CAROLINE PEREIRA DE SOUZA
ADEQUABILIDADE DO MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO FÓLICO NO PRODUTO FOLIN
CAROLINE PEREIRA DE SOUZA
ADEQUABILIDADE DO MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO FÓLICO NO PRODUTO FOLIN
Trabalho de conclusão apresentado ao Curso de Química do Centro Universitário La Salle – Unilasalle, como exigência parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química.
Orientação: Prof. Drª Ana Cristina Borba Cunha
CAROLINE PEREIRA DE SOUZA
ADEQUABILIDADE DO MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO FÓLICO NO PRODUTO FOLIN
Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química pelo Centro Universitário.
Aprovado pelo avaliador em 11 de julho de 2012.
AVALIADOR:
__________________________________________ Prof. Drª Ana Cristina Borba Cunha
A Deus que me deu o dom da vida. À minha querida mãe Lili, que amo muito. Aos meus irmãos, Gabriela e Rafael, pelo companheirismo. Ao meu pai, Antônio Francisco (in memorian).
AGRADECIMENTO
Primeiramente agradeço a Deus por tudo que tem me concebido, mesmo não sendo o que eu espero, mas sim aquilo que eu preciso.
A todos que acreditaram no meu potencial, e ajudaram a alcançar o meu objetivo, de concluir a graduação em química.
Especialmente à minha mãe, Lili, por todo o seu amor e paciência, a minha irmã Gabriela pelas excelentes críticas ao meu trabalho, ao meu irmão Rafael, que mesmo longe sempre esteve perto, e ao meu namorado Roger por sempre me incentivar.
Agradeço a ajuda das minhas colegas, Marilene Boni e Lígia Deresz, que contribuíram muito na realização deste trabalho.
A minha orientadora, Ana Cristina Borba Cunha, agradeço pelo excelente profissionalismo na orientação do meu trabalho, pela atenção e dedicação neste momento tão importante, que é a conclusão da graduação.
RESUMO
O presente trabalho apresenta o estudo da adequabilidade do método de quantificação do teor de ácido fólico no produto Folin®, sendo utilizada para este a metodologia analítica a prática de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Foram realizadas várias análises do produto e utilizou-se os dados obtidos para se determinar os parâmetros de seletividade, linearidade, precisão e exatidão do método analítico utilizado em questão. Com a análise de todos os resultados analíticos verificou-se que os ensaios realizados estavam de acordo com o especificado na Resolução RE 899/2003 (ANVISA, 2003), e o método apresenta-se validado quanto à adequabilidade.
Palavras chave: Cromatografia líquida. Seletividade. Linearidade. Precisão. Exatidão.
ABSTRACT
The present work shows the suitability of the method of quantification of folic acid in Folin® product, and is used for this analytical methodology to the practice of High Performance Liquid Chromatography (HPLC). They performed several analyzes of the product and used the data obtained to determine the selectivity parameters, linearity, precision and accuracy of the analytical method in question. With the analysis of all the results, it was found that the tests were carried out according to the resolution specified in RE 899/2003 (ANVISA, 2003), and the method is presented regarding the suitability valited.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 9
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 10
2.1 Ácido Fólico ... 10
2.2 Validação de método analítico ... 11
2.2.1 Seletividade/Especificidade ... 12
2.2.2 Linearidade ... 13
2.2.3 Precisão ... 15
2.2.3.1 Repetibilidade ou repetitividade (repê) ... 15
2.2.3.2 Precisão intermediária ... 16
2.2.3.3 Exatidão ... 16
2.3 Cromatografia Líquida de Alta Performance (CLAE) ... 17
2.3.1 Fase móvel ... 18 2.3.2 Bombas ... 18 2.3.3 Injetor ... 18 2.3.4 Coluna ... 18 2.3.5 Detector ... 19 3 MATERIAIS E REAGENTES ... 20 3.1 Equipamentos ... 20 3.2 Vidrarias ... 20 3.3 Reagentes e materiais... 20
3.4 Método analítico para o teor de ácido fólico no produto ... 20
3.4.1 Preparo da fase móvel ... 21
3.4.2 Preparo da solução de diluição ... 21
3.4.3 Preparo da solução system suitability ... 22
3.4.4 Preparo da solução padrão de ácido fólico ... 22
3.4.5 Preparo da amostra de ácido fólico ... 22
3.5 Cálculo estatístico de linearidade ... 22
3.6 Cálculo estatístico de repetibilidade e precisão intermediária ... 23
3.6.1 Repetibilidade ... 23
3.6.2 Precisão intermediária ... 23
3.6.3 Cálculo estatístico da exatidão ... 23
4.1Seletividade/Especificidade ... 25 4.2 Linearidade ... 27 4.3 Exatidão ... 28 4.4 Precisão ... 29 5 CONCLUSÃO ... 30 REFERÊNCIAS ... 31
ANEXO A: RESULTADOS DO ANALISTA 1 ... 33
1 INTRODUÇÃO
O Ácido Fólico é uma vitamina do complexo B, indicada no tratamento de anemias e na prevenção de malformações do feto durante a gestação. Também é utilizado em pacientes com deficiência de vitamina B.
Cada vez mais as empresas estão buscando adaptarem-se as exigências normativas sobre a validação dos métodos analíticos. De acordo com Albano (2009) a validação de ensaios laboratoriais tem por objetivo a confiabilidade analítica do método escolhido ou desenvolvido na execução do ensaio e na obtenção do resultado. Este processo tem seu custo, pois gera mudanças, porém o mesmo deve ser considerado como um investimento e não como despesa. Afinal a validação é feita por exigência da fiscalização, de órgãos acreditados ou por uma visão futura de mercado da própria empresa.
