UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Veterinária
Dissertação
Estudo epidemiológico da infecção pelo vírus da
imunodeficiência felina em gatos domésticos da região sul do
Rio Grande do Sul
Fábio da Silva e Silva
1
FÁBIO DA SILVA E SILVA
Estudo epidemiológico da infecção pelo vírus da imunodeficiência felina em gatos domésticos da região do sul do Rio Grande do Sul
Orientador: Profa. Dra. Silvia de Oliveira Hübner
Pelotas, 2012
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área de conhecimento: Veterinária Preventiva).
Dados de catalogação na fonte:
(Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)
S587e Silva e Silva, Fábio da
Estudo epidemiológico da infecção pelo vírus da imunodeficiência felina em gatos domésticos da região sul do Rio Grande do Sul / Fábio da Silva e Silva ; orientador Silvia de Oliveira Hübner. Pelotas,2012.30f. : il..- Dissertação(Mestrado ) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária.Área de conhecimento Veterinária Preventiva. Faculdade de Veterinária. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2012.
1Gato 2.Epidemiologia 3.Subtipo 4.Vírus da imunodeficiência felina 5.PCR I.Hübner, Silvia de Oliveira(orientador) II. Título.
Banca examinadora:
Profa. Dra. Silvia de Oliveira Hübner – Universidade Federal de Pelotas (orientadora) Prof. PhD. Geferson Fischer – Universidade Federal de Pelotas
Prof. Dr. Marcelo de Lima – Universidade Federal de Pelotas
Agradecimentos
Aos meus pais queridos, Edmundo e Nidelcina que partiram durante meu período de mestrado, mas deixaram vivo o legado da busca pelo conhecimento, pois sempre priorizaram a minha formação acadêmica e me incentivaram a evoluir como indivíduo a partir do caminho da educação.
À minha amada esposa Débora, pelo carinho, companheirismo e compreensão, além do suporte técnico prestado na língua portuguesa e inglesa.
À minha orientadora Silvia de Oliveira Hübner, pela amizade, paciência e pelo apoio acadêmico na realização deste trabalho.
Ao Prof. João Pessoa da UNESP-Botucatu, por ter participado ativamente da execução do meu projeto de pesquisa.
À equipe (professores, funcionários e colegas) do Laboratório de Virologia e Imunologia Animal da UFPel que me acolheu e passou a fazer parte da minha família.
Às minhas colegas e amigas Paula e Clarissa, que foram fundamentais na execução das atividades de laboratório relativas ao mestrado.
À Universidade Federal de Pelotas que me proporcionou a realização do curso de Pós-Graduação em Veterinária.
Muito obrigado!
“Gatos amam mais as pessoas do que elas permitiriam. Mas eles têm sabedoria para manter isso em segredo”. Mary Wilkins
RESUMO
SILVA, Fábio da Silva e. Estudo epidemiológico da infecção pelo vírus da
imunodeficiência felina em gatos domésticos da região sul do Rio Grande do Sul. 2012. 30f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em
Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Orientadora: Silvia de Oliveira Hübner.
O vírus da imunodeficiência felina pertence à família Retroviridae, gênero Lentivirus e apresenta estrutura molecular e patogenia similar ao vírus da imunodeficiência humana (HIV), entretanto não é transmissível ao homem, sendo suscetíveis somente os felinos domésticos e selvagens. O FIV é classificado em cinco subtipos filogeneticamente diferentes de A a E, distribuídos mundialmente, além de cepas com recombinações entre os subtipos. Recentemente dois novos subtipos foram descritos, o subtipo F identificado nos Estados Unidos e Portugal, e o subtipo U-NZenv na Nova Zelândia. Considerando-se que os retrovírus têm a capacidade de integrar-se ao genoma celular, sob a forma de DNA de dupla fita, é possível a detecção do provírus em leucócitos infectados, através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). O presente trabalho investigou a ocorrência de infecção pelo vírus da imunodeficiência felina, entre os anos de 2010 e 2011, em gatos domésticos levados para atendimento médico no Hospital de Clínicas Veterinária da Universidade Federal de Pelotas e clínicas privadas da cidade de Pelotas, RS. Amostras de sangue de 70 animais, entre hígidos e doentes, foram colhidas e submetidas à técnica de nested-PCR. Os gatos testados foram classificados em dois grupos quanto à condição clínica: o grupo 1 foi representado por 28 felinos suspeitos de FIV, diagnosticados com linfoadenomegalia, sinais neurológicos ou com infecções crônicas e recidivantes; o grupo 2 representado por 42 animais livres de sintomatologia relacionada a FIV. Os resultados apontaram uma frequência de infecção pelo FIV de 15,7% (11/70). Das amostras positivas, 8 foram submetidas à caracterização molecular, sendo todas alocadas dentro do subtipo B. As manifestações clínicas mais diagnosticadas nos felinos que desenvolveram doença relacionada a FIV, foram as infecções secundárias broncopulmonares (4/10) e cutâneas (3/10). Outras alterações clínicas identificadas em animais positivos foram gengivite, uveíte, anemia e icterícia. Os animais infectados por FIV apresentaram letalidade de 30% durante o período de estudo. Em relação à faixa etária a maior proporção de felinos infectados apresentava idade superior a 10 anos. Diante dos dados apresentados conclui-se que o subtipo B do vírus da imunodeficiência felina apresenta circulação na população de gatos domésticos da região sul do Rio Grande do Sul, e que animais idosos acometidos por infecções crônicas ou recidivantes devem ser testados para esse agente.
