2011 / 2012 ( ) PARCIAL (X) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

Período: Agosto de 2011 / a Julho de 2012 ( ) PARCIAL

(X) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): Estratégia de Investigação Laboratorial de Erros Inatos do Metabolismo: Validação de Procedimentos e Implantação de Controle de Qualidade (Edital MCT/CNPq/CT-SAÚDE Nº 57/2010)

Nome do Orientador: Luiz Carlos Santana da Silva Titulação do Orientador: Doutor

Faculdade: Biomedicina

Unidade: Instituto de Ciências Biológicas Laboratório: Erros Inatos do Metabolismo Título do Plano de Trabalho:

Estratégia de Investigação Laboratorial de Erros Inatos do Metabolismo: Validação de Procedimentos e Implantação de Controle Interno de Qualidade (CIQ) para a Triagem Bioquímica na Urina e Ensaios Enzimáticos no Plasma.

Nome do Bolsista: Israel Osvaldo Lima de Melo (X) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/INTERIOR ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PARD ( ) PARD - renovação Tipo de Bolsa:

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INTRODUÇÃO

Os Erros Inatos do Metabolismo (EIM) são de origem genética e comprometem o metabolismo das células devido à ausência ou deficiência de uma enzima. Apesar de raros individualmente, os EIM (cerca de 600 distúrbios descritos) são freqüentes em conjunto, tendo uma incidência mundial estimada em 1:1000 recém-nascidos. Alguns EIM, como a fenilcetonúria, são mais freqüentes (1:11000) e por isso o diagnóstico neonatal pode ser realizado gratuitamente pelo Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN). Os EIM são distúrbios transmitidos, na sua quase totalidade, de maneira autossômica recessiva.

O presente plano aqui apresentado procura buscar meios de validar os instrumentos de diagnósticos, assim como estabelecer controle de qualidade dos procedimentos laboratoriais no Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo (ICB/UFPA) ligado ao atendimento em genética clínica no SUS. Esta estratégia favoreceria o reconhecimento destas práticas laboratoriais e poderia ser agrupada finalmente na tabela de procedimentos laboratoriais do SUS, fortalecendo o diagnóstico de doenças genéticas, como os EIM, no Brasil. A investigação laboratorial de EIM perpassa por uma série de fatos que por vezes atrasa ou dificulta o diagnóstico e o monitoramento destas doenças. Protocolos técnicos diferentes para a mesma análise de um metabólito ou enzimas, tratamento estatístico, número amostral insuficiente, instabilidade das propriedades físico-químicas das amostras biológicas, temperatura e tempo de armazenamento, infra-estrutura limitada, condições climáticas, interferências in

vivo, podem dificultar a precisão do diagnóstico laboratorial.

Para eliminar a interferência destas variáveis citadas medidas de garantia de qualidade preconizadas pela ANVISA (RDC 302) para laboratórios clínicos podem ser adotadas. Desta forma, o laboratório clínico deve assegurar a confiabilidade dos serviços laboratoriais prestados, por meio de, no mínimo: a) Controle Interno da Qualidade (CIQ); b) Controle Externo da Qualidade (CEQ) ou ensaios de proficiência.

O CIQ (controle intralaboratorial) consiste na análise diária de amostra controle com valores dos analíticos conhecidos para avaliar a precisão dos ensaios. Através do CIQ pode-se avaliar o funcionamento confiável e eficiente dos procedimentos laboratoriais para fornecer resultados válidos, que possam contribuir eficazmente no estabelecimento do diagnóstico clínico. O CIQ tem a finalidade de garantir a reprodutibilidade (precisão), verificar a calibração dos sistemas analíticos e indicar o momento de se promover ações corretivas quando surgir uma não conformidade dos resultados. Segundo a ANVISA (RDC N°. 302), o laboratório clínico deve realizar CIQ contemplando:

a) Monitoramento do processo analítico pela análise das amostras controle, com registro dos resultados obtidos e análise dos dados;

b) Definição dos critérios de aceitação dos resultados por tipo de analito e de acordo com a metodologia utilizada;

c) Liberação ou rejeição das análises após avaliação dos resultados das amostras controle.

