidos blastocistos. Outros

pesquisadores expuseram oócitos humanos e murinos a concentrações variáveis de

agente crioprotetor ou açúcares sem resfriamento e observaram considerável tolerância

celular às condições osmóticas impostas (Oda et al., 1992; Hotamisligil et al., 1996).

Os danos supracitados não são observados exclusivamente durante o

resfriamento, mas também durante o processo de descongelação/re-aquecimento, uma

vez que as células recuperam seu metabolismo na presença de substâncias tóxicas como

os agentes crioprotetores. Assim, El-Naggar et al. (2006) sugerem que as células ou

tecidos criopreservados devem ser descongelados em uma velocidade alta. Agentes

crioprotetores podem ser removidos em uma (Leibo, 1984), três (Rodrigues et al.,

2004a,b) ou mesmo em seis lavagens (Shelton, 1992). Apesar de uma lavagem ser

suficiente para embriões descongelados, folículos isolados e tecido ovariano devem ser

lavados em três passos para retirada de resquícios de agentes crioprotetores (Lima et al.,

2006; Sadeu et al., 2006; Santos et al., 2006).

2.9.4 Métodos de análise de FOPA criopreservados

Para a aplicação de um protocolo de criopreservação, é necessário determinar

o(s) agente(s) crioprotetore(s) mais indicado(s), sua concentração, tempo de exposição e

método de remoção. Um método prático para se verificar a qualidade folicular após a

congelação/descongelação é a histologia clássica. Contudo, esta análise morfológica não

é suficiente para se avaliar o processo de criopreservação (Schotanus et al., 1997; van

den Hurk et al., 1998; Martinez-Madrid et al., 2004), por permitir apenas a identificação

dos sinais primários da atresia (picnose nuclear, danos citoplasmáticos, desconexão

entre as células da granulosa e o oócito, bem como irregularidades na membrana basal)

- (Jorio et al., 1991; Hulshof et al., 1995; Demirci et al., 2002). A morfologia celular

observada por histologia não está sempre correlacionada com a integridade

ultra-estrutural, que requer o uso da microscopia eletrônica de transmissão para sua análise

(Santos et al., 2006). Além das organelas celulares, a verificação da integridade da

membrana plasmática também é fundamental para a avaliação da viabilidade celular, e

tem sido realizada utilizando-se o corante vital azul de trypan (Santos et al., 2007a,b) ou

o marcador fluorescente etídio homodímero (Schotanus et al., 1997; van den Hurk et al.,

1998). Outro parâmetro utilizado para a análise da viabilidade consiste na atividade

enzimática no citoplasma, detectável nas células foliculares através do composto

calceína-AM (Schotanus et al., 1997; van den Hurk et al., 1998), que é clivado por

enzimas esterase em células vivas, resultando em um produto fluorescente (De Clerck et

al., 1994).

2.10 Cultivo in vitro de folículos ovarianos

O objetivo principal do cultivo in vitro de FOPA é permitir o desenvolvimento

folicular assegurando o crescimento e a maturação oocitária, bem como a multiplicação

e posterior diferenciação das células da granulosa inclusas nesses folículos (Figueiredo

et al., 2008). O cultivo de ovários tem sido utilizado com diferentes propósitos como

avaliar a importância da vascularização, apoptose, fatores de crescimento e hormônios

para o desenvolvimento de FOPA dentre outros (Fortune et al., 2000; Erickson, 2001;

Flaws et al., 2001; O`Brien et al., 2003; Matos et al., 2007). Dentre os hormônios

testados e já comumente adicionados ao meio de base para o cultivo de folículos

ovarianos, destaca-se o FSH, sendo demonstrada sua importância para a manutenção da

viabilidade e proliferação das células da granulosa de FOPA (Matos et al., 2007; Choi et

al., 2008)

Em roedores, a pequena dimensão dos ovários possibilita o cultivo do órgão

inteiro, o que tem sido bastante útil para o estudo da foliculogênese inicial em pequenos

mamíferos (Fortune, 2003). Em animais domésticos de médio e grande porte, devido às

grandes dimensões dos ovários, não é possível utilizar este modelo. Para estes animais,

o cultivo de pequenos fragmentos de córtex ovariano, rico em folículos primordiais, tem

sido realizado para o estudo da ativação e crescimento de folículos primordiais caprinos

(Silva et al., 2004), bovinos (Braw-Tal e Yossefi, 1997) e humanos (Scott et al., 2004).

Esse tipo de cultivo in vitro tem a vantagem de manter a integridade estrutural folicular

e as interações entre as células foliculares e células do estroma, facilitando a perfusão

do meio para o tecido ovariano (Telfer, 1996). Já o segundo sistema de cultivo folicular

envolve o isolamento, mecânico ou enzimático, dos FOPA (Abir et al., 2001b),

permitindo o monitoramento diário do crescimento folicular, bem como o efeito in vitro

de hormônios e fatores de crescimento sobre cada classe folicular (Abir et al., 2001a).

Apesar dos métodos enzimáticos de isolamento serem mais práticos, os mecânicos têm

sido mais comumente adotados para o isolamento de FOPA de ovários bovinos (Itoh et

al., 2002), caprinos (Arunakumari et al., 2007), ovinos (Amorim et al., 2000), ratas

(Zhao et al., 2000) e camundongas (Lenie et al., 2004). Tais métodos têm

proporcionado a recuperação de um grande número de FOPA, sendo mais utilizados a

microdissecção para folículos com diâmetro igual ou superior a 150 μm (Lee et al.,

2007) e o isolamento pelo tissue chopper para folículos menores (Martinez-Madrid et

al., 2004) ou ainda a associação de ambos os métodos (Gupta et al., 2008). Além disso,