UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
TATIANA NUNES MASCARENHAS SÁ
PRODUÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO UTILIZANDO GLICEROL RESIDUAL DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL COMO SUBSTRATO
TATIANA NUNES MASCARENHAS SÁ
PRODUÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO UTILIZANDO GLICEROL RESIDUAL DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL COMO SUBSTRATO
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Engenharia Química, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química.
Orientadora: Profª. Drª. Sueli Rodrigues
FORTALEZA – CE
S115p Sá, Tatiana Nunes Mascarenhas
Produção de ácido cítrico utilizando glicerol residual da produção de biodiesel como substrato / Tatiana Nunes Mascarenhas Sá .
83 f: il. color. enc.
Orientadora: Profa. Dra. Sueli Rodrigues
Área de concentração: Processos Químicos e Bioquímicos. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia. Depto. de Engenharia Química, Fortaleza, 2011.
1. Ácido cítrico 2. Biodiesel 3. Fermentação 4. Glicerol I. Rodrigues, Sueli (orient.) II. Universidade Federal do Ceará – Programa de
Pós-Graduação em Engenharia Química III.Título
AGRADECIMENTOS
Agradeço, em primeiro lugar, a Deus, meu Senhor e Salvador, por guiar-me e por ter-me concedido saúde e disposição para os estudos e execução deste trabalho.
Aos meus pais, Otaciana e Valter, por estarem sempre presentes em minha vida, pela dedicação, amor, carinho, cuidado, apoio e por toda a educação e princípios ensinados.
Ao grande amor de minha vida, amigo, companheiro, meu noivo e, em breve esposo, Edilson, por estar comigo nesses doze anos, e por todo amor, compreensão, auxílio e paciência dedicada a mim. Aos seus pais Edilson Ferreira e Maria do Socorro, por serem tal uma segunda família para mim.
Às minhas lindas e amadas irmãs Ticiana e Luciana por todos os momentos que passamos juntas, pela amizade e companheirismo que desfrutamos todos esses anos.
À professora Dra. Sueli Rodrigues, por receber-me no laboratório em que trabalha e ensina, pela paciente orientação e oportunidade de aprender. Pelos ensinamentos preciosos que tanto estimularam e contribuíram para a formação desta pesquisa, os quais certamente significaram e seguirão por significar um marco em minha vida pessoal, profissional e acadêmica.
Ao meu grande amigo Tiago, que tanto me apoiou e ajudou, desde a graduação, e que participou ativamente deste projeto. Agradeço por toda amizade, inclusive para além das portas do laboratório, e por toda a ajuda durante a realização dos experimentos.
A todos que acreditam em minha capacidade e apóiam meus estudos. Aos amigos que conheci durante a caminhada da vida, em especial: Ana Laryssa, Adrinaldo, José Cláudio, Danielle Pessoa, Renatinha, Alexandre. As minhas tias Otacione e Ione por todas as orações e apoio.
Genilton, Raíssa, Márcia e Rivalda, pela amizade e por terem participado de meu crescimento acadêmico.
Aos amigos “colabioradores” do Laboratório de Biotecnologia: Tiago, Rosy, Cláudia, Luiz Carlos, Mariana, Simone, Imilena, Cristiane, Soraya, Ana Laura, Tatiane Maciel, Mayra, Jonas, Niedla, Diva, Micael, Raquel, Rayanne e Thatyane Vidal. Obrigada pelo companheirismo, ajuda e amizade no ambiente de trabalho e fora da universidade.
Aos colegas do Departamento de Engenharia Química, em especial Francisca Maria, Milena, Janaina, Jefferson, Kerolaine, Assis, Cleiton, Valeria, Márcio e Álvaro.
Aos membros da banca examinadora, Profª. Dra. Luciana e Dra. Gorete, que aceitaram o convite para participar da banca de avaliação deste trabalho.
Aos os professores do Departamento de Engenharia Química pela competência, ensinamentos e colaboração durante o curso de mestrado.
À secretária do curso de Pós-Graduação, Maria, pela amizade e pela dedicação e ajuda no decorrer do curso
À Universidade Federal do Ceará, pela possibilidade de cursar o mestrado e seguir a carreira acadêmica.
RESUMO
Devido aos incentivos governamentais, os quais impulsionam a produção de biodiesel, tal combustível tem sido produzido em larga escala. Entretanto, o referido crescimento tem se revelado exacerbado, fazendo surgir um preocupante fator: o destino do glicerol excedente da produção de biodiesel. Tal inquietação se mostra clara ao se revelar um importante dado: para cada tonelada de biodiesel obtido, são gerados 100 Kg de glicerol, o que provoca efeitos adversos à economia do biodiesel. Neste contexto, teme-se que o excesso de glicerina produzida, a qual provoca um elevado nível de poluição, possa ser descartada de maneira irresponsável no meio ambiente. Sendo assim, têm-se desenvolvido pesquisas destinadas à busca de alternativas para a utilização do volume excedente de glicerol. A bioconversão de glicerol por via fermentativa é uma alternativa que agrega um valor significativo para a produtividade da indústria de biodiesel. O glicerol pode ser utilizado por inúmeros micro-organismos, em processos metabólicos, como fonte de carbono. Leveduras como as da espécie Yarrowia lipolytica, quando cultivadas em meio com limitação de nitrogênio, são capazes de produzir quantidades significantes de ácido cítrico a partir do glicerol. O ácido cítrico é, atualmente, um dos mais importantes ácidos orgânicos produzidos por via fermentativa. Devido às suas características, tem sido amplamente utilizado na indústria de alimentos e bebidas e também como aditivo em detergentes, produtos farmacêuticos, cosméticos e de higiene pessoal. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo avaliar, através de fermentação, rotas de bioconversão do glicerol residual da produção de biodiesel com elevados níveis de impurezas, para obtenção de ácido cítrico. Para isso, foram utilizadas, inicialmente, duas cepas de leveduras potencialmente produtoras do ácido: Yarrowia lipolytica NRRL YB 323 e Yarrowia lipolytica NRRL YB 423. Utilizando a Metodologia de Planejamento Experimental e Análise da Superfície de Resposta, foram investigadas as concentrações iniciais de fonte de carbono e fontes de nitrogênio orgânico (extrato de levedura) e inorgânico (sulfato de amônio) em frascos agitados. Os resultados revelaram que a concentração inicial ideal de glicerol residual do biodiesel como fonte de carbono, dentro da faixa estudada, foi de 20g.L-1. Quanto às fontes de nitrogênio, pôde-se constatar que estas não apresentaram notável influência para a produção do ácido. Também verificou-se que a adição de Tiamina ao meio não promoveu o aumento na quantidade de ácido cítrico acumulado. A levedura Yarrowia lipolytica NRRL YB 423 se revelou mais eficaz na produção do ácido. Foram realizados ensaios em fermentador de bancada para avaliar- se a melhor concentração de oxigênio dissolvido no meio. Viu-se que as concentrações mais elevadas de oxigênio dissolvido no meio fermentativo favorecem a produção de ácido cítrico. Para níveis de oxigênio de 50%, observou-se um menor rendimento, enquanto que, para 70%, a produção de ácido cítrico foi favorecida. O rendimento percentual final para a produção de ácido cítrico obtido a partir de 20g.L-1 de glicerol residual do biodiesel adicionado inicialmente ao meio foi de 24,80% em três dias de fermentação.
