RAQUEL GARCIA PEREIRA BRATHWAITE DETERMINAÇÃO DE BENZO(A)PIRENO EM CHÁ VERDE CANOAS, 2010.

RAQUEL GARCIA PEREIRA BRATHWAITE

DETERMINAÇÃO DE BENZO(A)PIRENO EM CHÁ VERDE

CANOAS, 2010.

RAQUEL GARCIA PEREIRA BRATHWAITE

DETERMINAÇÃO DE BENZO(A)PIRENO EM CHÁ VERDE

Trabalho de Conclusão do Curso realizado no Centro Universitário Unilasalle, como parte dos requisitos para obtenção do título de Bacharel em Química.

Orientação: Prof

. Dr

Marisa Tsao.

CANOAS, 2010

RAQUEL GARCIA PEREIRA BRATHWAITE

DETERMINAÇÀO DE BENZO(A)PIRENO EM CHÁ VERDE

Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel no Curso de Química do Centro Universitário La Salle – Unilasalle.

Aprovado pela avaliadora em 07 de julho de 2010.

__________________________________________

Prof

. Dr

Marisa Tsao

Unilasalle

À minha mãe, irmãos e ao Marcelo, pelo

amor, amizade, compreensão e

confiança, o tempo todo.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, que me deu uma família maravilhosa, saúde e força, tornando possível a realização deste trabalho.

À minha mãe, Daunila, agradeço a todo seu carinho, por sua atenção e compreensão, por sua dedicação e amor incondicional. Obrigada pelo exemplo de vida e luta pelo papel de mãe e pai. A minha vitória é tua também, te amo.

Aos meus queridos irmãos, Felipe, Rafael, Kely e Gabriela (famosa e complicada família Brath), e ao meu amado, Marcelo, família a qual amo muito e é minha base para tudo nessa vida.

À minha orientadora, Dra. Marisa Tsao, pelo exemplo de profissional, pela atenção, ajuda, compreensão e importantes ensinamentos e incentivos em todos os momentos e também a todos os professores que puderam me ajudar nesta caminhada.

A Souza Cruz, empresa da qual faço parte atualmente, pela grande oportunidade que tive de crescer profissionalmente, pela disponibilidade, que possibilitaram a realização deste trabalho.

A minha grande amiga Lilian, fiel companheira de trabalho e de faculdade pelos grandes e ótimos momentos que vivemos, espero continuar a compartilhar bons momentos da minha e da tua vida.

Agradeço, enfim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para que

este trabalho se tornasse realidade.

“Você ganha forças, coragem e confiança a cada experiência em que você enfrenta o medo. Você tem que fazer exatamente aquilo que acha que não consegue”.

Eleanor Roosevelt

RESUMO

Este trabalho descreve o estudo de determinação de Benzo(a)pireno, em amostras de chá verde, utilizando Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas utilizando Impacto de Elétrons .

Palavras-chaves: Chá Verde. HPAs. Benzo(a)pireno. Cromatografia Gasosa.

Espectrometria de massas.

ABSTRACT

This work describes Benzo(a)pyrene determination, in green tea samples, using Gas Chromatography Mass Spectrometry using electron impact.

Keywords: Green Tea. HPAs. Benzo(a)pyrene. gaseous Cromatografia.

Espectrometry of masses.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - O chá. ...16

Figura 2 - Campos de chá verde...18

Figura 3 - A colheita de chá. ...19

Figura 4 - Estrutura molecular de alguns hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. . ...22

Figura 5 - Estrutura molecular do B(a)P...23

Figura 5 - Esquema de um cromatógrafo a gás. ...35

Figura 6 - Cromatograma ideal para uma amostra contendo três substâncias. ...36

Figura 7 - Esquema de componentes de um sistema de cromatografia gasosa com espectrometria de massas (GC/MS) ...37

Figura 8 - Esquema representativo de um analisador tipo quadrupolo ...38

Figura 10 - Amostras pesadas e prontas para iniciar o procedimento ...51

Figura 11 - Etapa de filtração ...52

Figura 12 - Secagem em evaporador rotatório...52

Figura 13 - Etapa de eluição da amostra ...53

Figura 14- Coleta do Benzo(a)pireno após a eluição ...54

Figura 15 - Transferência da amostra para frasco (vial) cromatográfico ...54

Figura 16 - Injeção em CG/MS...55

Figura 17 - Curva de calibração de B(a)P ...62

Figura 18 - Cromatograma do ponto 7 da curva de calibração. ...65

Figura 19 - Espectro de massas do B(a)P D12 (PI), íons 260 e 264. ...66

Figura 20 - Espectro de massas do Padrão B(a)P, íons 250 e 252. ...66

Figura 21 - Cromatograma da amostra 4, extração do chá com diclorometano...67

Figura 22 - Cromatograma da amostra 4, extração da infusão com diclorometano... ...68

Figura 23 - Espectro de massas da amostra 4, massa 260 e 264 (B(a)P D12.) ....68

Figura 24 - Espectro de massas da amostra 4, massa 250 e 252 (B(a)P)...69

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Classificação em grupos de acordo com a evidência de

carcinogenicidade de HPAs em humanos e em animais. ...27

Quadro 2 - Classificação de alguns HPAs de acordo com grupos estabelecidos pela IARC, relacionada carcinogenicidade...28

Quadro 3 - Níveis de (B(a)P) reportados na literatura para alguns alimentos...31

Quadro 4 - Níveis máximos de B(a)P em alguns tipos de alimentos de acordo com o Regulamento (CE) nº 208, de 04 de fevereiro de 2005, da Comunidade Européia...32

Quadro 5 - Padrões analíticos utilizados. ...46

Quadro 6 - Soluções estoque primárias...47

Quadro 7 - Soluções estoque secundárias. ...47

Quadro 8 - Soluções estoque terciárias. ...48

Quadro 9 - Soluções para estabelecer a curva de calibração...49

Quadro 10 - Íons Selecionados e Tempo de Retenção ...57

Quadro 11 - Condições de análise do extrato de chá verde por GC-MS ...58

Quadro 12 - Dados de área versus concentração dos padrões...61

Quadro 13 - Estudo de Limites de Detecção e Quantificação...64

Quadro 14 - Limites de Detecção e Quantificação do método CG/MS. ...64

Quadro 15 - Percentagem de recuperação de B(a)P em 3 níveis de fortificação. ...64

Quadro 16 - Resultados de B(a)P obtidos pelo método CG/MS proposto. ...69

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

B(a)P Benzo(a)pireno

B(a)PD12 Benzo(a)pireno dodecadeuterado CCD Cromatografia em Camada Delgada

CG Cromatografia Gasosa

CG/MS Cromatografia Gasosa com Detector de Massas SIM Monitoramento de Íons Seletivos

DCM Diclorometano (CH

Cl

)

HPAs Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento IARC International Agency for Research on Câncer EPA United States Environmental Protection Agency

LD Limite de Detecção

LQ Limite de Quantificação

PI Padrão Interno

ND Não Detectado

mg Miligrama

ng Nanograma

r

Coeficiente de Correlação

SPE Solid Phase Extration (Extração em Fase Sólida – EFS) Ai Área do analito na amostra

Api Área do padrão interno na amostra I Coeficiente linear da curva analítica

Qpi Quantidade de padrão interno adicionado (ng) S Coeficiente angular da curva analítica

m Massa da amostra

EUA Estados Unidos da América

CTC Cortar, Triturar, Concentrar

OMS Organização Mundial de Saúde

FAO Food and Agriculture Organization

JECFA Joint Expert Commite on Food Additive (Comitê Conjunto de Peritos em Aditivos Alimentares - CCPAA)