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JUSTIFICATIVA

Desde 2004, o Ministério da Saúde (MS) tem mostrado iniciativas para configurar uma estratégia que culmine com fomentos para a área de Genética Clínica. Nesse contexto, somado à necessidade de estruturar no Sistema Único de Saúde (SUS) uma rede de serviços regionalizada e hierarquizada que permita atenção integral em Genética Clínica, melhorando o acesso a esse atendimento especializado, o Ministério da Saúde formulou a Política Nacional de Atenção Integral em Genética Clínica. A política proposta tem como objetivo principal estruturar e fortalecer a Atenção em Genética Clínica no SUS, na perspectiva da promoção, prevenção e recuperação da saúde, com ênfase no cuidado continuado, humanizado e integral em saúde, visando à ampliação do acesso e a promoção da racionalização das ações de saúde, contribuindo, assim, para o aumento da resolutividade do sistema com segurança, qualidade, eficácia e eficiência.

O Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (SGM/HCPA) se consolidou como um centro de referência latino-americano para a investigação dos EIM. Em 2006, graças ao primeiro edital do MCT-CNPq/MS-SCTIE-DECIT voltado às linhas de apoio em genética clínica, o Prof. Dr. Roberto Giugliani implantou, através do projeto Erros Inatos do Metabolismo: Implantação de uma Rede Nacional para a Investigação, Diagnóstico e Suporte à Pesquisa, a Rede EIM. Esta iniciativa tem facilitado o sucesso do tratamento de muitos EIM, o qual, segundo o Dr. Giugliani, exige um diagnóstico em fase precoce, que por sua vez depende de vários fatores, tais como: (1) a suspeita clínica de EIM pelo médico assistente; (2) a coleta de amostras apropriadas para a realização dos testes diagnósticos indicados para a situação específica; (3) o transporte dessas amostras ao laboratório de referência em condições adequadas: e (4) a existência de laboratórios de referência adequadamente equipados e com profissionais capacitados que disponibilizem as técnicas necessárias ao diagnóstico.

Existem hoje no Brasil diversos laboratórios, a maioria localizada em hospitais púbicos ligados a universidades, com diferentes capacitações para realizar testes diagnósticos para EIM, os quais têm sido acionados de modo informal para apoiar no diagnóstico. O SGM/HCPA foi um dos centros pioneiros no diagnóstico de EIM no Brasil e se tornou o centro de referência informal de uma rede composta por serviços das diferentes regiões do Brasil, integrando alguns laboratórios com diferentes capacitações para realizar testes diagnósticos. Tomando como base o incentivo à implantação de laboratórios regionais com competências para determinados procedimentos que envolvem desde os exames iniciais até aqueles determinantes de diagnóstico, esta proposta se deterá principalmente na avaliação da potencial contribuição de uma rede de laboratórios e serviços para o diagnóstico e tratamento dos EIM no Brasil, focando a validação de procedimentos laboratoriais e a implantação de controle de qualidade interno e externo nestes procedimentos. Os parâmetros laboratoriais adotados pelo SGM/HCPA serão considerados os modelos para a validação e o controle de qualidade dos procedimentos.

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OBJETIVOS

Estabelecer mecanismos de validação de procedimentos e implantar controle interno de qualidade (intralaboratorial) na triagem bioquímica na urina e em ensaios enzimáticos, métodos usados na investigação laboratorial de EIM. Objetivos específicos:

a) Treinamento de recursos humanos com o intuito de implantar técnicas de triagem inicial para o diagnóstico e o monitoramento do tratamento de alguns EIM;

b) Validar e determinar parâmetros de controle interno de qualidade (CIQ) para testes colorimétricos de triagem bioquímica na urina para a investigação de EIM.

c) Validar e determinar parâmetros de controle interno de qualidade (CIQ) para ensaios enzimáticos aplicados especialmente na investigação de doenças de depósito lisossômico.