ABSTRACT
Due to government financial incentives, which boost the production of biodiesel, there has been a large scale production of this fuel. However, this growth has proved to be exaggerated, rising a worrying factor: the destination of the glycerol excess from biodiesel production. Such concern is clearly shown to prove an important fact: for every ton of biodiesel produced, 100 kg of glycerol are generated, which leads to adverse effects on the biodiesel economy. In this context, it is feared that the over-produced glycerine, which causes a high level of pollution, can be discarded irresponsibly into the environment. So, researches have been being developed, aiming to find other alternatives for the use of the extra volume of glycerol. The bioconversion of glycerol by fermentation is good option that adds significant value to the productivity of the biodiesel industry. Glycerol can be used by several microorganisms in metabolic processes, as a carbon source. Some yeasts species, such as Yarrowia lipolytica, when grown on a media with a limited source of nitrogen, are able to produce significant amounts of citric acid from glycerol. Citric acid is currently one of the most important organic acids produced by fermentation. Due to its characteristics, it has been widely used in food and beverage industry and also as an additive for detergents, pharmaceuticals, cosmetics and toiletries. Thus, this study aimed to evaluate, through fermentation, bioconversion routes of residual glycerol from biodiesel production with high levels of impurities, in order to obtain citric acid. For this, two potential acid-producing yeast strains (Yarrowia lipolytica NRRL YB 323 and Yarrowia lipolytica NRRL YB 423) were initially used. Using the Methodology of Experimental Design and Response Surface Analysis, it was investigated the initial concentrations of carbon sources as well as organic (yeast extract) and inorganic (ammonium sulfate) nitrogen sources in shake flasks. The results obtained showed that the optimal initial concentration of glycerol from waste biodiesel as carbon source, within the studied range, was 20 g L-1. As to the nitrogen sources, they were proved having no remarkable influence on the acid production. It was also found that thiamine addition to the media did not promote the increase on the amount of the previously accumulated citric acid. Yarrowia lipolytica NRRL YB 423 was proved more effective on the acid production. The tests which were carried out in the fermenter aimed to evaluate the optimal concentration of dissolved oxygen in the media. It was observed that highest concentrations of dissolved oxygen in fermentation media, promotes the production of citric acid. For levels of 50% oxygen, there was a lower yield, while for 70%, citric acid production was favored. The final percentage yield for the production of citric acid obtained from 20 g L -1 of residual glycerol from the biodiesel initially added to the media was 24.80%, at the end of three days of fermentation.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estrutura do Glicerol (ARRUDA et al. 2006) ... 7
FIGURA 2 Fórmula estrutural do ácido cítrico... 12
FIGURA 3 Microscopia ótica das estirpes estudadas, utilizando a objetiva de 100x. Em A Yarrowia lipolytica YB-323 e em B Yarrowia lipolytica YB-423 ... 19
FIGURA 4 Fermentador TECNAL, modelo TEC-BIO R1.5 de 1,0L 27
FIGURA 5 Resultados da fermentação realizada em shaker, a qual se baseou nos experimentos de Levison et al. (2007), utilizando-se glicerol analítico a uma concentração inicial de 40g.L-1... 31
FIGURA 6 Velocidades específicas de crescimento microbiano e produção de ácido cítrico para a fermentação realizada em shaker, baseada nos experimentos de Levison et al. (2007), utilizando-se glicerol analítico, a uma concentração inicial de 40g.L-1. ... 32
FIGURA 7 Resultados da fermentação realizada em shaker, utilizando glicerol residual do biodiesel a uma concentração inicial de 40 g.L-1. ... 33
FIGURA 8 Velocidades específicas de crescimento microbiano e produção de ácido cítrico, para a fermentação realizada em shaker, utilizando glicerol residual do biodiesel a uma concentração inicial de 40 g.L-1... 34
FIGURA 9 Diferenças entre os rendimentos apresentados pela levedura Yarrowia lipolytica YB 323 para as três concentrações de glicerol, em meios com e sem tiamina ... 36
FIGURA 10 Diferenças entre os rendimentos apresentados pela levedura Yarrowia lipolytica YB 423 para as três concentrações de glicerol, em meios com e sem tiamina... 37
FIGURA 11 Diagrama de Pareto com o efeito estimado (valor absoluto) das variáveis testadas no planejamento experimental DCCFC, para a produção de ácido cítrico (%) por Yarrowia lipolytica YB 323... 40
variáveis testadas no planejamento experimental DCCFC, para a produção de ácido cítrico (%), por Yarrowia lipolytica YB 423... 40
FIGURA 13 Superfície de resposta para as variáveis: extrato de levedura e
glicerol em 48 h de fermentação com Y. lipolytica YB-323... 43
FIGURA 14 Superfície de resposta para as variáveis sulfato de amônio e
glicerol em 48 h de fermentação com Y. lipolytica YB-323... 44
FIGURA 15 Superfície de resposta para as variáveis extrato de levedura e
glicerol em 48 h de fermentação com Y. lipolytica YB – 423... 44
FIGURA 16 Produção de biomassa (g.L-1) de Y. lipolytica YB-323 para os
ensaios 1 a 9, com pH inicial ajustado para 6,0... 45
FIGURA 17 Produção de biomassa (g.L-1) de Y. lipolytica YB-323 para os
ensaios 10 a 17, com pH inicial ajustado para 6,0... 46
FIGURA 18 Produção de biomassa (g.L-1) de Y. lipolytica YB-423 para os ensaios 1 a 9, com pH inicial ajustado para 6,0... 47
FIGURA 19 Figura 19. Produção de biomassa (g.L-1) de Y. lipolytica YB-423 para os ensaios 10 a 17, com pH inicial ajustado para 6,0... 47
FIGURA 20 Variação de pH para Y. lipolytica YB-323 para os ensaios de 1 a 17... 48
FIGURA 21 Variação de pH para Y. lipolytica YB-423 para os ensaios de 1 a 17 ... 49
FIGURA 22 Rendimento percentual de ácido cítrico para Y. lipolytica NRRL 323 nos diferentes meios utilizados... 50
FIGURA 23 Rendimento percentual de ácido cítrico para Y. lipolytica NRRL 423 nos diferentes meios utilizados... 51
FIGURA 24 Comparação do rendimento final de ácido cítrico para as leveduras Y lipolytica 323 e Y lipolytica 423 em meio contendo 20g.L-1 de glicerol, suplementado e não suplementado com fontes de nitrogênio (extrato de levedura, sulfato de amônio)... 53
FIGURA 25 Dorna do fermentador com formação de
espuma... 55
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Produção e distribuição nacional de biodiesel ... 6
Tabela 2 Aplicações de ácido cítrico ... 14
Tabela 3 Composição do meio TSB (Trypticase Soy Broth) ... 20
Tabela 4 Composição do meio Agar batata Dextrose (HIMEDIA) ... 21
Tabela 5 Meio fermentativo adaptado de Levison et al. (2007) ... 22
Tabela 6 Composição do meio Fermentativo (Mineral) ... 23
Tabela 7 Variáveis utilizadas no DCCFC 23 para produção de ácido cítrico... 24
Tabela 8 Matriz do planejamento DCCFC (23)... 24
Tabela 9 Meio utilizado para investigação da supressão de fontes de nitrogênio .. 26
Tabela 10 Variação de pH, biomassa, rendimento de ácido cítrico e fator de conversão, para meios com e sem tiamina, a 48 h de fermentação - YB-323... 35
Tabela 11 Biomassa, rendimento de ácido cítrico e fator de conversão, para meios com e sem tiamina, a 48 h de fermentação - YB-423. ... 36
Tabela 12 Matriz do planejamento DCCFC 23 (valores codificados), resposta para a produção de ácido cítrico em rendimento(%) e fator de conversão de biomassa em produto (Yp/x) para YB 323 ... 38
Tabela 13 Matriz do planejamento DCCFC 23 (valores codificados), resposta para a produção de ácido cítrico em rendimento(%) e fator de conversão de biomassa em produto (Yp/x) para YB 423 ... 39
Tabela 14 Coeficiente de regressão para a resposta de produção de ácido cítrico, em rendimento percentual. (48h de produção) – YB-323 ... 41
Tabela 15 Coeficiente de regressão para a resposta de produção de ácido cítrico, em rendimento percentual (48h de produção) – YB-423. ... 41
Tabela 16 ANOVA para resposta produção de ácidos – YB-323. ... 42
Tabela 17 ANOVA para produção de ácidos – YB-423 55... 42
