INVESTIGAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DO CARANGUEJO- UÇÃ (UCIDES CORDATUS) COMERCIALIZADO EM TRES BARRACAS NA
PRAIA DO FUTURO EM FORTALEZA — CE — BRASIL.
ALBERTO JORGE GOMES DE ARAUJO
Trabalho Supervisionado (Monografia) apresentado ao Departamento de Engenharia de Pesca do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Ceará, como parte integrante das exigências para a obtenção do título de Engenheiro de Pesca.
A687i Araujo, Alberto Jorge Gomes de.
Investigação da qualidade microbiológica do caranguejo-uçã (Ucides cordatus)
comercializado em três barracas na Praia do Futuro em Fortaleza — CE — Brasil / Alberto Jorge Gomes de Araujo. – 2009.
36 f. : il. color.
Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Curso de Engenharia de Pesca, Fortaleza, 2009.
Orientação: Profa. Dra. Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira.
1. Caranguejos - Qualidade. 2. Caranguejos - Controle de qualidade. 3. Segurança alimentar. 4. Caranguejos - Qualidade. I. Título.
Prof2 Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira, Dra. Orientadora / Presidente
Renata Albuquerque Costa, M. Sc. Membro
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,Francisca Gleire Rodrigues de Menezes, M. Sc. Membro
VISTO
Prof. Moisés Almeida de Oliveira, D. Sc. Chefe do Departamento de Engenharia de Pesca
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
A Deus, causa primária de todas as coisas;
A meus pais, a quem dediquei esse trabalho, e meus irmãos, Vanessa e João Pedro, pelo carinho e incentivo durante essa caminhada, sem os quais seria tão difícil seguir com confiança no caminho certo;
Aos professores do Departamento de Engenharia de Pesca da Universidade federal do Ceará, pela formação de primeira qualidade, com consciência humana e social, fundamentais hoje em dia;
Ao Laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado do Instituto de Ciências do Mar, na pessoa da Profa. Dra. Regine Vieira, pela infra-estrutura disponibilizada para a realização deste trabalho;
À minha orientadora Profa. Regine Vieira, pelo ensino, disponibilidade, paciência e atenção primordiais, durante esses dez meses, na realização deste trabalho;
À Bióloga Profa. Dra. Diva Maria Borges-Nojosa, pelo carinho, paciência, dedicação e primeiras orientações nos trabalhos de extensão e aos amigos do Núcleo Regional de Ofiologia da UFC;
Ao Professor e amigo Marcos Antônio Barbosa da Silva, pela amizade, atenção, ensinamentos e pelo tempo disponibilizado para as prévias correções deste trabalho;
Aos amigos Bruno Ary, Clara Coe e Daniele Marques, pela amizade, força, companheirismo, e por todos os momentos de sufoco e de alegria passados juntos durante esses cinco anos de curso.
Aos amigos, Armando Soares, Lorena Colares, Michelle Costa, Mirna Antunes, Tatyane Pereira, Tayana Canafístula e Tidy, pela amizade e por todos os bons momentos vividos ao longo desses cinco anos;
Aos colegas de laboratório, Camilla, Cristiane, Edirsana, Gisele, Gleire, Lorena e Rafael, que cederam parte de seus tempos para me prestarem ajuda nos dias de coleta;
Aos colegas do curso de Engenharia de Pesca pelos bons momentos de convivência antes, durante e depois das aulas;
Às mães, Carmem Ary, Fátima Coe e Izelda Marques por todos os momentos de acolhimento maravilhosos;
Enfim, a todos aqueles, que de alguma forma, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho;
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA iii
AGRADECIMENTOS iv
LISTA DE FIGURAS vi
LISTA DE TABELAS vii
RESUMO viii
1. INTRODUÇÃO 1
1.1. A COMERCIALIZAÇÃO DO CARANGUEJO-UÇÁ 3
1.2. DETERIORAÇÃO DO PESCADO 4
1.3. BACTÉRIAS PATOGÊNICAS 5
2. MATERIAL E MÉTODOS 8
2.1. COLETA DAS AMOSTRAS 8
2.2. PREPARO DAS AMOSTRAS 8
2.3. ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS 10
2.3.1. COLIFORMES TERMOTOLERANTES 10
2.3.1.1. PROVA PRESUNTIVA 10
2.3.1.2. PROVA CONFIRMATÓRIA 10
2.3.2. Staphylococcus COAGULASE POSITIVA 11
2.3.3. PESQUISA DE Salmonella spp. 12
2.3.3.1. PRÉ-ENRIQUECIMENTO 12
2.3.3.2. ENRIQUECIMENTO SELETIVO 12
2.3.3.3. ISOLAMENTO EM MEIOS SELETIVOS 13 2.3.3.4. PROVAS BIOQUIMICAS DE TRIAGEM 13 2.3.3.5. PROVAS BIOQUIMICAS DE CONFIRMAÇÃO 13 2.3.3.6. IDENTIFICAÇÃO SOROLÓGICA 14
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 18
4. CONCLUSÃO 25
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 — Caranguejos acondicionados em plásticos estéreis 8
hermeticamente fechados.
FIGURA 2 — Bolsa Térmica usada no transporte dos caranguejos das 8
barracas até o laboratório.
FIGURA 3 — Exemplares de Caranguejo-uçá (Ucides cordatus), apoiados 9
em bandeja de metal.
FIGURA 4 — Bandeja, quebradores de nozes desinfetado, pinças e 9
placas de Petri.
FIGURA 5 — Patas utilizadas nas análises. 9
FIGURA 6 — Parte do cefalotórax utilizada para as análises. 9
FIGURA 7 — Fluxograma da análise de Coliformes termotolerantes a 15 45°C.