As empresas do ramo farmacêutico devem seguir as normas para validação definidas pela Anvisa, atualmente RE 899/2003, que cita que os métodos devem atender as exigências das aplicações analíticas, garantindo a confiabilidade dos resultados. Neste documento (RE 899/2003), também contém a informação de que os métodos farmacopeicos são considerados validados. Porém, na Resolução Diretória Colegiada (RDC)17/2010 que dispões sobre Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos, esses métodos devem atender as exigências de adequabilidade do método, garantindo que este cumpra as especificações do método validado.
Para avaliar a adequabilidade do método foram determinados os seguintes parâmetros: seletividade, linearidade, precisão e exatidão, conforme a Agência Nacional de Vigilância Sanitária prevê na Resolução RE 899/2003. Este trabalho teve como objetivo analisar estes parâmetros do método de determinação de ácido fólico no produto Folin®, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Ácido Fólico
O ácido fólico também denominado ácido pteroilglutâmico, é uma vitamina do complexo B (vitamina B9), a forma sintética do folato, com peso molecular de 441,40 g/mol, e que apresenta fórmula molecular: C19H19N7O6 – Ácido N-[4-[[(2-amino-3,4-diidro-4-oxo-6-pteridinil) metil] amino] benzoil]-L-glutâmico
Figura 1: Estrutura do ácido fólico
Fonte: Farmacopéia Brasileira.
O produto é uma medicação vitamínica complementar essencial na gestação e na lactação de humanos, contém 5 mg de ácido fólico em cada comprimido. É utilizado nas situações clínicas de anemias hemolíticas e megaloblásticas não-perniciosas causadas por deficiência de vitamina B12. O uso de ácido fólico no período que antecede e durante a gestação diminui a incidência de malformações do tubo neural.
O ácido fólico é uma vitamina essencial nos processos metabólicos intracelulares, necessária para a síntese de DNA. Apesar da presença na alimentação, os folatos são muito sensíveis ao calor, degradando com o cozimento dos alimentos. O folato atua também no metabolismo da homocisteína, através da doação do grupo metila para formação da metionina. O ácido fólico é absorvido no trato intestinal, principalmente no duodeno e jejuno, após a dissolução inicial no estômago. Após a absorção, o ácido fólico é rapidamente convertido no fígado e plasma em sua forma metabólica ativa, 5-metiltetraidrofolato mediante a enzima diidrofolato redutase. A eliminação do ácido fólico é por via renal. A quantidade em
excesso e excretada inalterada na urina. O folato é distribuído para o leite materno. O ácido fólico é removido por hemodiálise (BULA PRODUTO FOLIN® - GEYER MEDICAMENTOS S.A.).
2.2 Validação de método analítico
De acordo com a ANVISA, através da resolução da Diretória Colegiada (RDC) nº 17/2010, a validação é um ato documentado que atesta que qualquer procedimento, processo, equipamento, material, atividade ou sistema realmente e consistente leva aos resultados esperados.
A fim de garantir que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, é feita a validação a partir de análises experimentais obtendo assim, resultados confiáveis. (ANVISA, 2010). A validação é a comprovação, através do fornecimento de evidência objetiva, de que os requisitos para uma aplicação ou uso específicos pretendidos foram atendidos (NBR ISO 9000, 2000).
Para que seja feita uma validação é preciso um plano mestre de validação baseado em estudos de todos os métodos para validação, pois não há um método específico para cada análise. A partir de resoluções e guias, são feitas adaptações e ajuste das recomendações às suas necessidades. (LEITE, 1998).
Segundo Harris (2008) e Skoog (2009) a validação do método é o processo que prova que um método analítico é aceitável para os propósitos que ele se destina. Pode ser aplicada a amostras, metodologias e dados, e determina a adequação de uma análise a fim de fornecer a informação desejada.
Existem protocolos que são internacionalmente aceitos para a validação completa (full validation), que são o Protocolo Harmonizado Internacional e o procedimento ISO (International Standard Organization). O estudo interlaboratorial, destes protocolos necessita de um número mínimo de laboratórios e materiais para que seja feita a validação completa do método analítico. (RIBANI, 2004).
Porém, consta na RDC nº17/2010: “Parágrafo único. Os métodos analíticos compendiais não requerem validação, entretanto antes de sua implementação, devem existir evidencias documentadas de sua adequabilidade nas condições operacionais do laboratório.” (ANVISA, 2010)
Portanto, o método utilizado para análise de teor de ácido fólico no produto, deve ser testado quanto a sua adequabilidade, apesar de ser um método farmacopeico.
Para a avaliação da adequabilidade do método nas condições real de uso não será necessária repetir todos os parâmetros normalmente utilizados na validação de métodos analíticos. Conforme a Resolução – RE n° 899, de 29 de maio de 2003, da ANVISA, considerando que o produto em questão encontra-se classificado na categoria I da Tabela 1 descrita nessa resolução, os parâmetros da adequabilidade do método de determinação do teor de ácido fólico no produto Folin são:
a) Especificidade/seletividade; b) Linearidade;
c) Precisão Repetibilidade; d) Exatidão.
2.2.1 Seletividade/Especificidade
Na resolução RE 899/2003 (ANVISA, 2003) os termos especificidade e seletividade são definidos como sendo a capacidade do método de medir exatamente um composto em presença de outros componentes tais como impureza, produtos de degradação e componentes da matriz.
