RESULTADOS
______________________________________________Resultados e Discussão 58
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Seleção da espécie de Penicillium frente a conidiogênese
Para selecionar, através da produção de conídios, uma espécie para estudo, cinco espécies de Penicillium foram inoculadas em vários meios de cultura semi-sólidos e incubadas por três tempos distintos em estufa a 30°C.
A suspensão conidial obtida de cada cultura foi avaliada por contagem em Câmara de Neübauer. De acordo com os resultados apresentados nas tabelas 8, 9 e 10 (p. 5 e 56) foi possível estabelecer as melhores condições de cultivo para cada espécie e selecionar uma para ser quimicamente estudada.
Tabela 8. Média da contagem de conídios dos fungos incubados por 7 dias a 30°C (conid/mL X 10
7)
Tabela 9. Média da contagem de conídios dos fungos incubados por 10 dias a 30°C (conid/mL X 10
7)
YES CYA MEA AVEIA PDA
P. verrucosum 0,15 0,15 5,04 2,61 5,18
P.
ochrochlorum
0,04 0,01 0,92 0,56 2,15
P. waksmanii 3,10 0,27 3,24 2,48 3,43
P.
simplicissimum
0,02 0,01 0,72 0,34 0,98
P. viridicatum 0,42 0,88 4,37 9,78 4,70
______________________________________________Resultados e Discussão 59
Tabela 10. Média da contagem de conídios dos fungos incubados por 16 dias a 30°C (conid/mL X 10
7)
A conidiogênese de um fungo é ideal quando este apresenta maior concentração de conídios em menor tempo, otimizando a fase inicial do cultivo e conseqüentemente a produção de metabólitos secundários. Nesta etapa de desenvolvimento, os fungos P. verrucosum e P. viridicatum são os mais promissores. A figura 21 (p. 56) resume as melhores condições para cada espécie de Penicillium.
YES CYA MEA AVEIA PDA
P. verrucosum 0,98 0,24 3,06 2,59 3,54
P.
ochrochlorum
0,10 0,02 1,49 0,23 3,53
P. waksmanii 1,19 0,49 10,26 4,89 5,91
P.
simplicissimum
0,07 0,01 0,96 0,37 0,25
P. viridicatum 0,32 0,81 2,02 8,51 3,11
YES CYA MEA AVEIA PDA
P. verrucosum 2,03 0,16 2,11 3,10 4,65
P.
ochrochlorum
0,01 0,02 1,84 0,16 1,15
P. waksmanii 0,98 0,04 4,25 6,62 6,95
P.
simplicissimum
0,07 0,01 0,92 0,61 0,72
P. viridicatum 1,04 0,02 1,66 2,71 7,24
0 2 4 6 8 10 12
0 7 10 16
Tempo (dias)
Número de conídios (x 10
7conid/ml) P. verrucosum (PDA)
P. ochrochlorum (PDA)
P. waksmanii (MEA)
P. simplicissimum (PDA)
P. viridicatum (AVEIA)
______________________________________________Resultados e Discussão 60
Figura 21. Resumo das melhores condições de conidiogênese das 5 espécies de Penicillium
A obtenção de massa micelial, no meio pré-fermentativo, capaz de produzir quantidades detectáveis de substâncias, em meio fermentativo, é dependente da quantidade de conídios inoculada (Freitas, 2002). Portanto, P. verrucosum cultivado em meio PDA por 7dias a 30°C foi selecionado para cultivo e estudo químico neste trabalho devido à rapidez na produção de conídios e facilidade no preparo do meio de cultura selecionado.
Os fungos P. viridicatum e P. waksmanii foram cultivados e estão sendo estudados quimicamente por outros alunos do Laboratório de Química Farmacêutica da FCFRP-USP sob orientação da Prof a . Dr a . Mônica Tallarico Pupo.
O fungo P. simplicissimum apresentou coloração branca com mínima produção de conídios. Não houve alteração neste quadro quando deixado por alguns dias em contato direto com a luz e nem por permanecer até 20 dias em estufa a 30°C. Este fungo foi descartado para estudos posteriores devido à instabilidade apresentada e ao baixo número de conídios.
______________________________________________Resultados e Discussão 61
4.2 Triagem dos extratos de P. verrucosum pelos ensaios, in vitro, sobre a forma tripomastigota de T. cruzi, bioquímicos sobre as enzimas GAPDH de T. cruzi e APRT de L. tarentolae.
4.2.1 Ensaios sobre a forma tripomastigota de T. cruzi
Os 115 extratos brutos obtidos dos cultivos, em pequena escala, de P.
verrucosum foram testados na forma tripomastigota do parasita T. cruzi, com objetivo de selecionar o(s) mais promissor(es) para isolamento e identificação estrutural da(s) substância(s) (tabela 11, p. 58).
Os extratos que promoveram uma porcentagem de lise das formas tripomastigotas de T. cruzi acima de 50% foram considerados ativos.
Tabela 11. Extratos testados no ensaio com a forma tripomastigota de T.
cruzi.
N° (%) Lise
1mg/mL N° (%) Lise
1mg/mL N° (%) Lise 1mg/mL
Ac1 41,7 Aq39 41,5 Ac77 7,5
Ac2 37,1 Dc40 17,1 Ac78 11,6
Ac3 55,4 Dc41 50,6 Ma79 17,1
Ma4 50,8 Dc42 31,7 Aq82 20,5
Ma5 48,3 Me43 67,4 Aq83 6,8
Ma6 51,7 Me44 30,3 Me85 23,3
Aq7 52,9 Me45 41,6 Me86 8,2
Aq8 47,9 Ac46 9,0 Dc88 13,0
Aq9 56,7 Ac47 77,5 Dc89 5,5
Dc10 53,3 Ac48 46,1 Ac91 2,7
Dc11 35,8 Ma49 14,6 Ac92 30,1
Dc12 50,0 Ma50 13,5 Ac93 27,4
Me13 43,3 Ma51 1,7 Ma94 21,4
Me14 45,8 Aq52 39,0 Ma95 28,6
Me15 35,0 Aq53 39,0 Ma96 13,1
______________________________________________Resultados e Discussão 62
Ac16 1,7 Aq54 45,7 Aq97 51,1
Ac17 41,6 Dc55 38,4 Aq98 28,6
Ac18 31,5 Dc56 43,9 Aq99 14,9
Ma19 19,1 Dc57 22,6 Me100 4,1
Ma20 4,5 Me58 27,0 Me101 6,5
Ma21 6,6 Me59 61,2 Me102 53,6
Aq22 17,1 Me60 61,8 Dc103 39,0
Aq23 46,3 Ac61 27,4 Dc104 9,2
Aq24 43,3 Ac62 6,6 Dc105 14,0
Dc25 46,3 Ac63 41,5 Ac106 16,1
Dc26 45,1 Ma64 61,0 Ac107 25,3
Dc27 50,0 Ma65 27,4 Ac108 8,9
Me28 30,3 Ma66 1,2 Ma109 0,7
Me29 1,1 Aq67 51,2 Ma110 19,2
Me30 0,0 Aq68 29,3 Ma111 26,7
Ac31 8,4 Aq69 58,5 Aq112 8,6
Ac32 15,2 Me70 43,9 Aq113 10,6
Ac33 24,2 Me71 12,3 Aq114 0,0
Ma34 7,9 Me72 31,5 Me115 30,1
Ma35 3,9 Dc73 17,8 Me116 17,8
Ma36 1,7 Dc74 2,1 Me117 29,1
Aq37 14,6 Dc75 31,5 Dc118 21,2
Aq38 21,9 Ac76 17,1 Dc119 27,4
Dc120 10,96
Os extratos Ac47, Me59, Me60, Ma64 e Me43 apresentaram as
atividades antiparasitárias mais promissoras (figura 22, p. 60). Os três
primeiros são provenientes do cultivo de P. verrucosum em meio
fermentativo Takeuchi, o penúltimo em meio Czapeck e o último em meio
Jackson. É importante destacar que os extratos Me43, Me59 e Me60 foram
obtidos da massa micelial e apresentam o mesmo perfil químico,
evidenciado através de análise em CCDA. Estes resultados indicam que em
meio Takeuchi, tanto em 72 horas quanto em 144 horas, os metabólitos
secundários produzidos são muito semelhantes. Além disso, quando a
massa micelial de P. verrucosum foi cultivada por 48 horas em meio Jackson
______________________________________________Resultados e Discussão 63
e por 72 e 144 horas em meio Takeuchi, os metabólitos produzidos nestas diferentes condições apresentaram-se em misturas análogas.
