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Fisiologia e Fisiopatologia: Estereologia do rim: determinação do Vv, Nv e volume médio do glomérulo*

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Fisiologia e Fisiopatologia: Estereologia do rim: determinação do

Vv, Nv e volume médio do glomérulo*

Carlos AM Lacerda

I n t r o d u ç ã o

Pela observação de cortes com imagens bidimen-sionais (corte histológico, por exemplo) é possível determinar a tridimensão de um órgão, tecido, célula ou compartimento subcelular. A metodologia que pro-picia isto chama-se estereologia. ISS é a International Society for Stereology, sociedade que congrega pro-fissionais de diversas áreas do conhecimento que usam estereologia. A ISS também organiza congressos in-ternacionais, oferece cursos em todo o mundo e é responsável por 2 publicações científicas: The Jour-nal of Microscopy e Acta Stereologica. *

Esse texto destina-se ao médico clínico, ao nefro-logista, que são utilizadores-potencial dessa metodo-logia. Sendo assim, não será extenso na teoria este-reológica, mas pretende fornecer as etapas necessárias, na prática, para realizar e interpretar uma pesquisa estereológica do rim.

O primeiro mandamento da estereologia é traba-lhar com eficiência. Ser eficiente é trabatraba-lhar pouco (poucos indivíduos, poucos campos microscópicos analisados etc.), gastar pouco (poucas lâminas histo-lógicas, poucas fotomicrografias etc.), mas sem per-der a acurácia do resultado.

Laboratório de Morfometria e Morfologia Cardiovascular. Centro Biomédico da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Endereço para correspondência:

Carlos AM Lacerda

Laboratório de Morfometria e Morfologia Cardiovascular da Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Av. 28 de Setembro, 87 (fds). CEP 20551-030 RJ, Brasil. Tel./fax: (0xx21) 587-6416 E-mail: mandarim@uerj.br Http://www.rio.com.br/~mandarim

*O Laboratório de Morfometria e Morfologia Cardiovascular da UERJ é financiado parcialmente pelo CNPq (Processo 57.41.14/ 97-1) e pela Faperj (Processo E-26/170.086/97).

* Maiores informações estão nos endereços eletrônicos da ISS: (www.health.aau.dk/stereology/iss/) e do Laboratório de

Morfometria da UERJ (www.rio.com.br/~mandarim).

A reconstrução tridimensional também faz parte de métodos quantitativos. O glomérulo renal tem sido reconstruído tridimensionalmente com técnicas tra-dicionais (método de Born)1,2 e com auxílio de

com-putador.3

Métodos estereológicos para estimar o número e o tamanho de glomérulos devem ser usados para de-terminar valores-padrão. Podem também ser usados para identificar, em biópsias do rim de doentes re-nais, o risco e o prognóstico da evolução da doen-ça.4 Mas ainda há dificuldades que impedem esse

método de tornar-se amplamente usado na prática e que devem ser consideradas quando se faz um estu-do estereológico, como: estabelecer protocolo padrão de amostragem e processamento tecidual e definir pos-síveis variações relativas a faixa etária, ao sexo e ao grupo étnico.

Tamanho da amostra

Em estereologia interessa-se pelo aumento ou pela diminuição de determinada quantidade. Assim, temos a probabilidade p= ½ que isso ocorra.5 Portanto, para

usar o índice de significância a=0,05, o número míni-mo de indivíduos numa determinada pesquisa, ain-da estatisticamente significativo, será:

( )

eventos

p

2

1

=

logo, se n=5 temos:

( )

5

2

1

=

p

ou seja: p = 0,03 (p < 0,05)

Observe-se que não se está recomendando ter ape-nas 5 indivíduos na amostra (ou 5 animais num tra-balho experimental). Se houver mais indivíduos na amostra, tanto melhor, mas com n=5, número míni-mo de casos, ainda se obterão resultados explorá-veis estatisticamente.