FIGURA 8 — Fluxograma da análise de Staphylococcus aureus. 16
FIGURA 9 — Fluxograma das análises de Salmonella spp. 17
FIGURA 10 — Gráfico com os valores logaritimizados do Número Mais 19 Provável (NMP) para Coliformes termotolerantes a 45°C, das barracas A, B e C, obtidos nas patas. L é o limite imposto pela legislação brasileira.
FIGURA 11 - Gráfico com os valores logaritimizados do Número Mais 19 Provável (NMP) para Coliformes termotolerantes a 45°C, das barracas A, B e C, obtidos nos cefalotorax. L é o limite imposto pela legislação brasileira.
FIGURA 12 - Gráfico com os valores logaritimizados da Contagem 22
Padrão em Placas (CPP) para Staphylococcus aureus, das barracas A, B
e C, obtidos das amostras de patas. L é o limite imposto pela legislação brasileira.
FIGURA 13 - Gráfico com os valores logaritimizados do Contagem 22
Padrão em Placas (CPP) para Staphylococcus aureus, das barracas A, B
e C, obtidos das amostras de cefalotórax. L é o limite imposto pela
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 — Resultados do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes 18
termotolerantes a 45 °C das amostras de patas e cefalotórax de caranguejo (Ucides cordatus), cozido, adquiridas na barraca A.
Tabela 2 — Resultados do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes 18
termotolerantes a 45 °C das amostras de patas e cefalotórax de caranguejo (Ucides cordatus), cozido, adquiridas na barraca B.
Tabela 3 — Resultados do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes 19
termotolerantes a 45 °C das amostras de patas e cefalotórax de caranguejo (Ucides cordatus), cozido, adquiridas na barraca C.
Tabela 4 — Contagem de Staphylococcus coagulase positiva de 10 21
amostras de patas e cefalotórax de Caranguejo-uçá (Ucides cordatus)
adquiridos na barraca A.
Tabela 5 — Contagem de Staphylococcus coagulase positiva de 10 21
amostras de patas e cefalotórax de Caranguejo-uçá (Ucides cordatus)
adquiridos na barraca B.
Tabela 6 — Contagem de Staphylococcus coagulase positiva de 10 22
amostras de patas e cefalotórax de Caranguejo-uçá (Ucides cordatus)
RESUMO
O objetivo deste estudo foi investigar a qualidade bacteriológica da carne de caranguejo—uçá (Ucides cordatus) cozido, comercializado em três barracas (A ,
B e C) da Praia do Futuro , Fortaleza-CE. De cada barraca foram analisados 10 caranguejos, perfazendo um total de 30 amostras. Foram estimadas nas amostras as populações de Coliformes Termotolerantes (CT) a 45 °C; de
Staphylococcus coagulase positiva (S. coag +) e foi pesquisada a presença de
Salmonella spp. A população de CT nas amostras variou de < 1,8 a 14.000; a
de S. coag. + de < 10 a 7,5 x 106 e não foi confirmada a presença de
Salmonella spp. em nenhuma amostra de qualquer das três barracas. As
barracas A e C apresentaram, respectivamente, 2 e 6 amostras com contagens de CT acima do permitido e 2 e 1 amostras, respectivamente, com valores de
S. coag + acima do permitido pela legislação (BRASIL, 2001). Conclui-se que:
INVESTIGAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DO CARANGUEJO-UÇÁ (UCIDES CORDATUS) COMERCIALIZADO EM TRÊS BARRACAS NA
PRAIA DO FUTURO EM FORTALEZA — CE — BRASIL.
ALBERTO JORGE GOMES DE ARAUJO
1. INTRODUÇÃO
O pescado representa uma das mais importantes fontes protéicas de origem animal para a alimentação humana, sendo de rápida digestibilidade, possuindo teores satisfatórios de gorduras insaturadas, vitaminas e minerais. Em muitos países, principalmente da Europa e da Ásia, é a proteína de origem animal mais consumida (LEITÃO, 1984; GERMANO et al., 1998).
Dentre os produtos de origem animal, o pescado é um dos mais susceptíveis ao processo de deterioração, devido às suas características intrínsecas como: pH próximo à neutralidade, elevada atividade de água (Aa) nos tecidos, alto teor de nutrientes facilmente utilizáveis pelos microrganismos, acentuado teor de fosfolipídios e rápida ação destrutiva das enzimas presentes nos tecidos e nas vísceras (BRESSAN; PEREZ, 2000).
Os vários tipos de pescado, como qualquer outro alimento, têm suas microbiotas próprias e sofrerão alterações, dependendo de alguns fatores externos, tais como a contaminação de seu habitat, seja ele estuarino, lacustre
ou marinho, através de esgotos e cursos de água poluída. Apesar de as bactérias de ambos os habitats serem semelhantes, existem algumas bactérias
de interesse para a saúde pública e figurantes da legislação brasileira (BRASIL, 2001) que são detectadas apenas em ambientes salinos.
O caranguejo é um alimento altamente perecível, que merece cuidados no seu transporte, armazenamento e exposição de venda. Um dos principais problemas com esse pescado ocorre no seu processamento quando, o tratamento utilizado para se retirar a carne das patas e do corpo do animal é manual e feito após os indivíduos terem sofrido um cozimento rápido. Essa operação pode ser uma fonte de contaminação, principalmente de estafilococos. O uso de luvas e aplicação de boas práticas de higiene, aliados à manutenção das temperaturas adequadas e esfriamento rápido da carne, evitam esse problema no processamento desse crustáceo (CANN, 1974).