Figura 22. Extratos com atividade antiparasitária significativa no ensaio biológico, in vitro, realizado com a cepa Y da forma tripomastigota do Trypanosoma cruzi
Alguns extratos foram testados em menores concentrações e tiveram seus respectivos IC 50 calculados. Estes extratos apresentaram-se ativos contra a forma tripomastigota de T. cruzi, confirmando a presença de substâncias ativas (tabela 12, p. 61).
55 51 52 53
57 53
50 50 51 68
77
61 62 61 51
58
51 54
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
% de lise do parasita
Ac3
Ma4
Ma6
Aq7
Aq9
Dc10
Dc12
Dc27
Dc41
Me43
Ac47
Me59
Me60
Ma64
Aq67
Aq69
Aq97
Me102
______________________________________________Resultados e Discussão 64
Tabela 12. Comparação da atividade tripanocida em diferentes concentrações e IC 50 dos extratos brutos.
4.2.2 Ensaios bioquímicos com a enzima GAPDH de T. cruzi e enzima APRT de L. tarentolae
Os 115 extratos brutos obtidos em pequena escala foram avaliados frente a inibição das enzimas GAPDH de T. cruzi (tabela 13, p. 61) e APRT de L. tarentolae (tabela 15, p. 65).
Tabela 13. Resultados obtidos no ensaio da atividade enzimática da GAPDH de T. cruzi frente aos extratos brutos obtidos de culturas de P.
verrucosum
N ° [ ] % de inibição N ° [ ] % de inibição
Ac1 100 µ g 0,0 Dc55 180 µ g 0,0
Ac2 80 µ g 0,0 Dc56 140 µ g 0,0
Ac3 75 µ g 0,0 Dc57 100 µ g 0,0
Ma4 110 µ g 0,0 Ac61 100 µ g 5,8 Ma5 120 µ g 0,0 Ac62 70 µ g 21,1
Ma6 140 µ g 0,0 Ac63 90 µ g 2,5
Aq7 150 µ g 0,0 Ma64 120 µ g 0,0 Aq8 135 µ g 0,0 Ma65 150 µ g 0,0
Aq9 90 µ g 0,0 Ma66 140 µ g 0,0
Dc10 80 µ g 0,0 Aq67 150 µ g 0,0 Dc11 135 µ g 0,0 Aq68 150 µ g 0,0 Dc12 75 µ g 0,0 Aq69 160 µ g 2,9 Me13 90 µ g 0,0 Me70 150 µ g 0,0
N° (%)
1mg/mL
(%) 0,5mg/mL
(%) 0,25mg/mL
(%) 0,1mg/mL
IC
50( µ g/ml)
Ac3 55,4 47,9 23,1 0,7 513,3
Dc10 53,3 63,3 23,4 4,9 401,5
Me43 67,4 51,7 43,3 39,9 463,7
Ac47 77,5 56,6 37,8 12,3 393,2
Ac48 46,0 64,3 59,4 10,5 263,9
Me59 61,2 42,7 37,1 11,2 597,6
Me60 61,8 59,4 27,3 6,6 411,7
______________________________________________Resultados e Discussão 65
Me14 100 µ g 0,0 Me71 140 µ g 0,0
Me15 105 µ g 0,0 Me72 110 µ g 13,6
Me43 100 µ g 13,1 Ac76 90 µ g 2,3
Ac47 85 µ g 2,0 Ac77 90 µ g 11,6
Me59 110 µ g 0,0 Ma79 130 µ g 0,0
Me60 110 µ g 0,0 Ma80 150 µ g 0,4
Ac16 123 µ g 3,5 Aq82 110 µ g 3,8
Ac17 225 µ g 4,0 Aq83 180 µ g 11,4
Ac18 225 µ g 0,0 Me85 130 µ g 14,5
Ma19 125 µ g 0,0 Me86 150 µ g 11,1
Ma20 110 µ g 0,0 Ac91 130 µ g 10,2
Ma21 225 µ g 0,0 Ac92 90 µ g 11,1
Me28 140 µ g 0,0 Ac93 120 µ g 14,1
Me29 120 µ g 0,0 Ma94 160 µ g 22,1
Me30 120 µ g 0,0 Ma95 110 µ g 15,3
Ac31 105 µ g 6,4 Ma96 110 µ g 16,6
Ac32 85 µ g 3,5 Aq97 100 µ g 20,0
Ac33 250 µ g 6,4 Aq98 130 µ g 15,5
Ma34 170 µ g 1,1 Aq99 110 µ g 23,7
Ma35 210 µ g 0,0 Me100 110 µ g 11,2
Ma36 220 µ g 0,0 Me101 150 µ g 11,2
Me44 200 µ g 0,0 Me102 120 µ g 16,4
Me45 150 µ g 0,0 Ac106 90 µ g 16,8
Ac46 100 µ g 0,0 Ac107 80 µ g 0,0
Ac48 250 µ g 0,0 Ac108 90 µ g 0,0
Ma49 245 µ g 0,0 Ma109 130 µ g 0,0
Ma50 160 µ g 0,0 Ma110 130 µ g 0,0
Ma51 187 µ g 0,0 Ma111 110 µ g 0,0
Me58 140 µ g 0,0 Aq112 110 µ g 0,0
Aq22 150 µ g 0,0 Aq113 140 µ g 0,0
Aq23 130 µ g 0,0 Aq114 150 µ g 0,0
Aq24 140 µ g 0,0 Me115 120 µ g 0,0
Dc25 110 µ g 0,0 Me116 120 µ g 0,0
Dc26 100 µ g 0,0 Me117 130 µ g 0,0
Dc27 100 µ g 0,0 Dc118 120 µ g 0,0
Aq37 170 µ g 0,0 Dc119 160 µ g 0,0
Aq38 140 µ g 0,0 Dc120 100 µ g 0,0
Aq39 120 µ g 0,0 Dc73 190 µ g 0,0
Dc40 300 µ g 0,0 Dc74 140 µ g 0,0
Dc41 150 µ g 0,0 Dc75 80 µ g 0,0
Dc42 130 µ g 0,0 Dc88 100 µ g 0,0
Aq52 140 µ g 0,0 Dc89 100 µ g 0,0
Aq53 160 µ g 3,9 Dc103 130 µ g 0,0
Aq54 160 µ g 1,2 Dc104 130 µ g 0,0
Dc105 130 µ g 0,0
Controle-DMSO
______________________________________________Resultados e Discussão 66
No ensaio com a enzima GAPDH observou-se que os extratos mais ativos (tabela 13, p. 61) foram provenientes do cultivo do fungo em meio pré- fermentativo 48 horas. Além disso, o meio fermentativo Jackson foi o mais promissor para a produção de substâncias potencialmente ativas frente à enzima GAPDH de T. cruzi.