Palavras-chave: Gato. Epidemiologia. Subtipo. Vírus da imunodeficiência felina. PCR.
ABSTRACT
SILVA, Fábio da Silva e. Epidemiological study of the feline immunodeficiency
virus infection in domestic cats of the south region of Rio Grande do Sul State.
2012. 30f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Orientadora: Silvia de Oliveira Hübner.
The feline immunodeficiency virus belongs to the Retroviridae family, Lentivirus gennus and presents molecular structure and pathogenicity similar to the human immunodeficiency virus (HIV), therefore it is not transmissible to humans, being susceptible only the domestic and feral cats. FIV is classified in five phylogenetically different subtypes from A to E spread worldwide, apart from recombinant strains among the subtypes. Recently, two new subtypes were described, the subtype F identified in the United States and Portugal, and the subtype U-NZenv in New Zealand. Considering that the retroviruses have the ability to integrate the cell genome, under double stranded DNA form, it is possible to detect the provirus in infected leucocytes through the polymerase chain reaction (PCR) technique. The present report investigated the occurrence of the feline immunodeficiency virus infection between 2010 and 2011 in domestic cats submitted to medical treatment at the Hospital of Veterinary Clinics of the Federal University of Pelotas and private clinics from Pelotas, RS. Blood samples of seventy animals, healthy or sick, were collected and subjected to the nested-PCR technique. The tested cats were classified in two groups taking into account their clinical condition: the group 1 represented 28 FIV suspect cats with lymphadenomegaly, neurological disorders or chronic and recurring infections. The results pointed out a FIV infection frequency of 15,7% (11/70). Eight of the positive samples were subjected to molecular characterization, being all of them into the subtype B. The most diagnosed clinical manifestations in the cats that developed disease related to FIV were bronchopulmonar (4/10) and cutaneous (3/10) secondary infections. Another clinical disorders observed in the positive animals were gingivitis, uveitis, anemia and icterus. The FIV infected cats presented 30% of lethality during the period of study. Most of the infected cats were up to 10 years of age. Faced with the data shown in this report we could conclude that the subtype B of the feline immunodeficiency virus presents circulation in the domestic cat population of the south region of Rio Grande do Sul and elderly animals affected by chronic or recurring infections must be FIV tested.
SUMÁRIO RESUMO ... 6 ABSTRACT ... 7 1. INTRODUÇÃO GERAL ... 8 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 9 3. ARTIGO ... 13
Infecção e caracterização molecular do vírus da imunodeficiência felina em gatos domésticos da região sul do Rio Grande do Sul ... 14
3.1 RESUMO ... 14 3.2 ABSTRACT ... 14 3.3 INTRODUÇÃO ... 15 3.4 MATERIAL E MÉTODOS ... 16 3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 17 3.6 CONCLUSÃO ... 19 3.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 19 4. CONCLUSÃO GERAL... 23 5. REFERÊNCIAS GERAIS ... 24 6. ANEXO ... 28
8
1. INTRODUÇÃO GERAL
Com população estimada de mais de 100 milhões de felinos domésticos em todo o mundo, as infecções virais nessa espécie determinam uma casuística relevante no exercício da medicina felina (BARR et al., 1997). Dentre as infecções virais de importância destaca-se a infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV). O FIV foi isolado em 1987 nos Estados Unidos por Niels Pedersen, e desde então é reconhecido por determinar significativa imunossupressão em gatos (MACLACHLAN & DUBOVI, 2011).
No Brasil em 2010 a população de gatos estimada foi de 18,5 millhões, um crescimento de 9% em relação ao ano de 2009, em contrapartida a população de cães cresceu apenas 3,9% no mesmo período (ANFALPET).1 Esses dados refletem a crescente e significativa população de felinos no Brasil e a importância do diagnóstico do FIV, pois esse agente atua como fator predisponente ao desenvolvimento de infecções concomitantes.