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MATERIAIS E MÉTODOS

Os procedimentos laboratoriais estão listados abaixo com suas respectivas normas de coleta, de acordo com a Rede de Erros Inatos do Metabolismo e o Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.

a) Testes qualitativos na urina

1. Teste de Benedict (açúcares redutores) 2. Teste da dinitrofenilhidrazina (ceto-ácidos) 3. Teste do nitrosonaftol (metabólitos da tirosina) 4. Teste do cloreto férrico (metabólitos da fenilalanina) 5. Teste do cianeto-nitroprussiato (cistina e homocistina) 6. Teste da p-nitroanilina (ácido metilmalônico)

7. Teste do azul de toluidina (mucopolissacarídeos) 8. Teste de Watson-Schwartz ou Erlich (porfirinas) 9. Teste do nitroprussiato de prata (homocistina) 10. Teste do azul de toludina

Normas de coleta: colher 100mL de urina e congelar. Filtrar a urina em filtro esterilizante e armazenar/enviar em frasco plástico estéril.

b) Ensaios enzimáticos no plasma: 1. Alfa-galactosidase A (Doença de Fabry) 2. Arilsulfatase A (Leucodistrofia metacromática) 3. Beta-glicuronidase (Mucopolissacaridose tipo VII) 4. Biotinidase (Deficiência de Biotinidase)

5. Hexosaminidases (doenças de Tay-Sachs e Sandhoff) 6. Hexosaminidase A (%)

7. Quitotriosidase (marcador para doenças lisossômicas)

Normas de coleta: colher 10 mL de sangue com heparina, separar o plasma e congelar.

c) CIQ e validação de procedimentos na Triagem Urinária:

A interpretação da maioria das reações envolvidas na triagem urinária se dá pela visualização de cores ou por vezes precipitação de metabólitos, portanto, do ponto de vista estatístico, esta interpretação é considerada uma variável qualitativa. Todas as análises obedecerão aos procedimentos descritos em literatura para a interpretação de métodos colorimétricos qualitativos (Buist, 1968; Thomas & Howell, 1973).

Para medir a especificidade e a reprodutibilidade dos testes, foram coletadas 8 amostras da primeira urina (600 mL) da manhã de indivíduos hígidos, que não tenham ingerido quaisquer fármacos no período de uma semana. Estas amostras foram armazenadas em temperaturas diferentes: uma alíquota de 200mL em temperatura ambiente, uma alíquota de 200mL na geladeira e uma de 200mL no freezer -20C°. Todas as amostras foram analisadas em duplicata e repetidas por três dias consecutivos. As amostras armazenadas na geladeira

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foram analisadas uma semana, um mês e dois meses após a primeira análise. Somente as amostras que foram armazenadas no freezer foram analisadas 6 vezes: uma semana, um, dois, três, quatro e seis meses após a primeira análise.

d) Ensaios enzimáticos no plasma

Todas as análises obedeceram aos procedimentos descritos em literatura para a interpretação de métodos colorimétricos e fluorimétricos para os ensaios enzimáticos no plasma (Desnick et al., 1973; Singer et al., 1973; Peters et al., 1976; Suzuki, 1977; Wolf et al., 1983; Lee & Conzelmann, 1987; Morgan et al., 1990, Hollak et al., 1994; Michelin et al., 2005).