Conforme Albano (2009), a seletividade é a capacidade do método de diferenciar a substância a ser analisada e substâncias análogas. Este parâmetro pode ser analisado a partir da comparação dos sinais advindos do processamento da matriz, do extrato da matriz fortificado e do analito.
Segundo Barros (2002), a especificidade do método pode ser demonstrada através do desvio dos resultados obtidos pela análise do analito de interesse em amostras fortalecidas com todos os interferentes e os resultados obtidos com amostras não fortalecidas, contendo somente o analito. Quando não se conhecem os interferentes, a especificidade do método pode ser investigada pela comparação dos resultados com outros métodos/técnicas independentes.
Porém, Ribani et. al. (2004) diferencia a seletividade da especifidadede definindo a seletividade como sendo a capacidade que o método analítico tem de avaliar, de forma inequívoca, as substâncias em exame na presença de componentes que podem interferir com a sua determinação em uma amostra complexa. Dessa forma a seletividade avalia o grau de interferência de espécies como outro ingrediente ativo, excipientes, impurezas e produtos de degradação,
bem como outros compostos de propriedades similares que possam estar, porventura, presentes.
Segundo o INMETRO (2010) (DOQ-CGCRE-008) a seletividade e a especificidade estão relacionadas ao evento da detecção. Pois a seletividade de um método instrumental de separação é caracterizada pela distinção de um único analito em presença de outros. Já a especificidade está na produção de uma única resposta para apenas um analito específico. Entretanto, os dois termos são frequentemente utilizados indistintamente ou com diferentes interpretações. Porém, IUPAC sugere que se utilize somente o termo seletividade.
De acordo com Ribani et. Al. (2004), a seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do composto de interesse. Se a seletividade não for assegurada, a linearidade, a exatidão e a precisão estarão seriamente comprometidas. Por isto a seletividade deve ser o primeiro parâmetro a ser determinado na validação de um método instrumental de separação, já que algumas amostras podem sofrer degradação, gerando compostos que podem coeluir com a amostra de interesse.
A ANVISA (2003), na resolução RE 899/2003, determina que em métodos cromatográficos, devem-se tomar as precauções necessárias para garantir a pureza dos picos cromatográficos, através da utilização de detector de arranjo de fotodiodos, demonstrando que o pico cromatográfico é atribuído a um só componente.
2.2.2 Linearidade
Segundo consta na resolução RE 899/2003 (ANVISA), a linearidade relaciona e demonstra que os resultados analíticos são proporcionais a concentração do analito.
Já Leite (2002) explica o significado teórico de linearidade, como sendo a região da curva resposta ou de quantificação onde há relação direta sinal/concentração.
Para Albano (2009), Ribeiro (2008), Brito et. al. (2003) e Ribani et. al. (2004) a linearidade expressa à capacidade do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em análise, dentro de um intervalo específico. Sendo que esta relação entre o sinal medido (área ou altura do pico) e a
massa ou concentração da espécie a ser quantificada, é definida empiricamente com concentrações conhecidas do analito e o sinal de resposta obtido.
Então para se obter a linearidade é preciso que se alcance uma proporção direta entre os resultados e as concentrações do analito. Para isso é necessário construir uma curva de calibração, ou curva de resposta como cita Leite (2002). Esta irá apresentar no eixo x a concentração do analito e no eixo y o sinal da resposta, assim a equação da reta será: y=ax+b, onde a=coeficiente angular, que é a inclinação da curva aos eixos, e b=coeficiente linear, que é a intersecção da curva aos eixos. A figura 2 apresenta uma curva de calibração linear e a respectiva equação da reta
Figura 2: Curva de Calibração linear e a respectiva equação da reta
Onde: Y = Área do padrão; a = coeficiente linear da reta; x = Concentração;
b = coeficiente angular da reta = fator resposta;
AA = área do analito na solução injetada;
CC = concentração do analito na solução injetada (µg/L)
Fonte: Autoria própria, 2012.
De acordo com a ANVISA (2003) na RE 899/2003, a curva de calibração deve ter no mínimo cinco pontos, porém consta nas considerações gerais da resolução 899/2003 que esta deve obter no mínimo seis concentrações do padrão do fármaco. Também especifica um intervalo compreendido entre 80 – 120% da concentração teórica para fármacos e medicamentos.
Conforme Leite (2002) e Ribeiro (2008), a regressão linear (método dos mínimos quadrados) é uma forma de estimar qual a melhor reta que passa pelos pontos obtidos experimentalmente. O coeficiente de correlação relaciona x e y na curva sendo que os valores ideais esperados são 1 e -1, ou seja, quanto mais próximo da unidade maior a relação, maior a probabilidade de existir uma relação linear definida. Já se os valores ficarem próximo de zero indica que não há relação
linear. Para a ANVISA o coeficiente de correlação deve ser igual a 0,99, porém o INMETRO determina com sendo um valor acima de 0,90.
2.2.3 Precisão
A dispersão dos resultados entre ensaios independentes é definida por Ribani et. al. (2004) como sendo a precisão. Esta pode ser determinada através do cálculo de desvio padrão de resultados ou coeficiente de variação, que é uma estimativa do desvio padrão relativo.
A resolução RE 899/2003 (ANVISA) define a precisão como sendo a avaliação da proximidade de resultados em uma série de repetições de uma mesma amostra com múltiplas amostragens.
De acordo com o Instituto Nacional de Metrologia (2003) a precisão serve para avaliar a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições definidas.