A contaminação de alimentos de origem marinha e estuarina, como no caso do caranguejo-uçá, por bactérias Gram-negativas patogênicas ao homem é de grande interesse sob o ponto de vista da saúde pública. As bactérias do gênero Salmonella são transmitidas ao homem através de ingestão de
alimentos contaminados com fezes animais. Mesmo contaminados, os alimentos apresentam aparência e cheiro normais o que dificulta a detecção desses patógenos. As salmonelas são amplamente distribuídas na natureza, sendo ainda encontradas na microbiota natural de alguns animais de sangue frio (JAKABI et al., 1999). A Resolução - RDC N° 012, de 2 de janeiro de 2001, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA (BRASIL, 2001) recomenda ausência total de Salmonella spp. em 25 g de qualquer produto
alimentar.
Staphylococcus aureus é uma bactéria responsável por uma grande
variedade de infecções, desde as leves/moderadas (como as superficiais, de pele/partes moles) até aquelas envolvendo elevada morbidade e mortalidade, como a infecção da corrente sanguínea e a pneumonia (LOPES, 2005). Surtos de intoxicação alimentar são frequentemente relatados e os causados por S.
aureus são os mais comuns (RADDI; LEITE; MENDONÇA, 1988).
limites máximos de contaminação como forma de distinguir pescados de boa ou má qualidade.
1.1. A COMERCIALIZAÇÃO DO CARANGUEJO-UÇÁ
O caranguejo-uçá, Ucides cordatus (Linnaues, 1763), de coloração
azulada, arroxeada ou avermelhada, ocorre nas regiões de mangue do Brasil entre os estados do Amapá e Santa Catarina, com maior abundância a partir dos manguezais do Amapá até a Barra de Timonha, na divisa dos estados do Ceará e Piauí. A exploração desse recurso no Nordeste brasileiro reveste-se de grande importância social, já que dela se ocupa um grande contingente de pessoas residentes em áreas costeiras próximas aos manguezais. A captura e comercialização do crustáceo geram milhares de empregos, diretos e indiretos, nas comunidades pesqueiras das zonas de estuário onde a pesca apresenta aspectos muito primitivos. Devido ao seu alto consumo, é que foram estabelecidas normas para os catadores, sendo imposta uma proteção natural para a espécie, já que, pela diferença de tamanho, os machos são preferidos às fêmeas, o mesmo acontecendo para os indivíduos de pequeno porte. A
captura do U. cordatus é regulamentada por duas portarias do IBAMA: a de n°
1.208, de 22 de novembro de 1989, que estabelece tamanhos mínimos para a largura de carapaça na região Nordeste de 4,5 cm. A Lei n° 9.605 de 12 de fevereiro de 1998, Lei de Crimes Ambientais, prevê em seus artigos de 30 a 40 multas e penas de prisão de até três anos para quem destruir ou danificar
áreas de preservação permanente (APP), categoria em que o habitat do
1.2. DETERIORAÇÃO DO PESCADO
Pescado fresco é o produto obtido de espécimes saudáveis e de qualidade adequada ao consumo humano, convenientemente processado e conservado somente pelo resfriamento a uma temperatura próxima a do ponto de fusão do gelo (BRASIL, 1997).
A qualidade do pescado deve ser entendida como um conjunto de propriedades, características e atributos, que atenda às exigências do mercado e do consumidor (BARROS, 2003). Essa qualidade pode estar comprometida já no momento da captura, devido ao método utilizado e, também, ao manejo inadequado. Aliás, esses dois fatores são de fundamental importância para a futura conservação do pescado. O primeiro por ter uma grande influência com relação ao intervalo de tempo necessário para que o rigor mortis se instale e o
segundo por evitar e/ou retardar alterações autolíticas e microbianas do pescado.
Com o objetivo de aumentar o tempo de instalação do rigor mortis no
pescado, vários pontos são observados no momento da despesca e do abate para garantir um maior prazo de vida comercial. Dentre esses pontos valem salientar os cuidados com o trinômio tempo, temperatura e higiene e as práticas higiênico-sanitárias da embarcação pesqueira, água e gelo de boa qualidade suficientes para todos os processos sanitários a bordo, isolamento térmico adequado dos porões, método adequado para a captura da espécie desejada, evisceração imediata e retirada da cabeça e guelras em algumas espécies a bordo, lavagem com água clorada (50 ppm), estocagem em gelo até a chegada ao porto (VIEIRA et. al, 2004).
1.3. BACTÉRIAS PATOGÊNICAS
A qualidade higiênico-sanitária como fator de segurança alimentar tem sido amplamente estudada e discutida, uma vez que as doenças transmitidas pelos alimentos ao homem (DTA) são um dos principais fatores que contribuem para os altos índices de morbidade nos países da América Latina (AKUTSU et. ai. 2005). O comitê WHO/FAO (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1975) admite que as doenças oriundas da ingestão de alimentos contaminados seja, provavelmente, o maior problema de saúde do mundo contemporâneo.
O controle de qualidade dos alimentos requer um rigoroso monitoramento de todo o processo produtivo, desde a seleção da matéria-prima de qualidade, passando pelo seu processamento atendendo as boas práticas de manipulação, até o seu consumo. Como garantia de segurança e inocuidade dos alimentos, alguns métodos são empregados, dentre os principais estão as Boas Práticas de Fabricação (BPF) (LOVATTI, 2004), que são compostas por um conjunto de princípios e regras de higiene para o correto manuseio dos alimentos (NASCIMENTO; BARBOSA, 2007).