O FIV é considerado um agente cosmopolita, e apresenta uma prevalência mundial de 4 a 12%, embora os valores possam apresentar variabilidade de acordo com a área geográfica. Nos Estados Unidos e Canadá a prevalência encontrada variou entre 1 a 7% e, no Japão, onde a população de gatos errantes é alta, a prevalência chegou a 44% (HAYWARD et al., 2009). No Brasil, anticorpos contra o FIV foram detectados em 3,7% dos felinos assintomáticos e em 20,2% dos animais doentes, em um levantamento realizado durante os anos de 1998 e 1999, na cidade do Rio de Janeiro (SOUZA et al., 2002). Outro estudo realizado entre outubro de 2000 a outubro de 2002, incluindo 454 felinos oriundos de 13 cidades do estado de São Paulo, demonstrou que 14,7% (67/454) dos gatos estavam infectados (LARA et al., 2008). Já no Rio Grande do Sul, uma investigação epidemiológica referente à infecção pelo FIV foi realizada na cidade de Porto Alegre no ano de 2007 aonde constatou-se taxa de infecção de 21,5% (14/65) a partir de diagnóstico sorológico e molecular (SILVA et al., 2007). Em Pelotas e região não há registros de estudos epidemiológicos referentes à infecção pelo FIV.
1
Associação Nacional dos Fabricantes de Produtos para Animais de Estimação- Disponível em: < http: //anfalpet.org.br/portal/ >. Acesso: 25/02/2012.
9
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O vírus da imunodeficiência felina pertence à família Retroviridae, gênero
Lentivirus e apresenta estrutura molecular e patogenia similar ao vírus da
imunodeficiência humana (HIV), entretanto, não é transmissível ao homem, sendo suscetíveis somente os felinos domésticos e selvagens (HOSIE et al., 2009).
O genoma do FIV é composto de três grandes regiões denominadas de Gag,
Pol e Env. A região Gag codifica as proteínas estruturais internas, representadas
pela matriz (MA), capsídeo (CA) e nucleocapsídeo (NC). A porção Pol é responsável pela síntese das enzimas transcriptase reversa (RT), integrase (IN) e protease (PR). E a região Env codifica as proteínas do envelope viral, sendo elas a glicoproteína de superfície (SU), gp120 e a glicoproteína de transmembrana (TM), gp41. Além das três grandes regiões genômicas, o FIV também apresenta os genes acessórios Vif,
OrfA e Rev, responsáveis pela neutralização de citocinas da célula hospedeira,
ativação da transcrição e exportação do núcleo viral durante a replicação (KENYON & LEVER, 2011).
A imunossupressão observada nos animais infectados pelo FIV é o resultado da depleção dos linfócitos T auxiliares (CD4+), que leva a uma inversão da relação CD4/CD8. Paralelo à diminuição da contagem de linfócitos T CD4+ o FIV determina um quadro de hipergamaglobulinemia, decorrente da elevação de linfócitos B CD21- (TAKANO et al., 2012). Atualmente há indícios de que a imunossupressão pelo FIV pode ser exacerbada por disfunção na síntese de hormônios esteróides, a partir do aumento na concentração de estradiol e testosterona. Estudos sugerem que essas alterações hormonais possam agravar o quadro de imunossupressão de pacientes positivos para FIV, diminuindo a expressão do MHC II, a apresentação de antígenos, e a expressão de citocinas pelas células linfóides (TEJERIZO et al., 2012).
A disseminação do vírus no organismo ocorre principalmente pelos linfócitos CD4+ infectados e, em escala menor, pelos monócitos e macrófagos. Estes últimos relacionados com o vírus no estágio terminal da doença (RAVAZZOLLO & COSTA, 2007). O vírus também pode promover infecção de astrócitos e células da micróglia, determinando sintomatologia neurológica (FERNÁNDEZ et al., 2007). Os gatos infectados apresentam saliva com alta carga viral e o modo mais eficiente de
10
transmissão é a partir de mordedura, mas a transmissão também pode ocorrer verticalmente, por infecção uterina, via colostro ou amamentação (ARJONA et al., 2000).
A partir da análise da sequência de nucleotídeos do gene Env das regiões variáveis 3-5, o FIV é classificado em cinco subtipos filogeneticamente diferentes, de A a E, além de cepas recombinantes. Os subtipos A, B e C estão mundialmente distribuídos, sendo o subtipo D encontrado somente no Japão e Vietnã e o subtipo E identificado na Argentina (PECORARO et al., 1996; BACHMANN et al., 1997; TEIXEIRA et al., 2010). Recentemente dois novos subtipos foram descritos, o subtipo F identificado nos Estados Unidos e Portugal, e o subtipo U-NZenv encontrado na Nova Zelândia (HAYWARD et al., 2009; GRACE et al., 2011). No Brasil pouco se conhece sobre a diversidade genética do FIV. Até o momento a caracterização filogenética foi realizada nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio de Janeiro, identificando-se somente o subtipo B (CAXITO et al., 2006; LARA et al., 2007 MARTINS et al., 2008).