IPCS International Programme on Chemical Safety (Programa Internacional de Segurança Química – PISQ)

CE Comunidade Européia

ELL Extração Líquido-Líquido

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE)

FE Fase Estacionária

FM Fase Móvel

CH Cicloexil

IE Impacto de Elétrons

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...14

2 OBJETIVOS ...15

2.1 Objetivo geral ...15

2.2 Objetivos específicos ...15

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...16

3.1 A história do chá...16

3.2 Os chás...17

3.2.1 Etapas de processamento do chá ...19

3.2.1.1 Drenagem ...20

3.2.1.2 Vaporização...20

3.2.1.3 Rotação ...20

3.2.1.4 Secagem...21

3.2.1.5 Triagem...21

3.3 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos ...21

3.3.1 Benzo(a)pireno ...23

3.3.1.1 Propriedades físico-químicas...23

3.3.1.2 Aspectos históricos ...24

3.3.1.3 Fontes emissoras...25

3.3.1.4 Toxicidade ...26

3.3.1.5 Contaminação em alimentos ...29

3.4 Legislação vigente...30

3.5 Evolução da metodologia analítica para determinação de B(a)P em alimentos, bebidas e águas. ...32

3.6 Cromatografia ...33

3.6.1 Cromatografia em fase gasosa ...34

3.7 Espectrometria de Massas...36

3.7.1 Ionização por impacto de elétrons ...37

3.7.2 Analisador...38

3.8 Validação de resultados...39

3.8.1 Linearidade ...39

3.8.2 Limite de Detecção (LD) ...41

3.8.3 Recuperação ...42

4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL...44

4.1 Amostragem ...44

4.2 Materiais ...44

4.3 Equipamentos ...45

4.4 Reagentes...45

4.5 Padrões...46

4.6 Preparo de Padrões ...46

4.6.2 Soluções estoques secundárias ...47

4.6.3 Soluções estoques terciárias ...48

4.6.4 Solução de trabalho de padrão interno - B(a)P D12 ...48

4.6.6 Soluções padrão para estabelecer a curva de calibração ...48

4.7 Método de extração ...50

4.7.1 Extração do chá seco ...51

4.7.2 Extração em fase sólida (SPE- Solid Phase Extration)...53

4.7.3 Extração da infusão ...55

4.7.3.1 Método 1...55

4.7.3.2 Método 2...56

4.7.3.3 Extração em fase sólida...56

4.8 Método de Análise ...57

4.8.1 Condições de CG/MS ...57

4.9 Quantificação ...58

4.10 Linearidade...59

4.11 Limite de detecção...59

4.12 Limite de quantificação ...59

4.13 Recuperação ...60

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...61

5.1 Parâmetros de validação de resultados ...61

5.1.1 Linearidade ...61

5.1.2 Limite de detecção e limite de Quantificação...62

5.1.3 Recuperação ...64

5.2 Cromatogramas ...65

5.2.1. Cromatograma de Padrão ...65

5.2.1.1 Extração dos íons monitorados do Padrão ...66

5.2.2 Cromatograma de amostra ...67

5.2.2.1 Extração dos íons monitorados de amostra contaminada. ...68

5.3 Avaliação de resultados obtidos por extração com solvente...69

5.4 Avaliação de resultados obtidos da extração da infusão ...70

6 CONCLUSÕES ...71

REFERÊNCIAS ...72

14 1 INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, a contaminação de alimentos por substâncias tóxicas tem sido objeto de intensas pesquisas (TFOUNE, 2005; BETTIN, FRANCO, 2005).

Dentre essas, destacam-se os estudos relacionados aos Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs), compostos químicos que têm sido detectados em alimentos e bebidas (CARUSO, 2007), formados principalmente em processos de combustão incompleta de matéria orgânica. Encontram-se amplamente distribuídos na natureza como contaminantes de solos, ar, água e alimentos e esses compostos são considerados importantes contaminantes devido a seu elevado potencial genotóxico, mutagênico e carcinogênico, sendo capazes de desencadear doenças degenerativas no ser humano, dependendo da susceptibilidade genética de cada indivíduo e freqüência de exposição a esses compostos (CAMARGO, TOLEDO, 2002b; PEREIRA NETO et al, 2000).

Dentre os HPAs carcinogênicos, destaca-se o Benzo(a)Pireno (B(a)P), potente carcinógeno que tem sido utilizado por diversos pesquisadores como indicador da presença desses compostos em alimentos. No Brasil, já foram desenvolvidas metodologias direcionadas à determinação desta substância tóxica em produtos cárneos, óleos, gorduras e derivados, além de pesquisas de avaliação dos efeitos tóxicos no organismo humano (CAMARGO, TOLEDO, 2002a).

A contaminação de alimentos e bebidas por B(a)P pode ocorrer por meio de duas fontes principais: fontes naturais (processos geoquímicos, atividades vulcânicas e biossíntese por algas) e fontes antropogênicas (queimadas em florestas; atividades industriais como defumação, secagem direta com madeira e torrefação e poluição ambiental como tráfego, sistemas de aquecimento, vazamentos de óleo) (BETTIN, FRANCO, 2005; SIMAL-GÁNDARA et al., 2005;

GODOI et al., 2004; CONDE et al., 2004; EC, 2002; IPCS, 1998).

Com base no exposto, este trabalho visa avaliar a possível contaminação do

ser humano com a ingestão do composto químico Benzo(a)Pireno, através do chá

verde, além de avaliar suas implicações como substância tóxica para o organismo

humano.

15 2 OBJETIVOS

Os objetivos deste trabalho dividem-se em objetivos gerais e específicos.

2.1 Objetivo geral

Determinar a presença de Benzo(a)pireno em amostras de chá verde.

2.2 Objetivos específicos

a) Determinar Benzo(a)pireno em amostras de chá verde, por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de massa com Impacto de Elétrons

por:

- Extração com diclorometano (solvente);

- Extração com água, por infusão.

b) Comparar os resultados obtidos pelos dois tipos de extração estudados;

c) Discutir o alto potencial toxicológico do benzo(a)pireno à saúde humana.

16

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O levantamento bibliográfico foi realizado para elucidar questões polemicas a respeito da toxicidade do benzo(a)pireno.

3.1 A história do chá

O chá é a segunda bebida mais consumida no planeta, logo depois da água.

Cada cultura tem seus próprios costumes envolvendo o chá. Os japoneses, por exemplo, consideram o chá muito importante e criaram a Cerimônia do Chá, ou Chanoyu, como uma celebração ritualista da bebida. Muitos norte-americanos bebem chá gelado - e os que moram no sul dos EUA são famosos por consumir grandes quantidades de chá doce. A "hora do chá" ou o "chá da tarde" é uma tradição britânica (HOWSTUFFWORKS, 2008).

Figura 1 - O chá

Fonte: (HOWSTUFFWORKS, 2008).

Embora seja considerado, em grande parte, uma bebida social, os estudiosos

reconhecem o chá como uma substância medicinal há milhares de anos. Uma

pesquisa recente parece confirmar essas afirmações, sugerindo que o chá oferece

17 vários benefícios para a saúde, incluindo a redução do risco de câncer ou de doença cardíaca (KANG, 2010).

