EFEITO DO D-ALFA-TOCOFEROL SOBRE A FUNÇÃO
RENAL DE RATOS HIPERTENSOS
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Mestre em Ciências.
SÃO PAULO 2006
EFEITO DO D-ALFA-TOCOFEROL SOBRE A FUNÇÃO
RENAL DE RATOS HIPERTENSOS
Tese preparada durante o Curso de Pós-Graduação em Farmacologia - área de concentração Fisiofarmacologia - no Departamento de Fisiologia, Disciplina de Fisiologia Renal e apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, como requisito parcial, para obtenção do título de Mestre em Ciências
pelo Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.
Orientador: Profa. Dra. Guiomar Nascimento Gomes
São Paulo 2006
xv, 125f.
Tese (mestrado) Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Farmacologia.
Título em inglês: Effect of D-alpha-Tocopherol on the renal function of hypertensive rats.
1. Hipertensão. 2. Lesão Renal. 3. D-alfa-Tocoferol. 4. Rim/ Fisiologia.
Departamento de Farmacologia
Chefe do Departamento de Farmacologia
Profa. Dra. Rosana de Alencar Ribeiro
Coordenadora da Pós-Graduação em Farmacologia
Profa. Dra. Catarina Segreti Porto
EFEITO DO D-ALFA-TOCOFEROL SOBRE A FUNÇÃO
RENAL DE RATOS HIPERTENSOS
Presidente da banca: Prof. Dr.
Banca examinadora Prof. Dr. Prof. Dr. Prof. Dr. Aprovado em __/__/__ iv
de Nível Superior (CAPES).
interrompidos antes de terminar. Portanto, devemos: fazer da interrupção um caminho novo, da queda, um passo de dança, do medo, uma escada... do sonho, uma ponte, da procura, um encontro”.
Fernando Pessoa
respeito e por acreditar em mim.
À Profa. Dra. Guiomar Nascimento Gomes, minha orientadora, por todas as oportunidades concedidas, por toda confiança depositada, pelo carinho e amizade.
À Profa. Dra. Frida Zaladek Gil, pelo incentivo e pela tarefa louvável em transmitir os conhecimentos éticos para a pesquisa.
À Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina –UNIFESP-EPM, pela oportunidade.
Ao Departamento de Farmacologia da UNIFESP-EPM, em especial o setor de Fisiologia Renal e Termometabologia, pelo apoio e o incentivo ao meu crescimento pessoal e capacitação científica.
À biomédica e amiga Maria de Fátima Cavanal, por toda a paciência e todos os ensinamentos que enriqueceram este trabalho.
Ao pós-graduando Luigi Rocco, pela amizade e dedicação.
Aos alunos de graduação e amigos André Luís Laranjeira Forti e Mayra Zanetti, pela disposição em colaborar na realização prática e teórica dos diversos experimentos realizados.
Á Profa e amiga Sandra Lucas que esteve comigo em muitos momentos – de idéias e concretização.
Á Profa. Dra. Silvia Oliveira Rocha, pelo incentivo e amizade.
À Profa. Dra. Jacqueline Luz, à Profa. Mariana Doce Passadore e à biomédica Silvia, pelo respeito e carinho.
Á minhas amigas Renata Romanato e Amanda Magaton, pelo apoio nos momentos mais difíceis desta jornada e pelo incentivo para que não desistisse diante dos obstáculos.
Ao Rubens, pela paciência nas horas em que não pude estar com ele e por todas as horas em que ele esteve comigo.
Ao Milton da Disciplina de Nefrologia e à Ivone da Disciplina de Neurofisiologia, pela colaboração e pelos ensinamentos durante o meu trabalho.
À secretária Patrícia Felix da Silva, pela amizade e por me ajudar nos momentos que precisei.
À Luciane Santos Oliveira, secretária do Programa de Pós-graduação em Farmacologia UNIFESP-EPM, por sua dedicação a todos os pós-graduandos. À Profa. Dra. Catarina Segreti Porto, coordenadora do Programa de Pós-graduação em Farmacologia da UNIFESP-EPM.
Dedicatória--- vii
Agradecimentos--- viii
Lista de figuras--- xi
Lista de tabelas ---xii
Lista de abreviaturas e símbolos--- xiii
Resumo--- xv
1. INTRODUÇÃO--- 01
1.1 A hipertensão arterial e a função renal --- 02
1.2 Mecanismos de lesão renal --- 05
1.3 D-alfa-Tocoferol--- 13
1.4 Objetivos--- 15
2. MATERIAL E MÉTODOS--- 16
2.1 Modelo experimental---17
2.2 Estudo da função renal---19
2.3 Determinações --- 22
2.4 Análise morfológica dos rins--- 26
2.5 Cálculo da resistência da artéria renal --- 27
2.6 Método estatístico--- 28 3. RESULTADOS---29 4. DISCUSSÃO--- 45 5. CONCLUSÃO--- 57 6. ANEXOS---59 7. REFERÊNCIAS---105 Abstract x
Figura 1 – Curva de crescimento--- 33
Figura 2 – Gráfico de pressão arterial sistólica ao longo do tratamento---34
Figura 3 – Gráfico de função renal--- 35
Figura 4 – Gráfico de acidez titulável e carga excretada de amônio--- 36
Figura 5 – Gráfico de fração de excreção de sódio--- 37
Figura 6 – Gráfico de fração de excreção de potássio---38
Figura 7 – Gráfico de resistência vascular renal e espessura da camada média das artérias interlobulares---39
Figura 8 – Artérias interlobulares coradas pelo método de Verhoff---40
Figura 9 – Gráfico de área glomerular---41
Figura 10 – Cortes histológicos corados pelo método de Tricômio de Masson42 Figura 11 – Cortes histológicos corados pelo método de HE--- 43
Figura 12 – Gráfico de proteinúria e osmolaridade--- 44
Tabela 1 – Valores médios de peso corporal e renal--- 33 Tabela 2 – Valores médios de pressão arterial sistólica--- 34 Tabela 3 – Valores médios de função renal---35 Tabela 4 – Valores médios de acidez titulável e carga excretada de amônio - 36 Tabela 5 – Valores médios de excreção de sódio--- 37 Tabela 6 – Valores médios de excreção de potássio--- 38 Tabela 7 – Valores médios de resistência vascular renal e de morfologia das
artérias interlobulares--- 39
Tabela 8 – Valores médios de morfologia renal --- 41 Tabela 9 – Valores médios de proteinúria e osmolaridade---44
α Alfa
β Beta
ANGII Angiotensina II
ANSR Atividade do Nervo Simpático Renal
AP-1 Ativador de Plasminogênio
AT Acidez Titulável
AT1 Receptor de Angiotensina Tipo 1
cAMP AMP ciclíco
CE Carga Excretada
cGMP GMP cíclico
ECA Enzima Conversora de Angiotensina
ECMAI Espessura da Camada Média das Artérias Interlobulares
EDHF Fator Hiperpolarizante Derivado do Endotélio
EDRF Fator Relaxante Derivado do Endotélio
ENac Epithelial Sodium Channel
ENOS Óxido Nítrico Sintase Endotelial
ET-1 Endotelina
FE Fração de Excreção
FF% Fração de Filtração
FGF Fator de Crescimento de Fibroblasto
FPR Fluxo Plasmático Renal
FSR Fluxo Sangüíneo Renal
g Gramas
HE Hematoxilina e eosina
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
ICAM-1 Moléculas de Adesão Intracelular
IgA Imunoglobulina A
iNOS Óxido Nítrico Sintase Induzível
LDL Lipoproteína de Baixa Densidade
MCP-1 Peptídeo Quimiotáxicos de Monócitos-1
mg/24 hs Miligramas por 24 horas
mg/dl Miligramas por Decilitro
mOsm/l Miliosmol por Litro
Na+ Íon Sódio
NaCl Cloreto de Sódio
NADPH Nicotinamida-Adenina-Dinucleotídeo-Fosfato-Hidrogênio
NaOH Hidróxido de Sódio
NF-kappaβ Natural Killer- kappa beta
NH4+ Íon Amônio
nNOS Óxido Nítrico Sintase Neuronal
NO Óxido Nítrico
NOS Óxido Nítrico Sintase
O2- Ânions Superóxido
OPS Organização Pan-americana de Saúde
P Peso
PA Pressão Arterial
PAH Ácido Paraminohipurato de Sódio
PDGF Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas
PK+ Concentração Plasmática de Potássio
PNa+ Concentração Plasmática de Sódio
RFG Ritmo de Filtração Glomerular
ROMK Renal Outer Medullar K
ROS Espécies Reativas de Oxigênio
RVR Resistência Vascular Renal
SRA Sistema Renina-Angiotensina
SHR Ratos Espontaneamente Hipertensos
SOD Superóxido Dismutase
TGFβ Transforming Growth Factor β
U/P Urina/Plasma
V Fluxo urinário
V1a Receptor de Vasopressina 1a
VCMA-1 Molécula de Adesão Vascular
WKY Rato Wistar-Kyoto
Objetivos: Estudar a morfologia e a função renal de ratos hipertensos tratados com