O conhecimento da variabilidade genética do FIV é fundamental no desenvolvimento de vacinas que promovam imunidade a cepas específicas de uma determinada região. O sequenciamento do gene Env também possibilita a relação dos subtipos do FIV com padrões clínicos específicos (TEIXEIRA et al., 2010). A infecção pelo subtipo A está associada com o desenvolvimento de doença neurológica, já o subtipo B determina a ocorrência de um quadro de baixa morbidade, e o subtipo C pode causar enfermidade aguda, desencadeando severa imunodeficiência com 60% de mortalidade 18 semanas pós infecção (ROZìERES et al.,2008; HAYWARD et al., 2009).
As infecções crônicas, secundárias ou associadas, causadas por agentes infecciosos comensais ou patogênicos são frequentes em felinos com FIV, levando a complicações representadas por quadros de enterite, dermatite, gengivite e doença respiratória crônica (ZANUTTO et al., 2011). Gatos FIV positivos também apresentam cinco vezes mais chance de desenvolver linfoma ou leucemia do que gatos não infectados e os pacientes em viremia podem apresentar uveíte e glomerulonefrite por deposição de imunocomplexos (HARTMANN et al., 2011). Aproximadamente 5% dos felinos infectados por FIV apresentam encefalite, podendo desenvolver distúrbios de comportamento, demência, convulsão e déficit motor (MURPHY et al., 1999).
11
Os sinais clínicos de gatos com FIV não são suficientes para confirmar a infecção. Portanto, o diagnóstico deve ser realizado pela detecção de anticorpos pelo teste de imunoabsorção enzimática (ELISA) e confirmado pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) ou Western blotting (TIZARD, 2009), pois reações positivas falsas são comuns no teste de ELISA (NELSON & COUTO, 2006; VEIR et al., 2010).Considerando-se que os retrovírus têm a capacidade de integrar-se ao genoma celular sob a forma de DNA de dupla fita, é possível a detecção do provírus em leucócitos infectados pela técnica de PCR (CALDAS et al., 2000). Essa técnica apresenta como vantagem alta sensibilidade e especificidade, custo acessível e fácil reprodução (VEIR et al, 2010). Entretanto, a variabilidade genética do vírus e a baixa carga proviral em linfócitos de pacientes assintomáticos crônicos, podem determinar um resultado falso negativo (CRAWFORD et al., 2007; AMMERSBACH et al., 2011).
O tratamento, na maioria das vezes, é de suporte e dirigido contra as condições mórbidas relacionadas, sendo os antivirais também utilizados, porém apresentam potencial tóxico para os felinos (TEIXEIRA et al., 2010). A zidovudina (AZT) é uma droga antiviral amplamente utilizada no tratamento de gatos acometidos por FIV, é um fármaco análogo da timidina que bloqueia a DNA polimerase viral (transcriptase reversa) inibindo a replicação dos retrovírus (BOTHE et al., 2001). À semelhança do que ocorre no tratamento do HIV, o uso do AZT em felinos resulta no aparecimento de cepas mutantes ao fármaco. Um estudo realizado na cidade de Botucatu/SP no ano de 2007 demonstrou que o uso do AZT (10mg/ Kg/ dia) por 96 dias, em gatos positivos para FIV, não diminuiu a carga viral. Além disso, o sequenciamento genético da região codificadora da transcriptase reversa, constatou a presença de lisina na posição 41 que é relacionada ao fenótipo de resistência ao AZT (FIGUEIREDO et al., 2007). Outro medicamento também utilizado no tratamento da FIV é o interferon recombinante, pois apresenta atividade antiviral e imunomoduladora. O uso do inteferon-alfa humano em felinos é altamente questionável, pois essa droga é espécie-específica e pode induzir o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes ao fármaco. Recentemente foi desenvolvido o interferon-ômega recombinante felino, essa molécula tem mostrado-se bastante promissora, pois tem determinado, em pacientes infectados por FIV, melhora da condição clínica e normalização dos valores hematológicos (DOMÉNECH et al., 2011).