Tabela 18 Resultados da fermentação de meio contendo 20g.L-1 de glicerol – YB323 e YB 423 ... 52
Tabela 19 Resultados da fermentação de meio contendo 20g.L-1 de glicerol em Erlenmeyer de 500mL – YB323 e YB423 ... 54
dissolvido no meio... 56
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS... i
LISTA DE TABELAS... iii
1 INTRODUÇÃO... 01
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 04
2.1 O Biodiesel no Brasil ... 04
2.2 Glicerol ... 07
2.3 Yarrowia lipolytica... 09
2.4 Ácido cítrico... 12
2.4.1 Fatores químicos que influenciam a produção de ácido cítrico... 16
2.4.2 Fontes de Carbono e Nitrogênio... 16
2.4.3 Fontes de Fosfato... 17
2.4.4 Aeração e agitação ... 17
2.4.5 Demanda de Ácido Cítrico ... 18
3 METODOLOGIA... 19
3.1 Micro-organismos Utilizados ... 20
3.1.1 Ativação do micro-organismo... 20
3.1.2 Preparo de cultura-estoque de Y. lipolytica NRRL 323 e Y. lipolytica NRRL 423... 21
3.2 Preparo do Inóculo ... 21
3.3 Ensaios com glicerol analítico e residual do Biodiesel.... 21
3.4 Efeito da Tiamina ... 23
3.5 Efeito das concentrações iniciais de substrato (glicerol residual) e das fontes de nitrogênio orgânica e inorgânica ... 23
3.6 Testes sem adição de extrato de levedura e sulfato de amônio na composição do meio ... 25
3.7 Utilização de Erlenmeyer de 500mL... 26
3.8 Ensaios em fermentador ... 26
3.9 Métodos Analíticos ... 28
3.9.1 Avaliação da Biomassa (g.L-1) ... 28
3.9.2 Análise do pH ... 28
3.9.4 Determinação de ácido cítrico ... 29
3.10 Calculo do rendimento... 29
3.11 Determinação de parâmetros cinéticos... 29
3.11.1 Velocidades especificas... 29
3.11.2 Fator de conversão (Yp/x) ... 30
4 RESULTADOS ... 31
4.1 Ensaios com Glicerol analítico e Residual do Biodiesel ... 31
4.2 Efeito da Tiamina ... 34
4.3 Efeito das concentrações iniciais de substrato (glicerol residual) e das fontes de nitrogênio orgânica e inorgânica ... 37
4.3.1 Crescimento em Biomassa (g.L-1) ... 45
4.3.2 Variação de pH... 48
4.3.3 Produção de ácido cítrico... 49
4.4 Fermentação com Supressão de Fontes de Nitrogênio ... 52
4.5 Utilização de Erlenmeyer de 500ml ... 53
4.6 Fermentação em Bioreator ... 54
4.6.1 Ensaio em fermentador de bancada, teste de aeração ... 55
5 CONCLUSÕES ... 58
6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 59
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 60
1. INTRODUÇÃO
Em razão das limitações oriundas das fontes de energia fósseis e das crescentes preocupações ambientais, tem sido dada uma grande atenção, nos últimos anos, às fontes alternativas de energia. O desenvolvimento de energias alternativas é uma escolha inevitável para o crescimento econômico sustentável na sociedade. Dessa forma, tem aumentado a demanda por biocombustíveis. Como exemplos, podem-se citar o etanol e o biodiesel obtidos a partir de matérias-primas renováveis, como a cana-de-açúcar, materiais lignocelulósicos, oleaginosas, gordura animal, dentre outras, cuja utilização permite uma maior redução das emissões de monóxido de carbono, quando comparados a combustíveis derivados do petróleo (LIN et al., 2011).
As rotas de obtenção de biodiesel são craqueamento, esterificação e transesterificação, sendo esta última a predominantemente utilizada. O processo consiste na reação entre um material graxo, de origem vegetal ou animal, e um álcool de cadeia curta (metanol ou etanol) na presença de um catalisador. Os principais resíduos gerados são tortas e farelos, oriundos da extração do óleo vegetal, e a glicerina, resultante da reação de transesterificação (YAZDANI e GONZALEZ, 2007).
O Brasil se destaca no panorama mundial do biodiesel, devido à sua grande diversidade em grãos, de onde é extraído o óleo vegetal, e à sua destacável criação de animais bovinos, que fornecem gordura animal e sebo. Frente a esse grande potencial produtivo, o Governo Federal, ao final do século XX, intensificou as discussões sobre a produção e uso do biodiesel, tendo sido efetuados vários estudos por comissões interministeriais em parceria com universidades e centros de pesquisa. Muitas estratégias foram traçadas pelo governo brasileiro. Dentre elas, destaca-se a criação do Programa Brasileiro de Desenvolvimento Tecnológico do Biodiesel (PROBIODIESEL), que visa à gradual substituição do diesel proveniente do petróleo pelo biodiesel (POUSA et al., 2007).
Até o ano de 2005, já havia sido realizada a substituição de todo diesel consumido no Brasil pelo B5 (composto de 5% de biodiesel e 95% de diesel). Estima-se que em aproximadamente 15 anos o B20 (composto de 20% de biodiesel e 80% de diesel) será introduzido no mercado de combustíveis brasileiro (POUSA et al., 2007).
glicerol excedente da produção de biodiesel. Tal inquietação se mostra clara ao se revelar um importante dado: para cada tonelada de biodiesel obtido, são gerados 100 Kg de glicerol, o que provoca efeitos adversos à economia do biodiesel (BOWKER et al., 2008).
Segundo Miguel Rossetto, presidente da Petrobrás Biocombustível, em entrevista à Agência Estado, a produção de biodiesel foi quadruplicada no final de 2010, chegando a 495 milhões de litros (O ESTADO DE SÃO PAULO, 2010).
Neste contexto, teme-se que o excesso de glicerina produzida, a qual provoca um elevado nível de poluição, possa ser descartada de maneira irresponsável no meio ambiente (COSTA, 2008). Sendo assim, têm-se desenvolvido pesquisas destinadas à busca de alternativas para a utilização do volume excedente de glicerol. A bioconversão de glicerol por via fermentativa é uma alternativa que agrega significativo valor à produtividade da indústria de biodiesel (SILVA et al., 2009).
O glicerol pode ser utilizado por inúmeros micro-organismos, em processos metabólicos, como fonte de carbono. Leveduras como as da espécie Yarrowia lipolytica,
Cândida tropicalis, Klebsiella pneumoniae e algumas espécies de Rhodorula sp., quando
cultivadas em meio com limitação de nitrogênio, são capazes de produzir quantidades significantes de ácido cítrico em diversas fontes de carbono, tais como: açúcares, alcanos, álcoois, óleos, amido hidrolisado e glicerol (NÉMETH et al., 2003, VENTER et al., 2004).
O ácido cítrico tem sido produzido em grande quantidade, com uma taxa de produção global estimada em cerca de 1,6 milhões de toneladas em 2007. É utilizado para conferir um agradável sabor a alimentos e bebidas e também como aditivo em detergentes, produtos farmacêuticos, cosméticos e de higiene pessoal (BEROVIC e LEGISA, 2007).
Em geral, é produzido por fermentação microbiana submersa de melaço usando o fungo Aspergillus niger. Este processo, apesar de ser amplamente utilizado, apresenta alguns aspectos desfavoráveis, tais como a degeneração do ácido cítrico após determinado período de tempo e a necessidade de um longo período de fermentação – superior a sete dias - para a produção de quantidades significativas de produto, o que o encarece. Ante a isso, nos últimos anos surgiu considerável interesse em encontrar alternativas à produção deste ácido, como a investigação de leveduras potencialmente produtoras e fontes de carbono de baixo custo (SOCCOL et al., 2006).
apresentam ainda algumas vantagens em relação aos fungos, como maior taxa de conversão e produtividade, permitem um maior controle do processo em razão de serem unicelulares e a utilização de fontes de carbono alternativas que são mais acessíveis, economicamente, que a glicose (ANASTASSIADIS et al., 2008).
A produção de ácido cítrico por leveduras ocorre em duas fases. Na primeira, o crescimento microbiano é favorecido através de um meio com composição adequada, onde as condições de cultivo são ótimas e na segunda ocorre a produção propriamente dita, onde o meio é limitado em fontes nitrogênio orgânico e/ou inorgânico o que resulta em uma multiplicação celular pequena, com acúmulo alto de ácido cítrico (IMANDI et al., 2007).
Papanikolaou e seus colaboradores, em 2007, relataram que a levedura Yarrowia lipolytica cresce em glicerol, produzindo ácido cítrico. Concluiu-se que o glicerol pode ser um substrato adequado para a produção do ácido. Essa levedura produziu até 35g.L-1 de ácido cítrico com uma alta concentração inicial de glicerol sendo utilizado no meio de cultura. Os parâmetros de crescimento e produção de ácido cítrico em glicerol foram semelhantes àqueles obtidos com a glicose.