D-alfa-Tocoferol visando avaliar um possível efeito protetor do D-alfa-Tocoferol sobre as alterações da função renal causadas pela hipertensão arterial. Métodos: Ratos Wistar Kyoto (controle) e SHR (hipertensos) machos, com 2 meses de idade (200g), foram divididos em 4 grupos experimentais: controle tratado com óleo mineral (C), controle com D-alfa-Tocoferol (CT), hipertenso com óleo mineral (H), hipertensos com Tocoferol (HT). Os grupos CT e HT receberam D-alfa-Tocoferol (36mg/kg) em dias alternados por 60 dias. As pressões arteriais sistólicas foram aferidas quinzenalmente. A avaliação da função renal e a análise morfológica foram realizadas aos 4 meses de idade. Resultados: Observamos queda significativa da pressão arterial em HT em relação ao grupo H. Os animais do grupo H apresentaram valores de ritmo de filtração glomerular (RFG) menores que o grupo C. Em HT houve aumento do RFG em relação ao H. O fluxo urinário (V) no grupo H foi significativamente menor que os de C. Em HT os valores de V foram semelhantes aos de C. A fração de excreção e a carga excretada de Na+ em H foram
significativamente menores que em C. Em HT houve aumento de excreção de Na+
em relação ao grupo H. Os animais do grupo H apresentaram valores de carga excretada e fração de excreção de K+ significativamente menores que em C. Já em
HT, os valores de excreção de K+ foram semelhantes aos do grupo C. Em H
observamos aumento da ECMAI e da RVR em relação ao grupo C, enquanto que nos animais hipertensos tratados com D-alfa-Tocoferol não observamos estas alterações. Quanto à área glomerular, nos animais hipertensos, o tratamento com D-alfa-Tocoferol causou redução neste parâmetro. Observamos valores de proteinúria significativamente maiores nos animais hipertensos que no grupo controle e o tratamento com D-alfa-Tocoferol não alterou a excreção de proteínas no grupo HT.
Conclusões: O tratamento com D-alfa-Tocoferol preveniu a hipertrofia glomerular e
vascular; melhorou a função renal e a função vascular; normalizou a excreção renal de eletrólitos e água e reduziu a pressão arterial. O tratamento com D-alfa-Tocoferol foi benéfico, reduzindo os danos renais e vasculares causados pela hipertensão
arterial nos animais SHR.
1.1- A hipertensão arterial e a função renal
A hipertensão arterial é uma desordem vascular com etiologia complexa, contribuindo para outras doenças como: acidentes vasculares cerebrais, aterosclerose, falência renal e cardíaca e infarto do miocárdio (Izzo, Black, 1999).
Estima-se que existam 3,45 bilhões de adultos (a partir de 20 anos de idade) hipertensos no mundo, sendo que na população com mais de 60 anos de idade, mais de 50% é hipertensa (Mulrow, 1999). Na China, a estimativa é de 90 milhões de adultos hipertensos (Tao et al., 1995).
Nos EUA, a hipertensão atinge cerca de 50 milhões de indivíduos, ou seja, ¼ da população, e seu tratamento representa um custo assistencial de 37,2 bilhões de dólares ao ano (Carvalho, Almeida, 2001). No Brasil, estima-se que 15% a 20% da população adulta seja hipertensa (Silveira et al., 2001). Assim, devido a sua alta prevalência na população adulta e produtiva, a hipertensão pode ser considerada um dos principais problemas de saúde pública.
A etiologia da hipertensão arterial essencial, que acomete cerca de 90 a 95% da população de hipertensos (OPS, 1990), não está totalmente definida. Uma vez instalada, resulta em modificações nos rins, contribuindo para o desenvolvimento da nefroesclerose, exacerbando a hipertensão e resultando na falência renal (Razzaque et al., 2003).
Existem evidências que fatores como a idade, a raça negra ou o tabagismo, associados com a pressão arterial, contribuem para o desenvolvimento e progressão da nefroesclerose hipertensiva. Distúrbios metabólicos, abuso de drogas como cocaína e antiinflamatórios não-esteroidais, ingestão de sal, intoxicação por metais pesados e eventos intrauterinos e perinatais, também são
considerados fatores de risco. Fatores genéticos parecem estar envolvidos na sua gênese, como a suscetibilidade renal à hipertensão, onde genes podem determinar quão severas serão as lesões renais (Tylicki et al., 2002).
Richard Bright, em 1836, foi o primeiro autor a sugerir a inter-relação entre doença renal e hipertensão, estabelecendo assim, o conceito de origem renal da doença cardiovascular (Harlos, Heidland, 1994). Em 1879, a hipertensão como causa de lesão renal, foi sugerida pioneiramente por Mahomed (Cameron, Hicks, 1996).
Nesse contexto, o rim exibe um comportamento ambivalente, podendo ao mesmo tempo ser a causa da hipertensão ou sofrer seus efeitos lesivos, o que contribui, à medida que a lesão evolui, para manter o “círculo vicioso de Klahr” que propicia a progressão da lesão até os estágios de insuficiência renal terminal (Klahr, 1989).
No início do século passado, Fahr e Volhard (1919) observaram que a hipertensão arterial poderia causar alterações no tecido renal que resultavam no endurecimento deste órgão. Estes autores denominaram estas alterações de nefroesclerose. Posteriormente, o endurecimento do tecido renal foi atribuído ao processo de cicatrização ou substituição do parênquima renal normal por fibras de colágeno(Freedman et al., 1995).
Apesar do termo nefroesclerose estar amplamente difundido, não é exato, pois sugere um caráter prognóstico benigno às lesões vasculares da hipertensão essencial (nefroesclerose benigna) e implica um aspecto de esclerose que não está presente nas fases iniciais da doença (Malheiros, Saldanha, 1998). A nefroesclerose seguida das conotações benigna ou maligna, conforme o tipo de evolução do processo, também ocorre com o envelhecimento normal, mas é
exacerbada pela hipertensão arterial e ou, pela presença de outras doenças, como, por exemplo, o diabetes mellitus (Tylicki et al., 2002).
Na fase inicial do processo hipertensivo, o rim pode exibir características morfológicas dentro da normalidade. Com o passar do tempo as lesões vasculares decorrentes da hipertensão determinam o grau de comprometimento renal. Na fase benigna clássica, os rins apresentam–se com o volume normal ou moderadamente contraído, com a superfície externa finamente granulada, enquanto que na fase maligna, ele poderá se apresentar com volume normal ou aumentado, com petéquias difusas na superfície externa, que são conseqüentes ao extravasamento de sangue a partir das lesões arteriolares (Ribeiro, 1996).
Vários estudos indicam que a disfunção renal está intimamente ligada ao desenvolvimento da hipertensão em humanos e em modelos de animais experimentais (Roman, Cowley, 1985; Roman, 1986; Gross et al., 1994; Liu et al., 1994).
O Multiple Risk Factor Intervention Trial (MRFIT) mostrou que o risco crescente do desenvolvimento da insuficiência renal crônica terminal correlaciona–se com o aumento da pressão arterial. Quando a pressão arterial sistólica era maior que 200 mmHg, o risco de insuficiência renal crônica terminal era 48,2 vezes mais alto quando comparado a uma pressão arterial sistólica menor que 120 mmHg (Ljutié, Kes, 2003). No estudo Modification of Diet in Renal
Disease, os autores observaram que dos 95% de indivíduos com hipertensão
arterial, 83% tinham uma filtração glomerular menor que 10ml/min (Porush, 1998). A hipertensão maligna é aceita como causa de insuficiência renal, entretanto a relação da hipertensão essencial benigna com a insuficiência renal crônica terminal não é tão clara (Whitworth, 2005). Os dados da literatura têm sido
contraditórios em relação ao risco de hipertensos leves a moderados desenvolverem insuficiência renal clinicamente significante (Fournier et al., 1994; Zuchelli et al., 1995). Alguns autores observaram que não somente a hipertensão maligna, mas também a hipertensão benigna acelera o desenvolvimento de doenças renais (Baldwin, Neugarten, 1985; Shimamatsu et al., 1985).