O pescado pode se constituir em um importante veiculador de microrganismos patogênicos ao ser humano, responsáveis por diversas enfermidades. Sabe-se também que a contaminação por manipulação e processamento inadequados ou mesmo utilização de equipamentos e utensílios contaminados são fatores importantes para a presença dessas bactérias no pescado (MURATORI, 2000).
Dentre os agentes potencialmente patogênicos, associados ao consumo de carnes de pescado, sejam elas oriundas de moluscos, crustáceos, peixes, entre outros, estão as bactérias do grupo coliforme, as salmonelas e
Staphylococcus aureus. Todas decorrentes de fatores externos ao pescado,
provenientes da contaminação dos ambientes naturais de onde foram obtidos tais recursos pesqueiros, pelas descargas de efluentes de esgotos, etc. (GERMANO et al., 1993).
potencial do alimento, além de poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento.
Segundo a ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods) os microrganismos indicadores que oferecem um risco baixo ou indireto à saúde são os coliformes totais, os coliformes termotolerantes, os enterococos, as enterobactérias totais e Escherichia coli.
Dentre as bactérias de habitat reconhecidamente fecal, E. coli é a mais
conhecida e a mais facilmente diferenciada dos membros não fecais. Todos os demais membros do grupo têm uma associação duvidosa com a contaminação
fecal e E. coli, embora também possa ser introduzida nos alimentos a partir de
fontes não fecais, é o melhor indicador de contaminação fecal conhecido até o presente (SILVA et al., 1997).
O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae,
apresenta-se como bastonetes curtos, Gram-negativos, fermentadores, não esporulados, na maioria móvel por flagelos peritríquios (exceto S. Gallinarum e S. Pullorum),
de metabolismo aeróbio ou facultativamente anaeróbio. A temperatura ideal situa-se na faixa de 35 a 37 °C, sendo a mínima de 5 °C e a máxima de 47 °C. O pH ótimo para seu desenvolvimento fica próximo de 7,0 e valores superiores a 9,0 e inferiores a 4,0 são bactericidas e, com relação à concentração de sal, não toleram concentrações superiores a 9 % (JAY, 2002).
Alguns autores têm relatado a importância da Salmonella nas DTA,
especificamente nos pescados. Vieira (2004) cita autores relatando que no Japão, onde é muito comum pratos a base de frutos do mar crus, 70 % das DTAs que ocorrem nos meses de verão originam-se de produtos da pesca. Os autores Mohamed Hatha; Lakshmanaperumaisamy (1997) encontraram
Salmonella em 14,25 % das amostras de peixes e 17,39 % nas de crustáceos
em mercados de peixes em Coimbatore, Sul da Índia.
Staphylococcus aureus pertence à família Micrococcaceae, sendo cocos
Tradicionalmente, os estafilococos estão divididos em duas categorias, coagulase positivos e coagulase negativos. Essa divisão está baseada na capacidade de coagulação do plasma, que é uma importante propriedade marcadora de patogenicidade. Entre os coagulase positivos, S. aureus
representa, até então, a única espécie envolvida em infecções humanas, tanto de origem comunitária quanto hospitalar (MARTINS, 1999a).
Com relação à resistência térmica, S. aureus são inativados em
temperaturas superiores a 60 °C por 3 minutos, e a estocagem sob temperaturas muito baixas por períodos de tempo prolongados pode reduzir o número de microrganismos viáveis. É capaz de crescer bem em concentrações de 7-10 % de NaCI, existindo cepas que se desenvolvem em até 20 `)/0. Seu pH ótimo encontra-se entre 6 e 7, mas conseguem se multiplicar na faixa de 4,0 a 9,8 (JAY, 2002).
Alguns trabalhos, no Brasil, indicam a presença desse patógeno em pescados. Ayulo et al. (1994) isolaram S. aureus em pescados na região Sul
principalmente em mexilhões e carne de caranguejo. Vieira et al. (1998) isolaram S. aureus em camarões frescos na feira livre de pescado do Mucuripe,
Fortaleza — CE.
A legislação brasileira estabelece padrões microbiológicos para cada tipo de alimento. No caso da Salmonella, o padrão para moluscos bivalves,
carne de siri e similares cozidos, temperados ou não, industrializados resfriados ou congelados é de ausência em 25 g do produto. Para o Estafilococos coagulase positiva, em um plano de três classes o limite "m", que separa o lote aceitável do de qualidade intermediária, é de 5 x 102, e o limite "M", que separa o lote de qualidade intermediária aceitável do inaceitável, é de 103 (BRASIL, 2001).
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Coleta das amostras
Os caranguejos utilizados na pesquisa foram adquiridos em três barracas (A, B e C) localizadas na Praia do Futuro em Fortaleza, Ceará, em dez coletas, entre os meses de maio e outubro de 2009. Foram adquiridas três unidades de animal de cada barraca A, B e C, sendo, no final, analisados um total de 90 caranguejos. As barracas foram escolhidas aleatoriamente.
No momento da compra, os caranguejos foram colocados separadamente em sacos plásticos estéreis hermeticamente fechados, sendo um saco plástico para cada barraca (Figura 1), acondicionados em bolsa térmica (Figura 2) e transportados até o Laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado no Instituto de Ciências do Mar (LMAP-Labomar). Os caranguejos foram sempre processados de acordo com a ordem de aquisição: barracas A, B e C, respectivamente.
FIGURA 1 — Caranguejos acondicionados em plásticos estéreis hermeticamente fecha-dos.
FIGURA 2 — Bolsa térmica usada no trans-porte dos caranguejos das barracas até o laboratório.