Deste modo, o presente estudo teve como objetivo geral avaliar, através de fermentação, rotas de bioconversão do glicerol residual da produção de biodiesel com elevados níveis de impurezas, visando à obtenção de ácido cítrico. Os objetivos específicos foram:
Estudar a influência da concentração inicial de glicerol adicionado ao meio fermentativo.
Definir a composição do meio de cultivo para produção de ácido cítrico em escala de bancada.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1.O Biodiesel no Brasil
Conforme o art. 4ª da Lei nº 11.097/2005, que modificou o art. 6º, XXV da Lei nº 9.478/97, o biodiesel é um “combustível derivado de biomassa renovável para uso em
motores a combustão interna ou, conforme regulamento, para outro tipo de geração de energia, que possa substituir parcial ou totalmente combustíveis de origem fóssil”.
Os combustíveis fósseis esgotam-se progressivamente, sendo necessário encontrar um combustível alternativo para suprir a demanda energética mundial (BASHA et al., 2008).
Os atuais esforços em prol da redução da poluição ambiental e a crise energética têm estimulado o mercado mundial de biocombustíveis. A economia global tem mantido o seu crescimento e a demanda por energia limpa e recursos renováveis encontra-se em contínuo aumento (BILGEN et al., 2008).
A utilização dos biocombustíveis, em geral apresenta destacáveis benefícios, incluindo sustentabilidade, energia renovável, o que diminui a dependência do petróleo, redução dos gases estufa, contribuindo para a redução da poluição atmosférica desenvolvimento regional, social e agrícola, podendo-se destacar ainda seu alto ponto de fulgor e excelente lubricidade. (DEMIRBAS, 2007). Assim, o uso de biocombustíveis, como o biodiesel, tem sido visto como uma alternativa viável.
Neste sentido, a busca intensiva por combustíveis alternativos ao petróleo, aqui se enquadrando o biodiesel, apresenta grande importância, principalmente para os países economicamente emergentes (OLIVEIRA et al., 2006). É fundamental que tal combustível mantenha uma correlação harmoniosa com o desenvolvimento sustentável, conservação de energia, eficiência e preservação ambiental (AGARWAL, 2007).
óleos vegetais e gorduras animais. O referido combustível não apresenta emissão de gases tóxicos, mostrando-se ambientalmente benéfico (KARMAKAR, et al., 2010).
No Brasil, a produção e comercialização de biodiesel apresenta importantes vantagens, no que se refere à disponibilidade de matéria-prima para sua produção e ao crescimento contínuo da indústria de óleos vegetais e etanol (OLIVEIRA et al., 2006; OISTI. 2007).
A produção de biodiesel encontra-se significativamente acelerada. O governo brasileiro estabeleceu a obrigatoriedade da adição de biodiesel ao combustível de petróleo, mediante o art. 2º da Lei nº 11097/2005, que introduz o biodiesel na matriz energética brasileira, sendo fixado em 5% (cinco por cento), em volume, o percentual mínimo obrigatório de adição de biodiesel ao óleo diesel comercializado ao consumidor final, em qualquer parte do território nacional.
O art. 1º da Resolução ANP (Agência Nacional de Petróleo) nº 04/2010, publicada no Diário Oficial da União de 03 de fevereiro e retificada do Diário de 22 de fevereiro do mesmo ano, que alterou o art. 1º, parágrafo único da Resolução ANP nº 07/2008, determinou que o biodiesel deveria ser adicionado ao óleo diesel na proporção de 5%, em volume, a partir de 1º de janeiro de 2010.
De acordo com “Boletim Mensal de Biodiesel” divulgado pela ANP, em maio de 2010 existiam 64 plantas, produtoras de biodiesel, autorizadas pela Agência para operação no país, o que corresponde a uma capacidade autorizada de 14.086,03 m3/dia. Há ainda duas novas plantas autorizadas para construção e quatro plantas autorizadas para ampliação de capacidade produtora (ANP, 2010). A Tabela 1 mostra a distribuição e capacidade de produção das plantas de biodiesel autorizadas para operação e comercialização no Brasil.
Tabela 1. Produção e distribuição nacional de biodiesel
Estado Quantidade de plantas processadoras Capacidade Autorizada de Operação (m3/dia) Representatividade por Estado (%)
RS GO SP MT BA PR TO MG MA CE PA RJ MS RO 05 05 07 22 03 04 02 06 01 02 02 01 02 02 2997,33 2257,70 1981,65 1361,96 996,71 513,00 441,00 410,11 360,00 304,11 115,00 60,00 41,00 37,00 25,24 19,00 16,69 11,47 8,39 4,32 3,71 3,45 3,03 2,56 0,97 0,51 0,35 0,31
TOTAL 64 11876,57 100
*Fonte: ANP, 2010
Além da glicerina, a cadeia produtiva do biodiesel gera vários outros co-produtos (torta, farelo etc.), que podem agregar valor e constituírem-se outras fontes de renda importantes para os produtores (GONÇALVES et al., 2006; YAZDANI e GONZALEZ, 2007).
2.2.Glicerol
“Glicerol” é o nome comum do composto orgânico 1,2,3-propanotriol (Figura 1), descoberto por Carl W. Scheele, em 1779, durante a separação de uma mistura aquecida de óxido de chumbo (PbO) preparada com óleo de oliva. Seus sinônimos são: glicerina, trihidroxipropano, glicil álcool, gliceril e 1,2,3-trihidroxipropano. (RYWI SKA, A et al.2010). Pasteur (1958) também observou a formação de glicerol como subproduto da fermentação alcoólica, em concentrações de 2,5 - 3,6% do conteúdo de etanol (REHM, 1988).
Figura 1. Estrutura do Glicerol (ARRUDA et al., 2006)
O glicerol é o principal subproduto gerado na produção de biodiesel, sendo que aproximadamente 10% do volume total de biodiesel produzido correspondem a glicerol (DASARI et al., 2005; JOHNSON E TACONI 2007).
Com o intuito de prevenir-se futuros problemas derivados da acumulação de glicerol e para tornar a produção de biodiesel mais competitiva, torna-se necessário a busca de alternativas para o uso do glicerol bruto gerado nesta produção. Este subproduto, em sua forma pura, possui inúmeras aplicações industriais, como aditivos para a indústria de alimentos, química e farmacêutica. O glicerol obtido, resultante da transesterificação de triglicerídios com álcool, apresenta impurezas como água, sais, ésteres, álcool e óleo residual, que lhe conferem um baixo custo (OOI et al.,2004).
Na indústria de alimentos, o glicerol é utilizado como aditivo alimentar, agindo como estabilizante, antioxidante, sequestrante, emulsificante e umectante. Na indústria farmacêutica, é utilizado em xaropes, devido à sua viscosidade (MORRISON, 1994). Também é um agente crioprotetor em micro-organismos, não permitindo a formação de cristais de gelo dentro da célula e mantendo a estabilidade celular e viabilidade durante o processo de conservação por congelamento (BRISSON et al, 2001).
A glicerina constitui uma fonte de matéria-prima para produtos de alto valor agregado, como polímeros, obtidos através de conversão química ou bioquímica (rotas fermentativas), aditivos para combustíveis, como ésteres e éteres de glicerina, antibióticos, analgésicos e leishmanicidas (KARINEN et al., 2006 e YAZDANI E GONZALEZ, 2007).
A rentabilidade de vários processos depende, em parte, da venda dos subprodutos, o que permite a redução dos custos de produção e, consequentemente, do preço final do produto. Assim, há um grande interesse na purificação do glicerol ou no seu reaproveitamento direto, sem tratamento, que proporcionará a viabilização do processo de produção de biodiesel, permitindo que este se torne competitivo no crescente mercado de biocombustíveis. Os processos destinados à sua purificação incluem filtração, destilação a vácuo, descoloração e troca de íons para a remoção, principalmente, de K+ e Na+ utilizados como catalisadores (YONG et al. 2001).
considerado uma fonte de carbono altamente assimilável por bactérias e leveduras sob condições aeróbicas e anaeróbicas (ITO et al., 2005).