O ensaio foi realizado com um alvo específico em baixa concentração, por isso para extratos brutos foi difícil estimar a porcentagem de inibição da atividade enzimática, uma vez que um extrato pode conter substâncias ativas em concentrações muito baixas.
Um exemplo disto pôde ser ilustrado pela inibição de 3,9% da atividade enzimática apresentada pelo extrato hexânico dos galhos de Pilocarpus spicatus (Vieira et al., 2001). Deste extrato foi isolada uma cumarina, chalepina, que apresentou IC 50 = 64µM (Vieira et al., 2001) tornando-se um promissor protótipo para o desenho de inibidores mais ativos. A obtenção da estrutura do complexo cristalino chalepina - GAPDH (figura 23, p. 64) indicou as interações do produto natural com aminoácidos do sítio catalítico da enzima (Pavão et al., 2002) e possibilitou o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na inibição, bem como a proposição de novas estruturas cumarínicas potencialmente ativas, que vêm sendo sintetizadas em projeto paralelo coordenado pela Profa. Dra.
Mônica Tallarico Pupo.
Comparando-se os resultados de inibição da enzima GAPDH com os
obtidos na lise das formas tripomastigotas de T. cruzi, observou-se que os
extratos Aq97 e Me102, oriundos do meio fermentativo Jackson, mostraram-
______________________________________________Resultados e Discussão 67
se promissores, o que sugere uma futura investigação com isolamento e identificação de substâncias bioativas com mecanismo de ação possivelmente via inibição da enzima GAPDH (tabela 14, p. 65).
Figura 23. Comparação da estrutura monomérica nativa da GAPDH de T.cruzi (rosa) e complexada (azul) com o inibidor chalepina
Dos 115 extratos brutos ensaiados no teste bioquímico para inibição da enzima APRT de L tarentolae, os extratos Dc73, Dc75, Dc88, Dc103 e Dc104 apresentaram as atividades inibitórias mais promissoras (tabela 15, p.
65). Os dois primeiros foram provenientes do cultivo de P. verrucosum em meio fermentativo Czapeck, Dc88 em meio Vogel e os dois últimos em meio Jackson. É importante destacar que estes extratos foram cultivados em meio
O O HO
Chalepina
______________________________________________Resultados e Discussão 68
pré-fermentativo por 48 horas e que foram obtidos da massa micelial do fungo extraída com CH 2 Cl 2 . Estes dados ilustram o potencial de culturas de P. verrucosum na produção de metabólitos ativos inibidores da enzima APRT de L. tarentolae.
Tabela 14. Comparação dos extratos com atividade superior a 15% de inibição da enzima GAPDH com a % de lise da forma tripomastigota de T. cruzi
Tabela 15. Ensaio da atividade enzimática da APRT de L. tarentolae frente aos extratos brutos obtidos de culturas de P. verrucosum
N° [ ] % de inibição N° [ ] % de inibição
Ac1 50 µ g 1,5 Me58 70 µ g 3,9
Ac2 40 µ g 0,0 Me59 55 µ g 0,0
Ac3 38 µ g 12,7 Me60 55 µ g 1,2
Ma4 50 µ g 0,0 Ac61 50 µ g 0,0
Ma5 65 µ g 0,0 Ac62 80 µ g 0,0
Ma6 70 µ g 0,0 Ac63 75 µ g 0,0
Aq7 75 µ g 3,4 Ma64 50 µ g 8,7
Aq8 65 µ g 0,0 Ma65 75 µ g 3,6
Aq9 45 µ g 3,4 Ma66 60 µ g 5,8
Dc10 48 µ g 0,0 Aq67 60 µ g 4,1
Dc11 65 µ g 0,0 Aq68 80 µ g 4,1
Dc12 38 µ g 0,0 Aq69 85 µ g 0,4
Me13 45 µ g 3,9 Me70 75 µ g 0,0
N ° % de lise da forma tripomastigota
(1mg/mL)
% de inibição da GAPDH ( ≈ 100 µ g/mL)
Ac62 6,6 21,1
Ma94 21,4 22,1
Ma95 28,6 15,3
Ma96 13,1 16,6
Aq97 51,1 20,0
Aq98 28,6 15,5
Aq99 14,9 23,7
Me102 53,6 16,4
Ac106 16,1 16,8
______________________________________________Resultados e Discussão 69
Me14 50 µ g 0,0 Me71 115 µ g 0,0 Me15 50 µ g 0,0 Me72 65 µ g 10,2
Ac16 50 µ g 2,4 Ac76 50 µ g 0,0
Ac17 50 µ g 1,2 Ac77 85 µ g 0,0
Ac18 50 µ g 4,3 Ma79 63 µ g 3,4
Ma19 50 µ g 2,5 Ma80 65 µ g 6,3
Ma20 50 µ g 3,1 Aq82 50 µ g 0,0
Ma21 50 µ g 4,4 Aq83 85 µ g 0,0
Aq22 115 µ g 5,9 Me85 65 µ g 0,0
Aq23 70 µ g 8,0 Me86 65 µ g 0,0
Aq24 65 µ g 7,2 Ac91 55 µ g 0,0
Dc25 55 µ g 5,3 Ac92 80 µ g 0,0
Dc26 50 µ g 7,7 Ac93 55 µ g 0,0
Dc27 50 µ g 7,1 Ma94 75 µ g 0,0
Me28 70 µ g 9,2 Ma95 60 µ g 0,0
Me29 60 µ g 5,9 Ma96 55 µ g 0,0
Me30 60 µ g 6,6 Aq97 90 µ g 0,0
Ac31 50 µ g 10,6 Aq98 85 µ g 1,5
Ac32 50 µ g 9,8 Aq99 75 µ g 0,0
Ac33 50 µ g 0,0 Me100 90 µ g 1,2 Ma34 50 µ g 0,0 Me101 70 µ g 4,3 Ma35 50 µ g 1,3 Me102 55 µ g 6,3 Ma36 50 µ g 3,0 Ac106 55 µ g 0,0 Aq37 75 µ g 0,5 Ac107 45 µ g 12,4 Aq38 65 µ g 2,7 Ac108 55 µ g 0,0 Aq39 65 µ g 6,2 Ma109 60 µ g 10,2 Dc40 50 µ g 0,0 Ma110 55 µ g 11,5 Dc41 75 µ g 12,1 Ma111 55 µ g 13,6 Dc42 65 µ g 10,9 Dc73 75 µ g 24,0
Me43 50 µ g 3,7 Dc74 95 µ g 9,4
Me44 100 µ g 2,9 Dc89 100 µ g 0,4
Me45 75 µ g 8,5 Dc103 70 µ g 30,0
Ac46 50 µ g 0,0 Dc104 50 µ g 17,0
Ac47 50 µ g 0,0 Aq112 80 µ g 0,0
Ac48 50 µ g 0,0 Aq113 65 µ g 4,1
Ma49 50 µ g 0,0 Me115 60 µ g 0,0
Ma50 50 µ g 0,0 Me116 85 µ g 3,3
Ma51 50 µ g 0,0 Dc118 65 µ g 2,0
Aq52 50 µ g 4,1 Dc119 95 µ g 7,2
Aq53 95 µ g 6,4 Dc75 75 µ g 38,9
Aq54 65 µ g 7,3 Dc88 100 µ g 28,4
Dc55 95 µ g 5,2 Dc105 70 µ g 6,7
Dc56 60 µ g 2,5 Aq114 75 µ g 0,0
Dc57 55 µ g 6,1 Me117 70 µ g 0,0
Dc120 70 µ g 0,7
Controle-DMSO
______________________________________________Resultados e Discussão 70
Entre os 18 extratos brutos tripanocidas encontrados (figura 22, p.