A precisão é pode ser definida em três níveis: a) Repetitividade ou repetibilidade
b) Precisão intermediária c) Reprodutibilidade
2.2.3.1 Repetibilidade ou repetitividade (repê)
Segundo Albano (2009), Skoog (2006), Rodrigues et al. (2008), Lima (2007) e Leite (2002) repetibilidade é a máxima diferença aceitável entre resultados independentes de repetições feitas no mesmo ensaio e no mesmo laboratório.
O termo repetibilidade é utilizado pela ANVISA, porém o INMETRO utiliza o termo repetitividade, pois é adotado pelo vocabulário Internacional de Metrologia, mas os dois termos são definidos como sendo a concordância entre os resultados de medições sucessivas da mesma amostra com o mesmo analista.
Também é chamada de precisão intra-corrida, pois é feita no mesmo instrumento, com o mesmo analista e no mesmo dia (FECHIO, 2009; CASSIANO, 2009). Esta pode ser verificada através da estimativa do desvio padrão relativo de 9 (nove) determinações, sendo 3 concentrações, baixa, média e alta, com 3 réplicas cada a 100% da concentração do teste.
2.2.3.2 Precisão intermediária
De acordo com a resolução RE 899/2003 (ANVISA) a precisão intermediária é também chamada de precisão inter-corridas, pois é a concordância de resultados obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes, mas no mesmo laboratório. A precisão pode ser expressa como o desvio padrão relativo ou coeficiente de variação (CV%).
Ribani et.al.(2004), Pedott (2010) e Nascimento et al. (2008) evidenciam que o principal objetivo deste parâmetro é verificar que no mesmo laboratório o método fornecerá os mesmo resultados. Afinal, este indicará o efeito das variações dentro do laboratório devido à mudança de dias e analistas.
2.2.3.3 Exatidão
Albano (2009) define exatidão como a tendência em apresentar resultado maior ou menor que o valor real, ou seja, é a concordância entre o resultado de um ensaio e o valor de referência aceito convencionalmente como verdadeiro.
Segundo Ribani et al. (2004) a exatidão é o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro. Para avaliar a exatidão os processos mais utilizados são:
a) Materiais de referência: são também chamados de CRM (materiais de referência certificados), pois acompanham um certificado que possui um valor de concentração de uma dada substância e uma incerteza associada, que são comparados com os resultados obtidos no laboratório; b) Comparação de métodos: avalia o grau de concordância entre o método testado e o de referência, sendo que a incerteza do método de referência é conhecida.
c) Ensaios de recuperação: é a quantidade de analito adicionada que pode ser extraída e quantificada, ou seja, é o padrão da substância que é adicionado à matriz isento desta substância.
A ANVISA (RE 899/2003) define a exatidão como sendo a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro. Esta
deve ser determinada após o estabelecimento da linearidade e da especificidade do método, sendo verificada a partir de 9 determinações contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja 3 concentrações, baixa, média e alta, com 3 réplicas cada e é expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente:
Exatidão = concentração média experimental x 100 concentração teórica
2.3 Cromatografia Líquida de Alta Performance (CLAE)
O método analítico de determinação de ácido fólico é realizado no Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE), também chamado de HPLC (High Pressure Liquid Chromatography). Neste instrumento ocorre a separação de substâncias polares, iônicas, ionizáveis e apolares, através de uma coluna, variando a composição da fase móvel de acordo com a análise de interesse (SKOOG, 2009; CIENFUEGOS, 2000). Abaixo temos um esquema de um cromatógrafo líquido de alta eficiência com todas as partes identificadas.
Figura 3: Esquema de um cromatógrafo líquido
2.3.1 Fase móvel
Trata-se de uma solução, com pH específico para análise, que é filtrada antes do uso por uma membrana, objetivando evitar que partículas sólidas obstruam o sistema de bombeamento e a coluna. A fase móvel deve ser preparada no dia da utilização para evitar degradação ou contaminação do solvente. Além disso, ela deve ser desgaseificada, pois o ar dissolvido pode formar bolhas que prejudica a bomba e faz com que a pressão diminua (CIENFUEGOS, 2000).
2.3.2 Bombas
São necessárias para que a pressão seja alta e o fluxo possa sobrepor à resistência das micropartículas da fase estacionária empacotadas na coluna, e também evitar que se formem microbolhas no sistema (CIENFUEGOS, 2000).
2.3.3 Injetor
É a parte do equipamento por onde se introduz a amostra, sem alterar a vazão do sistema, pois ocorre a diluição da solução injetada antes do contato com o solvente, evitando o alargamento da banda do cromatograma (CIENFUEGOS, 2000). A reprodutibilidade do equipamento é melhor já que utilizamos um equipamento com injeção automática (auto-sampler), diminuindo o intervalo entre as injeções garantindo assim maior eficiência na análise.
2.3.4 Coluna
São construídas de tubos de aço inoxidável com comprimentos que variam de 10 a 30cm, na forma reta evitando perda da eficiência. O diâmetro interno de colunas para líquidos geralmente é de 4 a 10mm e o tamanho de partícula mais comum da fase estacionária é de 5 a 10µm. Este tipo de coluna possui de 40 mil a 60 mil pratos/metro (SKOOG, 2006).
Para aumentar a vida útil de uma coluna utilizam-se as chamadas pré-colunas, que tem a função de proteger a coluna evitando que o sistema seja danificado (CIENFUEGOS, 2000).