12
Um grande número de vacinas experimentais contra FIV tem sido testado, incluindo imunógenos de vírus inativado, células infectadas, vacinas de DNA e recombinantes, mas a alta capacidade do lentívirus de evadir a resposta imune do hospedeiro torna-se um fator limitante na indução de imunidade frente ao FIV (DUNHAM et al., 2008). Uma vacina com preparados de vírus inativado, contendo o subtipo APetaluma e o subtipo DShizuoka ( Fel-O-Vax; Fort Dodge®; USA), foi licenciada
para comercialização nos Estados Unidos em 2002. Essa vacina apresenta eficácia comprovada contra subtipos homólogos e o subtipo heterólogo B, com um índice de proteção superior a 70% em animais desafiados (HUANG et al., 2009).
Devido à ausência de estudos epidemiológicos referentes à ocorrência do FIV na região sul do Rio Grande do Sul, o presente trabalho teve como objetivo diagnosticar o agente etiológico da imunodeficiência viral felina no município de Pelotas e região, a partir da reação em cadeia da polimerase, bem como realizar a caracterização molecular dos isolados obtidos para identificação do(s) subtipo(s) de FIV prevalente(s) na região.
13 3. ARTIGO 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Infecção e caracterização molecular do vírus da imunodeficiência felina em
10
gatos domésticos da região sul do Rio Grande do Sul
11 12
(Artigo científico a ser submetido ao periódico Arquivo Brasileiro de Medicina 13
Veterinária e Zootecnia)
14 15
14
Infecção e caracterização molecular do vírus da imunodeficiência felina em gatos
16
domésticos da região sul do Rio Grande do Sul, Brasil
17 18
[Infection and molecular characterization of the feline immunodeficiency virus in domestic 19
cats from the south of Rio Grande do Sul state, Brazil]
20 21
F.S. Silva1*, J.P. Araújo Jr2, G. Fischer1, G.D. Vargas1, P.F. Finger1, S.O. Hübner1 22
23
¹ Laboratório de Virologia e Imunologia Animal, Faculdade de Veterinária, Universidade 24
Federal de Pelotas, Capão do Leão, RS 96010-900, Brasil; 25
² Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, Universidade 26
Estadual Paulista, Botucatu, SP 18618-000, Brasil. 27
28
3.1 RESUMO
29 30
O presente trabalho investigou a frequência de infecção pelo vírus da 31
imunodeficiência felina (FIV), entre os anos de 2010 e 2011, em gatos domésticos submetidos 32
a atendimento clínico na cidade de Pelotas. Amostras de sangue de 70 animais, entre hígidos 33
(42) e doentes (28), foram colhidas e submetidas à técnica de reação em cadeia pela 34
polimerase (PCR), para diagnóstico da FIV. Os resultados apontaram uma frequência de 35
infecção pelo FIV de 15,7% (11/70) e a análise dos fatores associados a infecção pelo FIV 36
(sexo, idade e condição clínica) evidenciou que gatos com idade superior a 10 anos e 37
acometidos por infecções crônicas e recidivantes foram os mais suscetíveis. Oito das amostras 38
positivas foram submetidas à caracterização molecular, sendo todas alocadas dentro do 39
subtipo B. 40
41
Palavras-chave: gato, epidemiologia, subtipo, vírus da imunodeficiência felina, PCR 42
43
3.2 ABSTRACT
44 45
The present study investigated the frequency of the feline immunodeficiency virus
46
(FIV) infection between 2010 and 2011, in domestic cats submitted to medical attendance in
15
the city of Pelotas. Blood samples of seventy healthy (42) or sick (28) animals were obtained
48
and analyzed by the polymerase chain reaction (PCR) technique to diagnose FIV. The results
49
pointed out a FIV infection frequency of 15,7% (11/70) and the analysis of the factors (sex,
50
age and clinical condition) evidenced that cats up to 10 years of age attacked by chronic and
51
recurring infections were the most susceptible. Eight of the positive samples were submitted
52
to molecular characterization and all of them were placed into the subtype B.