Rosansky et al. (1990), estudaram 56 hipertensos essenciais e 59 normotensos controles por um período médio de 9,8 anos. Sendo que no início da observação, todos apresentavam valores séricos de creatinina normais e não apresentavam proteinúria. Estes autores observaram declínio na função renal significativamente maior nos hipertensos que no grupo controle.
Klag et al. (1996)estudaram a relação entre os diferentes valores de pressão arterial e o subseqüente desenvolvimento da insuficiência renal crônica terminal, e observaram que o risco relativo de desenvolver insuficiência renal crônica terminal variou conforme o nível da pressão arterial (estágios 1 a 4). Sugerindo que a hipertensão está associada ao aumento do risco de insuficiência renal crônica terminal. Além disso, Pohl et al. (1974), Mogensen (1982) e Bergstrom et al. (1986), observaram que a diminuição da pressão arterial diminui o ritmo de deterioração dos rins na falência renal.
1.2- O mecanismo de lesão renal
O comprometimento da função renal causado pela hipertensão parece ser causado por mecanismos distintos: - estreitamento ou obstrução de vasos pré – glomerulares resultando em isquemia; - transmissão da elevada pressão arterial pela perda da auto-regulação dos vasos pré-glomerulares (Klag et al., 1996;
Takebayashi et al., 2001); - participação da resposta inflamatória no compartimento tubulointersticial (Mai et al., 1993; Luft, Haller, 1995; Johnson et al., 2002); - excesso de ânions superóxidos e queda da bioatividade do óxido nítrico (NO) na vasculatura e nos rins (Chabrashvili et al., 2002; Touyz, 2003; Kishi et al., 2004).
Em condições normais, o mecanismo de auto-regulação do fluxo sangüíneo renal impede a transmissão da pressão arterial sistêmica elevada para os glomérulos, devido ao mecanismo de vasoconstrição da arteríola aferente. Em hipertensos leves a moderados, esse mecanismo de auto-regulação fisiológica está mantido, por isso a maioria dos hipertensos leve a moderados não desenvolve lesão renal significante. Iversen et al. (1987) observaram que na fase inicial da hipertensão em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) o dano renal era limitado, pois a pressão do capilar glomerular permanecia normal devido ao aumento da resistência da arteríola aferente.
Porém, uma falha parcial do mecanismo auto-regulatório do fluxo sangüíneo renal, permite a transmissão da elevada pressão arterial para o glomérulo – hipertensão intraglomerular – levando a hiperfiltração glomerular e conseqüentemente a esclerose glomerular (Ofstad et al., 1992). Esta é ainda exacerbada pela perda progressiva de outros néfrons. Os glomérulos remanescentes tornam-se hipertrofiados e com glomeruloesclerose segmentar (Hostetter et al., 2001).
Outros fatores podem estar envolvidos na lesão glomerular na hipertensão, como a lesão da célula endotelial (Luft, Haller, 1995). As células endoteliais formam uma camada de células alinhadas estrategicamente na parede do vaso, capaz de perceber as alterações hemodinâmicas e, juntamente com a camada
muscular lisa, responder a essas alterações levando a vasodilatação ou a vasoconstrição, como resposta imediata, e a modificações estruturais na parede em situações crônicas. Além disso, elas modulam processos biológicos relacionados à parede do vaso sangüíneo, incluindo a regulação da permeabilidade de lipoproteínas plasmáticas, adesão leucocitária, e a liberação de fatores pró-trombogênico e anti-trombogênico, fatores de crescimento e substâncias vasoativas (Rubanyi, 1993).
A lesão vascular causada pela hipertensão parece estar diretamente relacionada com a distensão da parede vascular como também pela agressão causada pelo shear stress (Lehoux, Tedgui, 1998). O shear stress é uma força tangencial resultante do atrito do sangue com o vaso e, parece atuar principalmente na superfície das células endoteliais. Esta força hemodinâmica parece ser particularmente importante porque ela estimula a liberação de substâncias vasoativas e muda a expressão gênica, o metabolismo e a morfologia celular (Davies, 1995).
O aumento do fluxo sangüíneo provoca aumento do shear stress sofrido pela parede vascular. O endotélio por sua vez, responde com a produção e a liberação imediata de NO, de prostaciclina, de ácidos epoxieicosatrienóicos e talvez de outros fatores relaxantes derivados do endotélio. O NO estimula a formação de cGMP, que abre os canais de potássio, hiperpolarizando a célula e diminuindo a entrada de cálcio na célula através do canal voltagem dependente (McDonald, Murad, 1996). As prostaciclinas atuam sobre um receptor para promover a vasodilatação por uma via dependente de cAMP. Os ácidos epoxieicosatrienóicos são potentes vasodilatadores os quais também abrem os canais de potássio nas células de músculo liso (Roman, 1999). Além disso, ocorre diminuição da
expressão da enzima conversora de angiotensina (ECA) e da endotelina-1 (ET-1), conseqüentemente diminuição da liberação de angiotensina II (ANGII) e aumento de bradicinina; resultando na vasodilatação.
O rim é um local muito importante na produção de NO (Nava et al., 1996), onde os seus efeitos são manifestados no local o qual foi produzido (Cowley, 1995). O NO participa nos vários processos vitais do rim, incluindo a regulação do fluxo sangüíneo renal, a resposta túbulo-glomerular (Welch et al., 1999), a secreção de renina e a regulação do volume extracelular (Mattson et al., 1996, Kone, Baylis, 1997).
Uma família de enzimas flavo-hemoproteínas associadas chamada de óxido nítrico sintase (NOS), converte a L-arginina biologicamente ativa numa forma intermediária instável, o NO, que é quebrado, formando componentes estáveis, o nitrito e o nitrato (Ignarro, 1996). Essa reação requer pelo menos seis cofatores incluindo, o NADPH, o FAD, o FMN, a tetrahidrobiopterina, o heme e a calmodulina (Ignarro, 1996). Três isoenzimas de NOS sintetizam o NO: a NOS neuronal (nNOS, tipo 1), a NOS induzível (iNOS, tipo 2) e a NOS endotelial (eNOS, tipo 3) (Flora Filho, Zilberstein, 2000).
A expressão da isoforma iNOS ocorre em diversos sistemas celulares tais como o endotélio vascular, o músculo liso e em macrófagos na resposta a estímulos como endotoxinas, citocinas e produtos microbianos (Nussler et al., 1993; Bredt, Snyder, 1994). A isoforma eNOS é produzida pelas células endoteliais da vasculatura, onde funciona como vasodilatador pelo relaxamento das células do músculo liso vascular (Busse et al., 1993). O NO produzido pela isoforma nNOS é liberado nas células neuronais e atua com neurotransmissor (Bredt, Snyder, 1994).
No rim, a eNOS é encontrada primariamente no revestimento endotelial dos vasos sangüíneos; o NO derivado do eNOS diminui a resistência vascular renal, contrariando os efeitos dos vasoconstritores endógenos tal como a angiotensina II (Braam, 1999; Frohlich, 1997). A NOS endotelial pode também modular diretamente a reabsorção de sódio no rim (Wilcox et al., 1993).
A NOS neuronal detectada na mácula densa (Beierwaltes, 1997) e em menor quantidade nos ductos coletores corticais (Wang et al., 1998), tem um papel chave na secreção de potássio, reabsorção de sódio regulado por hormônio (Giebisch, Wang, 1996) e na modulação da resposta túbulo-glomerular (Wilcox, 1998; Braam, 1999). O NO derivado da nNOS foi sugerido ser um importante regulador da secreção de renina mediada pela mácula densa (Beierwaltes, 1997; Braam, 1999). Dados recentes da literatura demonstraram que ratos espontaneamente hipertensos (SHR) apresentam uma menor expressão de eNOS e nNOS, sugerindo que essas enzimas possam ter importância na fisiopatologia da hipertensão arterial (Xu et al., 2000).
A hipertensão arterial prolongada, lesa as artérias interlobulares e arteríolas, produzindo redução da sua luz por espessamento das camadas muscular e elástica, podendo ocorrer também, a fibrose da íntima. Estas alterações podem resultar no comprometimento das artérias arqueadas e interlobares, reduzindo o fluxo sangüíneo efetivo e a filtração glomerular, levando, secundariamente, à isquemia glomerular e túbulo-intersticial (Ribeiro, 1996).
