EXTRACÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
TURMA 6 ANO LECTIVO 2010/2011
Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Bioquímica I
1.º Ano do Mestrado Integrado de Medicina
Com esta actividade experimental pretendeu-se fazer a extracção e quantificação do DNA genómico presente numa amostra de sangue.
Para tal procedeu-se à extracção do DNA com uma solução salina e à sua quantificação por espectrofotometria.
Sumário
Extrair o DNA genómico de uma amostra de sangue periférico.
Fazer a quantificação do DNA extraído por espectrofotometria, fazendo a leitura da densidade óptica a 260nm e 280nm.
Analisar os processos de extracção e quantificação do DNA.
Objectivos
Introdução
Nucleótidos
São ésteres fosfóricos dos nucleósidos
- Pentose (desoxirribose ou ribose) - Base azotada
- molécula de ácido fosfórico
Constituintes fundamentais dos ácidos nucleicos: DNA e RNA.
Fazem parte da estrutura de coenzimas, participando em reacções do metabolismo energético celular.
Participam em mecanismos de conservação, replicação e transcrição de informação genética.
Introdução
Ácidos nucleicos
Resultam da polimerização de muitos nucleótidos
São macromoléculas importantes no controlo celular, pois são responsáveis pelo armazenamento e transmissão da informação genética, que é expressa sob a forma de proteínas.
DOIS TIPOS FUNDAMENTAIS:
DNA – ácido desoxirribonucleico
RNA – ácido ribonucleico
mRNA (mensageiro)
tRNA (transferência)
rRNA (ribossómico)
Introdução
Propriedades dos Ácidos nucleicos:
Solubilidade:
São insolúveis em solventes orgânicos, pouco solúveis em ácidos diluídos, moderadamente solúveis em água e muito solúveis em soluções salinas diluídas.
Podem ser degradados por hidrólise química (alcalina) ou enzimática (endonucleases).
Absorvem radiação UV a 260nm.
Separados por cromatografia em coluna, ultracentrifugação ou por
electroforese em gel.
Introdução
Formas de detecção dos Ácidos nucleicos:
ESPECTRO DE ABSORÇÃO DEFINE-SE NA ZONA DA RADIAÇÃO UV com absorção máxima a 260 nm.
EFEITO HIPERCROMÁTICO.
Reagem com DIFENILAMINA formando um complexo corado azul por ligação à desoxirribose e aquecimento (detecção a 600 nm).
Reagem com solução de ORCINOL na presença de FeCl
3e aquecimento
formando um complexo amarelado por ligação à ribose (670 nm).
Introdução
RNA ÁCIDO RIBONUCLEICO
Cadeia simples.
A pentose é uma ribose.
Apresenta-se como sendo material genético de vírus, bactérias e seres vivos.
3 formas: - mRNA (codifica a informação genética do DNA)
- tRNA (traduz a sequência de bases do mRNA em aminoácidos)
- rRNA (combinado com proteínas forma os ribossomas- síntese proteica)
mRNA
rRNA
tRNA
Introdução
Propriedades físico-químicas do RNA:
Solubilidade:
Solúvel em soluções salinas diluídas.
Desnaturação química (alcalina), física (aquecimento) e enzimática (ribonucleases).
Separáveis por ultracentrifugação e por
cromatografia.
Introdução
DNA ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO
Tem forma de dupla hélice, com duas cadeias complementares e antiparalelas unidas por pontes de hidrogénio (A=T, C=G).
Aparecimento das cadeias de 5’->3’ pela DNA Polimerase.
Organização no núcleo sobre a forma de cromatina, que é DNA associado a histonas.
PRINCIPAL FUNÇÃO
Contém informação genética que é transcrita, formando-se mRNA. Este é traduzido pelos ribossomas originando proteínas que têm funções específicas na célula.
Introdução
Propriedades físico-químicas do DNA:
Peso molecular elevado.
Viscosidade.
Dupla hélice desnaturada por: temperatura, pH extremo, ureia e foramina, enzimas.
Desnaturação depende do número de bases e a renaturação é espontânea.
Susceptível de hidrólise ácida suave e não é hidrolisado por bases diluídas;
pode sofrer hidrólise enzimática (desoxirribonucleases e endonucleases).
Não forma intermediários cíclicos.
Liga iões Mg
2+e Ca
2+.