53
54
Keywords: cat, epidemiology, subtype, feline immunodeficiency virus, PCR
55 56
3.3 INTRODUÇÃO
57 58
O vírus da imunodeficiência felina (FIV) é um retrovírus do gênero Lentivirus, que 59
apresenta estrutura molecular e patogenia similar ao HIV (Hosie et al., 2009). Os gatos 60
infectados pelo FIV podem desenvolver disfunção imunológica caracterizada por 61
hipergamaglobulinemia, elevação de linfócitos B CD21- e depleção de linfócitos T CD4+ 62
(Takano et al., 2012). Os sinais clínicos observados são variáveis e inespecíficos. Em geral os 63
pacientes podem manifestar gengivite, emaciação, linfoadenomegalia, insuficiência renal 64
crônica, complicações neurológicas, diarréia crônica e infecções bacterianas (Zanutto et al., 65
2011), além de alterações hematológicas como anemia, leucopenia e linfopenia (Arjona et al., 66
2000). Entretanto, em relação ao HIV, o vírus da imunodeficiência felina apresenta menor 67
potencial de virulência, sendo que a maioria dos gatos infectados apresenta-se assintomático 68
por um longo período da vida, mesmo na ausência de tratamento antiretroviral (Hartmann, 69
2011; White e Norris, 2011). 70
O FIV é classificado em cinco subtipos filogeneticamente diferentes. Os subtipos A, B 71
e C estão mundialmente distribuídos, sendo o subtipo D encontrado somente no Japão e 72
Vietnã, e o subtipo E identificado na Argentina (Pecoraro et al., 1996; Teixeira et al., 2010). 73
Recentemente dois novos subtipos foram descritos, o subtipo F identificado nos Estados 74
Unidos e Portugal, e o subtipo U-NZenv encontrado na Nova Zelândia (Hayward et al., 2009; 75
Teixeira 2010). Além disso, recombinações entre os subtipos têm sido descritas (Bachmann et 76
al., 1997). No Brasil, pouco se conhece sobre a diversidade genética do FIV. Até o momento a 77
caracterização molecular foi realizada somente nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio 78
de Janeiro, identificando-se somente o subtipo B (Caxito et al., 2006; Lara et al., 2007; 79
Martins et al., 2008). 80
16
O FIV é considerado um agente cosmopolita e apresenta uma prevalência variável de 81
acordo com a área geográfica. Nos Estados Unidos e Canadá valores de prevalência de 1 a 7% 82
foram encontrados, enquanto que no Japão a taxa de prevalência reportada foi de 44% 83
(Hayward et al., 2009). Um estudo realizado no estado de São Paulo, incluindo 454 felinos 84
oriundos de 13 cidades, demonstrou que 14,7% (67/454) dos gatos estavam infectados (Lara 85
et al., 2008). No Rio Grande do Sul uma investigação epidemiológica referente à infecção 86
pelo FIV realizada na cidade de Porto Alegre constatou uma taxa de infecção de 21,5% 87
(14/65) a partir de diagnóstico sorológico e molecular (Silva, 2007). 88
O presente trabalho teve como objetivo determinar a frequência de infecção do FIV na 89
região sul do Rio Grande do Sul, mediante a detecção de DNA proviral por nested-PCR, 90
caracterização molecular dos isolados obtidos e análise dos fatores associados à infecção pelo 91 FIV. 92 93 3.4 MATERIAL E MÉTODOS 94 95
Durante o período de agosto de 2010 a agosto de 2011 foram colhidas 70 amostras de 96
sangue de gatos submetidos a atendimento médico no Hospital de Clínicas Veterinária da 97
UFPel e Clínicas Veterinárias privadas, localizadas na cidade de Pelotas, RS. Os animais 98
testados foram classificados em dois grupos quanto à condição clínica: o grupo 1 foi 99
representado por 28 gatos suspeitos de imunodeficiência viral felina, diagnosticados com 100
linfoadenomegalia, sinais neurológicos ou com infecções crônicas e recidivantes; o grupo 2 101
representado por 42 animais livres de sintomatologia relacionada a FIV. Sendo que todos os 102
pacientes positivos receberam acompanhamento médico de no mínimo 6 meses após o 103
diagnóstico, com objetivo de avaliar a evolução clínica dos pacientes e estabelecer a taxa de 104
letalidade. 105
As amostras sanguíneas foram obtidas por punção venosa, acondicionadas em frascos 106
contendo anticoagulante EDTA e armazenadas a 4°C. A extração do DNA proviral foi obtida 107
utilizando-se o Kit QIAamp (QIAGEN®), conforme especificações do fabricante em até 30 108
dias após a colheita das amostras. 109
Posteriormente, as amostras foram submetidas à reação de nested-PCR utilizando – se 110
primers correspondentes à região p17 e p24 do gene gag. As sequências dos primers externos
111
utilizados foram 5’ AAT ATG ACT GTA TCT ACT GC 3’ (sense) e 5’ TTT TCT TCT AGA 112