2.2. Preparo das amostras
do cefalotórax, placas de Petri onde seriam colocadas separadamente a carne obtida das patas e a obtida do cefalotórax e luvas cirúrgicas estéreis (Figura 4).
FIGURA 3 — Exemplares de Caranguejo-uçá (Ucides cordatus), apoiados em bandeja de metal.
FIGURA 4 — Bandeja, quebradores de nozes desinfetado, pinças e placas de Petri.
Em cada coleta foram obtidas porções de carne de patas e porções de carne de cefalotórax (Figuras 5 e 6 respectivamente), totalizando ao longo da pesquisa dez porções de carne de patas e dez porções de carne de cefalotórax de cada barraca.
FIGURA 5 — Patas utilizadas nas análises. FIGURA 6 — Parte do cefalotórax utilizada para as análises.
Para análise de Coliformes Termotolerantes e de Staphylococcus
coagulase positiva foram retirados 12,5 g de carne das patas e 12,5 g de carne
do cefalotórax e para a análise de Salmonella spp. as mesmas quantidades de
2.3. Análises microbiológicas
Foram feitas análises do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes
Termotolerantes, Contagem Padrão em Placa (CPP) de Staphylococcus
coagulase positiva e detecção da presença ou ausência de Salmonella spp.
conforme metodologia descrita pela Food and Drug Administration (FDA — USA), publicada no Bacteriological Analytical Manual, (1998).
2.3.1. Coliformes Termotolerantes 2.3.1.1. Prova Presuntiva
De cada amostra foram colhidos assepticamente 12,5 g de carne das patas e 12,5 g de carne do cefalotórax, para análise de Coliformes termotolerantes, que foram transferidos para 112,5 ml de solução salina 0,85 % estéril e colocados em liquidificador higienizado com álcool 70 % para homogeneização. Esta diluição correspondia à diluição de 10 -1. A partir dessa, foram feitas as demais: 10-2, 10-3 10-4 e 10-5, usadas para os procedimentos microbiológicos (Figura 7).
Foram inoculadas séries de cinco tubos de ensaio, contendo, em cada tubo, 10 ml de caldo lauril sulfato triptose (Caldo LST) e tubos de Duhran invertidos, com cada uma das diluições decimais preparadas. Em cada tubo com caldo LST foi adicionado 1,0 mL do inóculo com pipetador semi-automático e em seguida incubados em estufa bacteriológica a 35 °C por 48 horas. Após as 48 horas foram retirados os tubos de ensaio da estufa e contados os tubos positivos de cada diluição, os que apresentaram turvação e presença de gás (bolhas de ar) no interior dos tubos de Duhran.
2.3.1.2. Prova Confirmatória
Para a prova confirmatória foram repicados os tubos positivos no caldo LST com alça de níquel-cromo para os tubos com caldo
bili-lactose-verde-brilhante (caldo BVB) e caldo para Escherichia coli (caldo EC), ambos com
48 horas e os tubos de caldo EC colocados em banho-térmico a 44,5 °C ± 0,2 °C por 48 horas. Os primeiros expressam o Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais e os últimos o NMP de coliformes termotolerantes. Ambos os meios de cultura apresentam positividade, à semelhança do caldo LST, por turvação e formação de bolhas de gás nos tubos de Duhran. Os tubos positivos no caldo EC foram anotados para posterior consulta na Tabela de NMP segundo a edição mais recente do Bacteriological Analytical Manual online —
FDA (GARTHRIGHT, 2001).
2.3.2. Staphylococcus coagulase positiva
Para a contagem de Staphylococcus coagulase positiva (Figura 8) foi
utilizado o método da Contagem Padrão em Placas (CPP). A partir das diluições decimais originais foram também usadas alíquotas para os procedimentos da contagem de Staphylococcus coagulase positiva.
De cada uma das diluições decimais foram retirados 0,2 ml com pipetador semi-automático e adicionados por spread plate a placas de Petri contendo ágar Baird-Parker. As estrias no meio foram feitas com bastões de vidro estéreis (alças de Drigalski) até o mácula ser absorvido por completo pelo ágar. Em seguida as placas foram invertidas e incubadas a 35 °C por 48 horas em estufa bacteriológica.
Após 48 horas de incubação foi verificada a presença de colônias típicas
de Staphylococcus (colônias circulares, de coloração negra, com 2,0 a 3,0 mm
Para a prova da coagulase foram adicionados em tubos de ensaios, secos e estéreis, 0,1 ml da cultura em caldo BHI e 0,5 ml de plasma de coelho, reconstituído com salina a 0,85 %, e incubados a 35 °C em estufa. A cada hora eram examinados se havia, ou não, formação de coágulo, por até 6 horas. Foram considerados positivos os tubos onde havia formação de coágulos de qualquer grau.
2.3.3. Pesquisa de Salmonella spp.
O isolamento de Salmonella spp. foi obtido através da execução de
técnicas de enriquecimento e isolamento em meios de cultura seletivos próprios para esses microrganismos (Figura 9).
2.3.3.1. Pré-enriquecimento
A primeira etapa para isolamento de Salmonella spp. foi o
Pré-Enriquecimento, quando foram adicionados 12,5 g de carne retirada das patas em um Erlenmeyer contendo 112,5 mL de caldo lactosado (caldo CL) esterilizado e posteriormente incubado a 35 °C em estufa bacteriológica por 24 horas. O mesmo procedimento foi realizado para a amostra de carne do cefalotórax.
2.3.3.2. Enriquecimento seletivo
2.3.3.3. Isolamento em meios seletivos
Dos tubos de caldo RV e TT foram retirados inóculos e estriados em placas contendo ágar MacConkey (ágar MC) e ágar entérico Hektoen (ágar
HE) que foram incubadas a 35 °C em estufa bacteriológica, por 24 horas.