Para saber quantos campos se devem analisar em cada indivíduo, não há regra muito precisa, mas Cruz-Orive e Weibel5 consideram raros os casos em que

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jos determina as características básicas do sistema-tes-te, que são: número de pontos-teste (PT), comprimen-to da linha-teste (LT) e área-teste (AT). A Figura 2 ilus-tra o sistema-teste denominado M429,10, que deve ser

superposto à imagem histológica do rim para a conta-gem de pontos e de intersercçõteste. Porém, as es-truturas que cruzam os lados tracejados do sistema M42 (a linha proibida) não devem ser consideradas.11

Recentemente, alguns sistemas-teste ganharam ar-cos ciclóides com distribuição de orientação propor-cional ao seno do ângulo do eixo vertical.12

Sistemas-teste constituídos por ciclóides são feitos com auxílio de desenho assistido por computador e são mais efi-cientes quando as curvas-teste são escalonadas. É o sistema-teste de escolha quando se trabalha com os denominados “cortes verticais”.

Parâmetros estereológicos dos glomérulos renais Muitos parâmetros estereológicos podem ser de-terminados para quantificar os glomérulos renais. Mas, nesse texto introdutório, serão comentados ape-nas a densidade de volume (Vv[glom]), a densidade numérica (Nv[glom]) e, finalmente, o volume médio (Vol[glom]).

se necessita contar mais de 200 pontos sobre a estru-tura que se quer quantificar (com o sistema-teste M42, que tem 42 pontos-teste, isso eqüivale a aproximada-mente 5 campos por indivíduo. Porém, atenção: se a estrutura em questão ocupar, por exemplo, 1/5 do órgão, devem-se multiplicar os 5 campos por 5, ou seja, seriam 25 campos no total – maiores detalhes em Mandarim-de-Lacerda).6

Isotropia do órgão

Antes de mais nada, é necessário conhecer bem a morfologia do órgão (ou estrutura) que se quer quan-tificar. Veja-se o glomérulo renal: ao estabelecer o protocolo da pesquisa, deve-se considerar sua distri-buição e localização.

Isotrópico é o órgão ou tecido que apresenta as mesmas características em todas as direções, portan-to: isotropia = homogeneidade. Por isso, cortes his-tológicos isotrópicos são aqueles em que a estrutura aparece homogeneamente, diferente dos cortes ani-sotrópicos, em que há uma orientação na apresenta-ção do material. A avaliaapresenta-ção de muitos parâmetros estereológicos necessita de cortes aleatórios e uni-formemente isotrópicos (cortes AUI) como requisito. O rim é um órgão anisotrópico. Os glomérulos estão predominantemente localizados no córtex. Para obter sempre cortes AUI de qualquer tecido ou ór-gão, inclusive o rim, conta-se com o método do ori-entator ou ortotrip.7 O rim deve ser seccionado em 2

cortes consecutivos. O primeiro corte deve ser reali-zado num ângulo determinado aleatoriamente (por sorteio, por exemplo). Depois a face de corte deve ser apoiada e novamente o rim deve ser seccionado segundo um ângulo também aleatório. Agora já se pode admitir que os fragmentos obtidos contenham tecido de modo isotrópico (Figura 1). O procedimen-to poderá ser repetido nos casos em que o material for altamente anisotrópico.8

Sistemas-teste

Um sistema-teste é um conjunto de linhas (retas ou curvas) e pontos. Esse deve ser superposto à ima-gem morfológica para a contaima-gem estereológica. Po-dem-se construir sistemas-teste com arranjo regular ou não (isso é, aleatório). Existem diversos sistemas-teste propostos para variados fins, mas tradicional-mente são desenhados com retas, ou segmentos de reta, apresentando os arranjos geométricos triangu-lar, quadrado ou hexagonal. Cada um desses

arran-Figura 1. Desenho esquemático da realização do orientator em uma cenoura. Primeiro, um segmento intermediário da cenoura é separado através de dois cortes paralelos. Isto cria duas faces de corte ou planos iniciais de análise. Apoiado sobre o primeiro plano de corte procede-se um segundo corte, perpendicular ao primeiro, mas com direção aleatória (obtido por sorteio numa “roda numerada”, por exemplo). Então, apóia-se a parte restante do segmento da cenoura sobre a segunda face de corte e procede-se um terceiro corte, perpendicular ao procede-segundo, mas de direção aleatória. Esta última face de corte apresenta o tecido de forma aleatória e uniformemente isotrópica (corte AUI) (baseado em Howard e Reed)24.

