RESUMO. 1 Introdução. Palavras-chave: Camundongos. Ratos. PCR. Mycoplasma pulmonis.

RESUMO

DEtECçãO DE MyCOPLASMA PULMOniS nO tRAtO RESPiRAtóRiO

SUPERiOR EM ROEDORES AtRAvéS DA téCniCA DE PCR

Cyntia Marques dos Santos Corrêa de Godoy1_{, Mara de Souza Junqueira}1_{, Robison José da Cruz}1_,

Flávio Martins Ferreira1_{, Selmo Vicente Bernardino da Silva}1_{, Leandro Iannuzzi}1_{, Juliana Bortolatto}1

Objetivo: apresentar a técnica de PCR para a detecção de Mycoplasma pulmonis das colônias convencionais de camundongos das linhagens isogênicas C57BL/6, BALB/c e heterogênica Swiss, e ratos Wistar. Material e Métodos: A extração do DNA foi realizada a partir de fragmento de traqueia, utilizando para a reação de PCR os oligonucleotí-deos iniciadores F: 5’- CA TGT TCT TGG CCA CCTAT - 3’ e R:5’ - ATC CCT CAA TGA separados por eletroforese em gel de agarose. A visualização e fotodocumentação

Resultados e conclusão

de Mycoplasma pulmonis º

Palavras-chave: Camundongos. Ratos. PCR. Mycoplasma pulmonis.

1 Diretoria Técnica de Apoio ao Ensino e à Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

Autor para correspondência: Milena Coutinho da Motta E-mail: milena@biot.fm.usp.br Recebido para publicação: 09/08/2011 Aceito para publicação: 18/12/2011

1 intRODUçãO

ser a menor bactéria autoreplicante2_{, apresentar}

diminuto genoma3 _{e ausência de parede celular.}

Devido a sua limitada capacidade de biossíntese, algumas espécies são parasitas de hospedeiros e

2_.

Permanece ainda a dúvida se micoplasmas aderem à superfície das células ou as invadem2_{. A}

falta de parede celular permite um contato íntimo entre a membrana do micoplasma e a membrana da célula hospedeira e, em condições apropriadas, pode ocorrer fusão celular1_{. Durante o processo}

de fusão, os componentes do micoplasma são liberados dentro da célula hospedeira e afetam as funções normais da célula, devido à ação de enzimas bacterianas, dentre as quais as nucleases4_,

que podem degradar o DNA da célula hospedeira. Os micoplasmas interagem com os fagócitos mononucleares, estimulando a síntese de citocinas

5_{, excretam peróxido de}

hidrogê-nio e radicais superóxidos, possibilitando lesões na membrana das células hospedeiras onde se aderem nos resultados experimentais quando presente nos animais de laboratório6_.

Por serem ubíquos no reino animal, poten-cialmente os mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes podem ser portadores de espécies de

conven-cionais apresentam alta prevalência desse agente infeccioso7,8 _{usualmente na forma subclínica,}

porém quando os animais encontram condições ambientais desfavoráveis, tais como aumento do hospedeiro, estresse experimental, por exem-plo, podem desenvolver sintomas clínicos, como pneumonia e otite8_.

O diagnóstico da infecção por Mycoplasma

pul-monis pode ser realizado utilizando métodos

so-rológicos como teste imunoenzimático (ELISA) e

in vitro é um processo demorado e esses métodos

sorológicos frequentemente dão resultados incor-retos devido às reações cruzadas entre diferentes espécies de micoplasmas. São exames de baixa sensibilidade, pois, no início da infecção ou em a sua detecção. A reação em cadeia de polimerase o resultado não será comprometido se a infecção estiver em um estágio precoce ou se o animal for

6_.

Com o intuito de ampliar as informações no contexto do monitoramento sanitário de animais de laboratório, o Laboratório de Biologia Mole-Medicina da Universidade de São Paulo implantou a técnica de PCR para a detecção do Mycoplasma

pulmonis, devido a sua alta sensibilidade e

espe-9_.