Na hipertensão mais severa, ocorre redução do fluxo sangüíneo, devido ao aumento da resistência vascular, de modo que o shear stress diminuí. A redução do shear stress aumenta a produção da endotelina-1, promove a ativação da ECA, aumenta a conversão de ANGI em ANGII e diminuí a secreção de NO e
TGF-β, propiciando condições favoráveis à proliferação das células musculares. A endotelina -1 (ET - 1) é um peptídeo vasoconstritor produzido pelo endotélio e tem destacado-se pelo seu efeito sobre a função vascular. Estudos recentes sugerem a relação da ET - 1 na patogênese e na manutenção da hipertensão por afetar a hemodinâmica e a função excretora renal (Krum et al., 1998; Schiffrin, 2001; Montanari et al., 2003). O efeito vasoconstritor de ET - 1 sobre as artérias renais isoladas é maior em SHR quando comparado com o Wistar-Kyoto (WKY). Embora os animais SHR apresentem valores plasmáticos de endotelina mais baixos, a sua neutralização por anticorpos específicos contra endotelina em SHR, resulta em queda significante na pressão arterial e na resistência vascular renal, aumentando o RFG e o FPR.
A endotelina parece também alterar a função vascular através do aumento do estresse oxidativo, principalmente pela ativação dos genes dependentes de redox, pela estimulação da NF kappaβ e pela ativação da proteína S-1 (AP-1). A estimulação de moléculas de adesão vascular (VCMA-1), de moléculas de adesão intercelular (ICAM-1), de peptídeo quimiotáxicos de monócitos-1 (MCP-1) e de outros mediadores os quais levam a atração de macrófagos e neutrófilos para o interior da parede vascular, juntamente com a estimulação de fatores de crescimento (TGF-β), resulta no crescimento tecidual e na resposta inflamatória encontrada em alguns modelos em que a ET-1 está envolvida (Nicoletti, Michel, 1999; Muller et al., 2000).
As células endoteliais também atuam sobre a adesão leucocitária, a migração de monócitos e leucócitos na parede do vaso sangüíneo pela expressão de proteínas quimiotáxicas, como MCP-1 e pela expressão de moléculas de adesão, como VCAM-1 e ICAM-1 (Cybulsky, Gimbrone, 1991). Vários
pesquisadores demonstraram a relação inversa entre a expressão de VCAM-1 e o
shear stress, sugerindo que a adesão leucocitária deve estar diminuída em
condições de shear stress aumentado (Walpola et al., 1995; Ando et al., 1995; Tsao et al., 1995). Deste modo, é provável que a queda do shear stress resulte na adesão de leucócitos e transmigração dos mesmos, pelo aumento da expressão das moléculas de adesão e das proteínas quimiotáxicas (Traub, Berk, 1998).
O sistema imune parece ter um papel importante na patogenia da hipertensão (Abumiya et al., 1996; Geiger et al., 1997), com a infiltração de macrófagos e linfócitos no rim favorecendo o desenvolvimento ou manutenção de algumas formas de hipertensão (Okamura et al., 1999; Rodriguez-Iturbe et al., 2001). Segundo Quiroz et al. (2001) e Rodriguez-Iturbe et al. (2001), muitas das células mononucleares são os locais de geração de oxidantes, sendo relevante que, o sistema renina–angiotensina esteja ativado durante a diferenciação monócito–macrófago (Yanagitani et al., 1999). Além disso, a estimulação do receptor AT1 em macrófagos contribui para o aumento da produção de peróxido (Rodriguez-Iturbe et al., 2001). Portanto, o aumento da produção de radicais livres pelo infiltrado de macrófagos também parece participar deste processo, onde espécies reativas de oxigênio (ROS) agem como molécula de sinalização (Laursen et al., 1997; Trolliet et al., 2001).
O estresse oxidativo pode estar aumentado durante a hipertensão pelo aumento da produção de ROS tais como ânions superóxidos (O2-), peróxido de
hidrogênio (H2O2) ou pela queda das enzimas antioxidantes como a superóxido
dismutase (SOD) (Manning Jr et al., 2003). As espécies reativas de oxigênio podem atuar através de vários mecanismos resultando em mudanças vasculares na hipertensão: (1) ação direta nas células endoteliais e nas células musculares
lisas; (2) produção do peróxido nitrito, um potente constritor e oxidante do radical lipídico; (3) efeitos sobre o metabolismo de eicosanóide da célula endotelial; e (4) modificação oxidativa do LDL (Rubbo et al., 1995; Abe, Berk, 1998).
As espécies reativas de oxigênio podem também inativar os fatores de relaxamento endotelial, tais como o NO ou a prostaciclina. Desta maneira, em algumas patologias associadas com alto estresse oxidativo, como a hipertensão (Auch-Schwelk et al., 1989; Maggi et al., 1995), existe uma forte relação entre a alta geração de radicais livres e a tonicidade vascular alterada (Auch-Schwelk et al., 1989; Suzuki et al., 1998; Rota et al., 1998).
Dados de modelos experimentais sugerem que o aumento da concentração de O2- na vasculatura, resulta na rápida captura do NO, levando ao aumento do
tônus vascular e conseqüentemente, a elevação da pressão arterial (Harrison, Ohara, 1995; Panza, 1997). A maior produção de radicais livres e o aumento da sensibilidade dos hipertensos sujeitos ao estresse oxidativo é demonstrado em humanos (Kumar, Das, 1993) e em animais SHR (Kerr et al., 1999). Os SHR têm maior peroxidação lipídica que os seus controles (Schimke et al., 1995; Kitts et al., 1998), resultados que também podem estar relacionados à baixa proteção aos radicais livres, particularmente, pelos baixos níveis teciduais de D-alfa-Tocoferol (Schimke et al., 1995).
No rim, o aumento da produção de O2- está associado com a diminuição da
atividade biológica do NO, influenciando no tônus da arteríola aferente, na resposta túbulo-glomerular, na reabsorção de sódio e na regulação da pressão sangüínea em longo prazo (Wilcox, 2003).
1.3- D-alfa-Tocoferol
Entre os antioxidantes de moléculas pequenas e lipossolúveis, a vitamina E é a mais abundante em membranas biológicas e lipoproteínas (Van de Branden et al., 1997). Ela é reconhecida como um dos principais antioxidantes naturais do organismo (Tappel, 1970; Burton et al., 1985).
Também está presente em óleos de sementes, nozes, abacate, grãos, cereais, ovos, vegetais verdes e grãos de soja (Mahan, Arlin, 1995). Supõe-se que as vitaminas antioxidantes diminuem os danos teciduais pelo seqüestro dos radicais livres orgânicos e/ou desativação de moléculas de oxigênio excitadas (Van de Branden et al., 1997).
Assim, o efeito benéfico do tratamento com antioxidante como o D-alfa-Tocoferol, forma mais ativa da vitamina E, tem sido estudado em diferentes modelos de nefropatia. Chan et al. (1998) observaram que o tratamento com D-alfa-Tocoferol de animais com nefropatia por IgA reduzia os valores de proteinúria normalmente observados, sugerindo que ele estivesse atenuando a lesão glomerular neste modelo experimental. Van den Branden et al. (1997) observaram que em ratos submetidos a nefrectomia (5/6), o tratamento com D-alfa-Tocoferol reduzia significativamente o processo de glomeruloesclerose. A suplementação dietética perinatal de animais SHR com L-arginina e antioxidantes (vitamina C, taurina e vitamina E) atenuou o desenvolvimento da hipertensão e resultou na proteção renal de SHR idosos (Racasan et al., 2004).
A vitamina E tem vários efeitos potencialmente cardioprotetores: diminui a peroxidação lipídica (Gey et al., 1991; Becamish, 1993; Donnan et al., 1993), aumenta a utilização de glicose mediada pela insulina (Paolisso et al., 1993;
Sharma et al., 2000) e melhora a função endotelial (Raghuveer et al., 2001).
Frenoux et al. (2002) sugerem que uma dieta enriquecida com altos níveis de D-alfa-Tocoferol (1200 mg de D-alfa-Tocoferol/Kg de ração), também diminui a concentração plasmática de colesterol, a agregação e a adesividade plaquetária, porém esses efeitos somente são observados em animais SHR, indicando que eles são mais reativos a suplementação com D-alfa-Tocoferol.
