Transcriptase Reversa (DNA polimerase RNAdependente)

(1)

RT (transcrição reversa)-PCR Transcriptases reversas dos vírus AMV (“Vírus da Mieloblastose Aviária”) ou M-MuLV (“Vírus de Moloney da Leucemia do Ratinho”) podem ser usadas para produzir uma cópia de DNA complementar (cDNA) a partir de um molde de RNA.

5’

RNA

3’

Transcriptase Reversa

(DNA polimerase RNA-dependente)

+ primer

5’ 3’ cDNA

5’

3’

PCR

(2)

RT-PCR: para a síntese do cDNA pode usar-se um oligonucleótido específico, oligo(dT)_15-18, ou oligonucleótidos aleatórios - oligo(dN)₆

(3)

RT-PCR em 1 passo vs. RT-PCR em 2 passos

37-45 ºC

15-60 min

95 ºC 95 ºC

55 ºC

72 ºC

5 min

4 ºC



2 min

1 min

30-40 X

72 ºC

5 min

37-45 ºC

15-60 min

20 min

70 ºC

PCR

(4)

F R GP TP

_{Estudos de expressão e genes de referência.}

Os genes AGP6 e AGP11 são expressos unicamente no grão de pólen (GP) e tubo polínico (TP). A quantidade de cDNA total usada em cada reacção de PCR deve ser equivalente em todas as reacções da experiência. Os genes de referência Ubc9 e Tub4 (housekeeping genes) são usados para uniformizar a quantidade de cDNA em cada reacção

(5)

PCR com primers com adaptadores (para sequências de reconhecimento de enzimas de restrição, ou outro tipo de sequências)

PCR

(6)

RACE (“Rapid amplification of cDNA ends”) é uma variação de RT-PCR que amplifica sequências de cDNA desconhecidas correspondentes às extremidades 5’ ou 3’ do mRNA

5’-RACE

(7)

RACE (“Rapid amplification of cDNA ends”) é uma variação de RT-PCR que amplifica sequências de cDNA desconhecidas correspondentes às extremidades 5’ ou 3’ do mRNA

3’-RACE

(8)

PCR invertido (IPCR)

To obtain the promoter region of CrPrx1, a modification of an IPCR method (Ochman et al., 1988; Triglia et al., 1988) was performed as follows: TaqI- or Sau3AI-digested plant DNA (0.2 mg) was diluted to 1 ng/µL in T4 DNA ligase buffer (New England Biolabs), incubated at 65 °C for 5min, and then placed on ice for another 5 min. T4 DNA ligase was added (2 units) and the reaction mixture incubated for 16 h at 4 °C. DNA was then ethanol-precipitated and finally resuspended in 20 µL of DNase-free ddH2O. PCR was subsequently

performed on 7.5 µL of the ligated DNA preparation using an enzyme mixture of DNA polymerases (Taq and Tgo) with proofreading activity, according to the manufacturer’s instructions (Expand Long Template PCR System; Roche Molecular Biochemicals). Forward and reverse primers were

367-CAGAAATCACTATGCAAACATGC and 146-GGCCGAGTTGTTTGAGCTAC, respectively (forward primer was specific for a sequence in the first intron).

1350 800 M 1 2 A R F R F F Digestion R Taq I Taq I Ligation PCR Taq I B Taq I Taq I Taq I

(9)

PCR “nested”: 2 amplificações sucessivas: par de primers internos no 2º PCR: aumento da especificidade/validação de produto de PCR

(10)

PCR Multiplex: PCR com 2 a 20 pares de primers (várias reacções de PCR em simultâneo no mesmo tubo -> os amplificados têm que ter tamanhos diferentes)

•Verificar sequência dos primers “in silico” para possíveis interacções primer-primer

•Testar todos os amplificados separadamente usando o mesmo programa de PCR (idealmente não deve haver amplificados inespecíficos)

•Testar conjuntamente com todos os primers em concentrações equimolares e mesmo programa.

•Se alguns amplificados não aparecem (possivelmente os maiores) aumentar a concentração de primers para esses amplificados e limitar para os restantes.

•Outros variáveis: Temp. de emparelhamento e extensão, conc. tampão, conc. enzima, qualidade dNTPs.

(11)

PCR Multiplex: PCR com 2 a 20 pares de primers

Multiplex PCR of human genomic DNA for six exons of the human dystrophin gene. All

reactions were performed in duplicate as

described in the text. M, 100 bp ladder; Lanes 1 & 2, unaffected individual; Lanes 3 & 4,

affected individual 1; Lanes 5 & 6, affected individual 2; Lanes 7 & 8, affected individual 3.

(12)

PCR com primers degenerados para, por ex., isolar uma sequência génica num organismo quando só conhecemos a sequência desse gene em organismos relacionados; encontrar o maior número possível de sequências, traduzi-las,

alinhá-las, e procurar motivos conservados. Esses motivos podem ser locais adequados para desenhar primers degenerados

W P F A Q

TGG CCN TTY GCN CAR Ex.