Dessa forma, o objetivo deste trabalho é apre-sentar a técnica de PCR para a detecção do

Myco-plasma pulmonis das colônias convencionais de

camundongos das linhagens isogênicas C57BL/6, BALB/c e heterogênica Swiss e de ratos Wistar.

2 MAtERiAL E MétODOS

2.1 Animais

sexos, com idade entre 10 e 11 semanas, das

linhagens isogênicas C57BL/6, BALB/c e da linhagem heterogênica Swiss e de ratos Wistar, -de -de Medicina da Universida-de -de São Paulo, criados em condições convencionais, protegidos com barreiras sanitárias, no período de janeiro de 2008 a dezembro de 2010, dentro do programa de Controle Sanitário da unidade. Todos os procedi-mentos foram realizados de acordo com princí-pios internacionais de ética e bem-estar animal e aprovados pelo Comitê de Ética do complexo HC/

º 251/11.

2.2 Coleta de Amostras

Os animais foram eutanasiados em câmara de CO₂ e, após a assepsia com etanol 70%, em ca-a retirca-adca-a de um frca-agmento de ca-aproximca-adca-amente 0,5 mm. O material coletado foi colocado em um microtubo e mantido a -80ºC até o momento do uso.

2.3 Extração de DnA

A extração do DNA foi realizada como descrito

por Ausubel10

-sumidamente, a solução de lise é preparada com os seguintes reagentes Tris-HCL 0,5M; NaCl 5M; SDS 10%; EDTA 0,5M; Proteinase K, diferen-ciando da original que utiliza fenol/clorofórmio/ álcool isoamílico.

2.4 Reações em cadeia da polimerase (PCR)

Para a reação de PCR, foram utilizados 100 ng de DNA; 0,2 mMdNTPsmix (desoxiribonu-cleotídeos trifosfato); 1X tampão da Taq DNA polimerase; 2,0 mM MgCl₂; 1U (unidade) de AmpliTaq DNA polimerase Platinum; água milli-1 reação de 20 mL e 0,5 µmol/L de cada

o Primer 3 Software frodo.wi.mit.edu/primer3 e www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, sendo que a região do genoma bacteriano inicia-se em 96732 e ter-mina em 96883.

minutos; 35 ciclos de 95ºC por 1 minuto, 58ºC por 4ºC. Os produtos obtidos pela PCR foram separa-dos por eletroforese em gel de agarose (Invitrogen ultrapura) 1,5% contendo brometo de etídio. O marcador de peso molecular utilizado foi 50 pb DNA Ladder (Invitrogen).

A visualização e fotodocumentação foi reali-zada sob luz ultravioleta no BioDoc-It Imaging System - UVP.

de animais positivos para Mycoplasma pulmonis detectados por meio da utilização da técnica de La-boratório de Controle de Qualidade Sanitária do CEMIB/UNICAMP, bem como controles negati-vos (água e reagentes).

3 RESULtADOS

espécie-especí-Mycoplasma pulmonis em

camundongos e ratos mantidos em sistema con-vencional podem ser observados na tabela 1. Os produtos da PCR para Mycoplasma pulmonis estão

uma amostra por espécie/linhagem por canaleta. O M.pulmonis foi detectado em camundongos isogênicos C57BL/6, BALB/c e heterogênicos Swiss, nas percentagens de 38, 24 e 14, respec-tivamente, e em ratos Wistar, na percentagem de 52 (Tabela 1).