Chen et al. (2001) verificaram redução do estresse oxidativo, melhora da função e da estrutura vascular e a prevenção do progresso da hipertensão no modelo SHRSP (stroke-prone spontaneously hypertensive rats) com adição de 4% de NaCl, após a administração de vitamina C (1000 mg/dia) e vitamina E (1000IU/dia).
1.4- Objetivos
Considerando-se que:
1. o estresse oxidativo tem um importante papel na patogênese da hipertensão arterial visto que o excesso de espécies reativas de oxigênio e a baixa biodisponibilidade de óxido nítrico na vasculatura e nos rins, prejudica: a regulação da pressão arterial em longo prazo, o tônus de artérias e arteríolas renais, a resposta túbulo-glomerular e a reabsorção de sódio;
2. vários estudos relatam efeitos benéficos do tratamento com antioxidantes, como o D-alfa-Tocoferol em virtude de seus efeitos sobre a função endotelial, pelo aumento da disponibilidade total de antioxidantes.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento com D–alfa–Tocoferol sobre:
-a função renal de ratos WKY e SHR aos 4 meses idade;
-a resistência vascular renal em rins de ratos WKY e SHR aos 4 meses idade; -a morfologia glomerular (tamanho e número de glomérulos) e da artéria interlobular (espessura da camada média).
Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina (processo no
0092/04).
2.1- Modelo experimental
2.1.1- Animais
Foram utilizados ratos Wistar Kyoto (controle) e SHR (ratos espontaneamente hipertensos) machos provenientes do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, com peso de aproximadamente 200g e um mês e meio de idade. Os animais foram mantidos no biotério da Disciplina de Fisiologia Renal e Termometabologia, onde foram alojados em gaiolas plásticas coletivas, mantidos com livre acesso à ração (Purina Labina) e água.
2.1.2- Grupos experimentais
Foram constituídos os seguintes grupos experimentais:
C – controle (Wistar Kyoto);
CT – controle tratado com D-alfa-Tocoferol; H – controle hipertenso (SHR);
2.1.3- Tratamento
A partir dos 2 meses de idade, os animais do grupo CT e HT receberão D-alfa-Tocoferol (Sigma) 36mg/Kg. Enquanto que os grupos C e H receberão óleo mineral (Scheing-Plough). As drogas foram administradas por gavagem em dias alternados durante 60 dias.
2.1.4- Pressão arterial
A pressão arterial sistólica foi aferida pelo método indireto de pletismografia (Filizola BP6).
Primeiramente, os animais foram condicionados a entrarem no cilindro de acrílico de contenção durante 15 dias antes do período experimental, para que durante a aferição da pressão arterial já estivessem adaptados ao ambiente.
Durante o período experimental, o animal foi acomodado em um cilindro de contenção de acrílico, de dimensões apropriadas para seu tamanho, sendo que apenas a cauda ficava exposta. Para diminuir o estresse causado pela contenção, o cilindro era coberto com uma flanela. Em seguida, o esfigmomanômetro com sensor, conectado a um sistema de registro (Monitor Ratpaplb.b) era ajustado à porção proximal da cauda do animal (artéria caudal) e então era aferida a pressão arterial sistólica. Foram realizadas no máximo 3 aferições em seqüência.
As pressões arteriais sistólicas foram aferidas quinzenalmente durante os 60 dias de tratamento, sendo que a primeira aferição foi feita 5 dias após a administração de D-alfa-Tocoferol e de óleo mineral.
2.1.5- Avaliação da proteinúria
A determinação da proteinúria foi realizada uma semana antes dos animais serem submetidos ao clearance. Os animais foram mantidos durante 24 horas em gaiola metabólica (Criffa Barcelona Spain) para a coleta de urina. Ao coletor de urina foi acrescentado óleo mineral para evitar perdas por evaporação. Durante este período, os animais tiveram livre acesso à ração e água.
Após o período da coleta, os volumes urinários foram aferidos e as amostras foram acondicionadas em tubos de ensaio plásticos, e armazenados em freezer a -20ºC para posterior determinação da proteinúria.
O método utilizado para a determinação da proteinúria foi o de precipitação com ácido sulfossalicílico (Magalhães et al., 2006).
2.1.6- Avaliação da Osmolaridade
Para a determinação da concentração osmótica da urina de 24 horas foi utilizado o Advanced Wide – Range Osmometer 3W2.
2.2- Estudo da função renal
2.2.1- Cirurgia
Para o estudo da função renal os animais dos grupos C, H, CT e HT foram anestesiados com tiopental sódico (Abbott) na dose de 30mg/Kg de peso. Doses
adicionais foram administradas durante o experimento sempre que o plano anestésico dos animais superficializava - se.
Para manter a ventilação adequada, a traquéia do animal foi canulada com cateter de polietileno PE 260. A artéria carótida direita foi canulada com polietileno PE 20 para a coleta de 0,8 ml de sangue. A veia jugular externa esquerda foi canulada com polietileno PE 50 para infusão de diferentes soluções. A bexiga urinária foi canulada com sonda vesical de polietileno PE 260 através da qual, amostras de urinas foram colhidas, sob óleo mineral, para posterior análise das mesmas.
No início do experimento, os animais receberam infusão endovenosa contínua de uma solução composta de 0,9% de NaCl e 3% de manitol à velocidade constante de 100µl/min, através da bomba infusora (Harvard PHD 2000), durante 30 minutos. O objetivo desta infusão é repor as perdas hidroeletrolíticas ocorridas durante a cirurgia.
2.2.2- Determinação do ritmo de filtração glomerular e fluxo plasmático renal
O ritmo de filtração glomerular (RFG) foi avaliado pelo clearance de inulina. Após o período de reposição hidroeletrolítica, foi administrada uma dose prime de inulina (Sigma) 90mg/300g de peso corpóreo, com dose de manutenção de 1,5 mg/minuto para 300g de peso corpóreo, através da bomba infusora. A inulina foi dissolvida em solução salina com Manitol 3%.
O fluxo plasmático renal (FPR) foi avaliado através do clearance de paraminohipurato de sódio (PAH). Para isto, uma dose prime de PAH (Sigma) de
2 mg/300g de peso corpóreo foi dissolvida juntamente com a dose prime de inulina, sendo ambos administrados na veia jugular. A dose de manutenção do PAH foi de 0,4 mg/minuto para cada 300 gramas de peso corpóreo, foi administrada juntamente com a dose manutenção de inulina.
O ritmo de infusão, mantido durante todo o experimento, foi de 100µl/mim. Trinta minutos após o início da infusão da solução de manutenção contendo inulina e PAH, procedeu-se a coleta de 4 amostras de sangue e urina, com intervalo de aproximadamente 30 minutos cada uma.
As amostras de sangue foram colhidas com seringas previamente heparinizadas (Liquemine – Roche). As amostras de sangue foram centrifugadas a 3000 rpm durante 10 minutos em centrífuga (Fanem-SP. B-204-NR), sendo o plasma separado e armazenado em geladeira até o momento da dosagem.
As amostras de urina foram colhidas, sob óleo mineral, em tubos de vidro próprios, previamente pesados. Após as coletas, os tubos foram novamente pesados, com o objetivo de calcular-se o fluxo urinário, através da seguinte equação:
Onde:
V = fluxo urinário
F = peso do tubo com urina I = peso do tubo sem urina tempo = minuto
Os valores de fluxo urinários foram normalizados por quilograma.
tempo I F
Depois de pesadas, as amostras de urina foram armazenadas em geladeira nos próprios tubos de coleta, sob óleo mineral, fechados com filme plástico.
As concentrações plasmáticas e urinárias de inulina determinadas pelo método de Flores-Mendoza (1972), assim como as de PAH, determinadas pelo método de Smith (1945), foram utilizadas para o cálculo de clearance (Cl), através da fórmula:
Onde:
Cl = Clearance da substância estudada
[U] = concentração urinária da substância estudada [P]= concentração plasmática da substância estudada V = fluxo urinário
2.3- Determinações
2.3.1- Hematócrito
Após a canulação da artéria carótida direita, para o estudo da função renal, foi retirada uma amostra de 100µl de sangue para a determinação do hematócrito. O sangue retirado foi colocado num capilar de vidro (Glass Técnica para micro-hematócrito), o qual teve uma de suas extremidades vedada. O capilar com a amostra de sangue foi centrifugado a 4000 rpm por 15 minutos. Após a centrifugação, foi quantificada a porcentagem de células vermelhas no capilar.