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Vv[glom]

A lei básica da estereologia (princípio de Delesse)8

informa que a quantidade relativa de pontos que to-cam a estrutura é comparável à quantidade de área dessa estrutura contida na área-teste, ou a quantidade de volume dessa estrutura no volume-teste. Então, pode-se determinar a Vv[glom] da seguinte maneira:

T

P

glom

P

glom

Vv

[

]

=

[

]

µm°

sendo P[glom] os pontos que cruzam os glomérulos e PT o número total de pontos-teste do sistema-teste. O Vv[glom] pode ser multiplicado por 100 para expressar o resultado em percentagem.

Nem sempre é simples definir qual o aumento óti-mo para uma determinação estereológica. A Figura 3 ilustra a superposição do sistema-teste M42 em duas imagens diferentes da córtex renal, sendo a primeira com pequeno aumento e a segunda com maior aumen-to. Se a amostragem for realizada corretamente, e os cortes sendo AUI, não deverá haver diferença signifi-cativa na determinação da Vv[glom] nesses dois au-mentos e, nesse caso, é mais confortável usar o menor

Figura 3. Fotomicrografias da córtex renal com o sistema-teste M42

sobreposto. À esquerda em menor aumento, à direita em maior aumento. Ver o texto para descrição do cálculo do Vv[glom].

Figura 2. Desenho esquemático do sistema-teste M42 sobreposto a 5

estruturas (podem ser glomérulos, células, núcleos, etc). As estruturas que cruzam com a “linha proibida” (tracejada) não são consideradas. No desenho, o segmento d é a calibração do sistema (será medido para aplicações posteriores), bem como uma intersecção-teste (I) e um ponto-teste (Pp).

É lógico que num protocolo de pesquisa não se devem misturar aumentos diferentes, mas trabalhar sempre com um único aumento.

Nv[glom]

A Figura 4 mostra o que o parâmetro Nv[glom] re-presenta.

Figura 4. Desenho esquemático do número de glomérulos contido em 1mm³. À esquerda há 109 glomérulos/mm³ no rim de neonato humano, no centro há 19 glomérulos/mm³ no rim de criança com 7 anos de idade, e, à direita há 11 glomérulos/mm³ no rim de homem com 47 anos de idade (Elias e Henning)1.

Até há bem pouco tempo, para o cálculo da Nv, ne-cessitava-se conhecer a forma e a distribuição da estru-tura que se queria quantificar (métodos de Weibel & aumento, que analisa o córtex renal mais amplamen-te. No exemplo da Figura 3, considerando que os glo-mérulos que são cortados pela linha proibida (traceja-da) não devem ser considerados, há 4 glomérulos válidos na fotomicrografia do menor aumento e 2 váli-dos na fotomicrografia do maior aumento. Na primei-ra, considerando até a cápsula glomerular, vemos 5 pontos-teste sobre os glomérulos (Vv=5 42=0,119 ou 11,9%). Na segunda fotomicrografia, vemos 9 pontos-teste sobre os glomérulos (Vv=9 42=0,214 ou 21,4%).

÷ ÷

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Gomez13 e de Aherne14). Depois do trabalho de Sterio15

passou-se a dispor de método sem viés para determinar a Nv, método do “Disector”. Esse método exige apenas o conhecimento da espessura de microtomia.16

Também pode-se determinar o Nv[glom] pelo mé-todo do fractionator, mas não se desenvolverá esse tópico no presente texto, por que não se quer torná-lo muito torná-longo ou inacessível ao médico clínico. En-tretanto, as informações sobre o fractionator aplica-do ao rim podem ser conseguidas em Bertram.17

Descreveremos aqui o “disector”. Num corte his-tológico com espessura determinada, observado com objetiva de imersão em óleo, que diminui muito a profundidade de campo, podem-se focalizar 2 faces num mesmo campo microscópico: um plano superior e outro inferior. Considere-se a determinação do Nv[glom], e nos 2 planos se identificam os gloméru-los, mas considerando somente 1 dos planos (o su-perior, por exemplo), contam-se quantos glomérulos aparecem nesse plano e não aparecem no inferior. Quando o glomérulo aparecer nos 2 planos, não deve ser considerado. O plano inferior, na análise do vo-lume-teste, é um “plano proibido”, equivalente à “li-nha proibida” na análise da área-teste.17 Esse método

chama-se “disector óptico”, porque é realizado com a observação direta no microscópio de luz, variando-se o plano focal.