4 DiSCUSSãO

Tabela 1 -

Espécie Camundongos Rato

Linhagem C57BL/6 BALB/c Swiss Wistar

Positivos/Total de animais

% positivos 38

Figura 1 - Mycoplasma pulmonis em diferentes

Penetrando pelas vias respiratórias, inicia a colo nização pela cavidade nasal, com provável progressão para ouvido médio, laringe, traqueia e pulmões. A evolução depende de fatores do hospedeiro (idade, linhagem e estado sanitário) e do ambiente, como altas concentrações de amô-bacteriana. Algumas linhagens de camundongos são altamente resistentes, sendo geralmente as-sintomática. Quando se manifesta clinicamente, pode provocar a doença crônica respiratória, com broncopneumonia aguda em combinação com outras infecções pneumotrópicas ou fatores ex-trínsecos. Em jovens, geralmente é inaparente. Em ranger os dentes, dispneia, perda de peso, letargia, pelos arrepiados, movimentos giratórios quando suspensos pela cauda, cabeça inclinada, perda de redor dos orifícios nasais e dos olhos. Pode ainda provocar infecção no trato genital com redução da fertilidade11_.

Neste estudo, a pesquisa de Mycoplasma

pul-monis possibilitou a detecção de camundongos

positivos, sendo 38% da linhagem C57BL/6, 24% da linhagem BALB/c e 14% do heterogênico Swiss; 52% de ratos Wistar.

Pesquisas sorológicas realizadas em outros países registraram uma prevalência de 69% de

M. pulmonis em camundongos de diferentes

biotérios na Coreia, em levantamento feito de 1999 a 200312_{. Em Taiwan, mais que 20% das}

colônias de camundongos estavam contaminadas em 200713_.

controlado no Brasil, 57% de positividade M.

pulmonis em camundongos, isolados por

cultu-ra. Enquanto que o diagnóstico sorológico, por ELISA, constatou 92% de positividade da mesma colônia, mostrando que a sensibilidade do ELISA foi maior do que a do isolamento por cultura14_.

Em ratos, houve a constatação de 75% infec-tados em biotérios da Coreia e 40% em biotérios de Taiwan12,13_{. Na Europa Ocidental, M .pulmonis}

foi o agente infeccioso mais prevalente em mais de 100 colônias analisadas entre 2007 e 200815,16_.

17_{, foram}

detec-tadas 64,58% de amostras positivas de 240 ratos Wistar convencionais, provenientes de 8 biotérios diferentes.

18,19 _recomenda

a triagem periódica dessa bactéria nas colônias de camundongos e ratos. O diagnóstico de infecção por micoplasma é geralmente realizada por de-terminação sorológica ou isolamento por cultura. Porém, no diagnóstico sorológico pode ocorrer frequentemente reações cruzadas entre espécies, enquanto, no cultivo, é muito demorado para al-guns micoplasmas exigentes15_{. Sendo assim, no}

foi implantada como rotina do programa de con-trole sanitário a técnica de PCR para a detecção de Mycoplasma pulmonis, por tratar-se de um -ção desse agente etiológico, além de apresentar uma economia nos custos de aproximadamente 40%, quando comparado aos custos do teste de ELISA, segundo a avaliação realizada em nosso laboratório.

As diferentes taxas de contaminação encon-tradas pelos diversos autores, provavelmente, deve-se ao fato de as colônias convencionais terem origens e manejo diversos, além de terem sido detectados por diferentes métodos. Os re-sultados apresentados neste artigo referem-se a animais de laboratório mantidos há mais de 30 anos em condições convencionais, data do início de Medicina da USP, com as barreiras sanitárias sendo introduzidas ao longo dos anos.

5 COnCLUSãO

MyCOPLASMA PULMOniS DEtECtiOn in thE RODEntS

RESPiRAtORy tRACt By PCR

Objective: To introduce the PCR technique for detection of Mycoplasma pulmonis in rats. Methods: DNA extraction was made from a fragment of the trachea, using the PCR primers F: 5’-CA TCT TGG TGT CCA CCTAT - 3’ and R:5’ - ATC CCT CAA TGA GCT GGT electrophoresis. The viewing and photo documentation were performed under ultravioleta light. Results and Conclusion: The PCR allowed the detection of positive mice, 38% of that the use of PCR technique was effective for the diagnosis of Mycoplasma pulmonis

Keywords: Mycoplasma pulmonis.

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ABS

tRAC

t

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REFERê

nCi