Para medir a especificidade, sensibilidade e a reprodutibilidade dos ensaios enzimáticos, foram coletadas 10 amostras de sangue (20mL) com heparina. Foram separadas alíquotas de 2mL de plasma para a realização dos seguintes ensaios enzimáticos. a) Hexosaminidases totais, b) Hexosaminidase A (%), c) Biotinidase d) Quitotriosidase e) Beta-glicuronidase

As amostras de plasma foram armazenadas em temperaturas diferentes: uma alíquota de 2mL de plasma na geladeira e uma de 2mL de plasma no freezer -20C°. Assim que chegaram ao laboratório, todas as amostras foram analisadas em duplicata. As amostras armazenadas na geladeira foram analisadas uma semana depois de coletadas. Estas amostras foram analisadas mais 2 vezes: um mês e dois meses após a primeira análise. As amostras armazenadas no freezer foram analisadas por 6 vezes: uma semana, um mês, dois, três, quatro e seis meses após a primeira análise.

e) Análise estatística

O programa BioStat (versão 5.0) foi usado para a análise estatística dos resultados obtidos por este plano de trabalho.

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RESULTADOS

CIQ para Ensaios enzimáticos no plasma

A tabela 01 mostra o intervalo, média e desvio padrão dos resultados para a enzima Hexosaminidase A. Não houve diferença estatística em relação ao tempo e a forma de armazenamento (p>0,05).

Tabela 01: Ensaio enzimático no plasma para Hexosaminidase A (Hex A): análise em amostra fresca x análise de amostras armazenadas em geladeira x freezer. Os dados são expressos em porcentagem.

1A: primeira análise; 1SG, 1MG, 2MG e 3MG: amostras armazenadas na geladeira uma semana, um, dois e três meses após a primeira análise; 1SF, 1MF, 2MF, 3MF, 4MF, 5MF e 6MF: amostras armazenadas no freezer uma semana, um, dois, três, quatro, cinco e seis meses após a primeira análise.

A tabela 02 mostra o intervalo, média e desvio padrão para a enzima Hexosaminidase Total. Houve diferença estatística somente em relação ao tempo de um mês de armazenamento das amostras em freezer (p < 0,05). Esta diferença pode ser devida a erros metodológicos durante a execução do ensaio enzimático.

Hexaminidase A Min Max Media DP 1 A 57% 74% 66,30 5,22 1SG 61% 79% 69,00 6,05 1MG 56% 82% 69,30 8,19 2MG 61% 77% 70,40 5,81 3MG 57% 80% 70,90 7,21 1SF 59% 77% 70,00 5,31 1MF 59% 77% 70,60 5,31 2MF 63% 77% 69,60 5,62 3MF 62% 87% 73,40 8,23 4MF 47% 76% 65,50 8,40 5MF 60% 77% 69,60 5,85 6MF 52% 84% 67,20 10,43

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Tabela 02: Ensaio enzimático no plasma para Hexosaminidase Total: análise em amostra fresca x análise de amostras armazenadas em geladeira x freezer. Os dados são expressos em nmol/h/mL.

A tabela 03 mostra o intervalo, média e desvio padrão para a enzima Quitotriosidase. Não houve diferença estatística em relação ao tempo e a forma de armazenamento (p>0,05).

Tabela 03: Ensaio enzimático no plasma para Quitotriosidase: análise em amostra fresca x análise de amostras armazenadas em geladeira x freezer. Os dados são expressos em nmol/h/mL.

Hexosaminidase Total Min Max Media DP 1A 689,0 1258,0 965,40 201,10 1SG 734,0 1312,0 990,70 199,00 2MG 851,0 1403,0 1064,40 187,88 3MG 989,0 1701,0 1293,80 285,75 1MF 298,0 875,0 462,30* 173,12 2MF 712,0 1302,0 996,10 238,77 3MF 917,0 2937,0 1402,60 621,27 4MF 638.26 1339.59 989.42 254.74 5MF 974,0 1749,0 1258,20 270,25 6MF 896,0 2406,0 1481,80 527,08

Quitotriosidase Min Max Media DP 1A 17.62 59.58 33.81 15.77 1SG 20 40.1 31 6.88 1MG 23.34 34.88 30.61 5.23 2MG 24.7 51.28 34.46 8.76 3MG 24.7 53.1 39.73 9.22 1MF 22.38 55.12 38.15 11.9 2MF 17.1 49.9 32.69 11.45 3MF 24.8 48 35.9 8.58 4MF 21.28 31.41 25.63 4.42 5MF 14.14 41.41 28.55 7.21 6MF 15.93 46.24 37.1 8.86

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A tabela 04 mostra o intervalo, média e desvio padrão para a enzima beta-glicuronidase. Não houve diferença estatística em relação ao tempo e a forma de armazenamento (p>0,05).