60), os mais promissores foram oriundos do meio pré-fermentativo incubado por 24 horas, meio fermentativo Takeuchi e provenientes da massa micelial extraída com metanol e fluido da cultura extraído com AcOEt. Já os extratos ativos nas enzimas GAPDH e APRT, todos foram oriundos do meio pré- fermentativo incubado por 48 horas, mas para GAPDH houve o predomínio de extratos cultivados em meio fermentativo Jackson e extraídos do fluido da cultura, para a APRT, houve predomínio dos extratos obtidos da massa micelial do fungo cultivado em meios Jackson, Czapeck e Vogel.
Estes resultados demonstraram que a produção de diferentes metabólitos secundários bioativos varia de acordo com as condições de cultivo do fungo. Além disso, diferentes melhorias no cultivo poderiam ser futuramente introduzidas na tentativa de aumentar a produção dos metabólitos ativos.
4.3 Considerações gerais sobre o isolamento das substâncias
Os extratos Ac47 do fluido da cultura e Me59 da massa micelial foram selecionados para ter sua escala ampliada por apresentarem lise significativa das formas tripomastigotas de T. cruzi (tabela 22, p. 60). Além disso, são oriundos da mesma condição de cultivo de P. verrucosum.
O fracionamento do extrato Ac47, produzido em escala intermediária
resultou em muitas frações com baixo grau de pureza que não foram
ensaiadas e purificadas devido às pequenas massas obtidas. Os espectros
de RMN 1 H das frações finais, obtidas em escala intermediária, mostraram-
______________________________________________Resultados e Discussão 71
se em misturas complexas contendo sinais na região entre δ 0,8 e 1,4 indicando a possibilidade da presença de unidades de leucina, isoleucina, valina, alanina ou treonina nas estruturas. Além disso, observaram-se vários sinais entre δ 2,0 e 4,5 característicos de hidrogênio α-carbonílicos e ligados a carbono ligado a heteroátomo.
Visto que o estudo químico e o biomonitoramento estavam limitados devido às pequenas quantidades de massas e complexidade das misturas obtidas, o fungo P. verrucosum foi cultivado em escala ampliada para a obtenção de frações com massa suficiente para o isolamento. Novamente, os espectros de RMN 1 H das frações obtidas dos processos cromatográficos de Ac47 mostraram que as mesmas eram compostas por misturas de substâncias, constituídas principalmente por aminoácidos. Também observou-se em algumas frações sinais característicos de sistema aromático para dissubstituído (AA’XX’), possíveis para uma unidade de tirosina.
A complexidade das misturas sugeriu que as técnicas cromatográficas usuais não estariam sendo eficazes, devido a possível semelhança nas estruturas químicas dos aminoácidos precursores e conseqüentemente nas características das moléculas produzidas no metabolismo secundário de P.
verrucosum.
Cromatografia líquida de alta eficiência reciclante (CLAE - R), foi uma alternativa usada neste trabalho. Este cromatógrafo foi utilizado no laboratório de Produtos Naturais do Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos-UFSCar, disponibilizado pelo Prof. Dr.
Paulo Cezar Vieira. CLAE - R distingue-se das CLAE usuais principalmente
______________________________________________Resultados e Discussão 72
pelo fato de retornar a amostra a ser separada para a coluna. O número de vezes (ciclos) que a amostra volta para a coluna é ilimitado. Isto possibilita maior eficiência na separação.
Assim, optou-se por adotar esta técnica para algumas frações. A escolha foi feita em função das quantidades das frações, da análise prévia dos espectros de RMN 1 H e atividades de inibição da enzima GAPDH de T.
cruzi.
As frações Ac479.4.4 e Ac479.4.5 (escala ampliada) foram separadas por CLAE – R (figuras 24, p. 70; 25a, p. 71 e 25b, p. 72) das quais foi isolada a substância F1 (p. 73).
As frações obtidas por CLAE - R que se constituíam por mistura aparente de 2 ou 3 substâncias foram analisadas via ESI-EM/EM, na tentativa de se identificar as substâncias em mistura, mas a ionização por electrospray destas pequenas moléculas não ocorreu, limitando a utilização desta técnica. Este experimento foi realizado no pelo Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes no laboratório de Química Orgânica do Departamento de Ciências Farmacêuticas da FCFRP-USP.
O extrato Me59 obtido da massa micelial de P. verrucosum em escala
ampliada foi fracionado por técnicas usuais, levando ao isolamento das
substâncias M2, M3, M4, M5 e M6 (p. 73). A mistura de substâncias M2 foi
obtida por esterificação com diazometano, as substâncias M3 e M4 foram
acetiladas e a mistura de substâncias M6 foi transesterificada.
Figura 24. Cromatograma da fração AC47.9.4.4 em CLAE - R no tempo de retenção 0 a 150 minutos. Condições experimentais: coluna polimérica Shodex , φ =21, 5 mm e h = 500 mm, fluxo de 5 mL/min, MeOH:CH 2 Cl 2
1:1, 225 nm, 6 ciclos.
Minutes
0 20 40 60 80 100 120 140
Volts 0,0 0,1 0,2
0,0 0,1 0,2
ciclos 1 2 3 4 5 6
Substância F1
Figura 25a. Cromatograma da fração AC47.9.4.5 em CLAE - R no tempo de retenção 0 a 450 minutos. Condições experimentais: coluna polimérica Shodex , φ =21,5 mm e h = 500 mm, fluxo de 3 mL/min, MeOH:CH 2 Cl 2
1:1, 225 nm, 22 ciclos. (continuação na próxima página como figura 25b).
Minutes
0 100 200 300 400
Volts 0,0 0,1 0,2
0,0 0,1 0,2
ciclos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Minutes
450 500 550 600 650 700 750 800 850
Volts 0,0 0,1 0,2
0,0 0,1 0,2
Figura 25b: (continuação da figura 25a) Cromatograma da fração Ac47.9.4.5 em CLAE – R no tempo de retenção 450 a 860 minutos. Condições experimentais: coluna polimérica Shodex , φ =21,5 mm e h = 500 mm, fluxo de 3 mL/min, MeOH:CH 2 Cl 2 1:1, 225 nm, 22 ciclos.
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Substância F1
______________________________________________Resultados e Discussão 73
4.4 Substâncias Isoladas
HO
OH OH
OH OH
OH
(F1)
Alcalóide dicetopiperazínico
(M3) Manitol
(M2) Ácidos graxos
(M6) Triglicerídeos (M5)
Glicerilfosfocolina
O O
O O
O
O n
n
n
O OH n
O OH n
O H
HO
H HO
H
O
H OH H
OH
O
H OH H
OH H
HO H
H
OH
(M4) α, α - Trealose
N H
H N O
HO O
O P
O O
-O N
+OH
OH
______________________________________________Resultados e Discussão 74
4.4.1 Alcalóide dicetopiperazínico (F1)
A substância F1 foi isolada do fluido da cultura de P. verrucosum extraído com AcOEt. O sólido branco apresentou-se insolúvel em água.