Sabemos muito pouco sobre as origens do chá. Os humanos podem ter consumido chá por dezenas de milhares de anos, mas os registros que fazem referência ao chá têm apenas cerca de 2 mil anos. Um mito permaneceu, o do lendário imperador chinês Shen Nung que, segundo dizem, governou há mais de 5 mil anos. Shen Nung era conhecido como um talentoso cientista e artista e, para reforçar a higiene na China, pediu que todas as pessoas fervessem a água que seria bebida. Durante uma visita a uma região distante da China, ele parou com sua corte para descansar. Enquanto seus criados preparavam a água, uma rajada de vento levou algumas folhas de um arbusto próximo para dentro da água, deixando o líquido com uma coloração marrom-amarelada. Como era um cientista curioso, Shen Nung decidiu experimentar a água. Ele bebeu a infusão e achou a bebida revigorante. Assim, estava criado o chá (HOWSTUFFWORKS, 2008).

3.2 Os chás

Existem quatro tipos principais de chá: o verde, o preto, o de oolong (vermelho) e o chá branco. A cor do chá verde é variável, sendo que os tons variam entre o verde e o amarelo, além de o gosto e o aroma da bebida serem bastante característicos.

O que muitas pessoas não sabem é que esses quatro tipos de chá vêm de uma

única planta, a Camellia sinensis e não de quatro espécies de plantas diferentes.é a

maneira como as folhas de chá são processadas que são originados os diversos

tipos de chás, com seus sabores, cores e aromas específicos.

18

Figura 2 - Campos de chá verde

Fonte: (HOWSTUFFWORKS, 2008).

O chá, sob certos aspectos, é parecido com o vinho porque o ambiente em que ele é cultivado determina a maior parte de seu sabor e qualidade. As plantas utilizadas para a produção de chá costumam se adaptar melhor em solos ácidos e em regiões com alto índice de chuvas (cerca de 1 m por ano) (HOWSTUFFWORKS, 2008).

Chás produzidos em grandes quantidades são cultivados em plantações em

mais de 30 países, mas os quatro maiores produtores são a China, a Índia, o Quênia

e o Sri Lanka. A maioria dos chás é colhida à mão para que se possa conseguir a

qualidade necessária, enquanto que o uso de máquinas tende a danificar muito as

folhas. Geralmente são feitas duas colheitas durante o ano, a primeira no início da

primavera e a segunda no verão. Os cultivadores mantêm a planta do chá no estágio

inicial do cultivo com podas constantes, e colhem apenas duas folhas e um botão

dos topos das plantas (HOWSTUFFWORKS, 2008).

19

Figura 3 - A colheita de chá

Fonte: (HOWSTUFFWORKS, 2008).

Assim que os trabalhadores recolhem quantidades suficientes de folhas de chá, o estoque é levado rapidamente a uma fábrica que deve ficar localizada próxima da origem das folhas, porque, a partir do momento em que a folha é colhida, a oxidação já começa. O que distingue o chá verde dos demais é o seu processo de oxidação e no caso do chá verde, este não é oxidado, o que faz dele o mais claro de todos os chás – varia entre o verde e o amarelo claro – e aquele que mantém um dos maiores e mais potentes níveis de antioxidantes, apenas superado pelo chá branco. Colhido manualmente, são apanhadas sempre duas folhas e um rebento da planta Camellia sinensis para confeccionar o chá verde. Em vez de serem oxidadas, as folhas são imediatamente cozidas ao vapor, enroladas e deixadas para secar – só assim é que se consegue preservar a sua cor verde.

3.2.1 Etapas de processamento do chá

Existem duas maneiras de produzir o chá verde: por meio do método ortodoxo

e pelo método "Cortar, Triturar, Concentrar" (CTC). Os dois possuem cinco etapas

comuns, sendo a principal diferença é que no método ortodoxo o processamento é

feito à mão, ao passo que pelo CTC, são feitos por máquinas.

20 A seguir serão detalhadas as etapas de processamento do chá.

3.2.1.1 Drenagem

Na etapa de drenagem, as folhas de chá são espalhadas em grandes grupos e drenadas, isso é feito para que as folhas liberem um pouco da umidade retida nas folhas.

3.2.1.2 Vaporização

Depois que as folhas foram drenadas elas são colocadas em bandejas quentes, onde sofrem o processo denominado de vaporização. Neste, o processo de oxidação é interrompido, fazendo com que a folha de chá permaneça em seu estado atual, mantendo a coloração naturalmente verde.

3.2.1.3 Rotação

No processo de rotação pelo método ortodoxo, as folhas são giradas para que

a umidade restante seja liberada, revestindo a superfície das folhas. Esse método é

particularmente delicado, onde as folhas de chá costumam ficar inteiras. Já pelo

método CTC, ocorre o corte das folhas de chá em pedaços pequenos e o resultado

é um produto com aspecto de pó.

21 3.2.1.4 Secagem

No processo de secagem as folhas são secas com ar quente e as suas cores podem mudar desde de o tom cobre até o marrom ou preto.

3.2.1.5 Triagem

O processo final de triagem envolve a seleção das folhas de chá de acordo com o tamanho e a qualidade.

3.3 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos

Os Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) são produzidos por combustão incompleta ou pirólise da matéria orgânica. A formação pirolítica de HPAs é bastante complexa e variável, dependendo das condições reacionais. O esquema mecanístico aceito para esta reação envolve a polimerização via radicais livres, em várias etapas, até a formação de núcleos aromáticos condensados (LOPES, ANDRADE, 1996) (Figura 4). A formação destes compostos depende de fatores como tipo da biomassa presente, quantidade de oxigênio disponível, pressão e, principalmente, de calor, pois a concentração de HPAs aumenta linearmente na faixa de temperatura de 400 a 1000 ºC (CONDE et al., 2004).

Estudos revelam que os HPAs podem ser provenientes de várias fontes

antropogênicas como: queima do carvão, escapamentos de veículos, óleos

lubrificantes usados em motores, fumaça de cigarro, dentre outras, bem como de

fontes ambientais como erupções vulcânicas e queimadas espontâneas. A

contribuição de fontes naturais é muito limitada, contribuindo com pequenas

quantidades de HPAs, enquanto que as fontes antropogênicas representam o

principal processo de emissão destes compostos (BETTIN, FRANCO, 2005; SIMAL-

22 GÁNDARA et al., 2005; GODOI et al., 2004; CONDE et al., 2004; European Comission, 2002; IPCS, 1998).

Figura 4 - Estrutura molecular de alguns hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

Fonte: International Programme On Chemical Safety, 1998.

23 3.3.1 Benzo(a)pireno

Dentre os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, o benzo(a)pireno é um dos mais conhecidos e estudados. Segundo a IUPAC, a grafia recomendada é benzo[a]pireno, enquanto que o Chemical Abstract adota benzo(a)pireno. São sinônimas as seguintes formas: benzo(def)criseno; 1,2-benzopireno; 3,4- benzopireno; 6,7-benzopireno; alfabenzopireno; benzo(alfa)pireno; 3,4-benzpireno;

3,4-benz(a)pireno; B(a)P e B(a)P (IPCS, 1998; IARC, 1983 ).

Abaixo serão descritas algumas das principais características do composto Benzo(a)pireno.

Figura 5 - Estrutura molecular do B(a)P

Fonte: Chempider, 2010.