2.3. Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolytica é um micro-organismo estritamente aeróbio, eucariótico, do reino Fungi, pertencente à classe dos Ascomicetos, subclasse Hemiascomicetos. Foi originalmente classificada como Candida lipolytica e depois reclassificada como Endomycopsis lipolytica, Saccharomycopsis lipolytica e, finalmente, Yarrowia lipolytica (BARTH e GAILLARDIN, 1997).
Normalmente, é isolada de ambientes contaminados por compostos oleosos, como a Baía de Guanabara, Brasil, em indústrias de laticínios, participando da flora de queijos picantes (BARTH e GAILLARDIN, 1997), de produtos avícolas crus (ISMAIL et al., 1999), e é particularmente adaptada a substratos hidrofóbicos. Acredita-se que, evolutivamente, leveduras que vivem em meios aquosos onde a fonte de carbono é hidrofóbica e, portanto, se encontra dispersa no meio, sob a forma de gotas, tenham desenvolvido mecanismos para facilitar o acesso a este substrato devido à pequena probabilidade de contato das gotas de óleo, em constante movimento, com os micro-organismos.
Essa levedura é diferente dos modelos celulares mais estudados - Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe (consideradas leveduras “convencionais”) - em relação à fisiologia, genética e biologia molecular e, portanto, pertence ao grupo das leveduras “não-convencionais”, sendo a espécie mais estudada desse grupo (BARTH e GAILLARDIN, 1997).
Convém destacar ainda a produção de proteínas heterólogas, campo de estudo que tem sido explorado, em relação às leveduras não-convencionais, para pesquisa básica e aplicações biomédicas.
Historicamente, a Saccharomyces cerevisiae foi usada como hospedeiro para produção de proteínas heterólogas, levedura sobre a qual a literatura já acumulou vasto conhecimento, mas que apresenta, neste caso, baixa produtividade, pobre estabilidade de plasmídeo e baixa capacidade de excreção (MADZAK et al., 2004). Muller et al. (1998) testaram quatro leveduras não-convencionais e S. cerevisiae na produção de seis enzimas fúngicas, as não-convencionais, em sua totalidade, foram mais eficientes que a levedura convencional, sendo que Y. lipolytica foi o hospedeiro que apresentou melhor performance e reprodutibilidade.
Diferentemente de S. cerevisiae, na maioria das leveduras não-convencionais, como Y. lipolytica, a respiração em presença de oxigênio é essencial para o uso de açúcares. Y. lipolytica, sendo aeróbio restrito, não possui taxa de respiração, conteúdo de citocromos ou propriedades mitocondriais afetados por altas concentrações de glicose (FLORES et al., 2000;
BANKAR et al., 2009).
Kawasse (2001), em sua revisão, mencionou a importância do conhecimento da regulação do metabolismo de glicogênio para monitorar e controlar as condições de cultura de leveduras utilizadas em biotecnologia. Um decréscimo na amplitude das oscilações do reciclo de glicogênio foi o resultado obtido pelo mesmo autor, ao aplicar estresse oxidativo na fase exponencial de crescimento de células de Y. lipolytica.
O autor também observou o decréscimo do conteúdo de glicogênio intracelular nessas condições, concomitantemente à redução da atividade lipolítica intracelular e ao aumento da atividade extracelular. Para o experimento, que não foi submetido ao estresse, o conteúdo de glicogênio manteve-se oscilando em torno de um valor constante e as atividades lipolíticas intra e extracelular não variaram. Os referidos resultados sugerem que uma possível interação entre a lipase e o glicogênio tenha influenciado a excreção da enzima, o que já foi observado in vivo e in vitro (PEREIRA-MEIRELLES, 1997).
fosfatases), proteínas unicelulares e biosurfactantes são os principais produtos obtidos a partir deste micro-organismo (FINOGENOVA et al., 2005)
O fungo tem sido utilizado como um sistema modelo em estudos relacionados à fisiologia, genética, manipulação gênica, (FICKERS et al., 2006; BEOPOULOS et al., 2009). Embora essas avaliações tenham considerado diversos aspectos da Y. lipolytica, muitos progressos foram alcançados em áreas não-convencionais, relacionadas às aplicações ambientais e industriais desta levedura, no últimos anos.
Yarrowia lipolytica possui a capacidade de produzir moléculas dotadas de propriedades tensoativas, como demonstram alguns estudos desenvolvidos pela literatura especializada. Tais pesquisas apontam uma ampla diversidade entre as fontes de carbono utilizadas para produção de biossurfactante (AMARAL et al, 2006)
Em 2008, RUFINO et al. produziram biossurfactante utilizando glicose como fonte de carbono, a partir da levedura C. lipolytica UCP 0988, tendo-se apresentado alta atividade de emulsificação. AMARAL et al. (2006) utilizaram, igualmente, como fonte de carbono a glicose para a síntese do biossurfactante denominado Yansan, a partir de Y. lipolytica IMUFRJ 50682.
Devido à potencialidade em degradar alcanos, ácidos graxos e óleo, não é surpreendente que cepas de Y. lipolytica emirjam de vários estudos independentes como agente promissor no tratamento da poluição causada por óleos minerais e por resíduos oriundos da indústria de petróleo (FICKERS et al., 2006).
O glicerol também tem sido usado por Y. lipolytica como fonte de carbono para produção de biossurfactantes. Fontes (2008) utilizou glicerol bruto (proveniente da produção de biodiesel) como substrato para o crescimento celular e produção de biossurfactante e obteve resultados satisfatórios, com uma redução da tensão superficial de 22mN/m e um índice de emulsificação de 70,22%.
2.4.Ácido cítrico
O ácido cítrico (ácido 2-hidroxipropano-1,2,3-tricarboxílico), de fórmula química C6H8O7 e fórmula estrutural representada na Figura 2, é intermediário do ciclo dos ácidos tricarcarboxílicos. Foi isolado, do suco de limão, por Sheele, pela primeira vez em 1884, sendo o principal constituinte dos frutos cítricos. (MATTEY, 992).
Figura 2. Fórmula estrutural do ácido cítrico
O acúmulo do ácido cítrico por alguns fungos foi descoberto por volta de 1893, quando Wehmer descobriu que o Citromyces possuía a capacidade de acumular este ácido durante seu cultivo (SIEBERT e SCHULZ, 1979).
Foi produzido para o comércio exclusivamente através do processo fermentativo com Aspergillus niger e largamente utilizado na indústria de alimentos e bebidas, química, farmacêutica, dentre outras (WANG e LIU, 1996). Sua descoberta é atribuída ao alquimista islâmico Jabir Ibn Hayyan no século VIII dC.
Possui grande utilidade para as indústrias farmacêutica e alimentícia, pois suas características de sabor agradável, baixa toxidade e fácil assimilação permitem muitas aplicações (GREWAL e KALRA, 1995). É utilizado na indústria de alimentos para estimular o flavor natural de frutas, na fabricação de bebidas (principalmente refrigerantes), para prevenir a cristalização da sacarose em balas e age como estabilizante em sucos, emulsificante em sorvetes, bem como evita o escurecimento de alguns vinhos brancos.
1 4 2 – R ev is ã o B ib lio g rá fic a S á, T .N .M
Previne escurecimento em alguns vinhos brancos. Previne turvação de vinhos e cidras. Usado no ajuste do pH.
Previne acidificação excessiva. Estimula flavour natural de fruta. Acidulante em bebidas gaseificadas a
base de sacarose.
Usado no ajuste de pH. Fornece grau desejado de acidez e flavour. Aumenta a eficácia de conservantes
antimicrobianos.
Como emulsificantes em sorvetes e queijos processados. Agente acidificante e antioxidante em produtos de queijo.
Protege ácido ascórbico por inativação de metais pesados. Abaixa pH, inativando enzimas oxidativas.
Sinérgico de outros antioxidantes, como sequestrante. Ação estabilizante.
Complemento alimentar
Avaliação de micronutrientes em fertilizantes. Aumenta disponibilidade de fósforo em plantas.
Como efervescente em pós e tabletes em combinação com bicarbonatos. Anticoagulante. Promove rápida dissolução de ingredientes ativos. Acidulante em formulações levemente adstringentes.
Agente tamponante.Antioxidante como um quelante de íons metálicos.
Atual como agente tamponante e sequestrante de íons metálicos. Neutraliza bases. Usado em processos biodegradáveis não tóxicos e não corrosivos.