2.3.5 Detector
Responsável por receber e fornecer o sinal que representa a quantidade do analito no eluente da coluna (CIENFUEGOS, 2000). Utilizamos um equipamento com detector de malha de fotodiodos também conhecido como Diode Array Detector (DAD). Estes detectores possuem um sistema ótico invertido, em relação aos equipamentos UV convencionais, pois a célula é iluminada com luz policromática e a luz emergente da célula chega a uma rede de difração através da qual é dispersada até o elemento fotossensível. Utiliza-se um conjunto de fotocélulas ou fotodiodos ao invés de uma única célula como nos demais detectores.
3 MATERIAIS E REAGENTES
Para o estudo desenvolvido, foram utilizadas vidrarias certificadas, equipamentos qualificados, padrões farmacopeicos e reagentes preparados conforme métodos farmacopeicos, de forma a minimizar possíveis variáveis que possam interferir na confiabilidade do método empregado.
3.1 Equipamentos
Para a realização dos ensaios foi utilizado os seguintes equipamentos: balança analítica - Shimadzu, pHmetro - Hanna instruments, bomba de vácuo - Tecnal, ultrassom – Unique e Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência – Shimadzu.
3.2 Vidrarias
Para o preparo das soluções utilizadas, assim como a realização da análise de teor do ácido fólico, foram utilizadas as seguintes vidrarias: balões volumétricos de 10 mL/5 mL/25 mL/50 mL e 100 mL, pipetas volumétricas de 2 mL/5 mL e 10 mL, Kitasato, erlenmeyer 25 mL, funil de vidro, vials 2 mL.
3.3 Reagentes e materiais
Para a análise de teor do ácido fólico foram utilizados os seguintes reagentes: água purificada, perclorato de sódio P.A, hidróxido de amônio P.A, metanol grau HPLC, hidróxido de potássio 1 N, fosfato de potássio monobásico P.A, Ácido fólico padrão USP, Compostos relacionados A do ácido fólico – padrão USP, filtro quantitativo faixa preta – diâmetro 12,5 mm, membrana filtrante hidrofílica 0,45 micras, filtro de seringa 0,45 micras.
3.4 Método analítico para o teor de ácido fólico no produto
O método analítico utilizado está descrito na Farmacopéia Americana (2009). A análise foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência. O cromatógrafo possui um detector de 254 nm e a coluna utilizada foi de 4,6 mm x 25 cm (coluna
L1). O fluxo de escoamento é de aproximadamente 1 mL/minuto. A cromatografia da solução system suitability e do padrão respondem de acordo com o procedimento: a resolução, R, entre os compostos relacionados A do ácido fólico (formiltetrahidrofolato de cálcio) e o ácido fólico não é menor que 3,6 e o desvio padrão relativo das replicações injetadas não é maior que 2,0%.
Foram injetados, separadamente volumes iguais (cerca de 25 µL) das soluções padrão e solução amostra no cromatógrafo, registraram-se os cromatogramas, e mediram-se as respostas do pico maior. A quantidade, em mg, de ácido fólico foi calculada (C9H19N7O6) na porção de comprimidos usando a fórmula: (CV) (ru/rs),
Onde:
c= concentração (mg/mL), de ácido fólico padrão na solução padrão v= volume (mL) de solução amostra
ru= pico de resposta obtido na solução amostra rs= pico de resposta obtido na solução padrão
3.4.1 Preparo da fase móvel
Foi preparada em um balão volumétrico de 1000 mL, uma solução em que foram colocados 70 g de perclorato de sódio, 40 mL de metanol e 14 mL de hidróxido de potássio 1N. Verificou-se e corrigiu-se o pH no valor de 7,2. Após foi completado o volume do balão com água ultrapura e a solução foi homogeneizada e filtrada com o auxilio de uma bomba de vácuo, kitasato e papel filtro de 0,45µm.
3.4.2 Preparo da solução de diluição
Foi preparada em um balão volumétrico de 1000 mL, uma solução em que foram colocados 10 g de perclorato de sódio e 20 mL de hidróxido de amônio. Completou-se o volume com água ultrapura e a solução foi homogeneizada. A solução de diluição foi utilizada como solvente no preparo das amostras e dos padrões.
3.4.3 Preparo da solução system suitability
Foi preparada uma solução contendo 0,2 mg /mL de ácido fólico padrão e 0,2 mg/mL de compostos relacionados A do ácido fólico contendo 20 mL de solvente aquoso. Antes do uso a solução foi filtrada (filtro 1 µm) e transferida para vial apropriado para injeção no cromatógrafo.
3.4.4 Preparo da solução padrão de ácido fólico
Dissolveu-se cerca de 30 mg de ácido fólico padrão, corrigido com o conteúdo de água, em 20 mL de solvente aquoso. O volume foi ajustado quantitativamente para obter uma solução de concentração conhecida de aproximadamente 0,20 mg/mL. Antes do uso a solução foi filtrada (filtro 1 µm) e transferida para vial apropriado para injeção no cromatógrafo.
3.4.5 Preparo da amostra de ácido fólico
A seguinte amostra foi utilizada nos ensaios: Folin® 5 mg - lote: 11.018.13 Validade: 12/13. Cada comprimido revestido contém 5 mg de ácido fólico e excipientes. Foram pesados individualmente 20 comprimidos e calculado o peso médio. Estes foram triturados com auxílio de gral e pistilo e transferiu-se quantidade do pó, exatamente pesado equivalente a 10 mg de ácido fólico, para um balão volumétrico de 50 mL e foram adicionados 20 mL de solvente aquoso. Após 5 minutos no ultrassom para dissolver o ácido fólico, completou-se o volume com água ultrapura. A solução foi misturada e filtrada para um erlenmeyer, com papel filtro faixa preta e descartada a primeira porção do filtrado. Antes do uso a solução resultante foi filtrada (filtro 1 µm) e transferida para vial apropriado para injeção no cromatógrafo.