Colônias típicas de Salmonella spp. em ágar MC crescem incolores
discretamente amareladas, e em ágar HE verde-azuladas com ou sem
produção de gás sulfídrico (H2S).
2.3.3.4. Provas bioquímicas de triagem
Foram transferidas três a cinco colônias suspeitas de cada placa para tubos de ensaio inclinados contendo ágar tríplice açúcar ferro (ágar TSI) e ágar lisina ferro (ágar LIA). Com auxilio de uma agulha de inoculação foi retirado o inóculo do centro de cada colônia selecionada e estriado na superfície inclinada (ápice) e inoculado em profundidade na base do ágar TSI. Sem ser flambada a agulha, foram inoculados em profundidade na base do meio LIA e estriados na superfície. Todos os tubos foram incubados a 35 °C por 24 horas.
Os tubos positivos para Salmonella apresentaram no meio TSI ápice
alcalino, coloração vermelha e base ácida de coloração amarela, e algumas vezes com produção de H2S. Já nos tubos com meio LIA apresentaram base alcalina com coloração púrpura.
As culturas com reações típicas nos meios TSI (base ácida/ápice) e LIA (base alcalina) foram submetidas a testes bioquímicos de confirmação.
2.3.3.5. Prova bioquímica de confirmação
O único teste bioquímico de confirmação realizado foi o teste do indol. Tubos de ensaio contendo 3,0 ml de ágar sulfeto indo! motilididade (ágar SIM) foram inoculados com auxilio de agulha de níquel-cromo, de forma que, a inoculação foi feita em linha reta, sem que o fundo do tubo fosse tocado. Esta prova também é usada para teste de motilidade.
aparecimento de um anel de coloração vermelho na superfície do meio indicava positividade do teste. A maioria das salmonelas é indol negativo, apresentando na superfície do meio um anel de coloração amarela. E são móveis.
2.3.3.6. Identificação sorológica
As culturas características de Salmonella spp. nos meios TSI, LIA e SIM
foram passadas para tubos de ensaio com TSA inclinado e incubadas a 35 °C por 24 horas e submetidas ao teste sorológico flagelar polivalente (H). A cada tubo de ensaio foram adicionados 2,5 ml de solução salina 0,85 % e levemente agitados, para que houvesse desprendimento da cultura no meio TSA para a solução salina 0,85 %. Com a ajuda de uma pipeta Pasteur foi adicionada uma gota do homogenato a placas de vidro contendo de 3 a 5 gotas de anti-soro
Salmonella flagelar (H) polivalente (anticorpo) diluído e agitado levemente por
60 segundos.
Amostra de Caranguejo
1 ml
12,5 g do macerado
em112,5 ml de salina. 10-1 10-2
1 ml
10-3 10-4 ler& Retirada da carne e
posterior homegeneízacão
ml 1 ml
10 ml Caldo Lauril
35 'C;48h
1 lmi 1ml imi 1mi
4414444144441 4 1 4 4 4---T4T1
oproon000000000p juo, o
• :1 ! ,¡. .,; : , H_•1 • II, • • . , ;1
e 0 9 9 0 09 99 lt 92 9 9 9 ,
4
Tubos turvados com produção de gás —
repassados para MB e EC
10 ml Caldo Bile Verde Brilhante (BVB)- Prova confirmatôna para coliformes totais (Cl) - 35 'CI48h
4 ml Caldo EC 45:C148h (Banho Maria) — Prova confirmatória para coliformes
termotolerantes
Prova Presuntiva
Prova Confirrnatória
Tubos Turvados com produção
de gás no EC
4, 4,
Amostra de Caranguejo
200 µI da diluição em
cada placa Mar Baird-Parker
35`C,148h
1 MI 1 MI 1 ml
9 ml de solução salina 0,85% de KlaCI
123 q do macerado em112,5 mi de salina
10-1 ,j 10-2 10-3 10-4
Contagem Padrão em Placas (CPP)
4
,
4
,
0,1 ml Caldo BHI + 0,5 ml de Plasma de coelho
Colônias com halo e centro negro, típicas de Staphococcus
aureus
Agar TSA 35`C/24h
Caldo BHI 35—Cr24h
Plasma de coelho reconstItuldo com solução salina 0,85%
35`C,2h em 2h Retirada da carne e
posterior homogeneização
1 ml em 10 mi de Cardo Tetrationato — 35`C/24h 0,1 ml em 10 ml de Caldo
Rappaport-Vassilladis — 42"Ci24h (Banho térmico)
Ágar McConkey 35"Cr24h
Ágar Hectoen 35 `C.+2411
Ágar McConkey
35'024h Agar Hectoen 35 'CJ2111
4, ISOLAMENTO EM MEIOS SELETIVOS
PROVAS BIOQUÍMICAS DE TRIAGEM E CONFIRMAÇÃO
k-1
TSI LIA SIM TSI LIA SIM TSI
4, v
+
o
r-,
SIM LIA 4,
4,
Retirada da carne e
posterior homogeneização Amostra de Caranguejo
17
PRÉ— ENRIQUECIMENTO
12,5 g do macerado em
112.5 ml Caldo Lactosado 35'6,24h
ENRIQUECIMENTO SELETIVO
TESTE SOROLÓGICO
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes termotolerantes (CT) a 45 °C nas amostras de patas e cefalotórax de
caranguejo Ucides cordatus, cozido, adquiridas nas três barracas da praia do
Futuro (Fortaleza- CE), estão apresentados nas tabelas 1, 2 e 3.