] [ ] [ P V U Cl= ×
2.3.2- Sódio e potássio sangüíneo e urinário
As concentrações de sódio e potássio sangüíneo e urinário foram determinadas por eletrodo seletivo (Na/K Analyser Ciba-corning, mod.614) para sódio e potássio.
2.3.3- Concentração urinária de amônio
A concentração urinária de amônio foi determinada pelo método colorimétrico.
2.3.4- Acidez titulável
A determinação da acidez titulável (AT) na urina foi feita pelo método de microtitulação, no qual 50µl de urina foram titulados com NaOH 0,01N, através de seringa de Hamilton, tendo como indicador a fenolftaleína.
2.3.5- Carga filtrada e carga excretada de sódio e potássio sangüíneo e urinário
As cargas filtradas de sódio e potássio foram determinadas multiplicando-se a concentração sangüínea de cada uma das substâncias pelo seu respectivo RFG, ou seja:
p x RFG CFx= × [ ]
Onde:
CFx = carga filtrada da substância RFG = ritmo de filtração glomerular
[x]p = concentração da substância no plasma
As cargas excretadas de sódio e potássio foram determinados multiplicando-se a concentração de cada um dos elementos pelos multiplicando-seus respectivos fluxos urinários, ou seja:
Onde:
CEx= carga excretada da substância V = fluxo urinário
[x]u = concentração da substância na urina
2.3.6- Carga excretada de amônio
A carga excretada de amônio foi determinada multiplicando-se a concentração de cada um dos elementos pelos seus respectivos fluxos urinários, ou seja:
Onde:
CEx= carga excretada da substância
u x V CEx= × [ ]
u
x
V
CEx
=
×
[
]
V = fluxo urinário
[x]u = concentração da substância na urina
2.3.7- Fração de filtração e fração de excreção de sódio e potássio
A fração de filtração foi obtida dividindo-se o ritmo de filtração glomerular pelo fluxo plasmático renal, ou seja:
Onde:
FF% = fração de filtração
RFG = ritmo de filtração glomerular FPR= fluxo plasmático renal
As frações de excreção de sódio e potássio foram determinadas dividindo-se a carga excretada pela carga filtrada de cada um:
Onde:
FEx= fração de excreção da substância (Na+ ou K+) CEx = carga excretada da substância (Na+ ou K+) CFx= carga filtrada da substância (Na+ ou K+)
100 %= × FPR RFG FF 100 × = CFx CEx FEx
2.4- Análise morfológica dos rins
2.4.1- Preparação dos cortes histológicos
Os rins dos animais foram colhidos e pesados em balança analítica e em seguida, foram secionados em corte longitudinal. Logo em seguida mergulhados em líquido de Bouin (750ml de solução saturada de ácido pícrico, 200ml de formalina 37% e 50ml de ácido acético glacial), onde permaneceram por 24 horas.
Após a fixação, foi realizado o processo de desidratação, diafanização, impregnação por parafina líquida e em seguida inclusão.
2.4.2- Coloração
Os cortes dos blocos de parafina foram realizados em espessura de 5µm e corados pelo método de Tricrômio de Masson e pelo método de hematoxilina e eosina, para a identificação da morfologia geral; pelo Método de Verhoff, para analisar as artérias interlobulares.
2.4.3- Determinação da área glomerular, diâmetro glomerular máximo, médio, mínimo, número de glomérulos por campo e espessura da camada média da artéria interlobulares
Os cortes histológicos foram observados em microscópio triocular acoplado a uma câmara de vídeo. As imagens adquiridas foram projetadas em uma tela de
microcomputador.
Num aumento de 200 vezes, foram estudados vinte campos corticais aleatórios, em cada lâmina. Usando-se o programa de análise de Imagens Image-Pró Plus (Média Cybernética, Microscope Leica DMLB, Câmera Sonny), foram medidos os diâmetros glomerulares máximo e mínimo, e a área de todos os glomérulos identificados em cada campo foi determinada pelo programa.
O número de glomérulos por campo foi determinado num aumento de 100 vezes em dez campos aleatórios.
As artérias interlobulares foram identificadas num aumento de 200 vezes. Foram feitas 4 medidas da espessura da camada média da artéria interlobular usando o mesmo programa acima descrito, em dez campos aleatórios.
2.5- Cálculo da resistência da artéria renal
A resistência da artéria renal foi obtida dividindo-se a média da pressão arterial sistólica antes da realização do clearance pelo fluxo sangüíneo renal, ou seja:
Onde:
R = resistência da artéria renal
Pmédia = média da pressão arterial sistólica antes do clearance FSR= fluxo sangüíneo renal
O fluxo sangüíneo renal foi determinado dividindo-se o fluxo plasmático renal
FSR Pmédia R=
por 1 menos o hematócrito:
Onde:
FSR = fluxo sangüíneo renal FPR = fluxo plasmático renal Ht = hematócrito
2.6- Método Estatístico
Os resultados foram apresentados em média ± erro-padrão. O teste utilizado foi análise de variância (ANOVA) com teste complementar de Bonfferroni para comparação de três ou mais grupos experimentais.
O nível de significância foi de 5% (p < 0,05). ) 1 ( Ht FPR FSR − =
Na tabela 1 estão apresentados os valores de peso corporal, peso renal absoluto e peso renal relativo referente aos animais estudados. Observamos que os animais do grupo H apresentaram peso corporal e peso renal absoluto maiores que os obtidos para os animais controles. Entretanto, não observamos alterações no peso renal relativo dos grupos estudados.
Na figura 1 estão apresentadas as curvas de crescimento dos grupos estudados a partir do início do tratamento. Observamos que o tratamento com D-alfa-Tocoferol não interferiu no ganho de peso dos animais.
Na tabela 2 estão apresentados os valores médios de pressão arterial sistólica dos grupos estudados. Na figura 2 está apresentada a evolução das pressões arteriais sistólicas desde o início do tratamento. Neste período, como esperado, os animais hipertensos apresentaram valores de pressão arterial sistólica significantemente maiores que os animais normotensos. Após um mês de tratamento com D-alfa-Tocoferol (com 3 meses de idade), observamos que os animais do grupo HT apresentaram valores de pressão arterial significantemente menores que dos animais do grupo H. Entretanto, estes valores de pressão arterial ainda foram significantemente maiores que os observados nos grupos C e CT. Os valores de pressão arterial obtidos nos grupos C e CT apresentam-se dentro da faixa de normalidade.
Os parâmetros de função renal, ou seja, os valores de ritmo de filtração glomerular (RFG), de fluxo plasmático renal (FPR), de fluxo urinário (V), de razão urina/inulina (U/P) e de fração de filtração (FF%), obtidos nos diferentes grupos experimentais podem ser observados na tabela 3. Verificamos queda importante do RFG no grupo H em relação ao grupo controle. Por outro lado, os animais hipertensos tratados com D-alfa-Tocoferol apresentaram valores de RFG
semelhantes aos dos animais controle, sugerindo um efeito benéfico deste antioxidante. Observamos também nesta tabela que o tratamento com D-alfa-Tocoferol causou aumento do FPR nos animais dos grupos CT e HT, possivelmente por efeito sobre a hemodinâmica renal.
Na tabela 4 estão os dados de acidez titulável (AT) e carga excretada de amônio (CENH4+) dos grupos estudados. O grupo hipertenso apresentou valores
de AT e CENH4+ significativamente maiores que os obtidos para o grupo controle.
Enquanto que no grupo hipertenso tratado com D-alfa-Tocoferol houve diminuição da carga excretada de íon amônio em relação ao grupo hipertenso.
A concentração plasmática (PNa+), a carga excretada (CENa+) e a fração de
excreção (FENa+) de sódio dos grupos estudados encontram-se na tabela 5.
Observamos que os animais do grupo H apresentam valores de CENa+ e de
FENa+ significativamente menores que os valores dos animais do grupo C,
sugerindo que nestes animais esteja ocorrendo retenção de sódio. Por outro lado, houve aumento da CENa+ no grupo HT em relação ao grupo H.