3.5 Cálculo estatístico de linearidade
Antes de iniciar o cálculo estatístico de linearidade foi aplicado em todas as análises, o teste Q, que indicou qual resultado deveria ser descartado por apresentar discrepância nos resultados.
A linearidade foi determinada através da construção da curva analítica da área do pico resultante versus a concentração do padrão de Ácido Fólico. Os padrões foram preparados com solução de diluição com aproximadamente 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70% da concentração de trabalho do padrão (200µg/mL), pois conforme consta na Resolução 899/2003 da ANVISA a faixa de concentração deve ser de 25 a 150% da concentração de trabalho que se quer validar. Para os resultados serem aceitos o coeficiente de correlação deve ser maior ou igual a 0,990.
3.6 Cálculo estatístico de repetibilidade e precisão intermediária
3.6.1 Repetibilidade
A repetibilidade foi demonstrada pelo ensaio de sete preparações de amostra do mesmo lote, preparados conforme item 3.4.5, as amostras foram quantificadas pelo método CLAE, no mesmo dia, pelo mesmo analista e a mesma instrumentação, a metodologia utilizada para o ensaio foi o procedimento operacional padrão da empresa.
3.6.2 Precisão intermediária
A precisão intermediária foi demonstrada pelo ensaio de sete preparações de amostra do mesmo lote, preparados conforme item 3.4.5, as amostras foram quantificadas pelo método CLAE, em dias diferentes, com analistas diferentes e a mesma instrumentação, a metodologia utilizada para o ensaio foi o procedimento operacional padrão da empresa.
3.6.3 Cálculo estatístico da exatidão
A exatidão foi determinada através de uma amostra, na qual quantidade conhecida de ácido fólico padrão foi adicionada ao placebo (lactose monohidratada, dióxido de silício, amidoglicolato de sódio, lactose monohidratada aglomerada, celulose microcristalina, estearato de magnésio, metacrilato dimetilamino etila copolímero, trissilicato de magnésio, dióxido de titânio, amarelo de quinolina laca (D
& C n°10), polietilenoglicol). Estas concentrações foram de 25, 100 e 125% da concentração teórica analisada (200µg/mL), cada concentração foi feita em triplicata.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1Seletividade/Especificidade
A seletividade ou especificidade foi determinada através da comparação dos cromatogramas do placebo (amostra isenta de ácido fólico), da amostra e do padrão de ácido fólico. Também podemos demonstrar a pureza do pico (peak purity index = 1) através do detector de arranjo de diodos. A figura 4 apresenta o cromatograma do placebo (amostra isenta de ácido fólico). Já a figura 5 apresenta o cromatograma do padrão de ácido fólico e a figura 6 a amostra de comprimido que contém ácido fólico.
Figura 4: Cromatograma do placebo
Figura 5: Cromatograma do padrão ácido fólico
Fonte: Autoria própria, 2012.
Figura 6: Cromatograma da amostra
Fonte: Autoria própria, 2012.
O método pode ser considerado seletivo (específico) pois comparando as figuras 2, 3 e 4, podemos observar que a figura 2, referente ao cromatograma do placebo (isento de ácido fólico), não apresentou nenhum pico. Entretanto, as figuras 3 e 4 apresentaram um único pico referente ao ácido fólico. Também pode-se observar que a pureza do pico das figuras 3 e 4 é demonstrado através do detector de arranjo
de diodos, onde apresenta peak purity index = 1.00, que representa 100% de pureza do pico. Comparando as figuras 3 e 4 podemos evidenciar que não existem diferenças entre eles, ou seja, trata-se do mesmo pico característico do ácido fólico.
4.2 Linearidade
A linearidade foi realizada a fim de garantir que os resultados obtidos são proporcionais à concentração do padrão de ácido fólico, de acordo com o intervalo definido no item 3.5.
De acordo com a RE 899/2003 o coeficiente de correlação deve ser maior que 0,990.
Foi construída a curva analítica de padrão de ácido fólico (figura 5) a partir da tabela 1, que apresenta os resultados obtidos através das análises de teor de ácido fólico pelo método CLAE.
Tabela 1: Resultados obtidos através dos ensaios para obtenção da linearidade
(µg/mL) 140 160 180 200 220 240 250
Área 1 6146237 7082562 7909159 8761223 9617061 10535698 10984336
Área 2 6173105 7072196 7914227 8779811 9612986 10545220 10990232
Área 3 6183468 7111695 7921276 8777069 9620657 10549284 10989106
Média 6167603,33 7088817,67 7914887,33 8772701 9616901,33 10543400,7 10987891,3 Fonte: Autoria própria, 2012.
Figura 6: Curva analítica da linearidade
Curva de Calibração y = 43511x + 87475 R2 = 0,9998 6000000 7000000 8000000 9000000 10000000 11000000 12000000 130 150 170 190 210 230 250 270 Concentração µg/mL Á re a
A figura 6 apresenta a curva analítica da área do pico resultante versus a concentração para a concentração do padrão de ácido fólico. Os padrões foram preparados conforme item 3.4.4 em aproximadamente 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70% da concentração de trabalho do padrão (200 µg/mL).
A linearidade do método pode ser validada pois a curva analítica obtida apresentou coeficiente de correlação (R2) igual a 0,99, conforme solicita a ANVISA na resolução RE 899/2003.