3.3.1.1 Propriedades físico-químicas

O Benzo(a)Pireno é um dos HPAs mais conhecidos e estudados. Sua fórmula

molecular é C

H

, apresentando massa molecular de 252,3 g/mol. Possui a

aparência de cristais em forma de agulhas de cor amarelo-pálido; apresenta baixa

volatilidade; pontos de fusão e ebulição de 178,1°C e 310 – 312°C (a 10 mmHg),

24 respectivamente; pressão de vapor a 25°C é de 2,13 x 10

Pa e a constante de Henry a 20°C, 1,86x10

. Além disso, esse composto sofre foto-oxidação quando exposto à luz solar ou radiação fluorescente (CARUSO, 2007).

Como os demais HPAs, o B(a)P é lipossolúvel, apresentando coeficiente de partição octanol/água (log/K

= logaritmo da concentração de equilíbrio (K) ou do coeficiente de partição octanol (o) e água (w=water)) igual a 6,04 e solubilidade em água a 25°C de 3,8 µg/L. Desta forma, em sistemas aquosos, o B(a)P tende a concentrar-se em sedimentos ou permanecer associado à matéria orgânica em suspensão (PEREIRA NETTO et al, 2000).

3.3.1.2 Aspectos históricos

As primeiras provas dos riscos ocupacionais e ambientais dos HPAs foram obtidas em 1922 de estudos em que extratos orgânicos de fuligem tinham ação tumoral em animais e, também pela ação neoplásica do extrato de material particulado. De acordo com Cunha (2007), pode-se considerar como o início da química dos HPAs o isolamento do B(a)P do carvão, em 1931 e, subseqüentemente, a sua síntese no mesmo ano. A identificação do B(a)P como uma nova substância química, em 1933, permitiu identificar como sendo esta o agente cancerígeno em animais. Em 1970 o B(a)P e outros HPAs foram caracterizados como agentes cancerígenos, de distribuição mundial, em ambientes respiráveis e como constituintes de aerossóis urbanos. Neste mesmo ano, foi reconhecido o poder carcinogênico dos extratos de partículas atmosféricas até então atribuído ao B(a)P, demonstrando que a atividade cancerígena não era somente devida a esta substância, mas, também, à presença de outras substâncias orgânicas ainda desconhecidas e também presentes no material orgânico de fontes de emissão primárias (COSTA, 2001).

Também nos anos 70 foi introduzido um método muito sensível e eficaz para a

determinação da mutagenicidade de substâncias químicas, por meio de ensaios

envolvendo bactérias do gênero Salmonella que ficariam conhecidos como ensaio

de mutagenicidade ou "Teste de Ames – Salmonella" em homenagem a seus

25 autores (Ames et al., 1975). A partir desta época, muita atenção tem sido dada à avaliação de HPA em matrizes ambientais e biológicas (COSTA, 2001).

3.3.1.3 Fontes emissoras

Os HPAs são emitidos por fontes naturais e antropogênicas. A contribuição

das fontes naturais é muito limitada restringindo-se, praticamente, à queima

espontânea de florestas e emissões vulcânicas. As fontes antropogênicas

representam o principal processo de produção de HPAs (Lee et al. 1981). A

queima de combustíveis como petróleo e seus derivados, carvão, madeira, gás de

carvão etc; produz HPAs e muitos outros poluentes atmosféricos. A quantidade e

os tipos de HPAs formados dependem das condições específicas do processo e

do tipo de combustível, sendo que processos mais eficientes emitem menores

quantidades de HPAs. A fumaça de cigarro, queimadas e calefação

(especialmente em países de clima temperado) são importantes fontes de HPAs e

derivados (Lopes et al. 1996). Os HPAs são oriundos também de fontes

tecnológicas que podem ser móveis ou estacionárias. Entre as fontes móveis,

destaca-se o motor de combustão interna como o principal emissor destas

substâncias para o ambiente. Este tipo de motor é o mais comum em diversos

veículos de transporte de cargas e passageiros. As fontes estacionárias são

subdivididas entre as utilizadas na geração de energia elétrica e calor e aquelas

ligadas à atividade industrial (produção de alumínio) e de incineração

(principalmente de rejeitos químicos) e podem emitir uma grande variedade de

produtos de combustão incompleta (Netto et al. 1999). As fontes veiculares de

emissão têm uma grande importância devido à complexidade e quantidade, cada

vez maior, de material que é lançado na atmosfera. O material particulado emitido

por veículos a diesel, por exemplo, é constituído principalmente de carbono

elementar que atua como superfície de condensação de HPAs e de outros

compostos aromáticos.

26 3.3.1.4 Toxicidade

O interesse pelo estudo da contaminação por HPAs e seus derivados reside no fato de que muitos deles são potencialmente carcinogênicos e mutagênicos (IARC, 1983). Os HPAs estão entre aqueles poluentes que apresentam atividade cancerígena e mutagênica, podendo provocar tumoração em animais e mutação em bactérias (EC, 2002). A exposição humana aos HPAs pode ocorrer por diferentes vias, como inalação, pele ou por ingestão. A ação exercida pelos HPAs é ativada durante o seu processo metabólico, visando à formação de compostos hidrossolúveis para facilitar a sua excreção. O mecanismo de eliminação envolve a formação de epóxidos, seguidos de compostos polihidroxilados, os quais são mais solúveis em água, viabilizando a sua eliminação pela via urinária. Um destes intermediários pode reagir com a guanina do DNA e formar um aduto dando origem a processos de tumoração (LOPES, ANDRADE, 1996). Segundo a International Agency for Research on Câncer (IARC), os HPAs são classificados de acordo com a evidência de carcinogenicidade em humanos e em animais experimentais.

Os agentes são divididos nos grupos 1, 2A, 2B, 3 e 4 e estão descritos no

quadro 1.

27

Grupo Caracterização

1

O agente é carcinogênico para humanos.

Esta categoria é atribuída quando existe suficiente evidência de carcinogenicidade em humanos.

2

Esta categoria inclui agentes que apresentam evidência quase suficiente de carcinogenicidade em humanos, ou que apresentam suficiente evidência de carcinogenicidade em animais experimentais.

Este grupo é ainda dividido em Grupo 2A (prováveis carcinogênicos para humanos) e Grupo 2B (possíveis carcinogênicos para humanos).

2A

O Grupo 2 A é utilizado para os agentes que apresentam limitada evidência de carcinogenicidade em humanos e suficiente evidência de carcinogenicidade em animais experimentais.

2B

O Grupo 2 A é utilizado para os agentes que apresentam limitada evidência de carcinogenicidade em humanos e suficiente evidência de carcinogenicidade em animais experimentais. O Grupo 2 B refere-se a agentes para os quais há inadequada evidência de carcinogenicidade em humanos, mas há suficiente evidência de carcinogenicidade em animais experimentais

3 O agente não é classificado como

carcinogênico para humanos

4 O agente é provavelmente não carcinogênico para humanos.

Quadro 1 - Classificação em grupos de acordo com a evidência de carcinogenicidade de HPAs em humanos e em animais.