Introdução
RNA vs. DNA
RNA DNA
Nome Ácido ribonucleico Ácido
desoxirribonucleico Bases
Azotadas Adenina , Uracilo,
Guanina e Citosina Adenina, Timina, Guanina e Citosina
Pentose Ribose Desoxirribose
Estrutura/
Hélice simples dupla
Introdução
EXTRACÇÃO DO DNA
CONDIÇÕES FUNDAMENTAIS:
Pureza molecular;
Pipetagens de Precisão;
Esterilidade dos Materiais;
Cuidados no manuseamento, e material de protecção
.Extracção com solução salina (NaCl 5,3 M)
para remover as proteínas da amostra
É fundamental para a obtenção de DNA com
qualidade para ser
analisado por PCR
Introdução
QUANTIFICAÇÃO DO DNA
A QUANTIFICAÇÃO DO DNA PODE SER FEITA POR:
ESPECTROFOTOMETRIA
Processo análogo ao DNA: λ =260nm
FLUORIMETRIA
Utilização de corantes fluorescentes (ex: RiboGreen)
Permite a detecção e quantificação de pequenas quantidades de RNA.
COMPARAÇÃO DE BANDAS (GEL).
Introdução
QUANTIFICAÇÃO DO DNA
SOLUÇÃO
(extrato de DNA + H₂O mili-EQ estéril)
Espectrofotometria
(Cuvette de Quartzo)
λ= 260 nm λ= 280 nm
Avaliar a
quantidade de DNA Estimar a contaminação de proteínas
AGITAÇÃO
Introdução
QUANTIFICAÇÃO DO DNA
Menor que 1,5 Entre 1,5 e 2,0 Maior que 2,0
Contaminação com proteínas
Amostra de DNA com pureza
adequada
Contaminação com RNA
[DNA] (mg/ml) = DO260 x 0,05 x factor diluição
REAGENTES
Tampão A (Tampão de lise dos glóbulos vermelhos)
Tampão B (Tampão de desproteinização)
SDS 10%
Solução de Proteinase K (20mg/ml)
NaCl 5,3M
Isopropanol frio ou Etanol 70% frio
Material
Tubos de Eppendorf
Pipeta de Pasteur
Tubos de ensaio
Pipetas graduadas
Pompete
Vortex
Procedimento
Adicionou-se 1 volume de tampão A e 2 volumes de H2O MilliQ estéril a 4ºC.
Submeteu-se a vortex moderado durante 30 segundos.
Incubou-se em gelo durante, no mínimo, 3 minutos.
Centrifugou-se a 3500 rpm, durante 15 minutos, a 4ºC.
Removeu-se o sobrenadante.
Centrifugou-se novamente a 3500 rpm, durante 15 minutos e a 4ºC.
Retirou-se o sobrenadante.
Adicionou-se 5 ml de Tampão B e 500 µl de SDS.
Submeteu-se a vortex forte, durante 30 a 60 segundos
Adicionou-se 50 µl de solução de Proteinase K (20 mg/ml).
Incubou-se a 55ºC durante 1 a 2 horas.
Colocou-se em gelo durante 2 a 3 minutos.
Adicionou-se 4 ml de solução saturada de NaCl, sujbmetendo-se novamente a vortex.
Centrifugou-se a 4500 rpm durante 15 a 20 minutos a 4ºC.
Transferiu-se o sobrenadante cuidadosamente para um tubo limpo.
Adicionou-se um volume de isopropanol frio (guardado a -20ºC) igual ao volume de isopropanol que fica no tubo.
Removeu-se a “medusa” com uma pipeta de Pasteur para um tubo eppendorf 1,5 ml e lavou-se com 1 ml de etanol frio a 70%.
EXTRACÇÃO DO DNA
Resultados
Não procedemos à QUANTIFICAÇÃO DO DNA, apenas o observamos.
1 - EXISTE CONTAMINAÇÃO?
1,5 ≤ Quociente ≤ 2 Não Quociente < 1.5
Quociente > 2
2 – QUANTIFICAÇÃO
[DNA] (mg/ml) = DO260 x 0,05 x factor diluição
Sim
Discussão
Os eritrócitos não têm núcleo nem mitocôndrias, logo não têm DNA. Para além disso, têm hemoglobina que, sendo uma proteína, pode danificar a qualidade da amostra.
Assim sendo, os eritrócitos foram removidos, adicionando, para tal, o tampão A, que provoca a sua lise.