4.3 Exatidão
A exatidão foi determinada conforme consta no item 3.7, através do cálculo de % de recuperação.
Tabela 2: Resultados análise exatidão
Concentração (µg/mL) 50 200 250 Área 1 2239703 9046643 11313614 Área 2 2240186 8995500 11330966 Área 3 2243518 9011750 11278750 Média 2241136 9017964 11307776 DPR (%) 0,092687 0,289772 0,235172 [ ] padrão (mg/ml) 51,0934 205,5915 257,7946 % recuperação 102,1868 102,7958 103,1179 Média 102,7 Fonte: Autoria própria, 2012.
De acordo com os critérios de aceitação, que constam na resolução (RE 899/2003) da ANVISA, o percentual de recuperação deve estar entre 95 e 105%. Sendo que estas determinações foram feitas conforme consta no item 3.5. Assim, calculamos a média das concentrações de 50, 200 e 250 µg/mL e obtivemos o valor de 102,7% que é um valor considerado aceito para a exatidão do método.
4.4 Precisão
Para determinar a precisão, conforme consta no item 3.6, as análises foram feitas por dois analistas diferentes em dias diferentes obtendo os resultados a seguir. As tabelas específicas referentes às áreas do pico da amostra comparando dois analistas encontram-se no anexo 1e 2, respectivamente.
A tabela 3 apresenta os resultados do analista 1 no primeiro dia, as análises foram feitas em 7 réplicas pois o ácido fólico trata-se de um fármaco. Calculando o desvio padrão relativo obtemos o valor de 0,73%, este valor é aceitável para validar a repetibilidade do método, pois consta na resolução RE 899/2003 (ANVISA) que este valor deve ser menor que 5%.
Tabela 3: Resultados do analista 1 no primeiro dia
Analista 1 Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Média 9685704 10022456 9915877 9811916 9856365 9790851 9841510 DPR (%) 0,985784 0,333618 0,206733 0,130454 0,417758 0,396412 0,326267 [ ] padrão (mg/ml) 0,220593 0,228333 0,225883 0,223494 0,224515 0,22301 0,224174 Resultado (%) 109,28 111,04 111,34 111,12 111,57 111,27 111,76 Média 111,05 DPR (%) 0,7378 Fonte: Autoria própria, 2012.
A tabela 4 apresenta os resultados do analista 2 no segundo dia, as análises foram feitas em 7 réplicas pois o ácido fólico se trata de um fármaco. Calculando o desvio padrão relativo obtemos o valor de 0,46%, este valor é aceitável para validar a precisão intermediária do método, pois consta na resolução RE 899/2003 (ANVISA) que este valor deve ser menor que 5%.
Tabela 4: Resultados do analista 2 no segundo dia
Analista 2 Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 DPR (%) 0,204626 0,046969 0,058162 0,089381 0,32306 0,320184 0,070878 [ ] padrão (mg/ml) 0,219782 0,226811 0,217565 0,222677 0,22133 0,217537 0,222063 Resultado (%) 107,8 108,63 107,39 107,46 107,26 108,26 107,86 Média 107,81 DPR (%) 0,4615 Fonte: Autoria própria, 2012.
5 CONCLUSÃO
O objetivo deste trabalho foi suprir uma necessidade da empresa em atender as normas da legislação vigente, a RDC 17/2010 na qual cita que os métodos farmacopeicos não necessitam ser validados, porém é necessário que existam evidências documentadas de sua adequabilidade nas condições operacionais do laboratório.
A partir destas considerações efetuou-se a adequabilidade do método determinação de teor de ácido fólico. Os parâmetros verificados foram: seletividade (especificidade), linearidade, precisão e exatidão.
Todas as análises foram realizadas pela metodologia analítica CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência ou HPLC).
Para verificar o parâmetro da seletividade (especificidade) foram comparados os cromatogramas da amostra, padrão e o placebo. Para avaliar a linearidade foi construída uma curva analítica e avaliado o coeficiente de correlação, já a precisão foi determinada através da análise da variação dos resultados da análise de 7 amostras preparadas por dois analistas diferentes em dias diferentes.
A exatidão foi obtida pelo cálculo do percentual de recuperação de 7 amostras preparadas pelo mesmo analista no mesmo dia.
Observando os resultados obtidos pode-se concluir que os parâmetros avaliados neste trabalho estão de acordo com a RE 899/2003 (ANVISA, 2003) e serão utilizados como comprovação da adequabilidade do método de determinação do teor de ácido fólico no produto. Sendo assim método é seletivo, preciso e exato nas condições reais de uso do laboratório nas análises de rotina desse produto.
REFERÊNCIAS
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). Resolução da Diretória Colegiada nº 17 de 16 de abril de 2010 – Dispõe sobre as Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos. Brasília, 2010.
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). Resolução da Diretória Colegiada nº 899 de 29 de maio de 2003 – Guia para validação de métodos Analíticos e Bioanalíticos. Brasília, 2003.
ALBANO, Felipe Medeiros; RAYA – RODRIGUES, Maria Teresa. Validação e garantia da qualidade de ensaios laboratoriais – Guia Prático. Porto Alegre, RS: Rede Metrológica, 2009.
ALVES, Aline Scherer de. Estudo de Validação e Qualidade em Ensaios de Cobalto e Molibdênio. Trabalho de conclusão – Centro Universitário La Salle, Canoas, 2011.
BRITO, Natilene Mesquita. et. al. Validação de Métodos Analíticos: Estratégia e discussão. Revista Pesticidas: ecotoxicol e meio ambiente, Curitiba, v. 13, p. 129-146, jan/dez 2003. Disponível em:
<http://ojs.c3sl.ufpr.br/ojs-2.2.4/index.php/pesticidas/article/viewFile/3173/2546>. Acesso em: 19 maio 2012.