Fonte: International Agency for Research on Cancer, 2006a

28 O quadro 2 apresenta a classificação de alguns HPAs de acordo com a evidência de carcinogenicidade

HPA Classificação

Antraceno Grupo 3

Benzo(a)antraceno Grupo 2B Benzo(b)fluoranteno Grupo 2B Benzo(j)fluoranteno Grupo 2B Benzo(k)fluoranteno Grupo 2B Benzo(g,h,i)fluoranteno Grupo 3

Benzo(c)fenantreno Grupo 2B

Benzo(a)pireno Grupo 1

Benzo(e)pireno Grupo 3

Criseno Grupo 2B

Coronono Grupo 3

Dibenzo(a,c)antraceno Grupo 3 Dibenzo(a,h)antraceno Grupo 2A

Dibenzo(a,j)antraceno Grupo 3

Fluoranteno Grupo 3

Fluoreno Grupo 3

Indeno 1,23-cd-pireno Grupo 2B

Naftaleno Grupo 3

Pireno Grupo 3

Quadro 2 - Classificação de alguns HPAs de acordo com grupos estabelecidos pela IARC, relacionada carcinogenicidade

Fonte: International Agency for Research on Cancer, 2006b.

De acordo com a proposta do trabalho, que é a contaminação de

benzo(a)pireno em chá verde, no próximo item será abordada a somente a

contaminação de benzo(a)pireno em alimentos.

29 3.3.1.5 Contaminação em alimentos

Existem muitos estudos sobre a ocorrência de B(a)P em diversos tipos de alimentos, incluindo óleos vegetais, margarinas, maionese, produtos lácteos, frutas, vegetais, produtos defumados, chás, café, cereais, água, alimentos de origem marinha, alimentos grelhados entre outros (TFOUNI, 2005).

No caso dos óleos vegetais, a presença desses compostos é atribuída à etapa de secagem dos grãos, sendo a secagem à lenha a técnica que mais contribui para a formação dos compostos e sua presença no produto final. Embora a desodorização reduza os teores totais de HPAs, seu efeito não é substancial, sendo necessário o controle do óleo bruto ou a utilização de carvão ativo para remoção dessas substâncias (TOLEDO, CAMARGO, 1998).

A ocorrência de B(a)P em frutas e vegetais se deve principalmente à poluição ambiental. Neste caso, o material particulado se deposita na superfície destes, onde são concentrados pela camada de cera através de adsorção superficial (CAMARGO, TOLEDO, 2002c). O nível de contaminação depende da localização da plantação e da área de superfície do alimento exposta à contaminação. As plantações situadas próximas a rodovias dão origem a produtos com maiores teores de B(a)P (CAMARGO, TOLEDO, 2002a).

A contaminação de cereais se dá de maneira análoga à de frutas e vegetais, sendo a área de cultivo um fator muito importante. Outra via de contaminação dos grãos é a secagem dos mesmos pela aplicação de gases de combustão, com os teores de B(a)P variando em função do tipo de combustível utilizado e das condições de sua queima (CAMARGO, TOLEDO, 2002b).

A contaminação do café ocorre no processo de torrefação dos grãos. Quando se prepara a bebida no modo tradicional (café coado em processo direto), 20 a 30%

dos HPAs totais presentes no pó de café são extraídos para a bebida; entretanto, quando o pó de café é fervido juntamente com a água antes da filtração, forma-se um complexo HPA-cafeína que facilita a passagem dos hidrocarbonetos para a bebida, resultando em um café com maiores níveis de HPAs (CAMARGO, TOLEDO, 2002b).

O chá geralmente apresenta níveis superiores de B(a)P em relação ao café

torrado. A contaminação do chá se dá devido à poluição ambiental aliada à secagem

30 direta das folhas de chá (CAMARGO, TOLEDO, 2002b; CAMARGO, TOLEDO, 2002c).

Em produtos defumados os B(a)P são formados pela queima da madeira utilizada no processo. A maior concentração de B(a)P nesses produtos se dá imediatamente após a defumação, quando a sua concentração na fumaça diminui devido à decomposição na presença de luz e à interação com outros compostos.

Estes podem penetrar no alimento, onde ficam protegidos da luz e do oxigênio;

depois de algum tempo, a concentração se estabiliza em um valor constante (SIMKO, 2002). Segundo Azeredo (2001), o controle de alguns parâmetros importantes como temperatura, distância da fonte geradora e concentração de fumaça pode contribuir para a diminuição da contaminação de produtos defumados por B(a)P. Nos processos de defumação industriais mais modernos, a fumaça é gerada numa câmara separada e tratada antes de passar à câmara de defumação.

Passagem por filtros eletrostáticos e “lavagem” da fumaça (formação de fumaça líquida) são algumas das técnicas utilizadas para diminuir a contaminação da fumaça por B(a)P.

Quando alimentos são preparados em contato com a chama, como acontece com as carnes de churrasco, a gordura da carne em contato com o fogo, sofre pirólise e então retorna à carne na forma de fumaça, carregando os HPAs que contaminam a carne. Quanto maior o teor de gordura da carne, maior a quantidade de HPAs presente no produto, conseqüentemente maior teor de B(a)P (PHILLIPS, 1999; CAMARGO, TOLEDO, 2002c).

3.4 Legislação vigente

De acordo com Caruso (2007), vários estudos vêm sendo realizados com o

objetivo de avaliar quais são os alimentos ou grupo de alimentos que mais

contribuem na ingestão diária de B(a)P. Estes estudos revelaram que a maioria dos

alimentos citados no item 3.3.1.5 apresentam partículas deste composto. Além

disso, tem sido verificado que as fontes de exposição variam de acordo com o país e

o respectivo hábito alimentar.

31 A Quadro 3 apresenta a faixa dos níveis de Benzo(a)Pireno encontrados em alguns tipos de alimentos:

Alimentos B(a)P(µg/Kg)

Alimentos defumados nd* – 66,90

Alface 0,1 – 31,7

Óleo de oliva nd – 164,4

Óleo de soja nd – 42,90

Óleo de girassol nd – 8,0 Óleo de milho 1,51 – 58,9 Peixes e frutos do mar <0,005 – 4,54

* nd – não detectado

Quadro 3 - Níveis de (B(a)P) reportados na literatura para alguns alimentos

Fonte: Camargo, Toledo, 2002c.

A Portaria N° 518/2004 vigente estabelece limite má ximo de B(a)P apenas para a potabilidade de água (0,7 µg/L) (BRASIL, 2004) e para aroma de fumaça (0,03 µg/kg de produto final) (BRASIL, 2007). Somente alguns países possuem limites estabelecidos para um número restrito de alimentos (SIMKO, 2002): na Alemanha, Áustria e Polônia, o teor máximo permitido de B(a)P em carnes defumadas é 1µg/Kg e este valor tem sido usado como limite de referencia para avaliação do grau de contaminação de outros alimentos. Para óleos e gorduras, as indústrias alemãs têm suas próprias recomendações quanto aos limites. Por exemplo, a soma dos resíduos dos HPAs leves não deve exceder a 25 µg/Kg, enquanto que a soma dos HPAs pesados, que inclui o B(a)P, deve permanecer abaixo de 5 µg/Kg (CAMARGO, TOLEDO, 1998).

De acordo com decisão do Comitê Científico da Alimentação Humana, da

Comunidade Européia (CE), os níveis de HPAs e de B(a)P nos gêneros alimentícios

devem ser reduzidos a concentrações tão baixas quanto possível. Desta forma,

através do Regulamento (CE) nº 208, de 04 de fevereiro de 2005, este Comitê

determinou que se utilizasse o Benzo(a)Pireno como marcador relativo à ocorrência

de outros HPAs cancerígenos e determinou limites máximos para este contaminante

para alguns tipos de alimentos. Tais valores estão apresentados no Quadro 3.