Tabela 04: Ensaio enzimático no plasma para enzima beta-glicuronidase: análise em amostra fresca x análise de amostras armazenadas em geladeira x freezer. Os dados são expressos em nmol/h/mL.

A tabela 05 mostra o intervalo, média e desvio padrão para a enzima biotinidase. Em função de problemas metodológicos não foi possível realizar o ensaio para biotinidase com amostras armazenadas no freezer correspondente ao quinto mês de análise. Em relação à primeira análise houve redução significativa da concentração da enzima em todos os períodos analisados em amostras armazenadas na geladeira (p < 0,05). As amostras armazenadas em freezer permaneceram com os valores estáveis até o terceiro mês, a partir do quarto mês houve redução significativa (p<0,05).

Beta-glicuronidase Min Max Media DP 1ª 37,0 240,0 91,90 58,14 1SG 36,0 268,0 90,60 65,29 1MG 47,0 327,0 121,80 77,79 2MG 43,0 310,0 108,00 74,75 3MG 45,0 300,0 110,60 72,37 1SF 58,0 272,0 118,00 64,93 1MF 54,0 342,0 144,30 80,14 2MF 52,0 313,0 116,30 74,99 3MF 38,0 354,0 108,30 89,81 4MF 60,0 303,0 129,10 66,48 5MF 54,0 292,0 120,50 64,36 6MF 56,0 319,0 122,00 73,91

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Tabela 05: Ensaio enzimático no plasma para enzima biotinidase: análise em amostra fresca x análise de amostras armazenadas em geladeira x freezer. Os dados são expressos em nmol/h/mL.

1A: primeira análise; 1SG, 1MG, 2MG e 3MG: amostras armazenadas na geladeira uma semana, um, dois e três meses após a primeira análise; 1SF, 1MF, 2MF, 3MF, 4MF e 6MF: amostras armazenadas no freezer uma semana, um, dois, três, quatro e seis meses após a primeira análise.

CIQ para Triagem Urinária

A interpretação da maioria das reações envolvidas na triagem urinária se dá pela visualização de cores ou por vezes precipitação de metabólitos, portanto, do ponto de vista estatístico, esta interpretação é considerada uma variável qualitativa.

Foram analisadas oito amostras de urina de indivíduos hígidos em temperatura ambiente por três dias consecutivos e em geladeira. Não houve nenhum resultado positivo. Os testes prosseguiram, mas não houve nenhuma alteração no resultado das análises nos períodos posteriores. Os resultados mais relevantes estão apresentados na tabela 6.

Biotinidase Min Max Media DP 1 A 7.6 11.5 9.25 1.39 1SG 6 10.1 7.57 1.21 2MG 3.4 7.4 5.16 1.25 3MG 4.2 7.6 5.34 1.04 4MG 1.1 6 3.23 1.48 1SF 7.6 12 9.25 1.46 1MF 6.2 9.7 7.57 1.13 2MF 5.8 9.9 7.88 1.24 3MF 5.8 8.4 7.41 0.83 4MF 5.4 8.3 6.7 1.03 6MF 1.7 5.1 3.58 1.42

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Tabela 06: Triagem Bioquímica na Urina realizada 5 vezes: temperatura ambiente, amostras de 3 dias consecutivos e uma semana após amostras armazenadas em geladeira (n: 8)

TESTES 1 2 3 4 5 6 7 8

A Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

B Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

C Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

D Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

E Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

F Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

G Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

H Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

I Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo A. Teste de Benedict (açúcares redutores)