Vinhos e cidras
Refrigerantes e xaropes Geléias, compotas e conservantes Produtos lácteos Frutas congeladas
Óleos e gorduras
Alimento animal Agroindústria Produtos farmacêuticos Cosméticos Aplicações industriais
Fonte: SOCCOL et al., 2006
Bebidas
Alimentos
Agricultura
Farmacêutico
A produção de ácido cítrico depende, primordialmente, do potencial de síntese do micro-organismo utilizado. Porém, as condições do processo e a composição do meio fermentativo são variáveis importantes que, quando otimizadas, podem promover um acréscimo do rendimento (MILLIS, 1985).
Múltiplos fatores podem afetar o processo de produção de ácido cítrico. Os mais estudados são: concentração de íons metálicos (principalmente Mn2+), tipo de substrato (melaço ou sacarose), quantidade e tempo de inoculação. Contudo, poucos estudos foram desenvolvidos para verificar a influência das fontes de nitrogênio na produção de ácido cítrico.
O ácido cítrico provém do metabolismo de energia e sua acumulação é dependente de condições de desbalanceamento metabólico. Muitas leveduras também podem ser utilizadas para produção de acido cítrico. Dentre as leveduras mais empregadas, destacam-se as das espécies Yarrowia lipolytica, Cândida tropicalis e algumas espécies de Rhodorula sp (ROHER et al., 1996, VENTER et al., 2004).
Essas leveduras, quando cultivadas em meio com limitação de nitrogênio, são capazes de produzir quantidades significantes de ácido cítrico em diversas fontes de carbono, tais como açúcares, alcanos, alcoóis, óleos, amido hidrolisado e glicerol (ROHER et al., 1996, VENTER et al., 2004). O nitrogênio tem influência na síntese de enzimas que regulam o ciclo de Krebs e a via glicolítica, e o carbono na formação de produto e biomassa (PANDA et al., 1984).
A principal limitação do uso de leveduras na produção de acido cítrico é a formação de ácido isocítrico, que pode atingir níveis de até 50% do produto obtido.
Entretanto, de acordo com Rhoer et al. (1996), a produção de ácido isocítrico depende da espécie, da fonte de carbono e das condições de cultivo. A presença de acetato foi citada como benéfica para a levedura Yarrowia lipolytica UOFS Y-701 (VENTER et al., 2004).
2.4.1. Fatores químicos que influenciam a produção de ácido cítrico
A acumulação de ácido cítrico é bastante influenciada pela fonte de carbono (SOCCOL et al., 2003). Algumas estirpes de leveduras podem utilizar um largo espectro de fontes de carbono como substrato para produção de ácidos orgânicos. Uma condição especial para produção de ácidos orgânicos por Y. lipolytica é o excesso de fonte de carbono e limitação de nitrogênio, sais minerais ou tiamina. Para a produção de ácido cítrico, especificamente, a limitação de nitrogênio favorece o rendimento produtivo (FORSTER et al., 2007).
2.4.2. Fontes de Carbono e Nitrogênio
Os açúcares representam a fonte de carbono mais facilmente metabolizada pelos micro-organismos (ARMILIATO, 2000). Dentre os carboidratos metabolizados, a sacarose é a fonte de carbono mais favorável, seguido de glicose, frutose e galactose (SOCCOL et al., 2003 ). Diversos trabalhos desenvolvidos demonstram a potencialidade de cepas de Yarrowia para metabolizar outras fontes de carbono, incluindo glicerol procedente da indústria do biodiesel (HOLZ et al., 2009; RYWI SKA et al., 2010).
Algumas leveduras são capazes de utilizar diversas fontes de carbono para produção de ácido cítrico. Dentre as mesmas, encontram-se: n-parafinas, óleos naturais, ácidos graxos, etanol, glicose, sacarose e lactose (MATTEY, 1992; DARVISHI et al., 2009).
A fonte de nitrogênio é fornecida, geralmente, através do sulfato de amônio ou extrato de levedura (ARMILIATO, 2000). Segundo Mattey (1992), o nitrogênio é fornecido, geralmente, na forma de sulfato de amônio, extrato de levedura ou nitrato, a concentração ideal de nitrogênio varia de 1 a 3g.L-1, e a adição de quantidades maiores provavelmente não é economicamente viável.
Darvishi et al. (2009) estudaram a influência de diversas fontes de nitrogênio na produção de ácido cítrico, como NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2SO4, NH4H2PO4, caseína, uréia, peptona, farinha de soja, extrato de carne e extrato de malte, concluindo que a uréia foi a melhor fonte de nitrogênio para produção do ácido.
Vários estudos apontam a produção elevada de ácido cítrico por Yarrowia lipolytica utilizando glicerol da produção do biodiesel como fonte de carbono. Papanikolaou et al., (2002) e Papanikolaou et al., (2008) conseguiram uma produção alta de ácido cítrico após limitar o nitrogênio no meio. Levinson et al., (2007) apontam que a composição do meio de crescimento e a relação carbono/nitrogênio afetam a proporção dos ácidos cítrico e isocítrico produzidos e que é necessário estabelecer uma relação entre estes dois compostos para otimizar a produção de ácido cítrico.
2.4.3. Fontes de Fosfato
Em alguns trabalhos, verificou-se que a presença de fosfato no meio tem amplo efeito sobre o rendimento da produção de ácido cítrico. Baixos níveis de fosfato no meio tem efeito positivo na produção do ácido. Esse efeito atua em nível enzimático e não em nível de expressão genética. Paralelamente, o excesso de fosfato pode resultar na diminuição da fixação de dióxido de carbono, elevando a formação de certos ácidos e estimulando o crescimento, diminuindo a produção de ácido cítrico (GREWAL E KALRA, 1995; SOCCOL et al., 2006).
2.4.4. Aeração e agitação
bons rendimentos sejam obtidos. A fermentação de ácido cítrico é um processo essencialmente aeróbio e os micro-organismos requerem abundante suprimento de oxigênio para crescimento.
RANE E SIMS (1993) estudaram o efeito do oxigênio dissolvido para a produção de ácido cítrico por Cândida lipolytica Y1095. Durante a produção, a concentração de oxigênio dissolvido foi aumentada de 20% para 80%. Durante a fase inicial de produção, o oxigênio dissolvido não influenciou a produção do ácido. Entretanto, após a fase inicial de fermentação, com a elevação do oxigênio o rendimento aumentou em aproximadamente 50%.
2.4.5. Demanda de ácido cítrico
Devido à sua larga gama de aplicações, a demanda por ácido cítrico tem crescido diariamente. Sua produção mundial ultrapassa 800 mil ton/ano, sendo os maiores produtores a Europa e os Estados Unidos. O mercado cresce em torno de 4% ao ano e seu emprego em alimentos representa entre 55% e 65% do mercado total de acidulantes. A utilização de ácido fosfórico abrange de 20% a 25%, enquanto que o ácido málico envolve 5% do mesmo mercado. Pelas razões apresentadas, a indústria tem se dedicado à busca de novos substratos e processos tecnológicos, visando a diminuir o custo de produção do ácido cítrico (HAQ et al., 2004; GRAF, 2007).
3. METODOLOGIA
Os ensaios dest onde realizou-se um Plane processo fermentativo, e em e oxigênio dissolvido no m relatadas como produtoras d
3.1.Micro-organismos Ut
Foram avaliada NRRL YB-423 e NRRL Y (ARS Culture Collection, Pe inicialmente, por apresenta produção de ácido cítrico a YB 323 foi incluída, para e sido estudada, para a produ linhagens, foi escolhida a trabalhos.
Figura 3. Microscopia ótica Yarrowia lipolytica YB-323
este trabalho foram desenvolvidos inicialment nejamento Fatorial para investigar as variáveis
em fermentador de bancada, onde a concentraç meio foram investigados. Foram testadas dua s de ácido cítrico.