32 Produto alimentício B(a)P (µg/Kg de peso fresco)

Óleos e gorduras 2,0

Alimentos para lactentes e crianças 1,0 Carnes defumadas e produtos defumados à base

de carnes 5,0

Partes comestíveis de peixes defumados 5,0

Partes comestíveis de peixes 2,0

Moluscos bivalves 10,0

Crustáceos e cefalópodes 5,0

Quadro 4 - Níveis máximos de B(a)P em alguns tipos de alimentos de acordo com o Regulamento (CE) nº 208, de 04 de fevereiro de 2005, da Comunidade Européia

Fonte: Caruso, 2007.

3.5 Evolução da metodologia analítica para determinação de B(a)P em alimentos, bebidas e águas.

Na década de 60, a metodologia utilizada para análise de HPAs em alimentos envolvia Extração Líquido-Líquido (ELL), purificação em coluna cromatográfica clássica, separação em cromatografia em papel e em camada delgada e quantificação por espectrofotometria na região do ultravioleta. Eram empregados grandes volumes de solventes (em torno de 3000 mL), como etanol, dimetilsulfóxido, isooctano, e benzeno, sendo este último considerado cancerígeno (HOWARD et al., 1965, 1966 abc; 1968; MANOSKI et al., 1968; THE MERCK INDEX, 1989). A partir de 1975, Grimmer e Böhnke, propuseram uma metodologia que vem sendo bastante utilizada por diversos pesquisadores. Envolve ELL com cicloexano, com dimetilformamida/água e novamente com cicloexano. A etapa de purificação é feita em coluna clássica. Neste método, ainda eram gastos grandes volumes de solventes, acima de 2500 mL, aproximadamente. Esta metodologia, no entanto, vem sofrendo várias modificações desde a sua publicação, sendo que atualmente o volume de solvente empregado é quase 1/6 desse total (TFOUNI et al., 2007;

FALCÓ et al., 2003; CAMARGO, TOLEDO, 2002ab; CAMARGO, TOLEDO, 2001,

2000, 1998; CAMARGO, TOLEDO, 1998). Por outro lado, alguns pesquisadores têm

adotado o aparelho de ultrassom para extração de HPAs, obtendo resultados

satisfatórios com simplicidade, menor tempo de análise e pequenos volumes de

solvente. De um modo geral, os solventes mais utilizados para este fim são

33 acetona/n-hexano (JÁNSKÁ et al., 2006; BANJOO, NELSON, 2005), diclorometano (LIN et al., 2005), diclorometano/acetona (LIN, ZHU, 2004), éter etílico/cloreto de metileno (NIEVA-CANO et al., 2001), clorofórmio (CEJPEK et al., 1995), e cicloexano (JOE et al., 1982).

Nos últimos anos, observa-se um crescente número de trabalhos em que a extração em fase sólida vem sendo utilizada para extração ou purificação dos extratos de HPAs. Isto ocorre pela praticidade, custos relativamente pequenos, volume de solventes e tempo reduzidos, bem como pelos excelentes resultados de recuperação e repetitividade que este método proporciona (CARUSO, 2007).

A seguir é abordada a técnica de cromatografia, já que foi esta a técnica utilizada para elaboração da pesquisa.

3.6 Cromatografia

A cromatografia faz parte de um importante grupo de métodos de separação, que nos permite separar, isolar, identificar e quantificar substâncias, mesmo em misturas muito complexas.

Existem várias técnicas cromatográficas, que vão das mais simples, como a cromatografia em papel, até as mais sofisticadas, como a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). O ponto comum entre essas técnicas, e que caracteriza o método, é o fato dos componentes da mistura que compõem uma amostra, serem distribuídos entre duas fases. Uma delas permanece fixa, e por isso é chamada de fase estacionária (F.E.), enquanto a outra percola através da F.E., sendo então chamada de fase móvel (F.M.). Esta situação dinâmica resulta em uma migração diferenciada, ou seja, os componentes da amostra têm diferentes velocidades ao passarem pela fase estacionária. (SKOOG et al., 2001).

A fase estacionária, de forma geral, é acondicionada nas chamadas colunas

cromatográficas, que na sua maioria são tubos de vidro ou metal de dimensões

diversas. Quando essa fase é um sólido, basta que a coluna seja preenchida com o

mesmo, de acordo com técnicas especiais. Por outro lado, quando a fase

estacionária é um líquido, esse pode tanto revestir as paredes da coluna, no caso de

34 colunas capilares, quanto estar aderido a um suporte sólido com o qual se preenche a coluna.

A amostra é introduzida na coluna e a fase móvel carreia os diversos componentes dessa amostra através da coluna e, dependendo do tipo de cromatografia, pode participar ou não da separação. Assim, a separação dos diversos componentes será dada em função de uma maior ou menor afinidade de cada um deles, por cada uma das fases. Logo, o componente com maior afinidade pela fase estacionária fica mais tempo retido na coluna, enquanto aquele que tiver mais afinidade pela fase móvel percorrerá a coluna com maior rapidez. Outras características importantes na separação serão o tamanho da molécula, sua massa e, no caso da cromatografia em fase gasosa, sua pressão de vapor (ou ponto de ebulição) (SKOOG et al., 2001).

3.6.1 Cromatografia em fase gasosa

A cromatografia gasosa veio possibilitar, de maneira rápida e eficiente, uma série de separações extremamente difíceis, ou mesmo impossíveis pelos métodos convencionais, como por exemplo, a separação da mistura benzeno-cicloexano, impossível de ser feita por destilação fracionada, ou ainda, a análise de gases provenientes de automóveis, contendo mais de cem componentes, que podem ser separados por essa técnica. Os princípios do método cromatográfico são os mesmos para todas as formas de cromatografia, ou seja, é um processo no qual uma mistura de substâncias pode ser separada nos seus constituintes graças à passagem de uma fase móvel gasosa, que carreia a mistura, sobre uma fase estacionária.

Como o nome denota, a Cromatografia Gasosa (CG) é aquela em que a fase móvel é um gás , podendo a fase estacionária ser um sólido ou um líquido.

A função do gás usado como fase móvel é apenas a de carrear os componentes da amostra através da coluna, sem participar dos processos de interação. Por este motivo é chamado gás de arraste. Exemplos de gases mais utilizados em CG são o hélio (He), hidrogênio (H

) e o nitrogênio (N

).

Na figura abaixo se observam os principais componentes de um Cromatógrafo

a Gás.

35

Figura 5 - Esquema de um cromatógrafo a gás

Fonte: Skoog, 2001 p. 762.

O gás de arraste passa através de um regulador de pressão e penetra no

injetor de amostra, arrastando a amostra para a coluna. Os componentes da amostra

são separados durante a passagem pela coluna e, um após o outro, passam pelo

detector que, por sua vez, envia um sinal ao registrador. Quando qualquer

substância diferente do gás de arraste passa pelo detector, este gera um sinal

elétrico ao registrador proporcional, que passa para o papel ou para um computador

o registro dos sinais recebidos, compondo o cromatograma. Para uma amostra de 3

componentes (A, B e C), por exemplo, o aspecto do cromatograma ideal seria o

seguinte:

36

Figura 6 - Cromatograma ideal para uma amostra contendo três substâncias

Fonte: Adaptado de Skoog, 2006

Atualmente, existem muitos detectores que podem ser acoplados tanto a cromatografia gasosa, quanto à cromatografia líquida. No item a seguir, será abordado o detector Espectrometria de Massa (EM), o qual foi utilizado para elaboração deste trabalho.