Tabela 1 — Resultados do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes termotolerantes a 45 °C das amostras de patas e cefalotórax de caranguejo (Ucides cordatus), cozido, adquiridas na barraca A.
COLETAS Coliformes a 45 °C - NMP / g
Patas Cefalotórax
1° < 1,8 < 1,8
2° < 1,8 < 1,8
3° 1700 4
4° < 1,8 < 1,8
5° < 1,8 2
6° < 1,8 < 1,8
7° 350 1600
8° 9,3 12
9° < 1,8 4,5
10° <1.8 <1,8
Tabela 2 — Resultados do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes termotolerantes a 45 °C das amostras de patas e cefalotórax de caranguejo (Ucides cordatus), cozido, adquiridas na barraca B.
COLETAS Coliformes a 45 °C - NMP / g
Patas Cefalotórax
1°
2° 11 24 14 2
3° < 1,8 < 1,8
4° < 1,8 < 1,8
5° < 1,8 2
6° 2 < 1,8
7° < 1,8 < 1,8
8° < 1,8 < 1,8
9° < 1,8 < 1,8
NMP de Coliformes Termotolerantes
a 45 °C - PATAS
-#-B C
a 2a 3a 4a 5a Ga 7a ga ga 10a
Coletas
4 3,5 N 3 M 2,5 P 2 / 1,5 g 1 0,5 O 5 4,5 4 N 3'5 M 3 P 2,5 / 2 -
g 1,5 1 0,5 0 -1
NMP de Coliformes Termotolerantes a 45°C - CEFALOTÓRAX
ia 2a 3a 4a 52 6a 7a 8a 9a 10a
Coletas
19
Tabela 3 — Resultados do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes termotolerantes a 45 °C das amostras de patas e cefalotórax de caranguejo (Ucides cordatus), cozido, adquiridas na barraca C.
COLETAS Coliformes a 45 °C- NMP / g
Patas Cefalotórax
1° < 1,8 < 1,8
2° 7900 4900
3° 7900 7900
4° 2800 14000
5° 79 170
6° 9,3 14
7° < 1,8 9,2
8° < 1,8 < 1,8
9° 39 39
10° < 1,8 < 1,8
FIGURA 10 — Gráfico com os valores logaritimizados do Número Mais Provável (NMP) para Coliformes termotolerantes a 45°C, das barracas A, B e C, obtidos nas patas. L é o limite imposto pela legislação brasileira.
Das 30 amostras (10 de cada barraca) de carne das patas dos caranguejos cozidos, adquiridas nas barracas A, B e C da Praia do Futuro (Fortaleza-CE), oito (80,0%), 10 (100,0 %) e seis (60,0 %), respectivamente, estavam dentro dos limites estabelecidos pela legislação Federal (BRASIL, 2001). Conseqüentemente, somente duas (20,0%) da barraca A e quatro (40,0 %) da C, apresentaram-se fora do padrão tolerável cujo NMP / g para amostra indicativa é de no máximo 5 x 10 / g (item 7, alínea b).
Valores semelhantes aos encontrados para as amostras de carne de patas foram encontrados para as de cefalotórax, exceção apenas para uma (10%) da barraca A, que apresentou valor que excede os limites permitidos pela legislação.
A ocorrência desses coliformes em pescado pode significar que a captura foi realizada em ambientes com elevados índices de contaminação bacteriana ou poluição fecal (MURATORI et al., 2004). Semelhantes resultados foram encontrados por Sousa et. al. (2007). Os autores isolaram Escherichia
coli, Enterobacter aerogens, Klebsiella oxycota, Citrobacter amalonaticus e
Citrobacter diversus da carne de caranguejos-uçá, dos manguezais de São
Luís — MA. Essas bactérias fazem parte do grupo dos Coliformes e vivem na microbiota intestinal humana e de animais de sangue quente.
Inadequações ocorridas durante a captura, armazenamento, transporte e beneficiamento, também são responsáveis pela ocorrência desses microrganismos em pescado. Mesmo após o alimento ter sido preparado de forma correta e com utensílios isentos de contaminantes, o manuseio inadequado pode ser fonte de transferência dessas bactérias para os caranguejos. Segundo Vieira (2004), os principais agentes contaminantes do pescado, durante o processamento, são as bactérias do grupo coliforme, enterococos e estafilococos.
Nas tabelas 4, 5 e 6 e figuras 11 e 12 são observados os resultados das contagens de Staphyloccocus coagulase positiva das 30 amostras de patas e
cefalotórax dos caranguejos comercializados nas barracas A, B e C da Praia do Futuro (Fortaleza —CE).
No gênero Staphylococcus, a espécie Staphylococcus aureus,
mais conhecida, e freqüentemente implicada na etiologia de uma série de infecções e intoxicações no homem e nos animais, enquanto que os estafilococos coagulase-negativa (ECN) têm sido considerados saprófitas ou raramente patogênicos (KLOOS; SCHLEIFER,1975).
Contudo, durante a última década, considerável progresso na classificação sistemática dos estafilococos e no desenvolvimento de métodos para a identificação do gênero, espécies e subespécies têm permitido aos clínicos se inteirarem da variedade de ECN presentes em amostras clínicas e, assim, os considerarem como agentes etiológicos de uma série de processos infecciosos (KLOOS; BANNERMAN, 1994).
Tabela 4 — Contagem de Staphylococcus coagulase positiva de 10 amostras de patas e cefalotórax de Caranguejo-uçá (Ucides cordatus) adquiridos na barraca A.