GTA CTT TCT GG 3’ (anti-sense) e a dos primers internos 5’ TAT TCA AAC AGT AAA 113
TGG AG 3’ (sense) e 5’ CTG CTT GTT GTT CTT GAG TT 3’ (anti-sense). A primeira 114
17
reação amplifica uma sequência de nucleotídeos de 658 pares de base (pb) de DNA e a 115
segunda reação uma sequência de 329 pb (Hodatsu et al., 1998). 116
Cada reação foi executada em um volume total de 25µl contendo: 1.25U de Taq DNA 117
Polimerase, 2.5μl de tampão de PCR 10X, 1.75mM de MgCl2, 0.25mM de cada dNTP, 1µl de
118
cada primer a 10pmol/µl, 7.5μl de Betaine 5M (Sigma-Aldrich®) e 5μl do DNA extraído. Os 119
ciclos padronizados para a amplificação do DNA foram: uma incubação inicial a 96°C por 7 120
minutos, seguida de 45 ciclos, cada um consistindo de desnaturação a 94°C por 60 segundos, 121
anelamento a 45°C por 60 segundos, extensão pela polimerase a 72°C por 90 segundos e 122
extensão final a 72°C por 5 minutos. Ao final da reação, os produtos foram submetidos à 123
eletroforese e logo analisados em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio (0,5 124
mg/ml) e comparados com marcadores de peso molecular de 100 pb. Em todas as reações 125
foram incluídas amostras contendo água ultra-pura como controle negativo e uma amostra 126
com células infectadas por FIV (gentilmente cedida pelo Laboratório de Virologia e 127
Diagnóstico Molecular do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de 128
Biociências da UNESP/Botucatu-SP) como controle positivo. 129
Para sequenciamento, as amostras positivas no nested PCR foram submetidas a uma 130
segunda reação para amplificação de um segmento da região Env. Em seguida os produtos 131
tiveram suas bandas extraídas do gel e purificacadas com o Kit SV Gel and PCR Clean-up 132
System Promega (Wizard®). Os fragmentos purificados foram submetidos a sequenciamento 133
direto utilizando-se o Big Dye® Terminator V 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied 134
Biosystems) e o aparelho de sequenciamento automático ABI 3500 (Applied Biosystems). 135
Todo o procedimento de caracterização molecular foi realizado no Laboratório de Virologia e 136
Diagnóstico Molecular do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de 137
Biociências da UNESP, Campus de Botucatu, SP. 138
Variáveis como condição clínica, faixa etária e sexo foram analisadas como possíveis 139
fatores de associação a infecção pelo FIV, mediante o tratamento estatístico do Qui-quadrado 140
(x2), fixando-se o valor de 1% para o nível de rejeição da hipótese de nulidade. 141
142
3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
143 144
Das 70 amostras submetidas ao nested-PCR 11 apresentaram-se positivas, 145
determinando uma taxa de frequência de infecção pelo FIV, na população estudada, de 146
15,7%. O valor encontrado está próximo às prevalências relatadas no Rio de Janeiro de 147
16,7% e São Paulo com 14,7% (Souza et al., 2002; Lara et al., 2008).Na América do Norte, a 148
18
prevalência relatada foi de 1% em gatos hígidos e de 7% em animais doentes, dados esses 149
inferiores ao do presente estudo. Contrastando com os valores dos Estados Unidos e Canadá, 150
a prevalência encontrada no Japão, onde a população de gatos errantes é alta, foi de 44%, 151
(Hayward et al., 2009), valor esse bem superior ao dos levantamentos epidemiológicos 152
realizados no Brasil até o presente momento. 153
Em relação ao estado de higidez dos pacientes (Tab. 1), foi observado que a proporção 154
de felinos positivos com sinais clínicos associados a FIV (10/28) foi estatisticamente maior 155
(p<0,01) do que a proporção de felinos assintomáticos (1/42), estando de acordo com os 156
levantamentos epidemiológicos encontrados na literatura (Caldas et al., 2000; Souza et al., 157
2002; Lara et al., 2008; Murray et al., 2008). Dos felinos positivos para FIV 90,9% (10/11) 158
desenvolveram doença relacionada, apresentando principalmente infecções broncopulmonares 159
(4/10) e cutâneas (3/10) secundárias. Outras alterações clínicas associadas à infecção por FIV, 160
como gengivite, uveíte, anemia e icterícia, também foram detectadas em animais positivos. 161
O presente estudo foi realizado no estado do Rio Grande do Sul, em região 162
relativamente próxima à Argentina, onde foi identificado o subtipo E (Pecoraro et al., 1996). 163
Contudo, todas as amostras submetidas à caracterização molecular foram alocadas dentro do 164
subtipo B, sugerindo ser este o subtipo predominante nessa região. O conhecimento da 165
variabilidade genética do FIV é fundamental no desenvolvimento de vacinas que promovam 166