O espectro de RMN 1 H apresentou sinais referentes a 20 hidrogênios (tabela 16, p. 78 e figura 26, p. 82). A presença de dois dubletos em δ 7,38 (J= 8,6Hz; 2H) e δ 7,08 (J= 8,6Hz; 2H), caracterizando um sistema de spins AA’XX’, sugeriu a presença de uma unidade de tirosina na molécula, o que já era esperado através da análise prévia dos espectros das frações que originaram a substância F1 e do conhecimento da composição do meio de cultura rico em aminoácidos.
O espectro de massas indicou a presença de número par de átomos de nitrogênio na molécula, apresentando íon em m/z 277 ([M+H] + ).
Os sinais em δ 3,56 (dd; J= 13,6; 5,1Hz; 1H) e δ 3,24 (dd; J= 13,6;
4,5Hz; 1H) foram atribuídos aos hidrogênios benzílicos da unidade de tirosina. O acoplamento entre estes hidrogênios foi confirmado no mapa de contornos COSY 1 H - 1 H (figura 27, p. 83), que mostrou também o acoplamento destes hidrogênios com um hidrogênio na região em δ 4,64 (m;
1H), atribuído ao hidrogênio metínico α ao grupo amino e carbonílico da unidade de tirosina. Também neste mapa evidenciou o acoplamento do
Tirosina
COOH NH
2HO
______________________________________________Resultados e Discussão 75
hidrogênio em δ 4,64 com um hidrogênio em δ 9,26 (d; J= 2,0Hz; 1H), atribuído a um hidrogênio ligado a nitrogênio. A presença de um hidrogênio ligado a nitrogênio indicou que o nitrogênio deveria estar dissubstituído.
O espectro de RMN 13 C (tabela 16, p. 77 e figura 28, p. 84) apresentou 15 sinais, dos quais 2 apresentaram valores de deslocamento químico característicos de carbonos carbonílicos de amidas (δ 167,7 e 168,9), o que é esperado em substâncias originadas de condensação entre aminoácidos.
Os demais sinais no espectro de RMN 1 H sugeriram a presença de uma unidade de leucina: 2 dubletos em δ 0,84 (J= 6,3Hz; 3H) e δ 0,86 (J=
6,3Hz; 3H); um multipleto entre δ 1,86-1,96 (1H), 3 duplo duplo dubletos em δ 1,62 (J= 4,6; 9,6; 13,6Hz; 1H), δ 0,93 (J= 4,8; 9,8; 13,6Hz; 1H) e δ 4,14 (J=
3,3; 3,8; 9,6Hz; 1H). Os acoplamentos entre estes hidrogênios foram evidenciados no mapa de contornos COSY 1 H - 1 H. Novamente observou-se o acoplamento entre o sinal referente ao hidrogênio α carbonílico e α amino (δ 4,14) da unidade de leucina e o sinal em δ 9,16 (d; J= 2,0Hz; 1H) atribuído ao hidrogênio ligado ao nitrogênio da unidade de leucina.
HO O R'
R H N
Tirosina com N dissubstituído
______________________________________________Resultados e Discussão 76
Leucina com nitrogênio dissubstituído.
Além destes sinais foi observado um singleto largo em δ 11,40 atribuído ao hidrogênio fenólico da unidade de tirosina.
Com base nos dados discutidos foi proposta a estrutura de um alcalóide dicetopiperazínico (F1) formado pela condensação entre os aminoácidos tirosina e leucina.
Proposta para substância F1- C 15 H 20 N 2 O 3
O mapa de contornos HMQC (figura 29, p. 85) possibilitou as atribuições dos carbonos da molécula. O mapa HMBC (figura 30, p. 86;
figura 31, p. 87 e figura 32, p. 88) permitiu a confirmação da proposta estrutural, além de confirmar as atribuições dos deslocamentos químicos de carbono e hidrogênio.
As principais correlações observadas no mapa de contornos HMBC para a comprovação do anel dicetopiperazínico foram as correlações do H-1 com C-3 e H-4 com C-6. As correlações destes hidrogênios ligados aos nitrogênios com os carbonos metínicos só seriam possíveis numa estrutura contendo o anel dicetopiperazínico.
R' N H
R O
N H
H N O
HO O
______________________________________________Resultados e Discussão 77
Correlações 1 H - 13 C observadas no mapa de contornos HMBC
Tabela 16. Dados de RMN 1 H (400 MHz) e RMN 13 C (100 MHz) para a substância F1 (δ, piridina-d 5 )
Posição δ H δ C
1 9,26 d (2,3; 1H) -
2 - 168,9
3 4,14 ddd (3,3; 3,8; 9,6; 1H) 53,8
4 9,16 d (2,0; 1H) -
5 - 167,7
6 4,61-4,66 m (1H) 57,4
7 7a- 3,56 dd (13,9; 5,1; 1H)
7b- 3,24 dd (13,9; 4,5; 1H) 39,9
8 - 126,9
9 7,38 d (8,6; 1H) 132,2
10 7,08 d (8,6; 1H) 116,2
11 - 158,1
12 7,08 d (8,6; 1H) 116,2
13 7,38 d (8,6; 1H) 132,2
7’ 7’a- 1,62 ddd (4,6; 9,6;13,6; 1H)
7’b- 0,93 ddd (4,8; 9,8; 13,6;1H) 45,0
8’ 1,92 m (1H) 24,2
9’ 0,84 d (6,3; 3H) 21,3
10’ 0,86 d (6,3; 3H) 23,3
11’ 11,4 sl (1H) -
* Constantes de acoplamentos, em Hz, e integrais entre parênteses 10' 9'
8'
7' 4 3
N H
H N O
O
1 6 5 7
HO
2 8
13 12 11
10 9
11'
______________________________________________Resultados e Discussão 78
Na tentativa de se determinar a configuração relativa do alcalóide dicetopiperazínico foi realizado o experimento de NOE-diff. Neste experimento, irradiou-se H-6, H-3 e H-7b, porém os NOE observados não permitiram a proposição da configuração relativa da molécula.
Alcalóides dicetopiperazínicos constituem uma classe de metabólitos secundários amplamente distribuída em fungos, principalmente em espécies de Penicillium (Laws & Mantle, 1985). Mais de 40 substâncias dicetopiperazínicas estão listadas como metabólitos de fungos e a mais freqüente biossíntese envolve a condensação de dois ou três aminoácidos como precursores (Laws & Mantle, 1985; Kozlovsky et al., 2000).