Qual deve ser a espessura ideal do disector? Ad-mite-se que essa espessura deve ser cerca de 1/3 do diâmetro médio da estrutura que se quer estudar.12

No caso do glomérulo renal humano, que normal-mente varia entre 150-200 µm de diâmetro, a espes-sura do disector deve estar entre 60-70 µm. Essa dis-tância ultrapassa a possibilidade de microtomia dos micrótomos de parafina. Dessa forma, deve-se utili-zar uma variante do método do disector para deter-minar o Nv[glom], o “disector físico”. Esse correspon-de a fazer a microtomia do córtex renal com espessura de praxe (digamos, 5µm), e analisar um corte a cada intervalo, de modo a corresponder a 60-70 µm (diga-mos 65 µm dividido por 5 µm, analisaría(diga-mos 1 corte a cada 13). Mas, na prática, para determinar o Nv[glom], é mais simples fazer a microtomia com 20 µm de es-pessura (o limite máximo dos micrótomos de parafi-na), o que acarretaria 1 corte a cada 3 (ou seja, a espessura do disector seria 60 µm).

A Figura 5 ilustra um esquema do método do di-sector. Ao saber que a espessura que separa os 2 pla-nos do disector (e), e se estiver trabalhando dentro

Figura 5. Desenho esquemático do disector mostrando os planos superior e inferior. O plano inferior é o “plano proibido” neste exemplo, então, as estruturas que cruzam este plano não são consideradas. AT corresponde a

área-teste, e é a espessura do disector.

de uma área pré-determinada por um sistema-teste (AT), então se pode determinar o volume do “Disec-tor” (Vol[disector]) e determinar diretamente o Nv[glom]: T

A

e

tor

di

Vol

[

sec

]

=

.

]

sec

[

] [ ] [

tor

di

Vol

Q

Nv

glom

Aglom

=

1/mm³

sendo

Q

A[ glom] o número de glomérulos encontrados AT que aparecem no plano superior, mas não no pla-no inferior (o plapla-no proibido).

A Figura 6 demonstra a contagem de glomérulos pelo método do disector físico. Vêem-se os planos superior e inferior em fotomicrografias independen-tes, separadas por 65 µm de espessura. Os gloméru-los apontados por setas aparecem na AT, sem cruzar a linha-proibida (mais fina), somente no plano supe-rior, por isso são contados. Os outros glomérulos apa-recem também no plano inferior (plano proibido nes-se caso), por isso não são considerados.

Quantos pares de disectors devem ser analisa-dos em cada indivíduo da amostra? Essa também é uma questão difícil de ser respondida sem outras considerações. Pode-se considerar que, se os cortes forem AUI, cerca de 10-15 pares de disectors por in-divíduo são suficientes. Isdo é pouco trabalho, de 15 a 20 minutos de observação por indivíduos, se

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houver 5 indivíduos por grupo, cerca de 100 minu-tos por grupo (pouco mais de uma hora e meia).

O disector, que foi usado para analisar a alteração do número de glomérulos quando há retardamento de crescimento renal intrauterino,18 também serviu para

quantificar a hipertrofia glomerular em ratos que rece-beram o aminonucleosídeo puromicina.19

Vol[glom]

Freqüentemente deseja-se conhecer o volume mé-dio dos glomérulos. Num trabalho estereológico, quando já se determinou o Vv[glom] e o Nv[glom], isso pode ser avaliado rapidamente, sendo o volu-me glovolu-merular médio igual a:

]

[

]

[

]

[

glom

Nv

glom

Vv

glom

Vol

=

µm³ Análise estatística

Deve-se observar, antes de qualquer análise de resultados quantitativos, qual o tipo de distribuição

das variáveis. O mais comum em estudos quantitati-vos são variáveis que obedeçam a distribuição nor-mal e, nessa situação, valemo-nos da estatística pa-ramétrica. No caso contrário, somos obrigados a aplicar a estatística não-paramétrica.

A distribuição normal tem curva de freqüência si-métrica (como um sino) e é caracterizada por dois pa-râmetros principais: a média e o desvio padrão. A mé-dia indica o centro da distribuição, e o desvio padrão indica a dispersão ou variabilidade da distribuição. A probabilidade de uma observação x ocorrer no inter-valo X1 e X2 é dada como a área sob a curva normal entre os pontos X1 e X2, que é perfeitamente conheci-da e apresentaconheci-da sob a forma de tabelas.

