Universidade Federal da Bahia
Escola de Medicina Veterinária
Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
Salvador-Bahia 2011
Estudo epidemiológico da Doença Infecciosa Bursal em sistema industrial e alternativo de produção avícola:
Caracterização molecular do vírus, soroepidemiologia e detecção de anticorpos em aves silvestres.
Priscila Sousa da Silva
PRISCILA SOUSA DA SILVA
ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO DA DOENÇA INFECCIOSA BURSAL EM SISTEMA INDUSTRIAL E ALTERNATIVO DE PRODUÇÃO AVÍCOLA:
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS, SOROEPIDEMIOLOGIA E DETECÇÃO DE ANTICORPOS EM AVES SILVESTRES
Orientadora: Profa. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes
Salvador – Bahia 2011
Dissertação apresentada ao Programa de Pós graduação em Ciência Animal nos Trópicos, da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na área de Saúde Animal.
Sistema de Bibliotecas da UFBA
Silva, Priscila Sousa da.
Estudo epidemiológico da doença infecciosa bursal em sistema industrial e alternativo de produção avícola : caracterização molecular do vírus, soroepidemiologia e detecção de anticorpos em aves silvestres / Priscila Sousa da Silva. - 2011.
98 f. : il.
Orientadora: Profª. Drª. Lia Muniz Barretto Fernandes.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária, Salvador, 2011.
1. Galinha - Doenças. 2. Ave silvestre - Doenças. I. Fernandes, Lia Muniz Barretto.
II. Universidade Federal da Bahia. Escola de Medicina Veterinária. III. Título.
CDD - 636.5
CDU - 636.52/.58
Estudo Epidemiológico da Doença Infecciosa Bursal em Sistema Industrial e Alternativo de Produção Avícola: Caracterização Molecular do Vírus,
Soroepidemiologia e Detecção de Anticorpos em Aves Silvestres
PRISCILA SOUSA DA SILVA
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos.
Salvador, 01 de abril de 2011.
Comissão Examinadora:
Profa Dra. Lia Muniz Barreto Fernandes – UFBA Orientadora
Profa Dra. Maria Emilia Bavia – UFBA
Prof Dr. Roberto José Meyer Nascimento PPGIm/Labimuno/ICS/UFBA
AGRADECIMENTOS
Eis uma tarefa difícil. A Deus agradeço todos os dias por estar viva e me dar a oportunidade de aprender. Muitas pessoas foram imprescindíveis nas diversas etapas desse trabalho e as colaborações, grandes ou pequenas, foram fundamentais. Outros contribuíram com amizade, carinho e afeto, ingredientes importantíssimos para um bom trabalho. Temendo esquecer alguém, deixo aqui meus sinceros agradecimentos a todos que conviveram comigo nestes dois últimos anos. Gostaria de destacar algumas pessoas que foram especialmente importantes.
Minha família, que sempre me incentivou e me apoiou, especialmente meus pais pelo apoio e incentivo em todas as decisões da minha vida. Serei eternamente grata por todos os ensinamentos...pelo todo e por tudo!
Minha orientadora Profa. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes, minha referência na Medicina Veterinária, pela confiança depositada em mim, pelos ensinamentos, exemplo de profissionalismo, amor à profissão e principalmente pelo incentivo à pesquisa. Meu sincero agradecimento.
A Família LASAB: Paulo César Costa Maia, Izabella Ramos, Tatiane Sales, Rickson Diego, Cynthia Oliveira, Inara Gonçalves, Jamille Lima, Nilson Santana, Vinícius Satyro e, novamente, a Profa. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes, agradeço não só pela ajuda, mas principalmente pela companhia e por tornar o laboratório uma parte da minha casa.
Ao Médico Veterinário Pedro Lima pela disposição e boa vontade na coleta das aves silvestres, especialmente por não me fazer desistir de acreditar.
À Brasil Foods, por autorizar a coleta de dados para execução de parte deste trabalho.
Todas as pessoas que conheci nas localidades visitadas durante a realização desse trabalho, pela disponibilidade e satisfação em ajudar, especialmente ao Sr. Carlos, sempre muito solícito em me acompanhar nas coletas.
À Thaís Batinga e Bruno Beltrão pela hospegadem e ajuda.
Lia Muniz Barretto Fernandes, minha grande amiga, obrigada por ter me ajudado, tanto na universidade como na vida pessoal, e pelo convívio tão harmonioso e saudável que tivemos durante esses anos. Obrigada por fazer parte da minha vida!
Meus amigos Aroldo Carneiro, Thadeu Mariniello, Mariana Coelho, Elitieri Neto, Thaís Batinga, Davi Azevedo, Leane Gondim, Matheus Resende, Alan Caine, Vanessa Silva, Cibele Barbosa, Ana Dávila, Bianca Lopes, Marajuce Silva, Silvério Júnior, Francisco Gonçalves, Lucas Botelho, Pablo Moreno, Gustavo Rodamilans e família Pinho saibam que vocês fizeram parte de uma das etapas mais importantes da minha vida. As lembranças de nosso convívio esses anos, serão por mim eternizadas.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo auxílio financeiro.
“Só se pode alcançar um grande êxito quando nos mantemos fiéis a nós mesmos.”
Friedrich Nietzsche
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS... ix
LISTA DE FIGURAS... x
LISTA DE ABREVIAURAS... xi
RESUMO... xii
SUMMARY... xiii
1. INTRODUÇÃO... 14
A Doença Infecciosa Bursal... 14
Avicultura no Brasil e na Bahia... 16
2. REVISÃO DE LITERATURA... 18
2.1 Definição... 18
2.2 Histórico e Distribuição Geográfica... 19
2.3 Características do agente etiológico... 23
2.4 Epidemiologia... 28
Suscetibilidade... 28
Transmissão... 30
Patogenia... 32
Sinais Clínicos e Lesões... 35
2.5 Diagnóstico... 39
2.6 Prevenção e Controle... 44
Medidas gerais de prevenção e controle... 44
Medidas específicas de prevenção e controle... 45
3. ARTIGOS CIENTÍFICOS... 51
3.1 Artigo 1... 50
3.2 Artigo 2... 72
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS... 82
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 83
LISTA DE TABELAS
ARTIGO 1
Frequência de anticorpos contra o vírus da Doença Infecciosa Bursal e detecção viral através da PCR/RFLP em criações de frango de corte e galinhas de quintal no polo avícola da Bahia.
Tabela 1. Distribuição dos títulos de anticorpos, coeficiente de variação, desvio-padrão e frequência de anticorpos em frangos de corte nas duas regiões estudadas.
Tabela 2. Distribuição dos títulos de anticorpos, coeficiente de variação, desvio-padrão e frequência de anticorpos em galinhas de quintal nas duas regiões estudadas.
Tabela 3. Detecção e caracterização do IBDV em frangos de corte e aves de subsistência de duas regiões do polo avícola da Bahia.
ARTIGO 2
Detecção de anticorpos contra o vírus da Doença Infecciosa Bursal em aves silvestres no polo avícola da Bahia.
Tabela 1. Soropositividade para Doença Infecciosa Bursal em espécies de aves silvestres.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o IBDV em frangos de corte da região de Feira de Santana com média de títulos evidenciada.
Figura 2. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o IBDV em frangos de corte da região de Alagoinhas com média de títulos evidenciada.
Figura 3. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o IBDV em galinhas de quintal da região de Feira de Santana com média de títulos evidenciada.
Figura 4. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o IBDV em galinhas de quintal da região de Alagoinhas com média de títulos evidenciada.
LISTA DE ABREVIATURAS
IBD – Infectious Bursal Disease
IBDV – Infectious Bursal Disease Virus
OIE – Escritório Internacional de Saúde Animal EUA – Estados Unidos da América
USDA – Departamento de Agricultura dos Estados Unidos vvIBDV – very virulent Infectious Bursal Disease Virus RNA – Ácido Ribonucléico
RT-PCR – Reação de cadeia de polimerase com transcriptase reversa IDGA – Imunodifusão em Gel de Ágar
ELISA – Ensaio Imunoenzimático VN – Vírusneutralização
SPF – Specific Pathogen Free
SILVA, P.S. Estudo Epidemiológico da Doença Infecciosa Bursal em Sistema Industrial e Alternativo de Produção Avícola: Caracterização Molecular do Vírus, Soroepidemiologia e Detecção de Anticorpos em Aves Silvestres
.