Utilizados
das inicialmente duas linhagens da levedura YB-323, fornecidas pelo Northern Regional R Peoria, Illinois, USA) (Figura 3). A linhagem
tar os melhores resultados dentre outras linha a partir de glicerol puro, segundo Levison et a a efeito comparativo, junto a YB 423, pois a m dução de ácido cítrico, a partir de glicerol. D a de melhor desempenho para ser utilizada no
ca das estirpes estudadas, utilizando a objetiva 23e em B Yarrowia lipolytica YB-423.
nte em frascos agitados eis de influência para o ração inicial de glicerol, uas cepas de leveduras
ra Yarrowia lipolytica: l Research Laboratory. m YB 423 foi escolhida, hagens já estudadas na t al. (2007). A linhagem mesma ainda não havia . Dentre as duas citadas no prosseguimento dos
3.1.1. Ativação do micro-organismo
As culturas liofilizadas de Y. lipolytica NRRL 323 e Y. lipolytica NRRL 423 foram transferidas para um Erlenmeyer de 50mL contendo 10mL de caldo TSB -Trypticase
Soy Broth - (HIMEDIA - Tabela 3), previamente esterilizado à temperatura de 121ºC, durante
15 minutos. Em seguida, os frascos foram incubados a 28ºC em shaker orbital (SOLAB), a 200rpm de agitação, por 24h.
Posteriormente, todo o conteúdo dos frascos foi transferido para Erlenmeyers de 100mL contendo 40mL do caldo TSB estéril. Os mesmos foram novamente incubados à temperatura de 28ºC em shaker orbital, a 200rpm de agitação, por 24 horas.
Tabela 3. Composição do meio TSB (Trypticase Soy Broth)
Componentes Composição (gL-1)
Triptona Soitona Dextrose Cloreto de sódio Fosfato de potássio dibásico
17,0 3,0 2,5 5,0 2,5
pH ajustado para 6,0 0,2
3.1.2. Preparo de cultura-estoque de Y. lipolytica NRRL 323 e Y. lipolytica NRRL 423
mesmos armazenados à temperatura de -20,0°C. A renovação das culturas foi realizada a cada três semanas.
Tabela 4. Composição do meio Agar batata Dextrose (HIMEDIA)
Componentes Composição (gL-1)
Infusão de batata Dextrose
Agar
20,0 20,0 15,0
pH final 5,6 0,2
3.2.Preparo do Inóculo
Para o preparo do inóculo, a cultura congelada, mantida em caldo TSB com 50% de glicerol, foi assepticamente transferida para um Erlenmeyer contendo 100ml de caldo TSB, com pH ajustado para 6,0 com HCl 1,0 N. A incubação foi realizada em shaker orbital (SOLAB) a 200 rpm, e 28,0°C por 24h (OSWAL et al., 2002). Após este período, para os testes iniciais com glicerol analítico e residual do biodiesel, foi utilizado inóculo na proporção de 1% (v/v). Os demais ensaios foram realizados com inóculo na proporção de 10% (v/v), com o intuito de se atenuar o tempo de fermentação.
3.3.Ensaios com Glicerol Analítico e Residual do Biodiesel
De acordo com Levison et al. (2007), a levedura por ele estudada, Yarrowia lipolytica NRRL 423, foi capaz de produzir até 21,6g.L-1 de ácido cítrico, a partir de 40g.L-1 de glicerol analítico em meio mineral, obtendo, dessa forma, 54% de rendimento, tendo como referência a concentração inicial de glicerol.
para o segundo teste, o glicerol residual do biodiesel (Meio 2), a fim de investigar-se a produção de ácido cítrico a partir deste resíduo. A composição dos meios analisados está disposta da Tabela 5.
Tabela 5. Meio fermentativo adaptado de Levison et al. (2007)
Componentes Composição (g.L
-1)
Meio 1 Meio 2
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4.7H2O Glicerol analítico
Glicerol residual Extrato de levedura
Sulfato de amônio Tiamina
1,7 12 1,25
40 - 0,25 0,25 0,006
1,7 12 1,25
- 40 0,25 0,25 0,006
pH inicial 6,0 0,4
O micro-organismo Yarrowia lipolytica NRRL 423 foi ativado em meio TSB, por 24 horas, e inoculado a 1% em Erlenmeyers de 250mL, contendo 50mL de meio para fermentação. Este foi esterilizado em autoclave a 121°C, por 15 minutos. A Tiamina foi esterilizada separadamente por filtração e, posteriormente, adicionada assepticamente ao meio frio.
3.4.Efeito da Tiamina
Estudou-se o possível efeito da tiamina na produção de ácido cítrico. Para tal, utilizou-se o Meio 2 descrito na Tabela 5, variando a concentração inicial de glicerol residual do biodiesel adicionado ao meio em 20g.L-1, 40 g.L-1 e 60 g.L-1 com e sem a adição da Tiamina. Ambas as cepas foram investigadas neste teste, tendo se dado o preparo do inóculo de acordo com o item 3.2. Com o intuito de se reduzir o tempo de fermentação, o meio foi inoculado com 10% (v/v) de inóculo, em vez de 1% (v/v), como utilizado anteriormente.
O pH foi ajustado, primeiramente, para 6,0, sendo mantido, durante a fermentação, no intervalo de 5,0 a 6,0. Os dados de variação de pH e produção de biomassa foram registrados, a produção de ácido cítrico foi verificada através da metodologia de acidez total titulável.
3.5.Efeito das concentrações iniciais de substrato (glicerol residual) e das fontes de nitrogênio orgânica e inorgânica
Visando-se a averiguar as concentrações iniciais ideais de glicerol residual do biodiesel e das fontes de nitrogênio orgânico (extrato de levedura) e inorgânico (sulfato de amônio), realizou-se um Planejamento Experimental variando as concentrações destes três componentes. Além das variáveis do planejamento, o meio de ensaio continha a composição apresentada na Tabela 6, (Levison et al 2007).
Tabela 6. Composição do meio Fermentativo (Mineral)
Componentes Composição (gL-1)
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4.7H2O
1,7 12 1,25
As variáveis foram avaliadas por meio de um Delineamento Composto Central Face Centrada (DCCFC), 23, incluindo 3 repetições no ponto central, totalizando, assim, 17 ensaios, conforme apresentado nas Tabelas 7 e 8.
Tabela 7. Variáveis utilizadas no DCCFC 23 para produção de ácido cítrico
Variáveis Código Concentrações (g/L)
-1* 0* +1*
Glicerol X1 20 40 60
Extrato de levedura X2 0,1 0,3 0,5
Sulfato de amônio X3 0,1 0,3 0,5
* Níveis codificados: Nível Superior: +1; Nível inferior: -1; Ponto central: 0.
Tabela 8. Matriz do planejamento DCCFC (23)
Ensaios X1 Variáveis codificadas X2 X3
1 - - -
2 - - +
3 - + -
4 - + +
5 + - -
6 + - +
7 + + -
8 + + +
9 - 0 0
10 + 0 0
11 0 - 0
12 0 + 0
13 0 0 -
14 0 0 +
15* 0 0 0
16* 0 0 0
17* 0 0 0
*Pontos centrais
x1 – Glicerol; x2 Extrato de levedura; x3 Sulfato de amônio
crescimento celular, pH e ácido cítrico através do método da acidez total titulável. A concentração de inóculo adicionado aos meios foi de 10% (v/v)
A abordagem experimental consistiu na alternação de todas as variáveis concomitantemente. Isso se dá em razão de as variáveis poderem se influenciar mutuamente e o valor ideal para uma delas poder depender do valor de outra. Este comportamento, denominado “interação entre variáveis”, é um fenômeno ocorrido frequentemente, sendo raras as ocasiões em que duas variáveis atuam de forma independente.
Para a constituição da matriz de ensaios, foram consideradas 3 variáveis independentes, nos níveis máximo (+) e mínimo (-), expressas nas Tabelas 06 e 07 com seus respectivos níveis. A variável dependente, ou resposta estudada, foi a produção de ácido cítrico. A análise estatística foi realizada através do programa Statistica (Statsoft) versão 7.0.
3.6.Testes sem adição de extrato de levedura e sulfato de amônio na composição do meio
Visando a diminuir os custos despendidos com o meio de fermentação, foram realizados testes em frascos agitados, suprimindo as fontes de nitrogênio orgânica e inorgânica, com a concentração inicial de glicerol residual a 20g.L-1 para cada micro-organismo estudado.