Arrefecimento da solução de extracção diminuiu a ruptura das moléculas de DNA.
Após a centrifugação, o que constituia o sobrenadante eram proteínas e células destruídas, daí este ser eliminado da amostra, ficando apenas o sedimento.
Quanto mais clara for a cor do sedimento, maior será a sua pureza.
PROCEDIMENTO RESULTADOS
Discussão
As restantes proteínas foram removidas pelo tampão B, já que a sua função é a desproteinização.
O detergente (SDS) provocou a lise das membranas celulares (incluindo nucleares) e desnaturou proteínas.
A solução de Proteinase k utilizou-se para destruir as proteínas.
O cloreto de sódio (NaCl) precipitou as proteínas e excluiu o DNA.
O álcool (isopropanol/etanol) forçou o DNA a precipitar e a sair da solução.
PROCEDIMENTO RESULTADOS
NOTA:
- As plaquetas não têm núcleo, mas, como têm mitocôndrias, são relevantes para a quantificação do DNA.
O RNA está em todas as partes da célula e é degradado muito facilmente, não sendo necessário removê-lo.
Discussão
Uma vez que não efectuámos os cálculos, não conseguimos saber se a amostra de DNA obtida tinha pureza adequada para aplicações posteriores. Isto verificava-se se o quociente entre os valores de densidade óptica a 260 nm e a 280 nm se situasse entre 1,5 e 2. Se o quociente fosse inferior a 1,5, haveria contaminação por proteínas. Caso se verificasse um valor superior a 2, poderíamos concluir que teria havido contaminação com RNA.
[DNA] – Se tivéssemos calculado a concentração de DNA que se obteve, poderíamos verificar a quantidade de DNA que foi possível obter a partir de 5 ml de sangue (rendimento da extracção), que, provavelmente, seria reduzida devido às perdas de DNA possíveis por:
- Acção de DNases citoplasmáticas
- Insuficiente e não imediata preservação a frio - Incompleta precipitação do DNA
PROCEDIMENTO RESULTADOS
Discussão
Possivelmente, podem pôr-se em causa alguns dos princípios básicos de manuseamento de ácidos nucleicos, tais como as pipetagens de precisão, a esterilidade de todos os materiais e soluções usadas, a pureza dos reagentes, a água (H
20 MilliQ estéril) usada para a preparação das soluções, o uso de bata e luvas de látex (para prevenir contaminações). Pode ter ainda havido uma centrifugação anómala ou o tempo de actuação dos reagentes ter sido menor que o necessário. Assim, tendo em conta a existência de erros, os resultados não são 100% fidedignos.
A dupla hélice da molécula de DNA é demasiado pequena para se observar.
Apesar de o DNA ser a maior molécula na célula, só pode ser visto com um microscópio electrónico. No entanto, pudemos observar o DNA na nossa experiência, isto por termos milhões de cadeias de DNA na amostra.
Como o RNA está em todas as partes da célula e é degradado muito facilmente, espera-se que não tenha interferido na experiência, contaminando a amostra de DNA.
PROCEDIMENTO RESULTADOS
Discussão
A extracção do DNA tem, posteriormente, várias aplicações:
PCR (Polymerase Chain Reaction)
- Permite ampliar milhões de vezes uma dada sequência nucleotídica de interesse - Permite o diagnóstico de doenças genéticas e a sequenciação de genes
Electroforese
- Permite avaliar a concentração do DNA extraído, por comparação de um marcador - Separação das moléculas de DNA de acordo com o tamanho
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
- Corte do DNA num local específico por enzimas de restrição - que podem detectar mutações em fragmentos da sequência de DNA, chamados polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição
SOUTHERN BLOT
- Combina a electroforese em gel com a hibridação
- Muito sensível para detectar sequências de DNA específicas
MICROARRAYS
- Usados para avaliar a expressão de muitos genes ao mesmo tempo (respostas fisiológicas específicas; no processo de desenvolvimento; em processos patológicos)
A técnica de extracção utilizada permite fazer uma extracção eficiente do DNA genómico, sem necessidade de recorrer a solventes orgânicos, permitindo assim a sua análise, nomeadamente por PCR.
A quantificação por espectrofotometria permite avaliar a pureza da amostra de DNA extraída e através do quociente entre DO260 e DO280 detectar se houve contaminação da amostra.