Salvador, Bahia, 2011. 98p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal da Bahia, 2011.RESUMO
A Doença Infecciosa Bursal é uma enfermidade viral imunodepressora, altamente contagiosa, causadora de perdas elevadas à indústria avícola por afetar direta ou indiretamente o desempenho das aves. O monitoramento constante e o conhecimento a respeito da cadeia epidemiológica da doença são fundamentais para a prevenção e o controle de surtos, uma vez que o agente etiológico possui alta resistência no ambiente e grande capacidade rearranjo genético, gerador de variantes virulentas. Este trabalho teve o objetivo de investigar a freqüência de anticorpos contra o vírus da Doença Infecciosa Bursal em criações comerciais, em galinhas de quintal e em aves silvestres no pólo avícola da Bahia; e realizar a reação em cadeia da polimerase - transcriptase reversa (RT- PCR), para a detecção e tipificação das amostras virais circulantes. Para os testes sorológicos em aves domésticas, foram coletadas 758 amostras de soro de frangos de corte e 320 amostras de galinhas de quintal. Para a detecção e caracterização do vírus nestas populações, foram coletados 6 pools de bursas de Fabrícius em frangos de corte e 3 pools em criações de subsistência, analisados posteriormente com PCR/RFLP. Os resultados revelaram que não há proteção uniforme na criação comercial nas duas regiões estudadas, sugerindo falha na vacinação e desafio com vírus no ambiente. Também observou-se altos títulos em aves de subsistência não vacinadas, com variação nos títulos de relacionada com desafios de campo. Nos testes moleculares verificou-se que 3 pools de frangos de corte eram positivos, sendo dois para cepa vacinal (G3) e um para cepa variante (G15). Nas criações de subsistência houve uma amostra positiva para cepa variante (G15). Os resultados demonstram a necessidade de monitoramento em ambas criações. Para verificar a presença de anticorpos contra a doença em aves silvestres, foram coletadas 76 amostras de soro de aves de vida livre que circulavam nos arredores dos aviários de frangos de corte, na região do pólo avícola da Bahia, para avaliação da presença de anticorpos contra o vírus da Doença Infecciosa Bursal. Foi encontrada evidência sorológica da infecção por IBDV em 5 (6,6%) das amostras em uma das espécies aviárias analisadas. Esses resultados sugerem a possibilidade que as aves silvestres que circulam nos arredores dos aviários comerciais atuam como propagadoras do IBDV na região. Este é o primeiro levantamento sorológico da IBD em aves silvestres da Bahia.
PALAVRAS-CHAVE: Doença Infecciosa Bursal, frangos de corte, galinhas caipiras, aves silvestres, ELISA, IDGA, RT-PCR.
SILVA, P.S. Epidemiological study of Infectious Bursal Disease in Industrial and Village Poultry System: Molecular Characterization of Virus, Seroepidemiology and Antibodies Detection in free-living wild birds. Salvador, Bahia, 2011. 98p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal da Bahia, 2011.
SUMMARY
Infectious Bursal Disease is an immunodepressing viral illness, highly contagious, that causes losses to avian industry, as it affects, directly and indirectly, poultry performance.
Constant monitoring and knowledge regarding epidemiological chain are fundamental for prevention and control of outbreaks, since the etiological agent is very stable and capable of genetic ressortment that generates virulent strains. The aim of this study was to investigate the frequency of antibodies anti-Infectious Bursal Disease Virus as well as to detect the virus in broilers, small scale chickens, and free-living birds at Bahia’s poultry production area, and perform RT-PCR to detect and classify circulating viral strains. For serological tests in domestic poultry there were collected 758 serum samples from broilers and 320 from free-ranging chickens. For virus detection and characterization there were collected 6 bursal pools from broilers and 3 from free-ranging chickens, which were further analyzed with PCR/RFLP. Results showed that there is no uniform protection in commercial flocks, suggesting that it may be occurring vaccination errors and that it may be occurring challenge from viruses at the environment. There were observed high titers in no vaccinated free-ranging chickens, with titers varying related with environmental challenge. Molecular tests revealed that 3 broilers pools were positive in which 2 matched the vaccine strain (G3) and 1 a variant strain (G15). One sample from free-ranging chickens was positive for the variant strain (G15). These results demonstrate the need for monitoring both types of exploration. For evaluation of the presence of antibodies anti-IBDV in wild birds, 76 serum samples were collected from free-living birds circulating around the broiler aviaries in the region of Bahia’s most important poultry production area, Serological evidence of IBDV infection was found in 5 (6.6%) samples from one of the bird species analyzed. These finding suggests that these wild birds can be responsible for spreading IBDV in the area. This is the first report of serological survey of IBD in wild birds from Bahia State, Brazil.
KEY-WORDS: Infectious Bursal disease, broilers, free-ranging chickens, wild birds, ELISA, IDGA, RT-PCR.
1. INTRODUÇÃO
A Doença Infecciosa Bursal
A Doença Infecciosa Bursal é uma enfermidade aguda e contagiosa, que se caracteriza por causar danos imunológicos permanentes nas aves afetadas. Reconhecida há mais de 40 anos, a doença continua a causar muitos prejuízos à indústria avícola comercial em todo o mundo. As perdas econômicas decorrentes desta enfermidade são muitas e variadas e se devem à morbidade e mortalidade, à imunossupressão observada nas aves sobreviventes, à ocorrência de doenças causadas por outros agentes, à redução da habilidade das aves em responder às vacinações e ao risco de introdução da enfermidade pela importação de produtos avícolas importados. O impacto econômico da doença é influenciado pela patogenicidade da amostra do vírus, susceptibilidade da linhagem, prevalência de outros patógenos, condições ambientais e práticas de manejo. A maioria dos lotes comerciais é infectada com o vírus causador da doença nos primeiros dias de vida, e nesses casos o efeito imunossupressor é ainda maior (SAIF, 1991; SHARMA et al., 2000, NILIPOUR, 2006).
No Brasil e na Bahia, a Doença Infecciosa Bursal é endêmica e a indústria avícola tenta reduzir as perdas adotando estratégias baseadas em programas de vacinação diversificados e em medidas de biosseguridade. No entanto, nem sempre tais estratégias alcançam a eficácia esperada, devido à falhas na aplicação da vacina e de medidas gerais de prevenção. Salle (1989), avaliou os níveis de anticorpos maternos em pintos de 1 dia de idade provenientes de quatro diferentes empresas avícolas do Rio Grande do Sul, observando variação entre 7 e 100% na proteção por anticorpos maternos após o
desafio com uma amostra clássica do sorotipo 1 do vírus da IBD , aos 14 e 21 dias. O autor concluiu que era fundamental investigar os programas de vacinação, métodos de aplicações das vacinas, a cepa vacinal (suave, intermediária ou forte) e as doenças intercorrentes.
Estudo preliminar realizado na Bahia revelou que os programas de vacinação adotados para prevenção da Doença Infecciosa Bursal por empresas avícolas do polo avícola não estavam atingindo a proteção esperada. Os títulos obtidos na análise sorológica, também sugeriram que estavam ocorrendo desafios de campo. Além de enfatizar a importância da revisão dos programas de vacinação, os autores alertaram para a necessidade de implantação de medidas de biosseguridade adequadas (MOURA &
MENDES, 2007).
A eficácia dos programas de vacinação utilizados contra Doença Infecciosa Bursal no polo avícola da Bahia também foi avaliada por Lima (2010), que analisou integrações de frango de corte de 4 empresas avícolas. Os resultados demonstraram que nenhuma das empresas possuía esquema vacinal excelente, sendo que duas conseguiram resultados bons, gerando títulos de anticorpos uniformes nas aves. A falta de uniformidade nos títulos em outras duas empresas avaliadas levou à consideração de que as aves comerciais vacinadas desses lotes avaliados estavam sofrendo desafio a campo pelo IBDV.
A circulação do vírus da Doença Infecciosa Bursal no ambiente da criação, a presença de vetores e hospedeiros, aumenta o desafio para os criadores. Como o vírus é altamente resistente no ambiente e facilmente transmissível entre aves, a presença de aves que sirvam como reservatórios é extremamente preocupante. Gonçalves (2009) observou a presença de altos títulos de anticorpos para IBD em galinhas de quintal na Bahia e alertou sobre a circulação do agente etiológico próximo aos ambientes de criação.
Avicultura no Brasil e na Bahia
No Brasil, a avicultura emprega mais de 4,5 milhões de pessoas, direta e indiretamente, e responde por quase 1,5% do Produto Interno Bruto (PIB) nacional (UBA, 2009). De acordo com a UBABEF, a produção de carne de frango chegou a 12,230 milhões de toneladas em 2010, com crescimento de 11,38% em relação a 2009, quando foram produzidas 10,980 milhões de toneladas. Com este desempenho o Brasil se aproxima da China, hoje o segundo maior produtor mundial, cuja produção de 2010 somou 12,550 milhões de toneladas, abaixo apenas dos Estados Unidos, com 16,648 milhões de toneladas, conforme projeções do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA). O crescimento em 2010 foi impulsionado principalmente pelo aumento de consumo de carne de frango e pela expansão de 5,1% nas exportações. Como resultado da produção em 2010, o consumo per capita de carne de frango no Brasil foi de 44 quilos no ano passado (UBABEF, 2011).
A maior parte da carne de frango é produzida por grandes empresas integradas ou cooperativas que adotam práticas de manejo e controles rígidos de produção, sendo que
mais de 70% das aves abatidas são inspecionadas pelo Serviço de Inspeção Federal (SIF) (ALVES, 2005).
Na Bahia o aumento da produção de grãos no oeste vem permitindo que o estado se consolide como um importante produtor de carne de frango. A disponibilidade de matéria-prima tem favorecido a expansão das granjas no estado, a exemplo do que aconteceu nos estados do Centro-Oeste. O alojamento de pintos de corte na Bahia cresce u 13,3% em 2009, totalizando 107,47 milhões de aves, duas vezes acima da média nacional, que foi de 6,2%. Entre os estados que fazem parte da nova fronteira agrícola (BA, MA, PI e TO), a Bahia se destaca como maior produtor de frango (SEAGRI, 2011).
Considerando a importância da avicultura para o Brasil e o crescimento da atividade na Bahia, bem como o impacto sócio-econômico da Doença Infecciosa Bursal, este trabalho teve o objetivo de investigar a frequência de anticorpos anti-IBDV em criações comerciais, em galinhas de quintal e em aves silvestres no pólo avícola da Bahia; e realizar a reação em cadeia da polimerase - transcriptase reversa (RT-PCR), para a detecção e tipificação das amostras virais circulantes.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Definição
A Doença Infecciosa Bursal (IBD), é uma enfermidade viral, aguda e altamente contagiosa, resultante da infecção pelo vírus da doença infecciosa bursal (IBDV) (CASTRO et al., 2009). A enfermidade acomete galinhas jovens, principalmente entre a terceira e a sexta semana de idade, sendo considerada mundialmente uma doença endêmica na avicultura comercial, podendo levar a perdas significativas (GENOVA, 2000; LIU et al., 2002; PHONG et al., 2003; TIWARI et al., 2003; KULÍKOVA et al., 2004; DIAS, 2007).
Também conhecida com Doença de Gumboro, a IBD é caracterizada pela extensa destruição dos órgãos linfóides, em particular da bursa de Fabrício, causando severo efeito imunossupressor e aumentando a suscetibilidade a outras doenças (WANG et al., 2008), podendo levar à infecções oportunistas e favorecer a ocorrência de outras enfermidades virais, como a doença de Newcastle, Bronquite Infecciosa das Galinhas e Laringotraqueíte (BANDA et al., 2003), além de reduzir a resposta à vacinação das aves (MÜLLER et al., 2003; PHONG et al., 2003). Como consequência da infecção, o lote afetado geralmente apresenta-se desuniforme devido à perda de peso (BANDA et al., 2003). O impacto econômico da Doença Infecciosa Bursal é influenciado pela virulencia da cepa do vírus, suscetibilidade das aves do lote, intercorrencias de patógenos primários e secundários além de fatores ambientais e de manejo (MÜLLER et al, 2003).
A Doença Infecciosa Bursal é considerada pelo Escritório Internacional de Saúde Animal (OIE) uma enfermidade transmissível, importante do ponto de vista sócio- econômico e/ou sanitário a nível nacional, e internacional, no comércio de animais e produtos de origem animal (OIE, 2004).
2.2 Histórico e Distribuição Geográfica
A Doença Infecciosa Bursal emergiu na região de Delmarva (EUA), no final da década de 50, como uma enfermidade aguda, causadora de alta morbidade e mortalidade em frangos de corte. A primeira descrição deste surto foi feita por Albert Cosgrove, no ano de 1962, relatando casos ocorridos na localidade de Gumboro, estado de Delaware (EUA). O consenso inicial era de que a nefrose aviária, ou Doença de Gumboro, era causada por uma variante do vírus da Bronquite Infecciosa (amostra Gray) devido às alterações renais encontradas. Como se percebeu depois, o equívoco se deu porque as duas infecções aconteciam simultaneamente em muitos casos e o agente etiológico era difícil de isolar usando as ferramentas disponíveis no momento (LASHER & DAVIS, 1997; LOJKIC et al., 2003; AL-NATOUR et al., 2004). Um dos esforços mais intensos para identificar o agente responsável pela Doença de Gumboro foi iniciado pelo grupo dos laboratórios L&M, em Marykand (EUA), que determinou que o agente causador da enfermidade era muito diferente do vírus da Bronquite (LASHER & DAVIS, 1997). O nome Doença Infecciosa Bursal, utilizado atualmente, se deve ao reconhecimento de que a bursa de Fabricius era o alvo principal do vírus causador da enfermidade (BERNARDINO & LEFFER, 2009; ITO et al., 2001; LUKERT & SAIF, 2003).
Nas décadas de 60 e 70, a Doença Infecciosa Bursal foi diagnosticada em diferentes regiões dos EUA (LEFFER, 2004). Em princípio, a prevalência da doença clínica foi reduzida com a introdução de vacinas vivas, a partir de 1966. A primeira vacina contra o IDBV foi preparada por Edgard na Universidade de Auburn. Essa vacina foi chamada apropriadamente de “não atenuada” porque continha uma suspensão de bursas obtidas de aves infectadas com um isolado de campo. Esta não foi apenas a primeira vacina para uso no campo, mas o primeiro e único produto derivado de bursas aplicado diretamente. Foi usado com sucesso em mais de 3 milhões de aves. A vacina satisfazia uma importante necessidade no momento, controlando a mortalidade por IBD. No entanto, havia a necessidade de desenvolver vacinas mais apropriadas, uma vez que o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) julgava arriscado o movimento para a utilização da vacina de Edgard em vários estados americanos, considerada por ele como uma “infecção planejada” (LASHER & DAVIS, 1997).
Novas pesquisas levaram ao desenvolvimento de vacinas inativadas, no final da década de 70. No entanto, no início da década de 80, ainda eram identificados sinais severos da doença nos EUA, bem como casos de imunodepressão sem demonstração de sinais clínicos, principalmente na área avícola de Delaware (VILLEGAS & BANDA, 2001).
Novos isolamentos, realizados a partir de surtos com sinais clínicos e mortalidade, inclusive em aves adultas, demonstraram grandes alterações na estrutura antigênica das proteínas do vírus causador da enfermidade (CHETTLE et al., 1989). As falhas vacinais relatadas em vários países nos anos de 1986 e 1987 foram atribuídas às novas variantes virais detectadas (JACKWOOD & SAIF, 1987; SNYDER et al., 1992).
Em 1986 surgiu na Europa uma variante muito virulenta do vírus da Doença Infecciosa Bursal (vvIBDV). Esta amostra demonstrou-se altamente patogênica, sendo capaz de
causar infecção em lotes de frangos de corte detentores de altos títulos de anticorpos maternais, e se disseminou rapidamente entre vários países europeus, causando perdas econômicas sérias e mortalidade de até 100% nas aves (ABDEL-ALIM et al., 2003;
BOLIS et al., 2003; ZORMAN-ROJS et al., 2003).
A partir da primeira descrição a enfermidade já foi relatada em Cuba e Chile (NODA et al., 2005); Brasil ( PAULA et al., 2004); Uruguai (HERNÁNDEZ et al., 2006);
Argentina (REMORINI et al., 2006); Croácia (LOJKIC et al., 2003); República Dominicana (PAGÈS-MANTÉ et al., 2000); Polônia e Hungria (DOMANSKA et al., 2004); China (LIU et al., 2002); Coréia (JEON et al., 2008); Malásia (TAN et al., 2004);
Paquistão (LONE et al., 2009); Egito (HASSAN, 2004); Nigéria (OKOYE & ABA- ADULUGBA, 1998); e Tanzânia (KASANGA et al., 2007). Esses relatos demonstram que o IBD já foi isolado em praticamente todos os continentes.
No Brasil a enfermidade foi descrita pela primeira vez por Nakano et al. (1972), e o primeiro relato de isolamento viral foi feito por Saukas, em 1978. Os primeiros surtos da Doença Infecciosa Bursal no Brasil ocorreram em Minas Gerais e foram considerados de alta patogenicidade. No entanto, até meados da década de 90, a predominância dos casos era da forma subclínica, com atrofia da bursa e problemas secundários decorrentes da imunossupressão, sendo que as vacinas comerciais de mercado conferiam proteção satisfatória (LEFFER, 2004; DIAS, 2007).
No início da década de 80 a vacinação com estirpe atenuada em células (Lukert) passou a ser realizada no nosso país, e, em meados desta, ocorreu a introdução das vacinas oleosas nas reprodutoras, mantendo-se a utilização de vacinas suaves na progênie, e introduzindo-se vacinas intermediárias para revacinações. Com objetivo de imunizar aves com altos títulos de anticorpos passivos, foram introduzidas para revacinações, na década de 90, as vacinas do tipo “forte” (CBMforte) (MICHELL, 2007).
No ano de 1997, foi diagnosticada no estado de São Paulo a forma altamente virulenta da IBD (vvIBD), em criações de aves de postura e corte, com mortalidade alta e sintomatologia clínica da doença. Em posterior identificação, através da similiaridade antigênica, genética e de patogenicidade, foi comprovada a semelhança com a cepa muito virulenta européia (DI FÁBIO et al., 1999; BERNARDINO & LEFFER, 2009).
Banda & Villegas (2004) caracterizaram geneticamente isolados brasileiros a partir da cepa vvIBDV e encontraram maior similaridade com isolados europeus do que com isolados americanos, sugerindo que a origem da variante brasileira seja européia.
Quatro anos após a identificação inicial da vvIBD em São Paulo, sua ocorrência foi relatada em todos os estados do país, até mesmo nas localidades mais distantes com pouca avicultura industrial, constituindo um problema que obriga as empresas avícolas a adotarem novas abordagens de prevenção com relação a biosseguridade e programas de vacinação (TESSARI et al., 2000; DI FÁBIO, 2002).
2.3 Características do agente etiológico
A Doença Infecciosa Bursal (IBD) é causada pelo vírus da doença infecciosa bursal (IBDV), tem simetria icosaédrica, não é envelopado e possui diâmetro variando de 55- 65 nm. O genoma viral consiste em uma fita dupla de RNA bi-segmentada (SCHRÖDER et al., 2000; OWOADE et al., 2004; COULIBALY et al., 2005), o que permitiu sua classificação dentro de uma nova família de vírus, a Birnaviridae, sendo considerada o protótipo do gênero Avibirnavirus (LEONG et al., 2000). Os vírus pertencentes à família Birnaviridae não infectam mamíferos e, são classificados em 3 gêneros: Aquabirnavirus, onde está classificado o Infectious pancreatic necrosis vírus (IPNV) que acomete salmonídeos e trutas; Avibirnavirus, constituído apenas pelo IBDV que infecta somente galinhas e Entomobirnavirus, incluindo o Drosophila X vírus que infecta Drosophila melanogaster (DOBOS et al., 1995).
Os birnavírus replicam-se no citoplasma causando leve depressão nos processos celulares de transcrição e tradução, sendo o mRNA viral transcrito por uma RNA polimerase dependente de RNA associada ao virion (MURPHY et al., 1999).
O IBDV possui morfologia hexagonal e seu genoma consiste de duas moléculas de RNA fita dupla que são chamadas A e B (DIAS, 2007). O segmento A codifica as proteínas virais VP2, VP3, VP4 e VP5, enquanto que a proteína VP1 é codificada pelo segmento B (VAN DEN BERG, 2000). Dentro do segmento A, a VP2 e VP3 são proteínas estruturais formadoras do capsídeo externo e interno, respectivamente (DIAS, 2007). A VP2 está relacionada com a antigenicidade do vírus, ou seja, expressão de epitopos que induzem uma resposta de anticorpos. Por isso, os anticorpos gerados por
ela permitem efetuar sua diferenciação dos sorotipos e subtipos virais. A VP3 é a principal responsável pela conformação estrutural do vírus e tem relação com antígenos grupos específicos (ITO et al., 2001). A VP4 é uma protease viral, a VP5 é uma proteína não-estrutural e ambas são responsáveis pela maturação das proteínas do capsídeo e pela liberação do vírus na célula infectada (DI FÁBIO, 2001; MÜLLER et al., 2003; KONG et al., 2004; LOMBARDO et al., 2000).
O segmento B codifica a proteína VP1, que possui atividade de polimerase e atua como a RNA polimerase dependente de RNA, sendo responsável pela replicação e transcrição do genoma do vírus nas células infectadas e, pelo encapsulamento das partículas virais (MACREADIE & AZAD, 1993; DI FÁBIO, 2001; MÜLLER et al., 2003; KONG et al., 2004; LOMBARDO et al., 2000). A VP1 encontra-se presente em pequenas quantidades no virion como proteína livre (DIAS, 2007) e também está ligada ao final do segmento do genoma viral (DIAS, 2007; MÜLLER et al., 2003). As proteínas da VP1 formam um distinto subgrupo de RNA dependente da RNA polimerase.
O IBDV se multiplica nos tecidos linfóides, com predileção pela bursa de Fabricius (SCHRÖDER et al., 2000; OWOADE et al., 2004; COULIBALY et al., 2005), podendo destruir precursores de imunoglobulinas (AL-NATOUR et al., 2004). O agente é altamente contagioso e imunossupressivo, causando morbidade e rara mortalidade em galinhas com 3 a 6 semanas de idade.
O vírus é considerado altamente contagioso entre aves e entre lotes. A sua resistência no meio ambiente e a ausência de imunidade são os principais fatores que facilitam a contaminação entre galpões. O IBDV tem infectividade elevada, pois pequenas doses do vírus são suficientes para instalação da infecção na ave. A virulência da cepa é variável e à medida que aumenta a virulência desta aumenta também a mortalidade (BERNARDINO & LEFFER, 2009).
Inicialmente, a maioria das variações na sequência de aminoácidos foi identificada em uma região localizada na proteína VP2. Essa região tem a maior variação da sequência de aminoácidos (KABELL et al., 2005; KASANGA et al., 2007) e por isso, é responsável pela emergência de novas variantes de IBDV e, pelas diferenças de antigenicidade e atenuação viral (MICKAEL & JACKWOOD, 2005). Contudo, variações substanciais em VP1, VP3 e VP4 também foram detectadas (KABELL et al., 2005; KASANGA et al., 2007). Mutações na VP1 são causas de variações antigênicas e modificações de virulência in vivo e atenuações in vitro (ITO et al., 2001). Análises filogenéticas indicam que o segmento B está relacionado com emergência de cepas vvIBDV (MÜLLER et al., 2003).
Algumas estruturas e sequências são essenciais para a viabilidade do IBDV, enquanto outras são específicas para cepas e tipos, incluindo sorotipos e patotipos. Cada modificação na composição genética das proteínas estruturais e regulatórias, e/ou na sequência poderia influenciar no ciclo viral, na especificidade ao hospedeiro e na virulência da cepa (VAN DEN BERG, 2000).
Os vírus com genoma RNA segmentado, como o IBDV, possuem uma grande diversidade genética devido a alta taxa de mutação da RNA polimerase e da possível ocorrência de rearranjos entre os segmentos genômicos. Essas modificações podem gerar tanto variações antigênicas quanto patogênicas, uma vez que podem alterar a virulência do vírus (VAN DEN BERG, 2000).
Dois sorotipos são descritos para o IBDV: 1 e 2. O sorotipo 1 abrange os vírus que são patogênicos para as galinhas. Os vírus pertencentes ao sorotipo 2 podem infectar galinhas e perus, mas não são patogênicos para ambas as espécies (ASHARAF, 2005;
GARDIN, 2000; MAJÓ et al., 2002). No sorotipo 1 existem diferentes cepas que são classificadas em clássica, variante antigênica, e muito virulenta (LOJKIC et al., 2008), que expressam diferentes graus de patogenicidade (LIM et al., 1999). Dentro das cepas clássicas encontram-se a grande maioria das amostras vacinais utilizadas em avicultura (SAIF, 1999; ASHRAF, 2005).
Os critérios utilizados para a classificação das cepas do IBDV incluem patogenicidade, antigenicidade e relação genética (ASHRAF, 2005). No Brasil, diferentes padrões de vírus têm sido encontrados em várias regiões através de ensaios de enzimas de restrição com sítios na região hipervariável da VP2, permitindo a diferenciação das cepas variantes antigênicas, clássicas e altamente virulentas (IKUTA et al., 2001).
O conhecimento de tipos patogênicos dos IBDVs serve para estimar a relação que pode ser estabelecida entre a exposição de uma ave ou lote ao vírus de campo ou vacinal,
com densidade populacional, eficiência do programa de vacinação e biosseguridade. O resultado desta interação permitirá avaliar o tipo de vírus prevalente e a severidade da doença induzida pelo vírus de campo em uma região, estado ou país (ITO et al., 2001).
O surgimento de cepas de maior virulência em criações industriais constitui um problema para avicultura (DI FÁBIO et al., 1999), fato esse que impõe aos avicultores a adoção novas abordagens de prevenção, no sentido de determinar vacinas, melhorar os programas de vacinação e aplicar medidas de biosseguridade (TESSARI et al., 2001).
O IBDV é bastante estável e muito resistente à inativação por agentes químicos e físicos, o que favorece a sua persistência no ambiente mesmo após a limpeza e desinfecção (ITO et al., 2001). O vírus é inativado em tratamentos com pH alcalino (12,0), porém permanece ativo em pH ácido (2,0); resiste à temperatura de 37°C por 90 minutos e 56°C durante 5 horas. O patógeno não é afetado por éter, clorofórmio, aldeídos, fenol, etanol, amônia quaternária e misturas complexadas (BENTON et al., 1967; VILLEGAS & BANDA, 2001; MORAES et al., 2005). Uma redução acentuada na infectividade do vírus foi observada após o tratamento com 0,5% de formalina por 6 horas. O vírus é resistente à inativação por cozimento, e existe o risco de introdução em criações de quintal através de produtos feitos com carne crua, já que o vírus pode estar presente na carne de aves aparentemente saudáveis (LUKERT & DAVIS, 1974). Essa resistência do vírus aos desinfetantes e compostos químicos acarreta longa sobrevivência nas instalações, podendo persistir no galpão por 10 dias depois que as aves infectadas são retiradas e pelo menos 52 dias na água, alimentos e fezes,
dificultando seu controle (VILLEGAS & BANDA, 2001; MAJÓ et al., 2002; MORAES et al., 2005).
2.4 Epidemiologia
Suscetibilidade
As galinhas são hospedeiras naturais do IBDV, sendo susceptíveis ambos os sexos e todas as raças (VAN DEN BERG, 2000). A manifestação clínica da doença é mais evidente quando a infecção ocorre a partir da terceira semana de idade (SANTOS et al., 2004). A imunidade maternal pode proteger a progênie até a terceira e quarta semanas de vida. Pintos com menos de três semanas de idade e sem anticorpos maternos sofrem severa imunossupressão, em alguns casos sem manifestação de sinais clínicos, podendo resultar em aves com crescimento retardado e mortalidade (SHARMA, 1999). O período de incubação pode ser muito curto e a duração da doença em torno de uma semana, sendo a mortalidade observada por volta do terceiro dia após infecção atingindo valor máximo entre três e sete dias, quando passa a declinar (TESSARI et al., 2000).
Gallus domesticus é a única espécie de ave conhecidamente suscetível à doença clínica e às lesões características causadas pelo IBDV. Outras espécies são suscetíveis à infecção com o vírus, porém são resistentes às manifestações clínicas da doença (SHARMA et al., 2000).
A doença é difundida nas aves domésticas, distribuída em todo o mundo e têm mais importância para a indústria do que para as aves domésticas (LOJKIC et al., 2003; AL- NATOUR, et al., 2004).
No Brasil, existem relatos de monitoramentos sorológicos para esses vírus na população avícola industrial (ROMERO et al., 1989). No entanto, não existem estudos de prevalência de anticorpos na população de aves criadas fora do sistema industrial, como galinhas de terreiro e aves silvestres (SANTOS et al., 2008).
Altas taxas de amostras positivas contra o IBDV foram identificadas em criações de galinha de quintal indicando que este vírus circulam amplamente na população de galinhas de quintal. A circulação do IBDV pode ser considerada um risco à sanidade avícola, considerando-se a capacidade de disseminação do agente viral (SANTOS et al., 2008). Aves silvestres e ratos também podem servir de reservatório do vírus (NILIPOUR, 2006).
Estudos sorológicos feitos por Wilcox (1983), evidenciaram uma infecção pelo sorotipo 1 em aves silvestres, sugerindo que essas aves participam da cadeia epidemiológica do IBDV servindo de reservatório do vírus.
Kasanga et al. (2008) detectaram uma parte do genoma do vírus clássico e do vírus muito virulento de provenientes de criações de pombos e de galinhas d’angola. Essa
relação de aves silvestres com galinhas demonstra que as aves silvestres podem estar participando da epidemiologia da Doença Infecciosa Bursal naturalmente.
Jeon et al. (2008) investigaram a causa de mortalidade de aves silvestres na Coréia do Sul. Das 107 aves de vida livre, de sete espécies distintas, encontradas mortas, cinco apresentaram positividade para IBDV na reação de cadeia de polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR). A análise filogenética da sequência do gene VP2 revelou que a amostra do vírus encontrada nestas aves era semelhante à amostra muito virulenta (vvIBDV) isolada de galinhas domésticas de regiões endêmicas. A inoculação desta amostra em aves livres de patógenos específicos acarretou 60% de mortalidade e severa atrofia bursal. Uma vez que quatro das cinco amostras positivas foram isoladas de aves aquáticas, os autores sugeriram que estas aves possam atuar como reservatórios, desempenhando papel importante na epidemiologia da IBD.
Transmissão
A ave infectada elimina o vírus para o ambiente por meio das fezes, sendo a transmissão tida somente como horizontal. A disseminação do IBDV dentro de um lote de aves ocorre pelas vias aéreas, digestiva e ocular, assim como, através de roupas, calçados, material de limpeza e trabalho, cama e fezes de aves infectadas e também veículos (WANG et al., 2007; VILLEGAS & BANDA, 2001; MORAES et al., 2005). Não há evidência de transmissão via ovo e nem de que aves infectadas permaneçam portadoras (VILLEGAS & BANDA, 2001; MORAES et al., 2005).
Cepas do IBDV isoladas de patos, gansos e pardais são patogênicas para galinhas apesar de possuírem diferentes graus de patogenicidade. Essas aves podem servir como possíveis veículos de transmissão do IBDV (WANG et al., 2007).
Aves silvestres, peixes ou insetos, carreadores assintomáticos ou aves com infecção latente podem ter tido um importante papel no aparecimento das amostras hipervirulentas (ITO et al., 2001).
O cascudinho (Alphitobius diaperinus) presente em muitos galpões de frangos é capaz de servir como um reservatório para o IBDV (MCALLISTER et al., 1995; NILIPOUR, 2006). O vírus foi isolado de besouros adultos até 14 dias após a exposição, e foi detectado nas larvas após 24h. O cascudinho vive em meio à cama do aviário, principalmente ao redor dos comedouros e, também no solo (até 20 cm de profundidade) e, encontra nos aviários, boas condições de sobrevivência, alimentando- se de fezes, ração e animais mortos (ALVES et al., 2005).
Howie & Thorsen (1981) relatam a existência de uma cepa de IBDV isolada de um conjunto de mosquitos Aedes Vexans presos ao sudoeste de Ontário. Apesar da cepa não produzir sinais clínicos ou lesões graves após a infecção, ela induziu altos títulos de anticorpos em galinhas inoculadas. Os autores sugeriram que a cepa isolada poderia ser útil como uma estirpe vicinal, uma vez que é apatogênica.
O IBDV também foi isolado das fezes de um cão 24 e 48 h após a ingestão de tecidos infectados com o vvIBDV. Embora o vírus recuperado nas fezes apresentasse taxa de mortalidade menor do que o vírus original, as aves sobreviventes à inoculação experimental tinham lesões claras IBD, indicando que o vírus afetou todas as galinhas inoculadas. Cães alimentados com aves mortas infectados com vvIBDV, podem desempenhar um importante papel como reservatório do vírus dentro das instalações, ou a propagação do vírus facilmente de uma galinha de quintal para o outra (PAGÈS- MANTE et al., 2004).
Patogenia
O sistema imune é responsável por conferir proteção às aves, evitando a entrada de patógenos (SHARMA et al., 2000). Estes, por não encontrarem sua entrada impedida pelas barreiras físicas ou controlados pelos mecanismos inatos de defesa, desencadeiam uma resposta imune adaptativa que será mediada principalmente pelos linfócitos T, linfócitos B e os macrófagos (GLICK, 1995; SHARMA et al., 2000). A imunidade adaptativa é altamente específica para o agente que estimula seu desenvolvimento, enquanto que a imunidade não-adaptativa ou inata é inespecífica. As células que participam da imunidade específica retêm uma "memória" de seu encontro com os patógenos mesmo depois deste ter sido eliminado do corpo e que a resposta imune detectável diminuiu (SANTIAGO et al.,1999).
As imunoglobulinas (Ig), também conhecida como anticorpos, são secretadas pelos linfócitos B, e constituem o principal componente da imunidade humoral. As aves têm três classes principais de imunoglobulinas: IgM, IgG e IgA. A IgM é encontrada na
superfície da maioria dos linfócitos B e é o primeiro anticorpo produzido depois da imunização primária. Com a evolução da resposta imune, as células produtoras de IgM passam a produzir IgG ou IgA. A IgA tem importância fundamental na indução da imunidade de mucosa. A IgG é o principal anticorpo produzido depois da imunização secundária e é a classe de Imunoglobulina predominante no sangue, também denominada de IgY quando extraída da gema de ovos. (HIGGINS & WARR, 2000).
Para proteção de aves contra desafios ou agente infeccioso, quatro tipos de imunidade são importantes. Elas são: anticorpos circulantes ou humorais, imunidade produzida localmente no trato respiratório ou intestinal, imunidade mediada por células – T e a imunidade de origem materna. Anticorpos humorais são produzidos em resposta à infecção ou pela vacinação. A imunidade mediada por células é considerada a mais importante na proteção contra os desafios, embora somente agora comecem a estar disponíveis as técnicas que possibilitam o estudo da imunidade neste sentido. Os níveis de anticorpos maternos declinam rapidamente. Em diversos locais da cabeça da galinha, a glândula de Harder (GH), glândula lacrimal (GL) e conjuntiva têm demonstrado conter elementos linfóides. Estes locais são denominados como Tecido Linfóide Associado à Cabeça (HALT) e acredita-se que eles constituem um sistema imune regional e, que quando o HALT está comprometido, a ave como um todo está potencialmente em risco (MONTGOMERY et al., 1997).
Em condições naturais, o modo de infecção mais frequente do IBDV se dá pela mucosa oral, porém as vias respiratórias e ocular também são usadas. Depois de quatro a cinco horas da entrada do vírus no organismo do animal, por células mononucleares
fagocitárias, denominadas macrófagos e células linfóides do ceco, duodeno e jejuno, bem como nas células de Kupfer do fígado (SHARMA et al., 2000). Nesses sítios podem ser observadas alterações funcionais importantes que resultarão em gastroenteropatias com eliminação de fezes aquosas e, principalmete, imunodeficiência local (ITO at al., 2001). Ao cair na corrente sanguínea, aproximadamente onze horas após a infecção, o agente viral infecta inicialmente a bursa, afetando sua morfologia e fisiologia, destruindo células linfóides nas regiões medulares e corticais foliculares (SHARMA et al., 2000). Posteriormente, uma segunda viremia ocorre e se estende aos órgãos como baço, timo e glândulas de Harder (MÜLLER et al., 2003; BERNARDINO
& LEFFER, 2009). Os antígenos virais podem ser encontrados no fígado e rim nas primeiras horas de infecção (SHARMA et al., 2000) e, na bursa, até nove dias pós- infecção (MÜLLER et al., 2003; BERNARDINO E LEFFER, 2009).
O IBDV destrói os linfócitos B e ativa outras células imunes. As aves expostas ao vírus são acometidas por uma imunodepressão transitória, mas que pode comprometer tanto a resposta humoral quanto a celular. A inibição da imunidade humoral ocorre pela destruição das células produtoras de imunoglobulinas pelo vírus. Os efeitos imunossupressivos podem atingir as aves a partir da terceira semana de idade e tende a desenvolver uma perda parcial ou permanente das funções do sistema imune, levando a diminuição do desempenho destas aves e danos para sua saúde (ITO et al., 2001;
MARTINS et al., 2005)
A doença pode apresentar a forma clínica ou aguda, com mortalidade variável, e a forma subclínica, sem mortalidade (ITO et al., 2001; SANTOS et al., 2004). A
patogênese e a resposta imune causada pelo IBDV podem variar dependendo da idade da ave infectada (RAUTENSCHLEIN et al., 2007). Aves a partir da terceira semana de idade são mais sensíveis à doença clínica e aves com menos de três semanas de idade são acometidas da doença subclínica com grave imunossupressão (ITO et al., 2001;
SANTOS et al., 2004; RAUTENSCHLEIN et al., 2007). O período de incubação da doença é muito curto e os sinais clínicos são vistos entre dois a três dias após infecção (ITO et al., 2001; SANTOS et al., 2004).
De acordo com Müller et al. (2003), o resultado de uma infecção pelo IBDV depende geralmente da cepa, da quantidade de vírus infectante, da idade e da raça da galinha, da rota de inoculação e da presença ou ausência de anticorpos neutralizantes. Como consequência da alta taxa de mutação e variabilidade genética, as diferentes cepas do IBDV apresentam disparidade em relação às propriedades antigênicas e patogênicas.
Sinais Clínicos e Lesões
Os sinais clínicos ocorrem em 10 a 20% das aves infectadas (MORAES et al., 2005) e estão associados à doença aguda ou clínica e incluem anorexia, depressão, penas arrepiadas, tremores, diminuição ingestão de água, desidratação, prostração, diarréia com fezes de tonalidade esbranquiçada ou consistência aquosa, apresentando cloaca suja e mortalidade variável (DI FÁBIO et al., 1999; SHARMA et al., 2000; BOLIS et al., 2003; BANDA & VILLEGAS, 2004).
As lesões mais típicas dessa doença, nos três primeiros dias após a infecção são edema e aumento de tamanho da bursa de Fabrícius, que é o órgão alvo do vírus, com ou sem deposição de material gelatinoso na superfície da serosa e às vezes hemorrágica.
Existem cepas que causam severas hemorragias na bursa de Fabrícius. No período subsequente, o edema desaparece e a bursa atrofia. As alterações da mesma sempre estão presentes, independente de as aves apresentarem infecção clínica ou subclínica.
Na necropsia são evidenciadas hemorragias no tecido subcutâneo e, principalmente, nos músculos das regiões das sobrecoxas e da coxas (NAGARAJAN & KIBENGE, 1997;
TESSARI et al., 2000; VAN DEN BERG, 2000; SANTOS et al., 2004). Lesões hemorrágicas também estão presentes na porção glandular do proventrículo (STOUTE et al., 2009). O baço encontra-se aumentado de volume e os intestinos mostram-se com a mucosa espessa e com grande quantidade de muco. Os rins apresentam-se congestos, aumentados de volume e com presença de uratos (TESSARI et al., 2000; SANTOS et al., 2004).
A evolução das lesões microscópicas na bursa de Fabrícius se dá da seguinte maneira:
no primeiro dia pós-infecção pode ser observada degeneração de células linfóides, início de afluxo de heterófilos e/ou células mononucleares e hiperemia. A partir do segundo ao terceiro dia, visualiza-se necrose folicular com acúmulo significativo de células inflamatórias, exsudato plasmático e, às vezes hemorragias. De modo geral, a atrofia folicular começa no ápice da cripta e a partir de quatro dias em diante, verifica- se atrofia folicular com depleção linfóide e formação de cavidade cística, mais evidente quando da infecção com o vírus mais patogênico (DI FÁBIO et al., 1999). Em outros órgãos, há predomínio de alterações no período de dois a três dias pós-infecção e são mais severos com vírus mais patogênicos. No baço, pode ser visualizada necrose de
bainha perarteriolar e ou acúmulo de células mononucleares na zona marginal e ou infiltrado de heterófilo. No timo, observa-se linfocitólise e atrofia cortical. Na tonsila cecal encontra-se infiltração aguda e predominante de heterófilos e linfocitólise. Já na glândula de Harder, ocorre degeneração de plasmócitos e aumento de células mesenquiais e fibroblastos. No rim aparecem aumentados e pálidos ou esbranquiçados, observa-se também necrose tubular, nefrite e nefrose devido à desidratação. No fígado nota-se degeneração de células de Kupffer (BOLIS et al., 2003).
As lesões post-mortem observadas incluem atrofia da bursa, desidratação e coloração enegrecida dos músculos peitorais, ambas frequentemente associadas com hemorragias na coxa. As aves que sobrevivem à fase aguda da doença eliminam o vírus e se recuperam dos sinais clínicos. A inibição da função das células B e T causada pela IBDV também é superada, e a bursa de Fabrício é recuperada (SHARMA et al., 2000).
Na forma subclínica, os sinais clínicos são moderados, manifestando com quadro de retardo de crescimento, palidez de crista e barbela, sonolência discreta ou redução da atividade geral. Devido a imunossupressão, as aves tornam-se mais susceptíveis a outras infecções como: colibacilose, coccidiose, dermatite gangrenosa e doença de Marek. As respostas vacinais também podem ser comprometidas devido à diminuição dos títulos de anticorpos (SHARMA et al., 2000).
As cepas clássicas são caracterizadas pela indução de depressão, anorexia, penas arrepiadas, tremores, diarréia esbranquiçada e aquosa, prostração e morte. Essas cepas
também induzem nefrite severa, bursite e atrofia da bursa (BANDA et al., 2003), resultando em imunodeficiência e mortalidade moderada (WANG et al., 2007), podendo chegar a 25% (VAN DEN BERG et al., 1991).
As cepas variantes antigênicas são mutações antigênicas da cepa clássica e possuem a habilidade de induzir imunossupressão em aves com níveis adequados de imunidade humoral. Elas causam uma rápida e severa atrofia da bursa de Fabrício, porém não produzem sinais clínicos da doença. A presença da cepa variante em poedeiras comerciais aumenta a suscetibilidade a outras doenças virais como a bronquite infecciosa, doença de Newcastle e laringotraqueíte, assim como a ocorrência de infecções oportunistas. Além disso, as aves apresentam redução no ganho de peso e, consequentemente, desuniformidade do lote (BANDA et al., 2003).
As cepas atenuadas foram geradas a partir da adaptação das cepas clássica e cepas variantes aos fibroblastos de embriões de galinha ou outras linhagens celulares, não provocam doença em galinhas e são utilizadas para produzir vacinas vivas (LIM et al., 1999).
As cepas muito virulentas podem causar dano severo na bursa de Fabrício, timo, baço e medula óssea, e são caracterizadas por alta mortalidade, que variam entre 60-100%.
Essas cepas podem romper a imunidade conferida pelos anticorpos maternos, e apesar de produzirem sinais clínicos semelhantes aos das cepas clássicas e possuírem o mesmo
período de incubação de 4 dias, a fase aguda é mais severa para as galinhas infectadas (LIM et al., 1999; WANG et al., 2007).
2.5 Diagnóstico
Para que haja controle efetivo da Doença Infecciosa Bursal em determinada área geográfica é fundamental que seja realizado o diagnóstico apropriado, uma vez que os animais acometidos podem não apresentar sinais clínicos evidentes ou característicos. O diagnóstico epidemiológico deve considerar informações a respeito de ocorrências anteriores, sinais clínicos observados, morbidade, mortalidade e idade das aves afetadas são fundamentais. A adoção rápida de medidas de controle e a redução de prejuízos depende do conhecimento da cadeia epidemiológica da doença e do estudo de todos os dados relacionados à ocorrência no plantel, avaliando as informações qualitativa e quantitativamente do ponto de vista sanitário (BERNARDINO & LEFFER, 2009).
Para o diagnóstico presuntivo são utilizadas ferramentas como a necropsia, associadas à provas laboratoriais, que são confirmatórias. O diagnóstico laboratorial pode ser direto, por meio de isolamento viral, ou indireto, com técnicas sorológicas convencionais (DI FÁBIO, 2002).
Inicialmente, o diagnóstico do IBDV era realizado pelo isolamento viral, pela precipitação em gel de ágar e pelos métodos de microscopia eletrônica que detectavam o vírus, mas não identificavam algumas de suas características antigênicas ou patogênicas. Os métodos que empregam anticorpos monoclonais foram usados para
detectar IBDV e identificar a presença dos locais antigênicos (JACKWOOD et al., 2003).
O diagnóstico sorológico é usualmente realizado através do teste de imunodifusão em ágar gel (TAKASE et al., 1993), vírus-neutralização (WEISMAN & HITCHNER, 1978) ou ELISA (HOWIE & THORSEN, 1981). A imunodifusão em ágar gel é um teste simples, mas a sensibilidade e especificidade podem variar entre laboratórios. O teste de vírus-neutralização é altamente específico porém, laborioso e demorado, requerendo estrutura laboratorial. Por isso não é utilizado na rotina de diagnóstico. O ELISA é o ensaio comumente utilizado e é sensível, específico e quantitativo. Os kits comerciais são viáveis para detectar anticorpos em amostras de soro. (JACKWOOD et al., 1996; MARTINEZ-TORRECUADRADA et al., 2000; DEY et al., 2009).
A difusão de uma substância solúvel em um meio fluido é um processo pelo qual a substância é transportada, de uma parte para outra, como resultado do movimento molecular. Para realização do teste, o ágar é colocado em placa de Petri ou lâmina de vidro. Em locais apropriados do gel são feitos orifícios em que se colocam volumes precisos de soros a serem testados, bem como soluções-padrão. O recipiente é incubado em câmara úmida até que ocorra a difusão (48 a 72 horas), sendo então determinada a área do halo de precipitação formado (FERREIRA & ÁVILA, 1996).
O ELISA é o mais notável desses testes porque foi adaptado para examinar muitas amostras em um curto intervalo de tempo (JACKWOOD et al., 2003). Desde os anos
80, o ELISA tem se tornado um método de diagnóstco de rotina fundamental para a melhoria do manejo sanitário das granjas de frangos de corte, por demonstrar a resposta imune em animais ou detectar anticorpos de maneira precoce, rápida, eficiente e econômica, possibilitando assim identificar a existência de infecção em uma granja independente da manifestação da enfermidade, observada no animal, através de sintomas e lesões (DI FÁBIO, 2001).
O teste pode ser classificado, inicialmente, em ELISA de fase sólida ou fase líquida. O ELISA de fase sólida é o teste comumente realizado em microplaca de 96 cavidades.
Ele compreende uma sequência de etapas de reação de subsequente lavagem. Em kits comerciais, o antígeno já vem fixado na placa. Inicialmente coloca-se o soro sanguíneo para teste da presença de anticorpos no soro. Os anticorpos presentes no soro fixam-se ao antígeno na placa e a seguir procede-se a lavagem e os passos de revelação da relação antígeno-anticorpo (VIDAL & RAZIA, 2001).
A sensibilidade e especificidade de um teste é essesncial para a interpretação do mesmo.
A sensibilidade mede a capacidade de um teste em detectar indivíduos com a infecção, classificados como verdadeiros positivos e, a especificidade, mede a capacidade de um teste em evitar resultados falso-positivos (ARAGON, 2007).
Independentemente do exame laboratorial solicitado é de extrema importância o envio do histórico de vacinações, pois as vacinas vivas podem causar certo grau de lesão na bursa (HOWIE & THORSEN, 1981). Na pesquisa de lesão através da histopatologia,
deve-se coletar bursa fechada, rins, proventrículo, fígado, baço e conservá-los em formalina a 10 % (JACKWOOD & SOMMER, 2002). Para realização de provas sorológicas deverão ser remetidos soros de no mínimo 20 aves do lote para realização principalmente de ELISA e os soros devem ser límpidos e congelados a – 20 0C até a realização do teste (HOWIE & THORSEN, 1981).
Os métodos de tipificação convencional incluem a vírus-neutralização (VN) e ensaio imunoenzimático de captura do antígeno com anticorpos monoclonais (AC-ELISA).
Para a realização do teste de VN, as cepas de campo devem ser adaptadas a desenvolver-se in vitro, porém, a maioria das cepas isoladas é difícil de adaptar ao crescimento; além disso, as características antigênicas e patogênicas do vírus podem ser modificadas durante os procedimentos de adaptação (BANDA et al., 2003). Além de consumir muito tempo, a VN é um teste caro e requer replicação da cepa utilizada em cultura de células SPF (JACKWOOD, 2004). O uso de técnicas moleculares cresceu rapidamente devido à rapidez, exatidão, e versatilidade do AC-ELISA, bem como as possíveis correlações com as propriedades antigênicas das cepas do IBDV. Os métodos baseados em ácidos nucléicos são ferramentas úteis para detecção viral porque o vírus pode ser detectado e tipificado sem o isolamento e propagação em culturas de células ou ovos embrionados.
Estudos genômicos permitem analisar as mutações no cromossomo que ocorrem naturalmente ou através de atenuações dos vírus de campo. Estes estudos permitem estimar a virulência e antigenicidade dos diferentes vírus e avaliar a evolução dos diferentes IBDVs (ITO et al., 2001).
Após o desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase (PCR), testes diagnósticos baseados nessa tecnologia foram criadas para o IBDV (JACKWOOD et al., 2003). A PCR aliada à digestão por enzimas de restrição (RFLP) serve para identificar e avaliar amostras de diferentes graus de patogenicidade, além de diferenciar isolados de campos e vacinais (JACKWOOD & SOMMER, 2002; BANDA et al., 2003). Embora este teste identifique somente um número relativamente pequeno dos nucleotídeos, é um teste rápido e pode ser usado para testar um grande número de amostras para uma sequência específica ou para uma mutação dentro dessa sequência. (JACKWOOD et al., 2003).
Através da análise dos resíduos de aminoácidos, foi possível reconhecer 13 padrões distintos de vírus da doença infecciosa bursal, sorotipo 1. As vacinas comerciais são classificadas em grupos 3, 4, 5, 6 e 9. Já os vírus de campo são classificados em grupos 7, 11, 14, 15, 16 e 17. A maioria dos vírus de campo do Brasil são classificados nos grupos 15 e 16 (ITO et al., 2001).
Para prova de PCR devem ser coletadas bursas de Fabrícius de cinco a oito aves acometidas, que devem ser congeladas para melhor conservação (JACKWOOD &
SOMMER, 2002).
Algumas lesões e sinais clínicos semelhantes à aqueles induzidos pelo IBDV podem ser encontrados em várias outras doenças, portanto é necessário considerar o diagnóstico diferencial para algumas enfermidades (BOLIS et al., 2003). Clinicamente a IBD confunde-se com a coccidiose, devido à prostação e penas arrepiadas e, à doença de
Newcastle, devido a mortalidade. Quadros de nefrite/nefrose devem ser diferenciados da Bronquite Infecciosa e, lesões no proventrículo devem ser diferenciados da Doença de Newcastle e Anemia Infecciosa. Deve ser feito diagnóstico diferencial no quadro de atrofia da bursa para a Doença de Marek (ITO et al., 2001; BOLIS et al., 2003).
2.6. Prevenção e Controle
Medidas gerais de prevenção e controle
Devido à alta resistência do IBDV às condições ambientais e à sua distribuição global, medidas de biosseguridade associadas à vacinação são essenciais para o controle e prevenção da IBD, que têm sido um dos grandes desafios da avicultura mundial (DIAS, 2007).
Em produção de aves, o programa de biosseguridade requer o desenvolvimento e implementação de um conjunto de políticas e normas operacionais eficazes que terão a função de proteger as aves contra a introdução de qualquer tipo de agentes infecciosos, tais como vírus, bactérias, fungos e/ou parasitas (SESTI, 2005).
Programas de biosseguridade são compostos por várias etapas de manejo e têm como objetivo a redução da introdução de microrganismos patogênicos, responsáveis pelos riscos de enfermidade aguda ou crônica em plantéis de frango de corte (ANDREOTTI
& GUIMARÃES, 2003). De acordo com SESTI (2005), a implantação de bons programas de biosseguridade inicia-se na elaboração de ações de controle a serem estabelecidas e seguidas nas normas específicas e findam na sua aplicação prática no
campo e nas atividades diárias. Antes da elaboração e implantação de qualquer programa de biosseguridade, é necessário que seja realizada uma análise e definição dos riscos e desafios aos quais o sistema de produção está sujeito.
No entanto, para o êxito de um programa de biosseguridade na prevenção e controle das doenças aviárias nas granjas, é necessária uma ação de educação continuada, envolvendo a participação de todas as pessoas que atuam na produção, por intermédio da orientação técnica aos funcionários e a confiança dos empresários (SESTI, 2005).
Para estabelecer um programa de controle é importante caracterizar as propriedades antigênicas e virulentas das cepas prevalentes em determinada área geográfica. Depois é necessário desenvolver métodos rápidos e acurados para tipificar as diferentes cepas de IBDV (BANDA et al., 2003).
Medidas específicas de prevenção e controle
O IBDV é altamente infeccioso e muito resistente e, por isso, a vacinação torna-se indispensável para proteger as galinhas, pois existe elevada pressão da infecção durante a primeira semana vida (MÜLLER et al., 2003). A imunização é o principal método utilizado para o controle da IBD em frangos, porque as aves infectadas montam uma resposta imunológica vigorosa, e acredita-se que esta resposta de anticorpos desempenha um importante papel na defesa contra a doença (RAUTENSCHLEIN et al., 2003; WANG et al., 2008). A estratégia de controle contra o IBDV em galinhas consiste em hiperimunizar matrizes para que possam ser transmitidos altos níveis de anticorpos