imunidade a cepas específicas de uma determinada área. Além disso, também possibilita a 167
associação de subtipos do FIV com padrões clínicos específicos (Teixeira et al., 2010). No 168
Brasil, até o momento, foi descrita a ocorrência única do subtipo B (Caxito et al., 2006; Lara 169
et al., 2007; Martins et al., 2008). 170
Somente 30% (3/10) dos felinos com sinais clínicos de FIV vieram a óbito durante o 171
período de 6 meses de observação após o diagnóstico. Possivelmente a baixa letalidade 172
verificada no estudo está relacionada ao subtipo B, que apresenta como característica a baixa 173
virulência (Bachmann et al., 1997), ao contrário do subtipo C, que está associado à 174
enfermidade aguda e de acentuada imunodeficiência, com 60% de mortalidade 18 semanas 175
pós infecção (de Rozìeres et al.,2008). 176
Como esperado, a categoria sênior (Tab. 1) apresentou de maneira significativa (p<0,01) 177
a maior proporção de felinos infectados (6/9). Esse resultado pode ser explicado pelo fato do 178
FIV apresentar um grande período de latência, determinando o aparecimento tardio dos sinais 179
clínicos, mesmo que a transmissão do vírus tenha ocorrido em idade jovem (Hartmann, 2011; 180
White e Norris, 2011). Contudo, diferentemente de outros estudos que apontam os machos 181
inteiros como os mais suscetíveis à infecção pelo FIV (Lara et al., 2008; Murray et al., 2008; 182
19
Samman et al., 2011), não foi observada diferença estatística entre sexos. Provavelmente isso 183
se deve ao fato de que 32,4% (12/37) dos gatos machos analisados eram castrados. Sabe-se 184
que a forma de transmissão mais comum é por meio de mordeduras, com ocorrência mais 185
frequente em gatos machos inteiros devido aos conflitos por acasalamento e territoriais 186
(Souza et al., 2002). 187
188
Tabela 1. Análise dos fatores associados à infecção pelo FIV nos 70 gatos oriundos da região 189
sul do Rio Grande do Sul, segundo sua positividade ao nested-PCR 190
Fatores de risco Total de amostras Amostras Positivas p/ FIV (%) Condição clínica Assintomático 42 1 (2,4%) Suspeito de FIV 28 10 (35,7%)* Condição sexual Macho 25 3 (12%) Macho castrado 12 1 (8,3%) Fêmea 21 4 (19,1%) Fêmea castrada 12 3 (25%) Faixa etária < 1ano (jovem) 21 0 (0%)
1-4 anos (adulto jovem) 18 3 (16,6%)
5-10 anos (adulto) 15 2 (13,3%)
>10 anos (sênior) 9 6 (66,6%)*
Idade desconhecida 7 0 (0%)
* Estatisticamente significativo no nível de 1%
191 192
3.6 CONCLUSÃO
193 194
Os resultados apontam uma frequência de infecção de 15,7% e permitem afirmar que o 195
subtipo B do FIV circula na população de felinos domésticos da região sul do Rio Grande do 196
Sul. Os dados ainda sugerem que gatos com idade superior a 10 anos acometidos por 197
infecções crônicas ou recidivantes apresentaram a maior proporção de animais positivos para 198 FIV. 199 200 201 3.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 202
20
203
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22
TAKANO, T.; HOSOYA, S.; SHIBAO, A.; NAGASI, B.; YOSHIOKA, H. et al. 257
Comparative study of the plasma globulin level, CD21- B-cell counts and FOXP3 mRNA 258
expression level in CD4+ T-cells for different clinical stages of feline immunodeficiency virus 259
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ZANUTTO, M.S.; FROES, T.R.; TEIXEIRA, A.L.; HAGIWARA, M.K. Características 270
clínicas da fase aguda da infecção experimental de felinos pelo vírus da imunodeficiência 271
felina. Pesq. Vet. Bras., v.31, n. 3, p. 255-260, 2011. 272
23
4. CONCLUSÃO GERAL
- A frequência de infecção para FIV em gatos domésticos da região sul do Rio Grande do Sul foi de 15,7%.
- As amostras positivas submetidas à caracterização molecular foram alocadas dentro do subtipo B, sendo esse o único subtipo identificado no país até o presente momento.
- Os felinos domésticos com idade superior a 10 anos e acometidos por infecções crônicas e recidivantes apresentaram a maior proporção de animais positivos para FIV.
24
5. REFERÊNCIAS GERAIS
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28
6. ANEXO
FIGURA 1.
Figura 1. Eletroforese em gel de agarose mostrando produtos da amplificação
da nested-PCR para FIV. Canaleta 1: marcador de peso molecular de 100 pb; Canaletas 6-7-10: amostras positivas. Canaleta 11: controle positivo. Canaleta 12: controle negativo. Seta indica 329 pb.
29
FIGURA 2.
Figura 2. Felino, macho, 10 anos e sem raça definida, positivo para FIV e com dermatite profunda por Sporothrix schenkii.