A finalidade deste teste foi avaliar se o meio contendo apenas glicerol como fonte de carbono e os demais componentes minerais (exceto fontes de nitrogênio), ao ser inoculado com o micro-organismo em fase exponencial, passaria de forma mais acelerada à fase de produção, visto que a fonte de nitrogênio, essencial para a multiplicação celular, seria somente aquela remanescente do meio de crescimento.
Tabela 9. Meio utilizado para investigação da supressão de fontes de nitrogênio
Componentes Composição (gL-1)
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4.7H2O
Glicerol
1,7 12 1,25
20
Adaptado de Levison et al (2007)
Aos frascos foram adicionados 10mL de inóculo, sendo em seguida incubados a 28ºC e 200rpm de agitação por 72h. Durante esse intervalo de tempo de incubação, as amostras foram retiradas a cada 24h. Realizaram-se as leituras das absorbâncias, a 600nm, para determinação da massa seca. As amostras foram centrifugadas em centrifuga (Excelsa I 206 – FANEM) por 10 minutos. O sobrenadante foi utilizado para determinação de ácido cítrico.
3.7.Utilização de Erlenmeyer de 500ml
Objetivando-se avaliar uma maior superfície de contato do micro-organismo com o oxigênio, foram utilizados Erlenmeyers de 500mL, contendo 50 mL de meio mineral (a mesma quantidade utilizada em frascos de 250mL). A concentração de 20g.L-1 de glicerol foi investigada para as duas cepas.
No processo fermentativo, os meios minerais (não-estéreis) contendo 20g.L-1 glicerol foram inoculados com 10% de inóculo e, posteriormente, incubados, a 28ºC e 200rpm, por um período de 72h. Diariamente, alíquotas de 5mL foram retiradas para medições de pH, produção de ácido cítrico e densidade ótica.
3.8.Ensaios em fermentador
módulo de medição e atuação com sensor de pH e O2, nível de espuma, temperatura e controle de agitação, sendo tudo conectado e um computador e controlado pelo software TECBIOSOFT. Nos experimentos realizados foram utilizados controle de temperatura, agitação e adição de hidróxido de sódio para controle de pH..
A aeração foi realizada, inicialmente, através de ar comprimido injetado no fermentador, por meio de um filtro HEPA. Após as primeiras 16h de fermentação, foi empregado oxigênio puro, também injetado no fermentador, e monitorado através do eletrodo de O2. Fixou-se a temperatura em 28°C e pH inicial de 6,0. Na Figura 04, vê-se o fermentador utilizado nos experimentos.
Figura 4. Fermentador TECNAL, modelo TEC-BIO R1.5 de 1,0L
Para cada fermentação, foram preparados 450mL de meio com 20g.L-1 de glicerol residual do biodiesel e 50 mL de inóculo, formando-se, assim, 10% (v/v) de concentração do inóculo. Amostras de 5mL foram retiradas a cada quatro horas de fermentação para as primeiras 24h, após esse período as amostras foram retiradas diariamente, e após a leitura das absorbâncias para determinação da biomassa, foram centrifugadas e o sobrenadante utilizado para determinação de glicerol e ácido cítrico por HPLC.
3.9.Métodos Analíticos
3.9.1. Avaliação da Biomassa (g.L-1)
Amostras das leveduras cultivadas em caldo TSB durante 24h foram centrifugadas, sendo o precipitado utilizado para a determinação da massa seca (biomassa). As concentrações celulares foram indiretamente determinadas por mensuração da densidade ótica das suspensões celulares, a 600nm. Os precipitados celulares foram lavados com água destilada e secos em estufa de circulação de ar, a 80°C. Em seguida, obteve-se, por regressão linear, as relações entre concentração celular e densidade ótica, a 600nm. As curvas de calibração e as equações estão em anexo.
3.9.2. Análise do pH
O pH foi determinado por leitura direta em potenciômetro (Marconi, modelo PA200), calibrado a cada utilização, com soluções tampão de pH 4,0 e pH 7,0 (AOC, 1992).
3.9.3. Acidez Total Titulável
3.9.4. Determinação de ácido cítrico por HPLC
Na determinação de ácido cítrico produzido por meio dos testes iniciais - com glicerol analítico e residual do biodiesel e em fermentador, empregou-se a metodologia de cromatografia líquida de alta performance (HPLC), utilizando-se a coluna BioRad HPX 87H, com as seguintes condições: fase móvel consistiu de ácido sulfúrico a 0,01N, temperatura da coluna 50°C, fluxo 0,6 mL/min. e detector de UV a 210 nm. Essas condições de análise foram baseadas nas recomendações do fabricante das colunas. A identificação, integração e quantificação dos compostos realizou-se por meio de um software de aquisição e processamento de dados, comparando-se com os padrões adequados.
3.10. Cálculo do rendimento.
O rendimento das fermentações foi calculado, utilizando-se os valores de ácido cítrico produzido (g.L-1) e de glicerol (analítico ou residual) inicial (g.L-1), pela Equação 3.
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3.11. Determinação de parâmetros cinéticos
3.11.1. Velocidades específicas
As equações 5 e 6 apresentam as expressões utilizadas para calculo das velocidades específicas de crescimento microbiano e formação de produto, respectivamente
+,
#
-.
-%&'()* /
+0
#
-.
1
%&'()* 2
3.11.2. Fator de conversão Yp/x
A capacidade de formação de produto pela massa celular foi definida como Yp/x, calculado pela razão entre o produto obtido (g/L) e a massa celular formada (g/L).
304,
1 5 16
- 5 -6
1
- %&'()* 7
Onde:
Yp/x :Fator de conversão de biomassa em produto (g.g-1)
Xm: Biomassa máxima
X0: Biomassa inicial
Pm: Produto final formado
4. RESULTADOS
4.1.Ensaios com Glicerol Analítico e Residual do Biodiesel
A Figura 5 mostra a variação dos valores de pH, biomassa (g.L-1) e ácido cítrico produzido (g.L-1) para uma fermentação de 10 dias, em relação ao Meio 1, (Tabela 5 do item 3.3 de Materiais e métodos) referente ao glicerol analítico.
Figura 5 – Resultados da fermentação realizada em shaker, a qual se baseou nos experimentos de Levison et al. (2007), utilizando-se glicerol analítico a uma concentração inicial de 40g.L-1.
Através das Figuras 5 observa-se que o pH apresentou uma variação entre 3,0 e 6,0, a produção de ácido cítrico teve inicio a partir de 24h de fermentação, onde ainda se verifica a multiplicação celular, no entanto, após as 96h de fermentação, onde se torna evidente a fase estacionária de crescimento microbiano, pode-se observar que a produção do ácido se demonstra acentuada.
Este comportamento, frente à produção de ácido cítrico pela levedura é característico de uma produção parcialmente associada ao crescimento. A Figura 6 apresenta
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
as velocidades especificas para a produção de biomassa e produto, observa-se que o micro-organismo iniciou a fermentação com uma pequena taxa de reprodução celular seguida pela transição à fase de crescimento onde a velocidade específica de crescimento foi máxima e chegando à fase de desaceleração. Após a fase de desaceleração o micro-organismo entrou na fase estacionária onde a taxa de crescimento celular foi quase nula, nesta fase a produção de ácido é mais evidenciada, no entanto também há uma pequena produção durante a fase de crescimento.
Figura 6 – Velocidades específicas de crescimento microbiano e produção de ácido cítrico para a fermentação realizada em shaker, baseada nos experimentos de Levison et al. (2007), utilizando-se glicerol analítico, a uma concentração inicial de 40g.L-1.
A análise dos resultados obtidos neste ensaio inicial, revelam que o rendimento máximo obtido de 15,18g.L-1 foi inferior ao obtido por Levison et al (2007), que obteve em seus estudos 21,6 g.L-1. Porém, verifica-se que o pH, ajustado adicionando-se ao meio NaOH a cada leitura realizada, de forma que permanecesse no intervalo de 5,0 a 6,0, pode ter se configurado um fator primordial para a produção do ácido, uma vez que, a despeito do controle realizado, o potencial hidrogeniônico não se conservou constante neste intervalo.
FORSTER, A. et al 2007, em estudos realizados com sacarose como fonte de carbono, ajustou o pH inicial no cultivo em 6,8. O pH médio durante o processo fermentativo encontrou-se entre 5,5 e 6,0, segundo esses autores esta é a faixa ótima para a produção do ácido.
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