CAPONI, Fabiane. Estudo da Repetitividade e Reprodutibilidade da Vitamina C. Trabalho de conclusão – Centro Universitário La Salle, Canoas, 2010.
CASSIANO, Neila Maria et al. Validação em métodos cromatográficos para análises de pequenas moléculas em matrizes biológicas. Química Nova, São Paulo, v. 32, n. 4, 2009.
CELEGHINI, Renata Maria dos Santos et al. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica por CLAE-IR para determinação de artemisinina em artemisia anual. Química Nova, São Paulo, v. 32, n. 4, 2009.
CIENFUEGOS, Freddy; VAITSMAN, Delmo. Análise Instrumental. Rio de Janeiro: Interciência, 2000.
FARMACOPÉIA Brasileira. 5. ed. Brasília, 2010. Disponível em
<http://www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/index.htm>. Acesso em: 20 maio 2012.
GEYER MEDICAMENTOS. Home Page. Disponível em: <http://www.geyermed.com.br/site>. Acesso em: 18 abr. 2012.
HARRIS, Daniel C. Análise Química Quantitativa. São Paulo: LTC, 2008.
INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, Normalização E Qualidade Industrial (INMETRO). Orientações sobre validação de métodos de ensaios químicos – DOQ – CGCRE – 008. Brasília: INMETRO, 2003
LANÇAS, Fernando M. Aumentando a eficiência das colunas de HPLC por meio da diminuição do diâmetro das partículas da fase estacionária: até onde? Scientia Chromatographica, v. 3, n. 1, 2011.
LEITE, Flávio. Validação em análise química. Campinas: Átomo, 2002.
LEITE, Flávio. Impurezas de degradação. Scientia Chromatographica, v. 1, n. 2, 2011.
NETO, Álvaro José dos Santos. Uma visão técnica para a compreensão e resolução de problemas em sistemas de cromatografia líquida. Scientia Chromatographica, v. 1, n. 2, 2011.
PEDOTT, Alexandre Homsi. Análise de Dados Funcionais Alicada ao Estudo de Repetitividade e Reprotubilidade: a nova das Distâncias. Porto Alegre: [s.n], 2010.
RIBANI, Marcelo, et. al. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química Nova, São Paulo, v. 27, n. 5, set/out 2004.
RIBEIRO, Fabiane Alves de Lima. Planilha de validação: uma nova ferramenta para estimar figuras de mérito na validação de métodos analíticos univariados. Química Nova, v. 31, n. 1, 2008. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422008000100029&script=sci_arttext>. Acesso em: 21 maio 2012.
RODRIGUES, Braz Antonio. et al. Análises do Sistema de Medição “MSA” aplicado no ensaio de dobramento de agulhas cirúrgicas. Ciências Exatas, Taubaté, v. 2, n. 1, 2008.
SKOOG, Douglas A.; HOLLER, F. James; NIEMAN, Timothy A. Princípios de Análise Instrumental. Porto Alegre: Bookman, 2006.
SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J; CROUCH, S. R.; Princípios de Análise Instrumental-6. ed, Porto Alegre: Bookmann, 2009.
SIMÃO, Valesca Costa. Estudo do Desenvolvimento de Metodologia para Linearidade e Precisão, no Etabonato de Loteprednol. Trabalho de conclusão – Centro Universitário La Salle, Canoas, 2011.
APÊNDICE A: RESULTADOS DO ANALISTA 1 Analista 1 Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Área 1 9576330 9986505 9921898 9820967 9810021 9750921 9810480 Área 2 9728372 10052624 9893041 9802865 9888736 9828439 9874600 Área 3 9752410 10028239 9932691 9806543 9870338 9793194 9839451 Média 9685704 10022456 9915877 9811916 9856365 9790851 9841510 DPR (%) 0,985784 0,333618 0,206733 0,130454 0,417758 0,396412 0,326267 Peso médio (mg) 138,4 138,4 138,4 138,4 138,4 138,4 138,4 Massa (mg) 279,1 284,5 280,8 278,4 278,5 277,4 277,6 [ ] padrão (mg/ml) 0,220593 0,228333 0,225883 0,223494 0,224515 0,22301 0,224174 Resultado (%) 109,28 111,04 111,34 111,12 111,57 111,27 111,76 Média 111,05 DPR (%) 0,7378 Fonte: Autoria própria, 2012
APÊNDICE B: RESULTADOS DO ANALISTA 2 Analista 2 Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Área 1 9646852 9961649 9559786 9774982 9709607 9541911 9748966 Área 2 9632749 9953697 9553380 9785750 9691285 9529052 9743169 Área 3 9671749 9953409 9548718 9768445 9752456 9587275 9756933 Média 9650450 9956251 9553961 9776392 9717782 9552746 9749689 DPR (%) 0,204626 0,046969 0,058162 0,089381 0,32306 0,320184 0,070878 Peso médio (mg) 135,1 135,1 135,1 135,1 135,1 135,1 135,1 Massa (mg) 275,2 282 273,8 279,9 278,8 271,5 278,1 [ ] padrão (mg/ml) 0,219782 0,226811 0,217565 0,222677 0,22133 0,217537 0,222063 Resultado (%) 107,8 108,63 107,39 107,46 107,26 108,26 107,86 Média 107,81 DPR (%) 0,4615 Fonte: Autoria própria, 2012