3.7 Espectrometria de Massas

A espectrometria de massas é uma técnica de detecção que utiliza o movimento de íons em campo elétrico e magnético para classificá-los de acordo com sua relação massa/carga. Desta maneira, a espectrometria de massas é uma técnica analítica por meio da qual as substancias químicas são identificadas e/ou quantificadas, separando os íons gasosos através do uso de campos elétricos e magnéticos. O dispositivo que realiza esta operação e utiliza meios elétricos para detectar os íons classificados é conhecido como espectrômetro de massas.

Um espectrômetro de massa é composto por sistema de vácuo, fonte de íons,

analisador de massas, detector de íons e sistema de processamento de dados,

assim como é demonstrado na figura 7.

37

Figura 7 - Esquema de componentes de um sistema de cromatografia gasosa com espectrometria de massas (GC/MS)

Fonte: Adaptado de Skoog, 2001, p. 272.

Na fonte de íons os componentes de uma amostra são convertidos em íons positivos ou negativos por bombardeamento das moléculas vaporizadas da amostra e são imediatamente acelerados em direção ao analisador de massa. Existem várias técnicas de ionização, sendo a de ionização química e ionização por impacto de elétrons (IE) as mais conhecidas. A seguir será detalhada de uma melhor forma a técnica de ionização por impacto de elétrons, sendo que esta foi à utilizada para a construção deste trabalho.

3.7.1 Ionização por impacto de elétrons

Na técnica de impacto de elétrons, comumente a mais utilizada, por ter maior

sensibilidade e maior abrangência, um espectrômetro de massas bombardeia

38 moléculas na fase vapor com feixe de elétrons de alta energia e registra o resultado do impacto dos elétrons como um espectro de íons separados na base da razão massa/carga (m/z).

Um analisador separa tais íons de acordo com a sua relação massa/carga (m/z), que geralmente é selecionada previamente de acordo com as massas de interesse para o analito em questão e então ocorre o registro dos sinais gerados num software, no qual é possível verificar o cromatograma gerado e após investigar as massas e áreas geradas, podendo ser calculado através de uma curva de calibração a concentração obtida na amostra.

3.7.2 Analisador

Um analisador bastante utilizado é o quadrupolo, porque este instrumento é considerado o mais barato, compacto e robusto espectrômetro de massas do mercado sendo considerado um filtro de massas de alta velocidade de varredura (SKOOG et al., 2001).

A Figura 8 mostra um esquema do analisador de massas quadrupolar e abaixo o sistema de seleção de massas, onde no eixo x são transmitidas razões massa- carga inferior a um determinado valor e no eixo y superior. Isto ocorre de forma que apenas uma unidade de massa seja estável em sua trajetória até o detector.

Figura 8 - Esquema representativo de um analisador tipo quadrupolo

Fonte: Adaptado de Skoog, 2006, p. 825.

Rolos do

quadrupolo Detector

Íons que serão

detectados

Íons descarragados

39

Um campo elétrico é formado por quatro barras paralelas as quais é aplicada uma corrente contínua que afeta o percurso dos íons. Para determinadas voltagens, somente os íons de uma relação massa/carga específica podem passar através do filtro do quadrupolo, enquanto os outros são varridos como moléculas descarregadas.

Finalmente um detector recebe os íons que foram separados pelo analisador, transformando a corrente de íons em sinais elétricos que são processados.

A seguir são descritos alguns parâmetros utilizados na validação de resultados.

3.8 Validação de resultados

A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas está sendo cada vez mais reconhecida e exigida. Dados analíticos não confiáveis podem conduzir a decisões desastrosas e a prejuízos financeiros irreparáveis. Para garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis ele deve sofrer uma avaliação denominada validação (RIBANI et al., 2004).

É fundamental que os laboratórios disponham de meios e critérios objetivos para demonstrar, através da validação, que os métodos de ensaio que executam conduzem para resultados confiáveis e adequados à qualidade pretendida (INMETRO, 2003).

3.8.1 Linearidade

A linearidade é a habilidade do método em gerar resultados diretamente

proporcionais à concentração do analito dentro da faixa de trabalho a qual

corresponde às concentrações máximas e mínimas do analito que podem ser

quantificadas com exatidão e precisão (RIBANI et al., 2004; SHABIR, 2003; LEITE,

2000). Na maior parte dos casos, a relação matemática entre o sinal e a

40 concentração da espécie de interesse deve ser determinada empiricamente, a partir de sinais medidos para diversas concentrações conhecidas dessa espécie (LEITE, 2000)

Essa relação matemática, muitas vezes, pode ser expressa através de uma equação de reta chamada de curva analítica. A equação da reta que relaciona as variáveis dependentes (y) e independentes (x) é:

Onde:

y: variável dependente;

x: variável independente;

a: coeficiente angular (expressa a inclinação da curva de calibração);

b: coeficiente linear (expressa a interseção da curva com o eixo y).

Matematicamente, a estimativa dos coeficientes de uma curva analítica a partir de um conjunto de medições experimentais pode ser efetuada usando o método matemático. Um dos mais conhecidos é o de regressão linear, também chamado de método dos mínimos quadrados, utilizado para estimar qual a melhor reta que representa os pontos da curva analítica. Além dos coeficientes de regressão a e b, também é possível calcular, a partir dos pontos experimentais, o coeficiente de correlação r, que expressa à relação de x e y na curva. Este parâmetro permite uma estimativa da qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximo de 1,0, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados. Para verificar se a equação de regressão é estatisticamente significativa podem ser efetuados os testes de ajuste do modelo linear, validade da regressão. Um coeficiente de correlação maior que 0,990 é considerado como evidência de um ajuste ideal dos dados para a linha de regressão.

y = ax + b

... (1)

41 3.8.2 Limite de Detecção (LD)

O limite de detecção (LD) de uma metodologia analítica é definido como a menor concentração de um analito que pode ser detectada em uma dada amostra, porém, não quantificada dentro dos limites de precisão e exatidão estabelecidos (SHABIR, 2003).É geralmente determinado através de soluções padrões muito diluídas, como uma comparação da relação sinal/ruído, ou seja, compara-se o sinal obtido das soluções com aqueles obtidos de brancos ou ruídos do sistema, estabelecendo assim o nível do ruído e o nível mínimo de sinal realmente detectável, sendo geralmente aceitas razões sinal/ruído de 2:1 a 3:1.

Dentre os métodos utilizados para calcular o limite de detecção, estão os procedimentos recomendados pela Eurachem, que é uma rede de organizações nacionais européias que juntamente com a Comissão Europeia tem por objetivo estabelecer um sistema para a rastreabilidade internacional dos resultados de medições químicas e promover as boas práticas laboratoriais. Os guias da Eurachem são traduzidos no Brasil pela Anvisa recomendam que o LD seja estabelecido efetuando-se a leitura ou injeção de amostras em branco, ou brancos fortificados na menor concentração aceitável, isto é, com um grau de incerteza aceitável. Em geral o limite de detecção é calculado através da média dos valores encontrados mais três desvios padrões, sendo também necessário estabelecer a média e o desvio padrão, conforme fórmulas abaixo:

Média: X = ∑ x

i

n

n

Desvio Padrão: S = ∑ (xi - x) n - 1

i

n

2

... (2)

... (3)

42

Onde:

X = média;

xi = resultado individual;

S = desvio padrão;

n = número de dado

3.8.3 Limite de Quantificação (LQ)

O limite de quantificação (LQ) é o menor valor determinado, em confiabilidade de precisão e exatidão aceitáveis, para uma determinada condição analítica.