B. Teste do Brometo de CTMA (mucopolissacarídeos) C. Teste do cloreto férrico (metabólitos da fenilalanina) D. Teste da dinitrofenilhidrazina (ceto-ácidos)

E. Teste do nitrosonaftol (metabólitos da tirosina) F. Teste de Watson-Schwartz ou Erlich (porfirinas) G. Teste da p-nitroanilina (ácido metilmalônico)

H. Teste do cianeto-nitroprussiato (cistina e homocistina) I. Teste do azul de toluidina (mucopolissacarídeos) J. Teste do nitroprussiato de prata (homocistina)

PUBLICAÇÕES:

Os resultados deste trabalho serão apresentados na forma de resumo submetido ao III Congresso Norte – Nordeste de Genética Médica que ocorrerá no período de 15 a 18 de Novembro de 2012, na cidade de Fortaleza (CE). Será também elaborado um artigo para ser submetido em revista indexada.

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CONCLUSÃO

Não houve diferença estatística em relação ao tempo e a forma de armazenamento para a enzima hexosaminidase A, indicando que pode ser analisada por pelo menos 4 meses de armazenamento em geladeira ou 6 meses de armazenamento em freezer (-20 graus). Esta enzima será aplicada no diagnóstico de doenças de depósito lisossômico como Doença de Tay-Sachs e Doença de Sandhorff.

Houve diferença estatística somente em relação ao tempo de um mês de armazenamento das amostras em freezer para a enzima Hexosaminidase Total, mas esta diferença pode ser devida a erros metodológicos durante a execução do ensaio enzimático. Esta enzima pode ser analisada por pelo menos 4 meses de armazenamento em geladeira ou 6 meses de armazenamento em freezer (-20 graus). Desta forma, a enzima em questão também pode ser aplicada para o diagnóstico de doenças de depósito lisossômico como Doença de Tay-Sachs e Doença de Sandhorff.

Não houve diferença estatística em relação ao tempo e a forma de armazenamento para a enzima beta-glicuronidase, indicando que pode ser analisada por pelo menos 4 meses de armazenamento em geladeira ou 6 meses de armazenamento em freezer (-20 graus). Esta enzima será aplicada no diagnóstico de uma doença de depósito lisossômico denominada Mucopolissacariodse VII.

Não houve diferença estatística em relação ao tempo e a forma de armazenamento para a enzima Quitotriosidase, indicando que pode ser analisada por pelo menos 4 meses de armazenamento em geladeira ou 6 meses de armazenamento em freezer (-20 graus). Esta enzima será aplicada no diagnóstico e monitoramento do tratamento de uma doença de depósito lisossômico denominada Doença de Gaucher.

Em relação à primeira análise houve redução significativa da concentração da enzima biotinidase em todos os períodos analisados em amostras armazenadas na geladeira (p < 0,05). Os resultados mostram que a atividade enzimática é estável até o terceiro mês de armazenamento no freezer (-20 graus). Esta enzima quando deficiente não pode reciclar a vitamina Biotina (complexo B), um cofator importante para várias carboxilases envolvidas no metabolismo.

Os testes de triagem analisados em amostras de urina em tempos diferentes revelaram resultados negativos até agora, não tendo influência das diferentes maneiras de armazenamento.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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DIFICULDADES Nada a declarar.

PARECER DO ORIENTADOR:

O graduando Israel Osvaldo Lima de Melo tem mostrado interesse em suas atividades científicas,.está amadurecendo do ponto de vista científico e tem mostrado assiduidade e interesse em suas atividades relacionadas ao presente plano de trabalho.

Gostaria de emitir conceito EXCELENTE e parecer favorável ao relatório final de seu plano de trabalho aqui descrito.

Data: 09 de Agosto de 2012.

_________________________________________ Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da Silva

ASSINATURA DO ORIENTADOR

Israel Osvaldo Lima de Melo ASSINATURA DO ALUNO

INFORMAÇÕES ADICIONAIS: