ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM FOLHAS DE Eugenia uniflora L.

(1)

Universidade Federal de Goiás Instituto de Química

ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM FOLHAS DE Eugenia uniflora L.

Aluna: Ariadne Gomes Carvalho Professora Dra. Suzana da Costa Santos

Goiânia 2013

(2)

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou down- load, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [x] Dissertação [ ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação

Autor (a): Ariadne Gomes Carvalho

E-mail: ariadnegcarvalho@hotmail.com

Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [x]Sim [ ] Não Vínculo empregatício do autor Servidor público federal

Agência de fomento: Capes Sigla:

País: Brasil UF: CNPJ:

Título: Isolamento e identificação de compostos fenólicos em folhas de Eugenia uniflora L.

Palavras-chave: Compostos fenólicos, Eugenia uniflora L., pitangueira

Título em outra língua: Isolation and identification of phenolic compounds in Eugenia uniflora L.

leaves

Palavras-chave em outra língua: Phenolic compounds, Eugenia uniflora L., pitanga tree

Área de concentração: Química

Data defesa: (dd/mm/aaaa) 19/07/2013

Programa de Pós-Graduação: Química

Orientador (a): Suzana da Costa Santos

E-mail: suzana.quimica.ufg@hotmail.com Co-orientador

(a):*

E-mail:

*Necessita do CPF quando não constar no SisPG

3. Informações de acesso ao documento:

Concorda com a liberação total do documento [ x ] SIM [ ] NÃO¹

Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o en- vio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação.

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________________________________________ Data: ____ / ____ / _____

Assinatura do (a) autor (a)

1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo.

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ii Universidade Federal de Goiás

Instituto de Química

ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM FOLHAS DE Eugenia uniflora L.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Química do Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás, como exigência parcial para a obtenção do título de Mestre em Química.

Área de Concentração: Química de Produtos Naturais

Orientadora: Prof^a. Dr^a. Suzana da Costa Santos

Goiânia 2013

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iii Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Bibliotecária responsável Ítala Moreira Alves CRB 1/2772 C331i Carvalho, Ariadne Gomes

Isolamento e identificação de compostos fenólicos em folhas de Eugenia uniflora L. / Ariadne Gomes Carvalho. -- Goiânia, 2013.

xv, 44 f. : il., figs., tabs.

Orientador: Profª. Drª. Suzana da Costa Santos.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás, Instituto de Química, Programa de Pós-graduação em Química, Goiânia, 2013.

Inclui bibliografia.

1. Compostos fenólicos. 2. Eugenia uniflora L. 3. Pitangueira. I. Título.

CDU: 547.565(043.3)

(5)

iv

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v AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer, primeiramente aos meus pais. Sebastião e Conceição, sem os quais eu nada teria e nada seria. Que me ensinaram a ter valores, a ser uma boa pessoa, lutar pelos meus sonhos e jamais passar por cima de ninguém para obter o que desejo.

À professora Suzana, que tanto me ensinou e contribuiu para minha formação como pessoa e pesquisadora. Cujos ensinamentos jamais me abandonarão, que se fixou como um modelo de organização, de professora, pesquisadora e de mãe presente que pretendo seguir. Pela paciência, compreensão e dedicação que sempre demonstrou.

À colega Gilmara, que ao longo deste tempo tornou-se mais que uma colega de laboratório e sim uma amiga. Que me auxiliou em diversos momentos dessa jornada, na qual ambas encontramos um apoio mútuo nos momentos difíceis em que nos encontrávamos. Às demais alunas Denise Oliveira Guimarães, Fabiana Fernandes Ferreira de Godoi, Sara Santiago Naves e Géssica Adriana Vasconcelos que contribuíram para a realização deste trabalho.

Aos meus demais amigos que fiz e cultivei durante estes anos, que tornaram meus dias pesados e difíceis mais leves e suportáveis. Pessoas maravilhosas que pretendo manter por perto pelo resto de minha vida, pois fazem meus dias mais felizes, desejam o melhor para mim (e a recíproca é verdadeira) e o simples pensamento de encontra- las é acompanhado de um sorriso em meu rosto.

Às minhas amadas irmãs que são minhas primeiras e melhores amigas, minhas confidentes, meu porto-seguro e um pedaço de mim.

Aos demais professores que contribuíram para minha formação.

À CAPES pelo apoio financeiro.

Ao IQ-UFG pela formação.

(7)

vi SUMÁRIO

Página

Lista de Figuras v

Lista de Tabelas vii

Lista de Figuras no Apêndice viii

Lista de Abreviaturas x

Resumo xi

Abstract xii

1. Introdução 1

1.1. Eugenia uniflora (Pitangueira) 1

1.2. Compostos fenólicos 3

1.3.Espectroscopia de RMN com variação de temperatura 5

1.4. Atividade biológica da Eugenia uniflora 6

2. Objetivos 8

3. Materiais e Métodos 8

3.1. Material botânico e preparação do extrato bruto 8

3.2. Fracionamento por partição entre solventes 9

3.3. Fracionamento e isolamento por cromatografia em coluna 9

3.3.1. Fração solúvel em metanol 9

3.3.2. Fração solúvel em acetato de etila 10

3.4. Análise espectroscópica dos compostos puros 11

4. Resultados e Discussão 12

4.1. 2,3-di-O-galoil-β–glicose 12

4.2. 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glicose 14

4.3. Gemin D 15

4.4. Hippomanina A 17

4.5. Oenoteína B 20

4.6. Eugeniflorina D2 24

4.7. Camptotina A 26

4.8. Canferol-3-O-α-L-ramnopiranosídeo 30

4.9. Quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo 32

4.10. Miricetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo 33

4.11. Miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-L-ramnopiranosídeo 35

5. Considerações finais 37

6 Referências bibliográficas 37

7. Apêndices 44

(8)

vii LISTA DE FIGURAS

Página Figura 1 Pitangueira adulta, flores e frutos com diferentes colorações. 2 Figura 2 Exemplos de taninos hidrolisáveis e seus grupos fenólicos. 4

Figura 3 Estrutura básica dos flavonóides. 5

Figura 4 Esquema de obtenção do extrato liofilizado. 8

Figura 5 Esquema de partição entre solventes do extrato liofilizado. 9 Figura 6 Esquema do fracionamento da fração solúvel em metanol. 10 Figura 7 Esquema do fracionamento da fração solúvel em acetato de etila. 11 Figura 8 Espectro de RMN ¹H do éster galoílico 2,3-di-O-galoil-β-glicose. 13 Figura 9 Espectro de COSY do éster galoílico 2,3-di-O-galoil-β-D-glicose. 13 Figura 10 Espectro de RMN ¹H do éster 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glicose. 15

Figura 11 Espectro de RMN ¹H do elagitanino gemin D. 16

Figura 12 Espectro de COSY do elagitanino gemin D. 17

Figura 13 Espectro de RMN ¹H da mistura de gemin D (G) e hippomanina A (H). 18 Figura 14 Espectro de HSQC da mistura de gemin D e hippomanina A. 18 Figura 15 Espectro de COSY da mistura de gemin D e hippomanina A. 19 Figura 16 Estrutura do dímero macrocíclico oenoteína B(a) e tellimagrandina I(b). 20 Figura 17 Espectros de RMN ¹H do dímero oenoteína B em três temperaturas. 21 Figura 18 Correlações do espectro de HMBC do elagitanino oenoteína B. 23 Figura 19 Estrutura do elagitanino dimérico eugeniflorina D2. 24 Figura 20 Espectro de RMN ¹H do dímero eugeniflorina D2 a 38^oC. 25 Figura 21 Estrutura do dímero camptotina A e suas subunidades. 27

Figura 22 Espectro de RMN ¹H da camptotina A. 27

Figura 23 Espectro de COSY do dímero camptotina A. 28

Figura 24 Espectro de HMBC do dímero camptotina A. 28

Figura 25 Estrutura inicial (1) e estrutura revisada (2) da camptotina A. 30

(9)

viii Figura 26 Estrutura do flavonóide canferol-3-O-α-L-ramnopiranosídeo. 30 Figura 27 Espectro de RMN ¹Hdo flavonóide canferol-3-O-α-L-ramnopiranosídeo. 31 Figura 28 Estrutura do flavonóide quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo. 32 Figura 29 Espectro de RMN ¹H do flavonóide quercetina-3-O-α-L-

ramnopiranosídeo com expansões.

32

Figura 30 Estrutura do flavonóide miricetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo. 33 Figura 31 Espectro de RMN ¹H da miricetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeocom

expansões.

34

Figura 32 Estrutura do flavonóide miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-L- ramnopiranosídeo.

35

Figura 33 Espectro de RMN ¹H do flavonóide miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-L- ramnopiranosídeocom expansões.

36

(10)

ix LISTA DE TABELAS

Página Tabela 1 Dados de RMN ¹H do éster galoílico 2,3-di-O-galoil-β-D-glicose. 14

Tabela 2 Dados de RMN ¹H e ¹³C do éster galoílico 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β- D-glicose.

15

Tabela 3 Dados de RMN ¹H e ¹³C do elagitanino gemin D. 17

Tabela 4 Dados de RMN ¹H e ¹³C do elagitanino hippomanina A. 19

Tabela 5 Dados de RMN ¹H e ¹³C do elagitanino oenoteína B (acetona-d6 + D2O, – 20 ^oC).

22

Tabela 6 Dados de RMN ¹H e ¹³C do elagitanino eugeniflorina D2 (acetona-d6

+ D2O).

26

Tabela 7 Dados de RMN ¹H e ¹³C do elagitanino camptotina A (acetona-d6 + D2O).

29

Tabela 8 Dados de RMN ¹H e ¹³C do flavonóide canferol-3-O-α-L- ramnopiranosídeo.

31

Tabela 9 Dados de RMN ¹H e ¹³C do flavonóide quercetina-3-O-α-L- ramnopiranosídeo.

33

Tabela 10 Dados de RMN ¹H e ¹³C do flavonóide miricetina-3-O-α-L- ramnopiranosídeo.

34

Tabela 11 Dados de RMN ¹H e ¹³C do flavonóide miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α- L-ramnopiranosídeo.

36

(11)

x LISTA DE FIGURAS NO APÊNDICE

Página

7.1. 2,3-di-O-galoil-β–glicose ⁴⁴

7.1.1. Espectro de massa 44

7.1.2. Espectro UV 44

7.2. 1,2,3,4,6-Penta-O-galoil-β-D-glicose ⁴⁵

7.2.2. Espectro RMN COSY 45

7.2.3. Espectro UV ⁴⁶

7.3 Gemin D ⁴⁶

7.3.2. Espectro RMN HSQC 47

7.4. Hippomanina A ⁴⁸

7.4.2. Espectro de RMN HMBC 48

7.5. Oenoteína B ⁴⁹

7.5.2. Espectro de RMN HSQC a -20ºC 49

7.5.3. Espectro de RMN HMBC a -20ºC 50

7.6. Eugeniflorina D2 ⁵¹

7.6.2. Espectro de RMN COSY a 38ºC 52

7.6.3. Espectro de RMN HSQC a 38ºC 52

7.6.4. Espectro de RMN HMBC a 38ºC 53

7.6.5. Espectro de UV 53

(12)

xi

7.7. Camptotina A ⁵⁴

7.7.2. Espectro RMN HSQC 55

7.8. Canferol-3-O-α-L-ramnopiranosídeo ⁵⁵

7.8.1. Espectro de RMN COSY 55

7.8.2. Espectro de RMN HSQC 56

7.9. Quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo ⁵⁶

7.10. Miricetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo ⁵⁷

7.11. Miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-L-ramnopiranosídeo ⁵⁹

(13)

xii LISTA DE ABREVIATURAS

HHDF Hexahidroxidifenila.

NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato.

RMN Ressonância Magnética Nuclear.

ROS Espécies Reativas de Oxigênio.

UV Ultravioleta.

COSY Espectroscopia de Correlação.

HSQC Espectroscopia de coerência heteronuclear de único quantum.

HMBC Espectroscopia de correlação de múltipla ligação heteronuclear.

HSV-2 Vírus da Herpes Simples tipo 2.

HSV-1 Vírus da Herpes Simples tipo 1.

DPPH Difenil-picril-hidrazila.

(14)

xiii RESUMO

Eugenia uniflora L., conhecida como pitangueira, é uma espécie amplamente distribuída no Brasil, onde suas folhas são usadas na medicina popular no tratamento de diarréia, febre, inflamação, hiperglicemia e hipertensão. Comprovou-se que muitas das suas atividades farmacológicas se devem aos compostos fenólicos presentes em suas folhas. A fim de isolar e identificar as substâncias fenólicas desta espécie realizou-se extração de suas folhas secas e moídas com uma mistura de acetona e água (1:1).Após a extração a acetona foi removida em rotaevaporador e o extrato aquoso foi particionado com acetato de etila. A fase aquosa foi liofilizada e parcialmente solubilizada em metanol. As frações acetato de etila e solúvel em metanol foram submetidas à cromatografia em coluna com Diaion HP-20 e Sephadex LH-20 como adsorventes. As substâncias isoladas foram caracterizadas por espectroscopia de RMN de ¹H e ¹³C (uni e bidimensional, com variação de temperatura) e massas.A técnica utilizada de espectroscopia com variação de temperatura mostrou-se extremamente promissora para identificação de compostos macrocíclicos, fornecendo dados precisos para elucidação e correção de assinalamentos já previamente descritos.Foram identificados dois ésteres galoílicos: 2,3-di-O-galoil-β-D-glicose (26 mg) e 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glicose (92 mg), dois elagitaninos monoméricos: 3- O-galoil-4,6-HHDF-β-D-glicose (540 mg) e 2-O-galoil-4,6-HHDF-β-D-glicose (20 mg) e três elagitaninos diméricos: oenoteína B (770 mg), eugeniflorina D2 (260 mg) e camptotina A (56 mg). Além dos taninos hidrolisáveis também foram isolados e identificados quatro flavonóides: quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (114 mg), canferol-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (80 mg), miricetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (32 mg) e miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-L-ramnopiranosídeo (97 mg). Pela primeira vez foram encontrados nesta espécie os compostos 2,3-di-O-galoil-β-D-glicose, 1,2,3,4,6- penta-O-galoil-β-D-glicose, 3-O-galoil-4,6-HHDF-β-D-glicose, 2-O-galoil-4,6-HHDF-β-D- glicose, camptotina A,canferol-3-O-α-L-ramnopiranosídeo e a miricetina-3-O-(2"-O- galoil)-α-L-ramnopiranosídeo. Através da metodologia utilizada foi possível isolar e identificar onze compostos polifenólicos, que serão posteriormente testados em diversos ensaios biológicos.

(15)

xiv ABSTRACT

Eugenia uniflora L., known as pitangueira, is widely distrubuted in Brazil; its leaves are used in popular medicine as a treatment for diarrhea, fever, inflamation, hyperglycemia and hypertension. The pharmacological activities are due mainly to the phenolic compounds present in its leaves; therefore the aim of this work was to isolate these compounds. Powdered air-dried leaves were homogenized in 50% aqueous acetone. The filtrate was concentrated and extracted with ethyl acetate, yielding AcOEt fraction. The aqueous layer was lyophilized and after that dissolved in methanol to separate the soluble and the insoluble methanolic fractions. The ethyl acetate and methanol soluble fractions were subjected to repeated column chromatography over Diaion HP-20 and Sephadex LH-20. Isolated compounds were analyzed by NMR H¹, C¹³, COSY, HSQC and HMBC (with variable temperature) and mass spectroscopy. The applied technique of temperature variation spectroscopy has proved to be extremely promising for identification of macrocyclic compounds, providing accurate data for not only elucidation but correction of previously described assignments. Two galloyl esters:

2,3-di-O-galloyl-β-D-glucose (26 mg), 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose (92 mg) and two monomeric ellagitannins: 3-O-galloyl-4,6-HHDP-β-D-glucose (540 mg) and2-O- galloyl-4,6-HHDP-β-D-glucose (20 mg) were obtained. The methanol soluble fraction furnished three dimeric ellagitannins: oenothein B (770 mg), eugeniflorinD2 (260 mg) and camptothin A (56 mg). In addition to hydrolysable tannins, four flavonoids were also isolated and identified: quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (114 mg), kaempferol-3-O- α-L-rhamnopyranoside (80 mg), myricetin-3-O-α-L-rhamno-pyranoside(32 mg) and myricetin-3-O-(2"-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside (97 mg).For the first time in this specie the following compounds were found 2,3-di-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,3,4,6- penta-O-galloyl-β-D-glucose, 3-O-galloyl-4,6-HHDP-β-D-glucose, 2-O-galloyl-4,6- HHDP-β-D-glucose, camptothin A, kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside, and myricetin-3-O-(2"-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside. The methodology applied in this work allowed the isolation and identification of eleven phenolic compounds, in the near future they will be tested in several biological assays.

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1. INTRODUÇÃO

O reino vegetal constitui uma fonte de novos compostos químicos que podem ser importantes devido a seu potencial uso na medicina ou mesmo por outras propriedades biológicas (Alice et al.,1991). O interesse crescente em produtos naturais obtidos de plantas brasileiras é responsável pelo amplo crescimento da pesquisa na área, fato ilustrado por este estudo que relata o isolamento e identificação de substâncias nunca previamente encontradas na espécie.

Os primeiros tratamentos médicos foram realizados com plantas medicinais e somente depois as ciências farmacêuticas desenvolveram remédios a partir destas fontes vegetais. As plantas em florestas remotas são uns dos melhores recursos naturais e sem dúvida possuem compostos com potencial medicinal. Praticantes leigos em medicina ainda usam ervas em locais isolados onde médicos treinados não se encontram disponíveis e contam somente com a experiência passada por gerações através do senso comum (Havsteen, 2002).

A Eugenia unifloraconhecida como “pitangueira” ou “ñangapirí” foi introduzida na medicina empírica pelos índios Guaranis no século XV, sendo sua dose terapêutica de 0,7 – 1,5 g de folhas secas ou frescas por litro de água fervente, ingerida por dia (Alonso, 1998). A partir do século XIX, a química orgânica começou a se desenvolver juntamente com os estudos que resultaram no isolamento de princípios ativos de plantas medicinais. Desde então, o interesse por essas plantas se espalhou e rendeu diversos princípios ativos muito utilizados até os dias de hoje como a morfinae a cânfora (Wheelwright, 1974). É de origem vegetal o suprimento de substâncias mais úteis para tratamento de diversas doenças humanas.

1.1.Eugenia uniflora (Pitangueira)

A pitanga ou pitanga-vermelha tem seu nome derivado do tupi: pi’tãg, que significa vermelho-rubro, representando a cor de seu fruto, que se apresenta nas cores:vermelha, amarelo-alaranjada e roxa; podendo ser quase preta. Sua árvore é comumente conhecida como pitangueira (Figura 1). No Paraguai e na Argentina é conhecida como Ñangapirí e foi objeto de diversos estudos nas décadas de 70 e 80.

Pertence à ordem Myrtales, família Myrtaceae, cuja espécie é Eugenia unifloraL.

(Lorenzi, 1998). A família Myrtaceae é composta por mais de 100 gêneros e 3600

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2 espécies de arbustos e árvores verdes, encontradas na Austrália, no Leste Asiático e nas Américas (Auricchio e Bacchi, 2003).

O gênero Eugenia está bem representado nas diversas formações vegetais do Brasil, assim como em toda a América tropical e subtropical. São relatadas mais de 500 espécies deste gênero, apresentando-se como arbustos ou árvores de morfologia bastante variada. Isso demonstra não apenas sua riqueza específica, mas também sua abundância e a frequência de suas espécies (Braga, 1985).

A pitangueira pode ser tanto um arbusto denso de 2 a 4 m de altura como, mais raramente, uma pequena árvore de 6 a 9 m. As variações climáticas determinam as épocas de florescimento e frutificação, que pode ocorrer duas ou mais vezes durante o ano. O fruto em processo de maturação sofre uma mudança de verde para amarelo- alaranjado, vermelho ou roxo em seu epicarpo. O sabor é doce ácido e o aroma intenso e característico (Lorenzi, 1998).

Figura 1. Pitangueira adulta, flores e frutos com diferentes colorações.

E. uniflora é nativa das regiões sul e sudeste do Brasil, porém é encontrada em todo o território devido à sua boa adaptação ao clima (Celli et al., 2011). Essa capacidade de adaptação permite seu cultivo em diversos lugares do mundo, tais como: América Central, América do Sul, Califórnia, Flórida, Havaí, Holanda, França, China, Tunísia, Algeria e Sri-Lanka (Gomes, 2007).

A pitangueira é bastante cultivada no Brasil para fim de consumo do fruto fresco ou para produção de sucos, sorvetes ou geléias (Celli et al., 2011). O óleo essencial de suas folhas é utilizado pela indústria cosmética devido a sua propriedade adstringente associada ao seu cheiro agradável.Contudo suas folhas apresentam interesse medicinal uma vez que são usadas em infusões ou decoctospara tratamentos de

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3 problemas digestivos (Henriques et al., 1993),e também como antidiarreico, diurético, antirreumático e antipirético (Côrrea, 1984) tais propriedades a tornam bastante utilizada na medicina popular. Às folhas é também atribuída a capacidade de diminuir níveis de colesterol, controlar ácido úrico no sangue, reduzir peso e pressão arterial (Ferro et al., 1988). Além disso, o extrato de suas folhas apresentou atividade inibitória frente à xanthina oxidase, enzima que catalisa a oxidação de xanthina a hipoxanthina e finalmente a ácido úrico, fornecendo a base farmacológica para a diminuição de ácido úrico por este apresentada (Schmeda-Hirschmann et al., 1987). Por isso diversos estudos já foram realizados para verificar suas atividades biológicas, através de testesin vitro e in vivo.

A composição química da família Myrtaceae é caracterizada pela presença de taninos, flavonóides, terpenóides (Malamanet al., 2011),leucoantocianidinas, esteroides (Bandoni et al., 1972), além de mono e sesquiterpenos(Wyerstahl et al., 1988), ácidos graxos, β-pineno, limoneno, cineol, pulegonas e cânforaem seusóleos essenciais (Retamar, 1982).

As folhas de E. uniflora são ricas principalmente em taninos hidrolisáveis, flavonóides e óleos essenciais. Elagitaninos macrocíclicos como oenoteína B, eugeniflorina D1 e eugeniflorina D2 já foram isolados e identificados, juntamente com 1,2,4,6-tetra-O-galoil-β-D-glicose egalocatequina(Lee et al.,1997) em suas folhas. Os flavonóides quercetina, miricetina e miricetina-3-O-ramnopiranosídeo também tiveram sua incidência relatada nas folhas desta espécie (Schmeda-Hirschmannet al., 1995);

além destes antraquinonas (Alice et al., 1991) e diversos componentes de seu óleo essencial já foram isolados (Maia et al., 1999).

As folhas da pitangueira estão na lista de plantas medicinais autorizadas pelo Ministério da Saúde (ANVISA) para o preparo de infusões, como pode ser visto na Resolução Brasileira número 267 (2005). Identificar substâncias provenientes de produtos naturais nativos com possível utilização econômica aumenta conforme a diversidadedas espécies, deste modo cresce a possibilidade de novos fármacos serem descobertos ou mesmo modelos de estrutura para a síntese de princípios ativos para medicamentos (Guerraet al., 2003).