Determina-se reduzindo a concentração do analito numa amostra até que seja encontrado um valor mínimo a partir do qual a precisão e exatidão do método já não são mais aceitáveis.

É normalmente expresso na mesma unidade das amostras, e pode também ser relatado como a concentração cuja relação sinal/ruído=10, através da análise do ruído do sistema. Para calcular o limite de quantificação a seguinte fórmula deve ser utilizada.

3.8.3 Recuperação

A recuperação é definida com uma proporção da quantidade da substância de interesse, presente ou adicionada na porção analítica do material teste, que é extraída e passível de ser quantificada. A informação de recuperação pode ser estimada através da fortificação de uma quantidade conhecida de um padrão de

LD = 3 X S

... (4)

LQ = 10 X S

... (5)

43 referência, ou de um composto substituto (RIBANI et al., 2004).

Conforme a ANVISA, pode ser calculada através da fortificação de uma amostra em três níveis diferentes, como por exemplo:

1º nível - ponto médio da faixa de trabalho menos 50% (concentração baixa) 2º nível - ponto médio da faixa de trabalho (concentração média)

3º nível - ponto médio da faixa de trabalho mais 50% (concentração alta) As determinações devem ser feitas usando o mesmo procedimento de quantificação especificado no método final, mas normalmente emprega-se um mínimo de seis replicatas de cada concentração. Os valores médios aceitos, em geral, dependem da faixa de concentração estudada, utilizando-se em muitos casos valores de recuperações aceitáveis de 80 – 120%.

A recuperação pode ser calculada através das fórmulas:

Onde:

C

= concentração do analito na amostra fortificada;

C

= concentração do analito na amostra não fortificada;

C

= concentração do analito adicionada à amostra;

A seguir é descrito o procedimento experimental, no qual é relatado como o processo de análise foi realizado.

% Rec = C

– C

C

X 100

... (6)

% Erro = 100 - %Rec

... (7)

44 4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

O procedimento experimental utilizado para a análise esta descrito abaixo.

4.1 Amostragem

As amostras de chá verde foram adquiridas no período de abril de 2009, no comércio de Porto Alegre/RS. Foram selecionadas sete amostras de chá verde de sache, de marcas diferentes, de forma aleatória, que posteriormente foram submetidas à análise para a identificação do contaminante Benzo(a)pireno.

As amostras foram codificadas como 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7.

4.2 Materiais

a) Frasco de 50 mL com tampa;

b) Balões volumétricos calibrados de 10, 50 e 250 mL;

c) Micropipetadores, Transferpette Dig, Brand – volume fixo: 250, 500 e 1000 µL e volume variável de 10 a 100 µL e 1,0 a 10,0 mL

d) Funil de separação de vidro, volume de 250 mL, com tampa e torneira de Teflon;

e) Balão de fundo redondo 50 mL, Pyrex;

f) Microseringas de 10 µL, Hamilton;

g) Papel de filtro qualitativo;

h) Pipeta Pasteur descartável;

i) Funil;

j) Tubo de ensaio;

k) Dispensador para frasco Dispensette de 50 mL;

l) Frasco (vial) com tampa para o amostrador automático.

45 4.3 Equipamentos

a) Sistema cromatográfico, Agilent, composto de cromatógrafo a gás (GC 6890), injetor automático modelo 7683, detector seletivo de espectrometria de massas (5973N), com acessório para ionização por impacto de elétrons, software (MSD Chemstation G 1701CA version D.03.00SP1);

b) Balança analítica com precisão de 0,1mg, Metler AG204;

c) Banho de ultra-som Chubby Thornton;

d) Chapa aquecedora Eletrolab;

e) Agitador orbital New Brunswick Scientific;

f) Misturador (mixer) Termolyne;

g) Sistema para extração em fase sólida Merck Lichrolut;

h) Coluna capilar de sílica fundida 5% fenil metilpolisiloxano (DB-5), 30 m, 0,32 mm, 0,25 µm (J&W Scientific 12-5032);

i) Rota evaporador Yamato RE540.

4.4 Reagentes

a) Diclorometano (CH

Cl

) - grau HPLC, marca TÉDIA;

b) Cicloexano (C

H

) - grau HPLC, marca TÉDIA;

c) Pentano (C

H

) - grau HPLC, marca TÉDIA;

d) Metanol (CH

OH) - grau HPLC, marca TÉDIA;

e) Água deionizada qualidade American Society for Testing and Materials (ASTM - Sociedade Americana para Ensaios e Materiais) grau 1;

f) Hydromatrix® (terra diatomácea) Chem Elut Varian 198004;

g) Cartucho contendo 1,0g de sílica gel e capacidade de 6,0mL, Applied Separations SPE 2107;

h) Cartucho contendo 1,0g de ciclohexil e capacidade de 6,0mL, Applied

Separations SPE 2077.

46 4.5 Padrões

No quadro 5, estão descritas as especificações dos padrões utilizados.

Padrão Fórmula Molecular Pureza (%) Marca Benzo(a)pireno -B(a)P C

H

98 Dr. Enrenstorfer

Benzo(a)pireno dodecadeuterado -

B(a)P D12

C

D

98 Dr. Enrenstorfer

Quadro 5 – Padrões analíticos utilizados.

Fonte: Autoria própria, 2010

4.6 Preparo de Padrões

A seguir estão descritas as etapas necessárias para a realização do preparo das soluções padrão e curva de calibração. Foi utilizado padrão analítico com pureza mínima de 98% de pureza, de benzo(a)pireno (B(a)P) e também de Benzo(a)pireno dodecadeuterado (B(a)P D12), que é utilizado como padrão interno do processo.

4.6.1 Soluções estoques primárias

a) Benzo(a)pireno (1,0 mg/mL)

Foi pesado aproximadamente 50 mg de benzo(a)pireno em balança

analítica, transferido para balão volumétrico de 50 mL e elevado ao volume

final com cicloexano.

47 b) Benzo(a)pireno dodecadeuterado (1,0 mg/mL)

Foi pesado aproximadamente 50 mg de benzo(a)pireno dodecadeuterado em balança analítica, transferido para balão volumétrico de 50 mL e elevado ao volume final com cicloexano.

Esta solução foi utilizada como Padrão Interno (PI)

O quadro 6 relaciona a massa de cada padrão analítico e sua respectiva concentração na solução.

Padrão Massa (mg) Concentração (mg/mL)

Benzo(a)pireno -B(a)P 50,0 1,0

Benzo(a)pireno - B(a)P D12 50,0 1,0

Quadro 6 – Soluções estoque primárias

Fonte: Autoria própria, 2010

4.6.2 Soluções estoques secundárias

c) Benzo(a)pireno (0,1mg/mL)

Foi transferida uma alíquota de 1,0 mL da solução estoque primária (a) para balão volumétrico de 10 mL e elevado ao volume final com cicloexano.

d) Benzo(a)pireno dodecadeuterado (0,1mg/mL)

Foi transferida uma alíquota de 1,0 mL da solução estoque primária (b) para balão volumétrico de 10 mL e elevado ao volume final com cicloexano.

O quadro 7 relaciona as alíquotas das soluções estoque primárias e suas respectivas concentrações,após diluição, nas soluções estoque secundárias.

Padrão Massa (mg) Concentração (mg/mL)

Benzo(a)pireno -B(a)P 1,0 0,1

Benzo(a)pireno - B(a)P D12 1,0 0,1

Quadro 7 - Soluções estoque secundárias

Fonte: Autoria própria, 2010