A tabela 17 (p. 78) apresenta as estruturas dos alcalóides dicetopiperazínicos isolados de espécies de Penicillium encontrados na literatura até Maio de 2003, incluindo as substâncias 2, 3, 33, 34, 37, 38 e 39 apresentadas anteriormente
Tabela 17. Alcalóides dicetopiperazínicos isolados de espécies de Penicillium
Estrutura Espécie Referência
HN NH O
O
42
P. megasporum Nozawa et al., 1989
HN
NH H O
O N NH
H
43
P. aurantiogriseum Larsen et al., 1992
______________________________________________Resultados e Discussão 79
HN
NH H O
H
O N NH
44
P. viridicatum Larsen et al., 1992
N N
HN NH OH
45
O
O
O
P. nordicum Larsen et al., 2001
HN NH O
46O
Penicillium sp. Kwon et al., 2000
N N
NH
H H
H O
O H
R 47 R=H 48 R= -COCH
3H
P. rugulosum Kozlovsky et al.,2001;
Kozlovsky et al.,2000b
N
N O
O
49 OH
P. brevicompactum Prasad, 1995
O N
H HN O
50
P. nigricans Birkinshaw & Mohammed,1962
N H N
N H N O
51 O
P. nigricans Laws & Mantle, 1985
______________________________________________Resultados e Discussão 80
52 N
N NH
O O
O
H H
H
P. aurantiogriseum Boyes-Korkis et al., 1993
N H
N NH O
O
53
P.rugulosum Solov’eva et al., 1997
NH N
N HN
OH O
O OH
54
P. fellutanum Kozlovsky et al.,1997
NH HN
NH O
O 55
P.rugulosum Kozlovsky et al.,1997
N N
NH O
O 56 O
P. piscarium Kozlovsky et al.,2000a
N N
N
MeO
OH OHO
O
57 O O
P. simplicissimum Mantle & Shipston,1987
Alguns derivados dicetopiperazínicos são conhecidos por suas
atividades biológicas, a estrutura 46 é um inibidor da enzima α-glicosidase
(Kwon et al., 2000), a estrutura 33, conhecida como roquefortine C foi
isolada de P. verrucosum (Musuku et al., 1994) e apresentou inibição
enzimática significativa do citocromo P450 de células de mamíferos (Aninat
et al., 2001).
______________________________________________Resultados e Discussão 81
Dicetopiperazinas isoladas de outros microrganismos apresentaram atividade antifúngica (Yang, et al., 2002) e antagonista da substância P (Barrow & Sedlock, 1994). Algumas dicetopiperazinas isoladas de plantas são potentes agentes sedativos (Lee & Liu, 2001), imunosupressores (Ravikanth, et al., 2001) e antitumorais (Pearce, 1994). Além disso, muitas dicetopiperazinas têm sido sintetizadas baseadas em protótipos naturais apresentando inibição de proteína tirosina quinase (Li & Peng, 1998) e inibição de HIV protease (Falorni et al, 1996).
Até o momento, não se encontraram relatos na literatura sobre a
presença da substância F1 em espécies de Penicillium ou qualquer outra
fonte natural de metabólitos secundários.
Figura 26. Espectro de RMN 1 H da substância F1 (Piridina-d 5 , 400 MHz)
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
11
7.00 7.10 7.20 7.30 7.40
9.15 9.20 9.25 9.30
4.10 4.20 4.30 4.40 4.50 4.60 4.70
3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70
1.60 1.70
1.80 1.90
2.00
0.85 0.90 0.95
1 (1H) 4 (1H) 9 e 13 (2H)
10 e 12 (2H)
7b’ (1H)
6 (1H)
3 (1H)
7a (1H) 7b (1H)
8’ (1H)
7a’ (1H) 10’ e 9’ (6H)
11’ (1H)
1 9' 8' 7' 4 3
2
NH
HN O
O HO
6 1 5 7 8 9 1110 1213
11'
Figura 27. Mapa de contornos COSY 1 H - 1 H da substância F1 (Piridina-d 5 , 400 MHz)
H1 H4 H6 H3
10' 9' 8' 7' 4 3
2
NH
HN O
O HO
6 1 5 7 8 9 1110 1213
11'
Figura 28. Espectro de RMN 13 C da substância F1 (Piridina-d 5 , 100 MHz)
20 20 30
30 40
40 50
50 60
60 70
70 80
80 90
90 100
100 110
110 120
120 130
130 140
140 150
150 160
160 170
170
2 5
11
9 e 13
10 e 12
8
6
3 7’
7
8’
9’
10’
10' 9' 8' 7' 4 3
2
N H H
N O
O HO
1 6 5 7 8
9 11 10 12 13
11'
Figura 29. Mapa de contornos HMQC da substância F1 (Piridina-d 5 )
10' 9' 8' 7' 4 3
2
NH
HN O
O HO
6 1 5 7 8 9 1110 1213
11'
Figura 30. Mapa de contornos HMBC da substância F1 (Piridina-d 5 )
10' 9' 8' 7' 4 3
2
N H H
N O
O HO
1 6 5 7 8 9 1110 1213
11'
Figura 31. Ampliação do mapa de contornos HMBC da substância F1 (Piridina-d 5 )
9' 8' 7' 4 3
2
NH
HN O
O HO
1 6 5 7 8 9 1110 1213
11'
Figura 32. Ampliação do mapa de contornos HMBC da substância F1 (Piridina-d 5 )
10' 9' 8' 7' 4 3
2
N H H
N O
O HO
1 6 5 7 8 9 1110 1213
11'
______________________________________________Resultados e Discussão 89
4.4.2 Ácidos graxos (M2)
A mistura dos ácidos graxos foi isolada da fração n-BuOH do extrato metanólico obtido do micélio de P. verrucosum.
No espectro no infravermelho da fração Me59.2.8 (figura 33, p. 91) foram observadas absorções de alguns grupos funcionais, listados na tabela 18 (p. 89).
Tabela 18. Principais absorções observadas no espectro no infravermelho da fração Me59.2.8
3283,54 cm -1 Deformação axial de O-H 2923,79 cm -1 Deformação axial de C-H 1736,27 cm -1 Deformação axial de C=O 1083,88 cm -1 Deformação axial de C-O 1458,85 cm -1 Deformação angular de C-O-H
As substâncias foram identificadas em mistura, após esterificação com diazometano. A determinação estrutural baseou-se em RMN 1 H e principalmente CG-EM dos ésteres metílicos (M2b) obtidos.
Na análise do espectro de RMN 1 H (figura 34, p. 92) dos ésteres metílicos alguns sinais característicos foram observados, como, tripleto em δ 2,30 (J= 7,8 Hz; 2H), referente a hidrogênios α às carbonilas, um singleto em δ 3,65 (3H) referentes aos hidrogênios metílicos do grupo carbometoxila,
O
OH n
O
OH
n
______________________________________________Resultados e Discussão 90
vários sinais entre δ 1,0 - 2,0, caracterizando hidrogênios da cadeia metilênica e um tripleto em δ 0,9 (3H) referente as metilas terminais.
A análise da mistura via CG-EM (figuras 35, p. 93; figura 36, p. 94 e figura 37, p. 95) possibilitou a determinação do tamanho das cadeias metilênicas. Os espectros de massas obtidos para cada substância do cromatograma foram comparados com os espectros da biblioteca do aparelho. Aqueles com índice de correlação superior a 90% foram indiretamente caracterizados (tabela 19, p. 90).
Tabela 19. Dados obtidos via CG-EM para os ésteres metílicos dos ácidos graxos
Picos T r (min.) [M + ] Fórmula
molecular nome
1 16,76 242 C 15 H 30 O 2 tetradecanoato de metila
2 18,20 256 C 16 H 32 O 2 pentadecanoato de metila
3 19,67 268 C 17 H 32 O 2 9-hexadecenoato de metila
4 20,16 270 C 17 H 34 O 2 hexadecanoato de metila
5 22,73 284 C 18 H 36 O 2 heptadecanoato de metila
6 25,11 294 C 19 H 34 O 2 9,12-octadecadienoato de metila
7 25,30 296 C 19 H 36 O 2 9-octadecenoato de metila
8 26,29 298 C 19 H 38 O 2 octadecanoato de metila
Figura 33. Espectro no infravermelho da fração Me59.2.8
Figura 34. Espectro de RMN 1 H dos ésteres metílicos (M2b) obtidos
Figura 35. Cromatograma, obtido via CG, dos ésteres metílicos da mistura M2b
(coluna DB - 5; 25 m, 0,25 cm, 0,25 µm, detector de massas) 1
2 4
5
6 7
8
3
______________________________________________Resultados e Discussão 94
Figura 36. Espectro de massas dos picos 1, 2, 3 e 4 obtidos via CG-EM 1
2
3
4
______________________________________________Resultados e Discussão 95
Figura 37. Espectro de massas dos picos 5, 6, 7 e 8 obtidos via CG-EM 5
6
7
8
______________________________________________Resultados e Discussão 96
4.4.3 Triglicerídeos (M6)
Os triglicerídeos foram isolados da fração AcOEt do extrato metanólico de P. verrucosum e identificados através de RMN 1 H.