Na tabela 6 estão apresentados os valores referentes à concentração plasmática (PK+), a carga excretada (CEK+) e a fração de excreção (FEK+) de
potássio dos animais estudados. Os animais do grupo H apresentaram valores de CEK+ e FEK+ significativamente menores que os valores obtidos para o grupo
C. Já os animais do grupo HT apresentaram valores de excreção de potássio semelhantes aos do grupo controle.
Os resultados referentes à resistência vascular renal (RVR) bem como a espessura da camada média das artérias interlobulares (ECMAI) dos animais experimentais estão expressos na tabela 7. Podemos notar que os animais do grupo H apresentaram aumento da espessura da camada média das artérias
interlobulares em relação aos controles. A resistência vascular renal destes animais também se apresentou aumentada, confirmando uma relação entre esses dois parâmetros. Nos animais hipertensos tratados com D-alfa-Tocoferol não observamos estas alterações.
Os parâmetros morfológicos renais estão apresentados na tabela 8. A área glomerular foi significativamente maior nos animais do grupo hipertenso quando comparado aos animais do grupo controle. Mais uma vez, os animais do grupo hipertenso tratado com D-alfa-Tocoferol apresentaram valores de área glomerular semelhante aos do grupo controle. Quanto ao número de glomérulos por campo não observamos diferenças significantes entre os grupos experimentais.
Os valores de proteinúria e osmolaridade de 24 horas podem ser verificados na tabela 9. Observamos que os animais hipertensos apresentaram valores de proteinúria significativamente maiores em relação ao controle e que o tratamento com D-alfa-Tocoferol não alterou este parâmetro.
Tabela 1 – PESO CORPORAL (G), PESORENAL ABSOLUTO (G) E PESO RENALRELATIVO (%) DE
C, CT, H E HT AOS 4 MESES DE IDADE. VALORES EXPRESSOS COMO MÉDIA ± ERRO PADRÃO, NÚMERODE AMOSTRAS/ANIMAISENTREPARÊNTESES
Grupos CorporalPeso (g) Peso Renal Absoluto (g) Peso Renal Relativo (%) C 276,57±7,03 (14/7) 1,18±0,03 (14/7) 0,43±0,01 (14/7) CT 285,71±3,19 (14/7) 1,20±0,04 (14/7) 0,42±0,01 (14/7) H 313,14±8,82# (14/7) 1,40±0,03● (14/7) 0,45±0,01 (14/7) HT 291,14±7,66 (14/7) 1,24±0,04♠(14/7) 0,43±0,01(14/7)
Nível de significância: #p < 0,01 vs Controle (C); ●p < 0,001 vs Controle (C); ♠p < 0,001 vs Hipertenso (H).
Figura 1 – Curva de crescimento dos animais estudados aos 2 meses (2M), 2
meses e 15 dias (2M15D), 3 meses (3M), 3 meses e 15 dias (13M15D) e 4 meses de idade (4M).
Tabela 2 – PRESSÃO ARTERIAL SISTÓLICA (MMHG) DE C, CT, H E HT AOS 2 MESES (2M), 2 MESES E 15 DIAS (2M15D), 3 MESES (3M), 3 MESES E 15 DIAS (3M15D) E 4 MESES DE IDADE
(4M). VALORES EXPRESSOS COMO MÉDIA ± ERRO PADRÃO, NÚMERO DE AMOSTRAS/ANIMAIS ENTRE PARÊNTESES
Pressão Arterial Sistólica (mmHg)
Grupos 2M 2M15D 3M 3M15D 4M
C 122,00±1,04(21/7) 123,10±0,62(21/7) 126,80±0,81(21/7) 123,10±1,66(21/7) 122,90±0,78(21/7)
CT 118,90±0,46(21/7) 119,00±0,83(21/7) 118,90±0,45(21/7) 118,30±0,71(21/7) 118,40±0,71(21/7)
H 142,30±1,56(21/7) ● 161,20±1,34(21/7) ● 196,40±1,99(21/7) ● 194,50±3,2(21/7) ● 197,00±1,91(21/7) ●
HT 136,30±1,78(21/7) 147,50±0,82(21/7) 175,80±1,29(21/7) ♠ 170,70±1,51(21/7) ♠ 175,90±0,48(21/7) ♠
Nível de significância: ●p < 0,001 vs Controle (C); ♠p < 0,001 vs Hipertenso (H).
Figura 2- Pressão arterial sistólica dos animais estudados ao longo do
tratamento. Nível de significância: ●p < 0,001 vs Controle (C); ♠p < 0,001 vs Hipertenso (H).
Tabela 3 – RITMO DE FILTRAÇÃO GLOMERULAR (RFG) (ML/MIN/KG), FLUXO PLASMÁTICO RENAL
(FPR) (ML/MIN/KG), FLUXO URINÁRIO (V) (ML/MIN/KG), RAZÃO U/P DE INULINA URINÁRIA E PLASMÁTICA (U/P) E FRAÇÃODE FILTRAÇÃO (FF) (%) DE C, CT, H E HT AOS 4 MESESDE IDADE.
VALORES EXPRESSOS COMO MÉDIA ± ERRO PADRÃO, NÚMERO DE AMOSTRAS/ANIMAIS ENTRE PARÊNTESES
Grupos (ml/min/Kg)RFG (ml/min/Kg)FPR (ml/min/Kg)V U/P (%)FF
C 7,04±0,15(28/7) 21,66±0,73(28/7) 0,17±0,01(28/7) 43,42±2,15(28/7) 33,98±1,84(28/7) CT 7,16±0,16(28/7) 26,05±0,80● (28/7) 0,17±0,01 (28/7) 43,10±1,51 (28/7) 28,31±1,19Ө (28/7) H 5,56±0,11● (28/7) 19,71±0,66 (28/7) 0,13±0,01Ө (28/7) 45,13±2,13 (28/7) 29,06±1,16 (28/7) HT 6,70±0,16♠ (28/7) 22,93±0,53♣ (28/7) 0,17±0,01∞ (28/7) 43,60±2,64 (28/7) 29,03±0,84 (28/7) Nível de significância: ●p < 0,001 vs Controle (C); Өp < 0,05 vs Controle (C); ♠p < 0,001 vs Hipertenso (H); ♣p < 0,01 vs Hipertenso (H); ∞p < 0,05 vs Hipertenso (H).
Figura 3- Ritmo de filtração glomerular (RFG), fluxo plasmático renal (FPR) e
fluxo urinário (V) dos animais estudados. Nível de significância: ●p < 0,001 vs Controle (C); Өp < 0,05 vs Controle (C); ♠p < 0,001 vs Hipertenso (H); ♣p < 0,01 vs Hipertenso (H); ∞p < 0,05 vs Hipertenso (H).
Tabela 4 – ACIDEZ TITULÁVEL (AT) (µEq/MIN/KG) E CARGA EXCRETADA DE AMÔNIO (CENH4+)
(µEq/MIN/KG) EM C, CT, H E HT AOS 4 MESES DE IDADE. VALORES EXPRESSOS COMO MÉDIA ± ERROPADRÃO, NÚMERODEAMOSTRAS/ANIMAISENTRE PARÊNTESES
Grupos (µEq/min/Kg)AT (µEq/min/Kg)CENH4+
C 2,62±0,11(28/7) 2,45±0,06(28/7) CT 1,76±0,07● (28/7) 2,22±0,07 (28/7) H 3,12±0,17#(28/7) 3,37±0,16●(28/7) HT 2,83±0,09 (28/7) 2,65±0,13♠ (28/7)
Nível de significância: ●p < 0,001 vs Controle (C); #p < 0,01 vs Controle (C); ♠p < 0,001 vs Hipertenso (H).
Figura 4- Acidez titulável e carga excretada de amônio dos animais estudados.
Nível de significância: ●p < 0,001 vs Controle (C); #p < 0,01 vs Controle (C); ♠p < 0,001 vs Hipertenso (H).
Tabela 5 – CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA (PNA+) (MEQ/L), CARGA EXCRETADA (CENA+)
(MEQ/MIN/KG) EFRAÇÃO DE EXCREÇÃO (FENA+) (%) DE SÓDIO DE C, CT, H E HT AOS 4 MESES
DE IDADE. VALORES EXPRESSOSCOMOMÉDIA ± ERRO PADRÃO, NÚMERO DEAMOSTRAS/ANIMAISENTRE PARÊNTESES Grupos PNa+ (mEq/l) CENa+ (mEq/min/Kg) FENa+ (%) C 142,50±0,76(20/5) 11,69±0,79(20/5) 1,14±0,07(20/5) CT 144,43±0,30 (28/7) 12,24±0,59 (28/7) 1,18±0,04 (28/7) H 145,30±0,67#(20/5) 5,74±0,43●(20/5) 0,73±0,05Ө(20/5) HT 146,21±0,54 (28/7) 10,20±1,42∞ (28/7) 1,03±0,13 (28/7)
Nível de significância: ●p < 0,001 vs Controle (C); #p < 0,01 vs Controle (C); Өp < 0,05 vs Controle (C); ∞p < 0,05 vs Hipertenso (H).