COLETAS Staphylococcus aureus
Patas Coagulase Cefalotórax Coagulase
1° 2°
3°
4°
1,2 x 103 3,8 x 103 1,4 x 103
<10
<10 <10 8,0 x 102
<10
50 <10 <10
6° 2,6 x 103 4,0 x 103
7° 2,6 x 103 3,0 x 103 +
8° 5,0 x 102 + 1,2 x 103
9° 1,2 x 103 + 7,5 x 106 +
10° <10 <10
Tabela 5 — Contagem de Staphylococcus coagulase positiva de 10 amostras de patas e cefalotórax de Caranguejo-uçá (Ucides cordatus) adquiridos na barraca B.
COLETAS Staphylococcus aureus
Patas Coagulase Cefalotorax Coagulase
1° 5,2 x 102 O
2° 5,1 x 103 O
3° O O
4° O O
5° O O
6° O O
7° O O
8° O O
9° O O
CPP de Estafilococos
7
Coagulase positiva - PATAS
L~. 6
CS,5
4
L.L. 3 2
--4—A la
~gr— C
L
a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 10a
COLETAS
CPP de Estafilococos Coagulase
positiva - CEFALOTOR4X
1' 2a 3' 4' 5" 6a 7a aa 9' 10a
COLETAS
Tabela 6 — Contagem de Staphylococcus coagulase positiva de 10 amostras de patas e cefalotórax de Caranguejo-uçá (Ucides cordatus) adquiridos na barraca C.
COLETAS Staphylococcus coagulase positiva UFC / g
Patas Coagulase Cefalotórax Coagulase
1° 2° 3° 4°
0 3,1 x 104 3,8 x 103
0
1,4x 103 O 9,5 x 103
5° 3,3 x 104 1,7x105
6° 0 3,2 x 103
7° 0
8° 0 O
9° 3,0 x 106 1,1 x 106
10° 0 O
FIGURA 12 — Gráfico com os valores logaritimizados da Contagem Padrão em Placas (CPP) para Staphylococcus aureus, das barracas A, B e C, obtidos das amostras de patas. L é o limite imposto pela legislação brasileira.
As barracas A e C apresentaram, cada, uma amostra de pata aquém da legislação vigente. Essa limita em 103 UFC /g a quantidade permitida de
Staphylococcus coagulase positiva para amostras de carne de siri ou similares.
A ocorrência dessa bactéria em alimentos cozidos, prontos para o consumo, no caso dos caranguejos, pode ser um indicativo de falha no manuseio, uma vez que, a bactéria apresenta mucosas, pele e glândulas do
homem como principal habitat e temperaturas a partir de 60 °C por 3 minutos
são suficientes para matar esse microrganismo (HOOBSS et. al., 1993).
Na carne do cefalotórax, somente 2 (20%) amostras da Barraca A e uma (10%) da C, apresentaram valores maiores que os permitidos na legislação
para Staphylococcus coagulase positiva (Tabelas 4 e 6). Espécies de
esfilococos são inicialmente diferenciadas pelo teste de coagulase.
Estafilococos que produzem coagulase são: S. aureus, S. intermedius, S.
delphini e algumas cepas de S. hyicus e S. schleiferi. Com exceção de S.
aureus todas as outras são isoladas de animais e raramente do homem, razão
pela qual a grande maioria das cepas quando isoladas de fontes onde houve a interferência do homem são consideradas pertencer a essa espécie (LARSEN;
MAHON,1995). O gênero Staphylococcus não é encontrado na microbiota
natural do peixe. O habitat natural desse microrganismo é a pele e as
membranas mucóides de animais e homem; a média de carreadores dessa bactéria nos indivíduos normais é de 50% ou mais. A presença de
Staphylococcus em pescado é uma indicação de contaminação pós — captura
devido à pobre higienização dos manuseadores. Como o microrganismo é um pobre competidor, dificilmente ele se multiplicará no pescado, entretanto nos crustáceos, por exemplo, nos camarões cozidos e sem carapaça ou nas carnes cozidas de caranguejo, onde a microbiota natural é reduzida ou eliminada, a
presença de Staphylococcus indica um alimento com potencial de intoxicação
(HUSS, 1988).
observou foi que em algumas coletas os indivíduos eram comprados já frios, pressupondo que já haviam sido, pelo menos por algum tempo, expostos à temperatura ambiente desde o seu preparo. Outra observação anotada foi que nas barracas A e C, aquelas que apresentaram casos de contaminação por S.
aureus, foram vistos funcionários de suas cozinhas transferindo caranguejos, já
cozidos, para sacos de transporte (plásticos estéreis) sem o uso de colheres ou pegadores, utilizando-se apenas das próprias mãos, desprovidas de luvas ou de qualquer outra ferramenta que impedisse o contato direto com o alimento. Na barraca C, em três coletas, foi observado o péssimo processo de lavagem dos caranguejos antes do preparo, o que fez com que, mesmo cozidos, os animais ainda apresentassem, aderidos aos pêlos das patas, quantidades excessivas de sedimento.
Não foi detectada Salmonella em nenhuma das 30 amostras de patas ou
cefalotórax, nas três barracas estudadas.
Essas bactérias estão amplamente distribuídas na natureza, tendo como principal habitat o trato intestinal de animais de sangue quente e de sangue frio (JAKABI et al.,1999), com exceção de peixes, moluscos e crustáceo,os quais podem vir a ser contaminados por habitarem locais poluídos, após a pesca ou mesmo no momento do consumo.
Estes estudos podem servir como indicativo de que a presença de
Salmonella spp. em pescados deve-se à falta de controle e higiene durante o
4. CONCLUSÃO
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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