Quantos primers diferentes na mistura? a) 5 b) 12 c) 24 d) 48 e) 64 f) 96

(13)

PCR com primers degenerados Na figura encontram-se alinhadas parte das sequências da enzima triose fosfato isomerase, para diferentes espécies muito distantes na escala evolutiva

Schizosaccharomyces_pombe VVACIGETLADREANETITVVVRQLNAIADKVQN--WSKIVIAYEPVWAI Saccharomyces_cerevisiae VILCIGETLEEKKAGKTLDVVERQLNAVLEEVKD--WTNVVVAYEPVWAI Lactuca_sativa VIACVGETLEQREAGTTMEVVAAQTKAIADKISS--WDNVVLAYEPVWAI Chlamidomonas_reinhardtii VIACIGETLEQRNSGSVFKVLDAQMDALVDEVKD--WTKVVLAYEPVWAI Drosophila_melanogaster VIACIGETLEEREAGKTNEVVARQMCAYAQKIKD--WKNVVVAYEPVWAI Homo_sapiens VIACIGEKLDEREAGITEKVVFEQTKVIADNVKD--WSKVVLAYEPVWAI Bacillus_subtilis PIICVGETLEEREAGKTNDLVADQVKKGLAGLSEEQVAASVIAYEPIWAI * ** * * * **** *** Schizosaccharomyces_pombe GTGKTGTPEEAQEVHAEIRKWATNKLGASVAEGLRVIYGGSVTGGNCKEF Saccharomyces_cerevisiae GTGLAATPEDAQDIHASIRKFLASKLGDKAASELRILYGGSANGSNAVTF Lactuca_sativa GTGKVASPAQAQEVHAGLRKWFCDNVSAEVSASTRIIYGGSVSGSNCKEL Chlamidomonas_reinhardtii GTGVVASPEQAQEVHAYLRQYCAKKLGAAVADKLRIIYGGSVSDTNCKDL Drosophila_melanogaster GTGQTATPDQAQEVHAFLRQWLSDNISKEVSASLRIQYGGSVTAANAKEL Homo_sapiens GTGKTATPQQAQEVHEKLRGWLKSNVSDAVAQSTRIIYGGSVTGATCKEL Bacillus_subtilis GTGKSSTAKDANDVCAHIRKTVAESFSQEAADKLRIQYGGSVKPANIKEY *** * * * ****

(14)

Genotipagem por PCR (ex. inserção Alu no locus PV92 do cromossoma 16)

PV92 Alu

Insertion

• A member of Alu repeat family

• Human-specific Alu insertion

• Found in a non-coding region of your DNA

• Not

diagnostic for any disease or disorder

5’ Alu 3’

(15)

Genotipagem por PCR

• The PV92 Alu is

dimorphic so

there are two

possible PCR

products:

641 bp

and 941 bp

No insertion: 641 bp 300 bp Alu insert 641 bp With Alu: 941 bp 5’ Alu 3’ Amplified Region

(16)

Genotipagem por PCR

*

Heteroduplex formado entre a cadeia de 641 bases e a cadeia de 941 bases

*

Primers concatenados

(17)

Alu

Repeats

• Classified as SINEs (Short

Interspersed Repetitive Element)

• Mobilized by an RNA

polymerase-derived intermediate (retroposition)

• Approx. 500,000 Alu copies per

haploid genome, representing about

5% of the genome

• Named for the Alu I restriction site

within the element

(18)

Evolutionary

Significance

of

PV92 Alu Inserts

• Highly conserved

• Inserted in the last 1,000,000

years

• Genotypes (+/+, +/–, –/–)

• Used in population genetics,

paternity analysis, and forensics

(19)

PCR com 3 primers: genotipagem de mutantes nulos de Arabidopsis por inserção de T-DNA (WT=selvagem; HZ=heterozigótico; HM= homozigótico)

N - Difference of the actual insertion site and the flanking sequence position, usually 0 - 300 bases MaxN - Maximum difference of the actual insertion site and the sequence, default 300 bps

pZone - Regions used to pick up primers, default 100 bps

Ext5, Ext3 - Regions between the MaxN to pZone, reserved not for picking up primers LP, RP - Left, Right genomic primer

BP - T-DNA border primer LB - the left T-DNA border primer BPos - The distance from BP to the insertion site

(20)

PCR de sobreposição (“overlap PCR”) para ligação de 2 produtos de PCR

PCR PCR

Extensão (sem primers) Combinar

Desnaturar/re-emparelhar

(21)

PCR de sobreposição (“overlap PCR”) para ligação de 2 produtos de PCR com locais de restrição nos flancos

PCR PCR

Extensão (sem primers) Combinar

Desnaturar/re-emparelhar

PCR

(22)

“Overlap” PCR: mutagénese sítio-específica: as mutações são introduzidas pelos primers. PCR1 PCR2 Misturar Desnaturar Emparelhar Estender PCR3

mutações em aminoácidos > rastrear funções biológicas, alterações estruturais mutações silenciosas > introduzir locais de restrição, ajustar utilização de codões

(23)

Método de mutagénese dirigida baseado no princípio do megaprimer. Protocolo de Tyagi et al., (2004). BMC

Biotechnology, 4:2

The first PCR (5 cycles) contains a limiting

concentration of the first flanking primer and is followed by a prolonged extension step. The second flanking primer is then added and the entire

mutated template is amplified by PCR (25 cycles). The second PCR product is digested with

appropriate restriction endonucleases to give desired mutated fragment, which then can be ligated to the expression vector.

(24)

Mutagénese dirigida (“site-directed mutagenesis”) baseado na utilização da enzima de restrição DpnI

(25)

(26)

Mutagénese dirigida (“site-directed mutagenesis”) baseado na utilização da enzima de restrição DpnI

General notes: DpnI cleaves only

when its recognition site is methylated. DNA purified from a dam+ _{strain will be}