Figura 5- Fração de excreção de sódio (FENa+) dos animais estudados. Nível de
Tabela 6 – CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA (PK+) (MEQ/L), CARGA EXCRETADA (CEK+)
(MEQ/MIN/KG) E FRAÇÃO DE EXCREÇÃO (FEK+) (%) DE POTÁSSIO DE C, CT, H E HT AOS 4
MESESDE IDADE. VALORESEXPRESSOS COMOMÉDIA ± ERROPADRÃO, NÚMERODEAMOSTRAS/ANIMAIS ENTREPARÊNTESES Grupos PK+ (mEq/l) CEK+ (mEq/min/Kg) FEK+ (%) C 3,08±0,12(20/5) 8,75±0,43(20/5) 40,59±1,83(20/5) CT 2,97±0,11 (28/7) 9,47±0,39 (28/7) 46,57±2,46 (28/7) H 3,07±0,06(20/5) 6,20±0,36●(20/5) 37,78±2,73(20/5) HT 2,51±0,03♠ (28/7) 7,78±0,28∞ (28/7) 46,87±1,63∞ (28/7)
Nível de significância: ●p < 0,001 vs Controle (C); ♠p < 0,001 vs Hipertenso (H); ∞p < 0,05 vs Hipertenso (H).
Figura 6- Fração de excreção de potássio (FEK+) dos animais estudados.
Tabela 7 – HEMATÓCRITO (HT) (%), FLUXOSANGÜÍNEORENAL (FSR) (ML/MIN/KG), RESISTÊNCIA VASCULAR RENAL (RVR) (MMHG/ML/MIN) E ESPESSURA DA CAMADA MÉDIA DAS ARTÉRIAS INTERLOBULARES (ECMAI) (Μ) DE C, CT, H E HT AOS 4 MESES DE IDADE. VALORES EXPRESSOS COMOMÉDIA ± ERROPADRÃO, NÚMERODEAMOSTRAS/ANIMAISENTREPARÊNTESES
Grupos HT (%) FSR (ml/min/Kg) RVR (mmHg/ml/min) ECMAI (µ) C 47,20±0,76 (8/2) 41,38±2,10 (8/2) 3,03±0,14 (8/2) 11,01±0,28 (280/7) CT 47,08±0,16(16/4) 46,01±2,26(16/4) 2,67±0,12(16/4) 10,87±0,21(280/7) H 48,50±0,57(8/2) 34,89±1,63(8/2) 5,61±0,24●(8/2) 16,24±0,37●(280/7) HT 48,20±0,90(16/4) 45,39±1,64♣(16/4) 3,94±0,16♠(16/4) 12,50±0,28♠(280/7)
Nível de significância: ●p < 0,001 vs Controle (C); ♠p < 0,001 vs Hipertenso (H); ♣p < 0,01 vs Hipertenso (H).
Figura 7- Fluxo sangüíneo renal (FSR), resistência vascular renal (RVR) e
espessura da camada média das artérias interlobulares (ECMAI) dos animais estudados. Nível de significância: ●p < 0,001 vs Controle (C); ♠p < 0,001 vs Hipertenso (H); ♣p < 0,01 vs Hipertenso (H).
Figura 8- Tecido renal corado pelo método de Verhoff, num aumento de 400x.
G – glomérulo, AI – artéria interlobular.
AI AI AI AI G G G G
Tabela 8 – ÁREA GLOMERULAR (μ 2), DIÂMETRO MÍNIMO (μ), DIÂMETRO MÁXIMO (μ), DIÂMETRO MÉDIO (μ) E NÚMERO DE GLOMÉRULO POR CAMPO DE C, CT, H E HT AOS 4 MESES DE IDADE.
VALORES EXPRESSOS COMO MÉDIA ± ERRO PADRÃO, NÚMERO DE GLOMÉRULOS ESTUDADOS ENTRE PARÊNTESES
Grupos glomerularÁrea (μ2) Diâmetro mínimo (μ) Diâmetro máximo (μ) Diâmetro médio (μ) Número de glomérulos por campo§ C 7824,11±96,32 (402) 85,36±0,59 (402) 11,81±0,77 (402) 97,96±0,61 (402) 9,06±1,27 (70) CT 7323,34±91,82●(402) 81,61±0,59●(402) 109,25±0,75●(402) 94,71±0,60#(402) 9,09±0,13(70) H 8794,70±114,82● (402) 88,24±0,68# (402) 120,30±0,85● (402) 103,75±0,70● (402) 7,29±0,26 (70) HT 7979,44±110,45(402) 83,89±0,65♠ (402) 114,96±0,87♠ (402) 98,81±0,68♠ (402) 8,17±0,25 (70) §Valores entre parênteses significam o número de campos estudados.
Nível de significância: ●p < 0,001 vs Controle (C); #p < 0,01 vs Controle (C); ♠p < 0,001 vs Hipertenso (H).
Figura 9- Área glomerular de C, CT, H e HT aos 4 meses de idade. Nível de
significância: ●p < 0,001 vs Controle (C); #p < 0,01 vs Controle (C); ♠p < 0,001 vs Hipertenso (H).
Figura 10- Tecido renal corado pelo método de Tricrômio de Masson, num
aumento de 400x. G – glomérulo, TP – túbulo proximal.
G TP G TP G TP G TP
Figura 11- Tecido renal corado pelo método de HE, num aumento de 400x.
G – glomérulo, TP – túbulo proximal.
TP TP TP TP G G G G
Tabela 9 – PROTEINÚRIA (MG/24HS) EOSMOLARIDADE (MOSM/KGH2O) DE 24 HORASDE C, CT,
H E HT AOS 4 MESES DE IDADE. VALORES EXPRESSOS COMO MÉDIA ± ERRO PADRÃO, NÚMERO DE ANIMAISENTRE PARÊNTESES
Grupos Proteinúria de 24 hs(mg/24hs) (mOsm/KgH2O)Osmolaridade
C 10,03±0,40 (11) 1801,91±27,95 (11) CT 9,12±0,37(13) 1817,69±31,34(13) H 15,36±1,43●(13) 1692,08±85,87(13) HT 14,92±0,78 (13) 1622,77±94,85 (13) Nível de significância: ●p < 0,001 vs Controle (C).
Figura 12- Proteinúria e osmolaridade de 24 horas dos animais estudados.
O papel do endotélio sobre o tônus vascular começou a ser estudado no início da década de 80 (1980) quando Furchgott e Zawadski verificaram que a acetilcolina em preparações vasculares, apesar de ser um potente vasodilatador “in vivo”, não produzia este efeito na ausência do endotélio (Rubanyi, Vanhoutte, 1986). O efeito vasodilatador foi inicialmente atribuído a uma substância vasoativa secretada pelas células endoteliais que passou a ser chamada de fator relaxante derivado do endotélio (EDRF). Posteriormente, o óxido nítrico (NO) foi identificado como a principal sustância responsável pelo relaxamento das células vasculares do músculo liso (Ignarro et al., 1988).
Atualmente, sabe-se que o endotélio está envolvido na manutenção do tônus vascular e da pressão sangüínea por regular a liberação de várias substâncias vasoativas tais como prostaciclinas, EDHF (fator hiperpolarizante derivado do endotélio), e o NO (Bayraktutan, 2000).
O NO, gerado dentro do endotélio vascular pela eNOS, é considerado o mais importante vasodilatador derivado do endotélio no conduto arterial (Ülker et al., 2003). Em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) observa-se menor expressão das enzimas eNOS e nNOS; assim essas enzimas podem ter importância na fisiopatologia da hipertensão arterial nestes animais (Xu et al, 2000).
Em animais hipertensos assim como em humanos com hipertensão essencial, a disfunção endotelial está associada ao excesso de radicais livres de oxigênio e com o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (Berry et al, 2000; Irani, 2000). Além disso, pacientes com hipertensão essencial (Galley et al, 1997; Russo et al, 1998; Irani, 2000) e animais SHR (Schimke et al., 1995) possuem baixos níveis de antioxidantes como a glutationa dismutase, a