1.2. Compostos fenólicos

As folhas deEugenia uniflora são ricas em compostos fenólicos, majoritariamente taninos e flavonóides (Auricchioet al., 2007). Comumente, taninos são tradicionalmente

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4 classificados em dois grandes grupos, taninos hidrolisáveis e taninos condensados (Haslam, 1998), estes nomes se baseiam em sua hidrólise e condensação que ocorre na presença de ácido ou enzima.Taninos encontrados em plantas compõem uns dos principais grupos de polifenóis antioxidantes que receberam grande atenção recentemente por suas propriedades benéficas a saúde humana (Zhang et al., 2009).

O mais simples dos taninos hidrolisáveis, os galotaninos, tratam-se apenas de ésteres poligaloílicosda glicose, onde vários grupos galoíla se interligam através de ligações depsídicas (Figura 2).Ao sofrer acoplamento oxidativo, grupos galoíla vicinais dão origem ao grupo hexahidroxidifenoíla (HHDF), este sob hidrólise produz ácido elágico.Deste modo, os elagitaninos possuem este grupo em sua estrutura, como exemplo a telimagrandina II.Os gruposgaloílae hexahidroxidifenoílarepresentam a parte polifenólica nas moléculas de taninos hidrolisáveis (Haslam, 1998).

OH OH HO

O

Galoíla

O O

OH OH HO HO OH HO

Hexahidroxidifenoíla

O

HO O OH

HO HO

O O O

O O

O OH OH OH

O O OH OH

OH OH OH OH O

Tellimagrandina II

O

HO O O O OH HO HO

O O

OH OH OH

O O HO

OH HO

O O OH OH

OH

OH O

O OH

O

O OH

Galotanino

Figura 2.Exemplos de taninos hidrolisáveis e seus grupos fenólicos.

Na natureza os taninos também são encontrados como oligômeros, gerados através do acoplamento oxidativo intermolecular C-O entre unidades do grupo HHDF e galoíla de outro tanino monomérico (Yoshida et al., 2005).Estudos prévios já descreveram a presença de taninos na espécie estudada, como o 1,2,4,6-tetra-O- galoil-β-D-glicose e os elagitaninos macrocíclicos diméricos oenoteína B, eugeniflorina D1 e eugeniflorina D2 (Lee et al.,1997), a estes se atribuem diversas atividades biológicas.

Flavonóides são compostos polifenólicos biossintetizados a partir da via dochiquimato e do acetato, precursores de vários grupos de substâncias como aminoácidos alifáticos e aromáticos, terpenóides, ácidos graxos dentre outros (Mann, 1987). Essa classe possui grande variabilidade química e funcional, antocianinas e ﬂavonóis, atuam nas plantas atraindo polinizadores e disseminadores de sementes.

Além da pigmentação em frutas, ﬂores, sementes e folhas, os ﬂavonóides também têm importantes funções na sinalização entre plantas e micróbios, na fertilização de

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5 algumas espécies, na defesa como agentes antimicrobianos e na proteção contra a radiação ultravioleta (Winkel-Shirley, 2001).Eles têm sido isolados em representantes de todos os grupos maiores de plantas verdes desde algas a anginospermas.

A estrutura do flavonóide não só é importante para constituir a base de dados de taxonomia, filogenia e hibridização da planta, mas também para atribuir a atividade por ela apresentada aos devidos princípios ativos (Ternai e Markhan, 1976).Sua estrutura fundamental(Figura 3) consiste em um esqueleto difenil propano (C6C3C6), arranjados em três anéis, sendo dois anéis benzênicos substituídos (A e B) e um anel pirano (cadeia heterocíclica C) acoplado ao anel A (Di Carloet al., 1999). Os flavonóides mais encontrados em espécies vegetais são o canferol, a quercetina e a miricetina. Nesta planta,E. uniflora,já foi descrita a presença de quercetina e miricetina e seus derivados ramnosídeos quercitrina e miricitrina (Schmeda-Hirschmannet al., 1995).

O

OH O H

O R

R R

A R

B C

Figura 3.Estrutura básica dos flavonóides.

Em cerca de 30 décadas a literatura sobre flavonoides cresceu enormemente.

Mais de 1000 artigos substanciais foram publicados. Isso se deve ao fato de as tão conhecidamente plantas medicinais serem ricas nestas substancias (Havsteen, 2002).

1.3. Espectroscopia de RMN com variação de temperatura

As técnicas de ressonância magnética nuclear são de grande valia para a elucidação estrutural de substâncias bioativas, já que as informações fornecidas são suficientes para determinar com precisão a estrutura de compostos orgânicos. Apesar disso devido à sua complexidade estrutural, elagitaninos macrocíclicos, presente na E.

uniflora, não apresentam espectros de ¹H e ¹³C precisamente informativos à 20ºC, visto que são observadas duplicações de cada sinal proveniente da mistura anomérica e alargamento de diversos sinais tanto aromáticos como glicosídicos (Yoshida et al.,

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6 1992). Este efeito é causado pela restrição rotacional causada pela ligação éter entre os grupos valoneoíla, devido a isto a interconversão entre seus confôrmeros é lenta.

Como os espectros de RMN não fornecem, à temperatura ambiente, informações suficientes para elucidação estrutural utilizaram-se de técnicas alternativas para obtê-la. Foi adotado o aumento de temperatura para 38ºC e 50ºC (Yoshida et al., 1992) a fim de melhorar a definição de cada sinal, contudo a resolução completa do espectro não foi obtida, não sendo possível identificar todos os hidrogênios aromáticos.

A metilação de todos os grupos hidroxi também foi utilizada, porém a resolução de todos os sinais não foi completamente obtida.

A oenoteína B, composto majoritário isolado neste estudo é um elagitanino macrocíclico com estrutura dimérica cujo espectro de RMN apresenta esta problemática. Para que os espectros de RMN apresentassem sinais bem definidos utilizou-se pela primeira vez abaixamento de temperatura para este tipo de dímero macrocíclico. Neste procedimento os sinais tornaram-se definidos na temperatura de – 20 ^oC, o que possibilitou a revisão dos deslocamentos químicos previamente assinalados para este composto.

1.4.Atividades biológicas da E. uniflora

Folhas de E. uniflora têm sido utilizadasna medicina popular na forma de infusão para o tratamento de pressão alta, reumatismoe também em distúrbios estomacais (Almeidaet al., 1995). Dentre as atividades já comprovadas para esta espécie podem- se citar: atividade diurética e anti-inflamatória (Schapoval et al., 1994), hipotensora (Consolini et al., 1999), antidiarreica (Gbolade et al.,1996), hipotérmica e antiespasmódica (Amorim et al., 2009), além de bactericida e citotóxica (Bouzada et al., 2009).

Foi também possível comprovar a atividade antioxidante do extrato metanólico das folhas de E.uniflora a partir do ensaio com microssomos hepáticos, peroxidação lipídica, induzida por Fe²⁺/ascorbato e por CCl4/NADPH. A atividade ocorre via redução do radical 2,2-difenil-1-picrilidazil e geração do radical superóxido (Velásquezet al., 2003).

Os estudos com espécies reativas de oxigênio (ROS) tem sido um corpo crescente de pesquisa em biologia e medicina. Estas espécies reativas são subprodutos da respiração celular e causam oxidação de lipídios, ácidos nucleicos e proteínas. Além disso, estes danos podem vir a causar doenças inflamatórias e

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7 neurodegenerativas. As células possuem sofisticados sistemas regulatórios para manter o balanço de ROS, entretanto desequilíbrios na homeostase podem gerar estresse oxidativo e causar dano celular(Bakkali et al., 2008). Acredita-se que antioxidantes exógenos possam ser empregados para melhorar ou amenizar situações em que dano oxidativo está envolvido (Halliwell et al., 1995).

Nos sistemas biológicos, os antioxidantes são de grande importância na prevenção de doenças do organismo, já que eles inibem o início e a propagação das reações oxidantes em cadeia, que são responsáveis pela criação de espécies oxigenadas altamente reativas (ROS), dessa forma prevenindo o desenvolvimento e reduzindo o risco de doenças degenerativas, diabetes, doenças coronárias e câncer (Diaz-Reinoso et al., 2006). Estes polifenóis antioxidantes encontrados em plantas recebem atenção crescente devido às suas diversas atividades quesão benéficas à saúde humana. Como cada uma dessas doenças é associada à acumulação de dano celular por longos períodos devido ao estresse oxidativo, acredita-se que a atividadeantioxidante e o seqüestro de radicais livres pelos polifenóis constituam a base dessas ações benéficas em seres humanos (Yoshidaet al., 2005). Além disso antioxidantes naturais estão em alta demanda não só como bio-fármacos, mas aditivos de comida e cosméticos anti-idade (Ozen et al., 2011).

Aos compostos fenólicos presentes na Eugenia uniflora atribui-se a atividade moderada apresentada por seu extrato contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli (Holetz, 2002). Estudos recentes sugerem que E. uniflora, dentre outras espécies da família Myrtaceae, apresenta promissora atividade tripanocida frente aovetor da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, além de baixa atividade citotóxica in vitro, fatores importantes que precedem testes in vivo para avaliação de uma nova droga (Santoset al., 2012). O extrato etanólico da E. unifloraapresentou também uma relevante atividade leishmanicida, inibindo 65% do crescimento da cepa testada a uma concentração de 100 µg/ml. Sendo este o primeiro relato da atividade do extrato desta planta frente ao Leishmania brasiliensis (Santos et al., 2013).

Devido às várias atividades biológicas apresentadas por esta espécie, ainda se fazem necessários mais investigações farmacológicas com seu extrato e identificação das substâncias isoladas nesta planta.

2. OBJETIVOS

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8 Este trabalho teve como objetivo isolar os principais compostos fenólicos presentes nas folhas de Eugenia uniflora para posterior uso como padrões em ensaios biológicos.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1.Material botânico e preparação do extrato bruto

As folhas de E. uniflora(1,0 kg) foram coletadas na cidade de Anápolis (S 16°20’12,8’’; W 48°56’19’’; 1066m), no estado de Goiás. Após secasna temperatura ambiente e ao abrigo da luz, estas folhas foram trituradas em moinho de facas e submetidas à extração com acetona aquosa 50%, à temperatura ambiente e com agitação mecânica. Após filtração, a acetona foi evaporada sob vácuo e o extrato aquoso foi filtrado em funil de Büchner para eliminação de clorofilas e graxas, fornecendo uma massade 9,12 g. O extrato aquoso foi liofilizado obtendo-se 174,27g de extrato bruto (Figura 4) resultando num rendimento de 17%.

Figura 4. Esquema de obtenção do extrato liofilizado.

3.2.Fracionamento por partição entre solventes

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9 Parte do extrato (24,27 g) foi reservado para ensaios posteriores enquanto 150 gdo extrato liofilizado foi suspendido em água e submetido à partição com acetato de etila,gerando a fração acetato de etila (15g) após a evaporação do solvente em rotaevaporador. A fração aquosa após liofilização foi suspendida em metanol e após filtração forneceu uma fração solúvel (86 g) e o precipitado insolúvel (39,22 g). A fração solúvel em metanol foi evaporada em rotaevaporador (Figura 5) (Santoset al., 2007).

Figura 5. Esquema de partição entre solventes do extrato liofilizado.

3.3.Fracionamento e isolamento dos compostos por cromatografia em coluna

3.3.1.Fração solúvel em metanol

A fração solúvel em metanol foi dividida em seis porções (11, 12, 14, 12, 15 e 9g) e cada uma foi submetida à cromatografia em coluna com Diaion HP-20 (Supelco)como adsorvente (coluna de adsorvente 27 x 4 cm, 200 g) (Figura 4). Utilizou- se gradiente começando com água, e depois soluções de água/metanol (20, 40, 60, 80 até 100 % metanol). As frações coletadas foram reunidas em cinco frações após análise por cromatografia em camada delgada, emplacas de alumínio de sílica-gel 60 F254 (Merck)como adsorvente e ácido fórmico, formiato de etila e tolueno (1:7:1) como eluente, seguido por revelação em lâmpada de UV (254 nm) e aplicação de solução etanólica a 1 % de FeCl3/HCl (0,1 %).

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10 As frações M3, M4 e M5 foram refracionadas utilizando-se o mesmo adsorvente e o mesmo gradiente anterior (Figura 4). Afração M2 e as subfrações geradas,M20 e M49, foram refracionadas em cromatografia em coluna com Sephadex LH-20(Sigma- Aldrich)(coluna de adsorvente 28 x 4 cm, 200 g), utilizando-se como eluente o gradiente de clorofórmio/etanol (8:2) com incrementos de 20 % de etanol até etanol puro, seguido de etanol/metanol (20, 40, 60, 80 até 100% metanol)(Figura 6).

Figura 6. Esquema do fracionamento da fração solúvel em metanol.

3.3.2.Fração solúvel em acetato de etila

Parte da fração acetato de etila(7 g) foi submetida à cromatografia em coluna utilizando-se Sephadex LH-20 como adsorvente (coluna de 27x4 cm, 200 g) (Figura 7).

Para tanto se utilizou como fase móvel um gradiente com aumento de polaridade, começando com diclorometano, em seguida diclorometano/etanol (10, 30, 50 até 100%

etanol),e depois etanol/metanol (20, 50, 80 até 100% metanol). As frações coletadas foram analisadas por cromatografia em camada delgada, emplacas de alumínio de sílica-gel 60 F254e solução de acetona:tolueno:ácido fórmico na proporção 3:3:1 como

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11 eluente, seguido por revelação em lâmpada de UV (254 nm) e aplicação de solução etanólica a 1 % de FeCl3/HCl (0,1 %).

Após as análises foram reunidas 16 frações, destas AE3 e AE5 foram refracionadas utilizando Sephadex LH-20 (24 x 2,5 cm, 100 g), utilizando-se o mesmo gradiente anterior (Figura 7).

Figura 7. Esquema do fracionamento da fração solúvel em acetato de etila.

3.4.Análise espectroscópica dos compostos puros

As substâncias puras foram analisadas por Ressonância Magnética Nuclear de

1H e ¹³C, uni e bidimensional, em equipamento Bruker Avance III – 500 MHz, solubilizadas em acetona-D6, acetona-D6 + D2O e metanol-D4. Espectros de absorção na região do UV-Vis foram obtidos em espectrômetro Beckman DU-70.Espectros de massa foram obtidos em aparelho Bruker microTOF (ESI-TOF MS) do Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais (UFRJ).

(27)

12

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O isolamento de compostos fenólicos polares só foi possível através da utilização de uma marcha direcionada para este tipo de compostos, para tanto já na extração foi utilizada uma mistura de acetona e água (50%), pois esta é a melhor condição para obtenção de taninos, sejam hidrolisáveis ou condensados (Mello &

Santos, 2003). A partição entre solventes ajuda na obtenção de frações com compostos de polaridades e estruturas semelhantes. A separação por cromatografia em coluna foi realizada com géis modificados, pois a utilização de sílica-gel para substâncias polares não é indicada pelo seu alto poder de adsorção. O gel vinílico polimérico Diaion HP-20 foi então escolhido para o início do fracionamento por ser o mais adequado para uma separação prévia de compostos polares (Okuda et al., 1989), com isso obtivemos cinco frações, usando um gradiente de água/metanol.

As três frações que apresentaram maior massa (M3, M4 e M5) foram refracionadas, inicialmente com o uso de Diaion HP-20, devido à elevada massa de cada uma. Os refracionamentos seguintes foram realizados com o gel dextrano hidroxipropilado, Sephadex LH-20, que mostrou separações mais eficientes quando o gradiente com aumento de polaridade foi usado como clorofórmio/etanol, etanol e metanol. Desta forma, o mecanismo de separação épreponderantemente por adsorção e infimamente por filtração em gel (Okuda et al., 1989). Após os fracionamentos foram identificadas onze substâncias fenólicas, sendo que noveforam obtidas puras.

4.1.2,3-di-O-Galoil-β-D-glicose

O éster galoílico2,3-di-O-galoil-β-D-glicose conhecido como nilocitina foi obtido na fração M56 (26 mg) e a sua estrutura foi determinada por meio de RMN ¹H e COSY.

No espectro de RMN ¹H foi possível observar a duplicação de todos os sinais devido à mistura de anômeros α e β na proporção 1:0,6 (Figura 6). Os sinais dos hidrogênios anoméricos se encontram blindados em δH 5,45 d (J = 3,6 Hz) para o anômero α e δH

4,95 d (J = 8,1 Hz) para o β, o que demonstra que o carbono anomérico está na forma de um hemiacetal, ou seja, a hidroxila não está esterificada. A partir dos sinais dos hidrogênios anoméricos foi possível identificar no espectro de COSY as correlações com os outros hidrogênios das glicoses (Figura 7 e Tabela 1). Na região dos aromáticos se observam dois singletos duplicados em δH 7,02, 7,06, 7,00 e 6,99 ppm o que indica a presença de dois grupos galoíla, que estão esterificados nos oxigênios

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13 ligados aos carbonos C-2 e C-3. Este fato foi deduzido pelos sinais desblindados em δH

4,90 (H-2α), 5,72 (H-3α), 5,05 (H-2β) e 5,38 (H-3β).

O espectro de UV apresentou um máximo de absorçãoem 271 nm condizente com os anéis aromáticos do grupo galoíla presentes na estrutura. No espectro de massas o pico do íon [M-H]¯ foi observado a m/z 483,0781, o que corresponde á fórmula molecular C20H20O14.

Figura 8. Espectro de RMN ¹H do éster galoílico 2,3-Di-O-galoil-β-glicose.

Figura 9. Espectro de COSY do éster galoílico 2,3-di-O-galoil-β-D-glicose.

OH O

H OH

O

O OH O O O H

O H

OH OH OH

O

(29)

14 Tabela 1. Dados de RMN ¹H do éster galoílico 2,3-di-O-galoil-β-D-glicose.

δH

H α anômero β anômero

1 5,45 d (3,6) 4,95 d (8,1)

2 4,90 dd (3,6; 10,2) 5,05 dd (8,1; 9,5)

3 5,72 dd (9,5; 10,2) 5,38 t (9,5)

4 3,83 dd (9,5; 10,2) 3,78 t (9,5)

5 3,58 m 3,58 m

6 3,83 dd (2,7; 11,9) 3,89 dd (2,4; 12,2)

6 3,72-3,79 m 3,72-3,79 m

Galoil 2’ e 6’ 7,02s; 7,06s; 6,99s; 7,00s Espectro realizado em acetona-d6. (Constantes de acoplamento em Hz)

Este éster galoílico foi isolado pela primeira vez de flores da espécie Tamarix nilotica (Tamaricaceae) (Nawwar et al., 1984) e recentemente encontrado em folhas de Syzygium forrestii (Myrtaceae) (Tian et al., 2011) e nas partes aéreas da espécie Reaumuria vermiculata (Tamaricaceae) (Nawwar et al., 2012).

4.2.1,2,3,4,6-penta-O-Galoil-β-D-glicose

O éster galoílico1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glicose foi obtido na fração EA11 (92 mg), sua estrutura foi determinada por meio de seus espectros de RMN H¹, COSY, HSQC, massas e comparação com dados da literatura (Beretta et al., 2011). O pico do íon [M-H]¯ foi observado a m/z 939,1146, o que corresponde á fórmula molecular C41H32O26. Seu espectro de UV mostrou um pico de máximo em 279 nm, comprovando a presença de anéis aromáticos dos grupos galoíla presentes. O seu espectro de RMN

1H (Figura 10) é bastante simples, pois como comprovado pelo sinal da glicose a δH

6,32 d (J = 8,3 Hz) o carbono anomérico é esterificado com um grupo galoíla, desta forma ele é um acetal e existe apenas como o anômero β. Na região dos aromáticos foram observados cinco singletos com integração para dois hidrogênios, o que demonstra a presença de cinco grupos galoílas. Os sinais dos hidrogênios e carbonos foram identificados através dos espectros de COSY e HSQC (Tabela 2).

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15 Figura 10. Espectro de RMN ¹H do éster galoílico 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glicose.

Tabela 2. Dados de RMN ¹H e ¹³C do éster galoílico 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glicose.

C/H δH δC

1 6,32 d (8,3) 93,4

2 5,62 dd (8,3; 9,7) 71,9

3 6,01 t (9,7) 73,5

4 5,68 t (9,7) 69,5

5 4,55 m 74,1

6 4,58 dd (2,0; 13,0) 62,9

6 4,30 dd (5,3; 13,0) -

Galoil 2’ e 6’ 7,02s; 7,04s; 7,09s; 7,11s; 7,18s 109,98

Espectro realizado em acetona-d6. (Constantes de acoplamento em Hz)

Este composto está presente em várias outras espécies que contem taninos hidrolisáveis, incluindo muitas plantas medicinais (Okuda et al.,1993). Ele apresenta um amplo espectro de atividades biológicas, tais como, atividade antioxidante, anticâncer contra vários tipos de tumores, antidiabético, além de efeitos gastro e cardioprotetor (Beretta et al., 2010).

4.3. Gemin D

O elagitanino gemin D (3-O-galoil-4,6-O-(s)-hexahidroxidi-fenoil-β-D-glicose) foi obtido nas frações M48, 58 e 69 (massa total 540 mg).Aestrutura foi determinada por meio de seus espectros de RMN ¹H, COSY, HSQC, espectrometria de massas e comparação com dados da literatura (Yoshida et al., 1985). O espectro de RMN ¹H deste composto se apresenta relativamente complexo (Figura 11), devido à duplicação dos sinais. Isso mostra que o gemin D existe como uma mistura de anômeros α e β na

O

HO O O O OH HO HO

O O

OH

OH OH

O O

HO OH HO

O O

OH OH

OH OH OH O

(31)

16 proporção de 1:1, pois sua hidroxila no C-1 não está esterificada, como comprovado pelos sinais desblindados em δH 5,26 d (J = 4,0 Hz) e 4,73 d (J = 8,0 Hz). Os outros sinais dos hidrogênios das glicoses foram assinalados através do espectro de COSY (Figura 12) e os de carbonos pelo espectro de HSQC (Tabela 3).

A presença de dois singletos duplicados entre δH 6,45 e 6,62 confirma o grupo hexahidroxidifenoíla (HHDF). A localização deste grupo nos carbonos C-4 e C-6 é deduzida pelos deslocamentos químicos dos dois hidrogênios em C-6, que se encontram com uma diferença de cerca de 1,45 ppm. O grupo galoíla está esterificado com a hidroxila do C-3, como comprovado pelos sinais desblindados em δH 5,48 e 5,30 que correspondem a H-3α e H-3β, respectivamente. No espectro de massas foi observado o pico do íon [M-H]¯ a m/z 633,0719, correspondendo a fórmula molecular C27H22O18. O espectro de UV apresentou absorções máximas em 222 e 261 nm, característico de elagitaninos.

Figura 11.Espectro de RMN ¹H do elagitanino gemin D.

Este elagitanino foi isolado pela primeira vez da espécie Geum japonicum (Rosaceae) e está presente em várias outras espécies que contem taninos hidrolisáveis (Okuda et al., 1993).

O

HO O OH

HO HO

OH O

O O

OH OH