O espectro de RMN 1 H (figura 38, p. 98), apresentou alguns sinais característicos de triglicerídeos, como tripleto em δ 0,88 (J= 7,0 Hz), referente as metilas terminais, sinais intensos na região de δ 1,25 referentes aos metilenos da cadeia alquílica, multipleto em δ 2,13 referente aos metilenos α às carbonilas, dois duplos dubletos em δ 4,14 (J= 2,3; 7,4 Hz) e δ 4,29 (J= 4,3; 7,6 Hz), relativos aos metilenos acilcarbinólicos.
Os ácidos graxos que esterificavam o glicerol, após reação de transesterificação (M6b), com MeOH e H 2 SO 4, foram identificados indiretamente por CG-EM (tabela 20, p. 97; figura 39, p. 99; figura 40, p. 100 e figura 41, p.
101). Além disso, os ésteres metílicos foram confirmados e quantificados usando padrões, via CG (tabela 20, p. 97; figura 42, p. 102 e figura 43, p. 103).
O O
O O
O O
n
n
n
______________________________________________Resultados e Discussão 97
Tabela 20. Dados obtidos via CG e CG-EM para os ésteres metílicos dos ácidos graxos que esterificam o glicerol
Picos T r (min.) [M + ] FM nome %
1 16,68 242 C 15 H 30 O 2 tetradecanoato de metila * 2 18,28 256 C 16 H 32 O 2 pentadecanoato de metila 1,06 3 19,76 268 C 17 H 32 O 2 9-hexadecenoato de metila 2,62 4 20,07 270 C 17 H 34 O 2 hexadecanoato de metila 20,52 5 25,06 294 C 19 H 34 O 2 9,12-octadecadienoato de metila 14,55 6 25,30 296 C 19 H 36 O 2 9-octadecenoato de metila 35,84 7 26,27 298 C 19 H 38 O 2 octadecanoato de metila 11,56
* não encontrado nos padrões do CG
______________________________________________Resultados e Discussão 98
Figura 38. Espectro de RMN 1 H dos triglicerídeos (CDCl 3 , 400MHz)
______________________________________________Resultados e Discussão 99
Figura 39. Cromatograma, obtido via CG, dos ésteres metílicos da mistura M6b
(coluna DB - 5; 25 m, 0,25 cm, 0,25 µm, detector de massas)
1 2
3 4
5 6
7
______________________________________________Resultados e Discussão 100
Figura 40. Espectro de massas dos picos 1, 2, 3 e 4 obtidos via CG-EM 1
2
3
4
______________________________________________Resultados e Discussão 101
Figura 41. Espectro de massas dos picos 5, 6 e 7 obtidos via CG-EM 5
6
7
Figura 42. Cromatograma dos ésteres metílicos da mistura M6, via CG (coluna HP - 1; 25 m, 0,25 cm, 0,25 µm, detector FID 300°C)
2
3 4
5 6
7
Figura 43. Cromatograma dos padrões de ésteres metílicos, via CG.
(coluna HP - 1; 25 m, 0,25 cm, 0,25 µm, detector FID 300°C)
2 3 4
5 6
7
104
4.4.4 Manitol (M3)
O manitol foi isolado da fração aquosa do extrato metanólico do micélio do fungo P. verrucosum cultivado em meio Takeuchi.
No espectro no infravermelho (figura 44, p. 107) foram observadas absorções de alguns grupos funcionais listados na tabela 21 (p. 104).
Tabela 21. Principais absorções observadas no espectro no infravermelho da subtância M3
3288,65 cm -1 Deformação axial de O-H 2948,29 cm -1 Deformação axial de C-H 1082,11 cm -1 Deformação axial de C-O 1421,75 cm -1 Deformação angular de C-H
O espectro de RMN 1 H (figura 45, p. 108) apresentou quatro sinais referentes a 8 hidrogênios carbinólicos, dois duplos dubletos em δ 3,67 (J=
11,6; 5,8 Hz) e δ 3,86 (J= 11,6; 2,5 Hz), um duplo duplo dubleto em δ 3,76 (J= 8,6; 5,8; 2,5 Hz) e um dubleto em δ 3,79 (J= 8,6 Hz). No espectro de RMN 13 C (figura 46, p. 109 e figura 47, p. 110) observou-se três carbonos carbinólicos em δ 71,0 (CH), δ 69,5 (CH) e δ 63,5 (CH 2 ), referentes aos seis carbonos presentes na molécula (tabela 22, p. 105). A existência de apenas
HO
OH OH
OH OH
OH
1 2 3 3' 2' 1'
105
três sinais de carbonos é explicada pela simetria observada na molécula (Collins & Ferrier, 1996).
Os valores encontrados referentes aos dados de RMN 1 H e 13 C do manitol foram confrontados com modelos da literatura, tabela 22 (p. 105) (www.aist.go.jp e Bock & Pedersen, 1983).
Tabela 22. Dados de RMN 1 H e RMN 13 C para a substância M3 δ C , Manitol
(Bock &
Pedersen, 1983)
δ C, M3
δ H, Manitol
(www.aist.go.jp)
δ H, M3 1 – 72,2 71,0 1a- 3,38 dd (10,7; 5,6; 2H)
1b- 3,61 dd (10,7; 3,3; 2H)
1a- 3,67 dd (11,6; 5,8; 2H) 1b- 3,86 dd (11,6; 2,5; 2H) 2 – 70,7 69,5 3,45 ddd (5,6; 3,3 2H) 3,76 ddd (8,6; 5,8; 2,5 2H) 3 – 64,6 63,5 3,54 d (2H) 3,79 d (8,6 2H)
* Constantes de acoplamentos, em Hz, e integrais entre parênteses.Solvente da literatura DMSO. Solvente da substância M3, D
2O, 400 MHz e 100 MHz.
Para confirmar a estrutura da molécula, a substância M3 foi acetilada utilizando-se anidrido acético e piridina em quantidades catalíticas e os espectros do respectivo acetato (M3a) foram obtidos.
Na análise do espectro de RMN 1 H da substância M3a (figura 48, p.
111), foi observada a presença de dois duplos dubletos em δ 4,07 (J= 12,4;
5,3 Hz) e δ 4,22 (J= 12,6; 3,0 Hz), referente a H-1a e H-1b, um multipleto em δ 5,07 referente a H-2, um dubleto em δ 5,45 (J= 8,6 Hz) referente a H-3 e a
presença de três singletos em δ 1,98, δ 2,01 e δ 2,07, referentes às metilas
dos grupos acetato. Os acoplamentos entre estes hidrogênios foram
evidenciados no mapa de contornos COSY 1 H - 1 H (figura 50, p. 113).
106
O espectro de RMN 13 C (figura 49, p. 112) apresentou sinais de três carbonos carbonílicos de éster em δ 170,3, três sinais de carbonos carbinólicos em δ 68,7, δ 68,3 e δ 62,5 e três sinais de carbonos metílicos dos grupos acetato em δ 20,5, δ 20,6 e δ 20,8. Estes dados foram confrontados com Bock & Pedersen, 1983 na tabela 23 (p. 106).
Tabela 23. Dados de RMN 13 C dos carbonos carbinólicos da substância M3a δ C, Acetato de manitol
(Bock & Pedersen, 1983)
δ C, substância M3a
1 – 62,0 62,5
2 – 68,1 68,3
3 – 67,7 68,7
Solvente da literatura DMSO. Solvente da substância M3a, Me
2CO, 100 MHz
Figura 44. Espectro no infravermelho, obtido para a substância M3
Figura 45. Espectro de RMN 1 H obtido da substância M3 (D 2 O, 400MHz)
HO
OH OH
OH OH
OH
1 2 3 3' 2' 1'
1a (2H) 1b (2H)
3 (2H)
2 (2H)
Figura 46. Espectro de RMN 13 C obtido da substância M3 (D 2 O, 100MHz)
HO
OH OH
OH OH
OH
1 2 3 3' 2' 1'
1
3
2
Figura 47. Espectro de DEPT obtido da substância M3 (D 2 O, 100MHz) HO
OH OH
OH OH
OH
1 2 3 3' 2' 1'
1 3
2
Figura 48. Espectro de RMN 1 H obtido da substância M3a (Me 2 CO, 400MHz)
AcO
OAc OAc
OAc OAc
OAc
1 2 3 3' 2' 1'
1a (2H) 1b (2H)
2 (2H)
3 (2H)
Figura 49. Espectro de RMN 13 C obtido da substância M3a (Me 2 CO, 100MHz) AcO
OAc OAc
OAc OAc
OAc
1 2 3 3' 2' 1'
1 3
2
AcO
OAc OAc
OAc OAc
OAc
1 2 3 3' 2' 1'
Figura 50. Mapa de contornos COSY 1 H - 1 H da substância M3a (Me 2 CO, 400MHz)
______________________________________________Resultados e Discussão 114
4.4.5 α,α-Trealose (M4)
A substância M4 foi isolada do micélio do fungo P. verrucosum, apresentando alta polaridade sendo solúvel apenas em água.
Na análise do espectro de RMN 1 H (figura 51, p. 119) foi observada a presença de vários sinais na região de hidrogênios de açúcares e um dubleto em δ 5,20 (J= 3,8 Hz) característico de hidrogênio anomérico.
No experimento de RMN 1 H, os sinais desdobraram-se em um tripleto em δ 3,45 (J= 9,3 Hz) correspondente ao H-4 e H-4’, um duplo dubleto (H-2 e H-2’) em δ 3,65 (J= 9,9 e 3,8 Hz) e um multipleto entre δ 3,74 e 3,90 (H-3 e H-3’, H-5 e H-5’, H-6a e H-6a’ e H-6b e H-6b’).
No espectro de RMN 13 C (figura 52, p.120), foram observados os sinais de 6 átomos de carbonos, que somados aos de hidrogênios sugeriram que a molécula fosse a glicose.
Após análise destes espectros a substância M4 foi então acetilada, utilizando anidrido acético e piridina em quantidades catalíticas, para a confirmação da estrutura. Novos espectros foram obtidos para o produto M4a.
Na análise do espectro no infravermelho (figuras 53, p. 121), foram observadas absorções de alguns grupos funcionais (tabela 24, p. 115) e ausência de deformação axial de O-H, confirmando a acetilação.
No espectro de RMN 1 H de M4a (figuras 54, p. 122), pode–se
observar na região de δ 3,99 a 4,08 a sobreposição de um duplo dubleto (H-
6a) com um duplo duplo dubleto (H-5) referentes a hidrogênios que acoplam
entre si (J= 2,3 Hz). Além disso, um duplo dubleto (H-2) em δ 5,03 (J= 3,8;
______________________________________________Resultados e Discussão 115
10,2 Hz) apresentou-se coalescente com um tripleto (H-4) em δ 5,05 (J= 9,8 Hz). Observou-se ainda, um duplo dubleto em δ 4,23 (J= 5,8; 12,1 Hz) referente a H-6b e um tripleto em δ 5,49 (J= 9,4 Hz) referente a H-3.
Todos os sinais corresponderam ao da glicose acetilada, com exceção de um dubleto em δ 5,29 (J= 4,0 Hz) referente ao hidrogênio anomérico. Este fato, aliado à presença de apenas quatro metilas referentes a grupos acetato, sugeriu que a molécula não fosse a glicose, e sim um dissacarídeo dímero da glicose, conhecido como trealose. Analisando a constante de acoplamento de H-1 e H-2 (J= 4,0 Hz), conclui-se que estes hidrogênios estão em relação cis, sendo que H-1 está em posição equatorial, o que só é possível para a α,α-trealose.
Tabela 24. Principais absorções observadas no espectro no infravermelho da substância M4a
3026,19 cm -1 Deformação axial de C-H
2960,15 cm -1 Deformação axial assimétrica de CH 3
2852,78 cm -1 Deformação axial simétrica de CH 2
1753,46 cm -1 Deformação axial de C=O
1433,60 cm -1 Deformação angular simétrica de CH 2
1370,22 cm -1 Deformação angular simétrica de CH 3
1222,44 cm -1 Deformação axial de C-C(=O)-O acetato 1039,76 cm -1 Deformação axial assimétrica de O-C-C
O espectro de RMN 13 C de M4a (figura 55, p. 123), apresentou
quatro sinais de carbonos carbonílicos de éster na região de δ 169,7 a 170,8,
______________________________________________Resultados e Discussão 116
sinais de carbonos carbinólicos do dissacarídeo e sinais de quatro carbonos metílicos de grupos acetato em aproximadamente δ 20,6.
Tabela 25. Dados de RMN 1 H e RMN 13 C para a substância M4 (δ, D 2 O)
P
δ C, (75 MHz) L-trealose
(Haines, 2003)
δ C , (100 MHz) M4
δ H , (300 MHz) L-trealose
(Haines, 2003)
δ H , (400 MHz) M4
1 93,9 93,5 5,20 d (2H) 5,20 d (3,8; 2H) 2 71,8 71,4 3,65 dd (3,6; 9,9;2H) 3,65 dd (3,8; 9,9; 2H) 3 73,2 72,8 3,74-3,90 m (2H) 3,74-3,90 m (2H) 4 70,4 70,0 3,45 t (9,3; 2H) 3,45 t (9,3; 2H) 5 72,9 72,4 3,74-3,90 m (2H) 3,74-3,90 m (2H) 6 61,2 60,8 3,74-3,90 m (4H) 3,80-3,90 m (4H)
* Constantes de acoplamentos, em Hz, e integrais entre parênteses. P = Posição
Os valores encontrados referentes aos dados RMN 1 H e 13 C da α,α- trealose e α,α-trealose acetilada foram confrontados com modelos da literatura (Haines, 2003), tabela 25 (p. 116) e tabela 26 (p.117). Além disso,
α, α- trealose
O H
HO
H HO
H
O
H OH H
OH
O
H OH H
OH H
HO H
H
OH
14 3 2
4'
3'
2' 1'
6 5 6'
5'