Os programas informáticos de estatística atualmen-te disponíveis podem, facilmenatualmen-te, estabelecer o tipo de distribuição da amostra. Além disso, calculam as medi-das de tendência central (média aritmética, média geo-métrica, mediana, moda) e as medidas de variabilida-de (variância, variabilida-desvio padrão, erro padrão da média, coeficiente de variação, separatrizes).

Usa-se o teste t (de Student) para testar se as mé-dias (ou as proporções) dos resultados quantitati-vos de 2 amostras (ou de variáveis de 2 amostras) são estatisticamente iguais (hipótese nula) ou não (hipótese alternativa). Nesse caso, se estará usando o teste t para amostras independentes. Algumas ve-zes se quer testar se houve aumento (ou diminui-ção) de determinado parâmetro quantitativo em de-corrência de, por exemplo, um tratamento farmacológico. Agora tem-se uma amostra de indiví-duos que deverá ser testada antes e após tal trata-mento, mas sempre com os mesmos indivíduos. Nes-se caso, devem-Nes-se testar as diferenças entre as médias dos resultados quantitativos com o teste t pareado. O equivalente não-paramétrico do teste t para amostras independentes é o teste de Mann-Whi-tney, enquanto que para o teste t pareado é o teste de Wilcoxon.

Caso haja mais de 2 amostras diferentes para tes-tar (ou então, mais de 2 variáveis de amostras dife-rentes), não se pode mais usar o teste t (ou seus equivalentes não-paramétricos). Deve-se, agora, pro-ceder a uma Análise da Variância (Anova), desde que haja homocedasticidade (homogeneidade) das variâncias. Pode-se associar à Anova um teste para conhecer o valor da diferença mínima entre as vari-áveis que é estatisticamente significativa (teste de comparações múltiplas, teste de Tukey, se as amos-Figura 6. Fotomicrografias em pequeno aumento de um disector físico da

córtex renal onde vêem-se inúmeros glomérulos. Considerando o plano inferior como o “plano proibido” apenas os glomérulos indicados por setas são contados neste par de disector

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tras tiverem o mesmo tamanho, ou teste de Bonfero-ni em caso contrário, por exemplo). O equivalente não-paramétrico da Anova é o teste de Kruskal-Wallis e, da mesma forma, podem-se associar a esse testes de comparações múltiplas.20

Algumas vezes estamos interessados em obser-var se há correlação entre um dado quantitativo e o indivíduo do qual ele provém. Esses dados podem ser analisados por regressão linear simples ou múl-tipla, o que permitirá fazer previsões. Análise multi-variada é outra técnica, muito em voga atualmente, para interpretar associações de mais do que 2 variá-veis simultaneamente.21,22 Sempre que se faz uma

cor-relação e se calcula a equação da regressão linear simples, também traça-se a reta referente a essa equa-ção. É recomendável, nesse caso, indicar os pontos da “nuvem de correlação” (cada ponto é referente a um indivíduo, ou uma medida quantitativa).

Realizar histograma de freqüência é importante para separar, quando existem, duas ou mais popu-lações diferentes de uma mesma amostra de dados. Isso pode ser particularmente importante quando se analisam populações de glomérulos e se suspeita que existam glomérulos pequenos e grandes.

Outro gráfico de muito valor visual na apresen-tação de resultados quantitativos, principalmente quando se testam diferenças entre médias ou medi-anas, é o gráfico do tipo Box Whisker. Nesse gráfi-co a amostra é subdividida em separatrizes, freqüen-temente em 4 subgrupos, cada um contendo 25% da amostra (os quartis). O intervalo interquartil (que representa os 50% do meio da amostra) são repre-sentados num retângulo (“box”) em que, normalmen-te, está indicado o valor da mediana. z

Tabelas, quadros, gráfico em setores, gráfico em barras, apresentações em escala logarítmica ou se-milogarítmica e muitos outras possibilidades devem ser lembradas como parte dos recursos a que se pode lançar mão na apresentação dos resultados de estu-dos quantitativos.

Análise de imagens por computador

Existem inúmeros programas e sistemas que fa-zem análise de imagens em microcomputadores. Em geral, esses programas foram desenvolvidos, inici-almente, para atender a uma determinada pesquisa e, depois, foram melhorados e comercializados. São bons quando se destinam apenas ao estudo morfo-métrico, isso é, calculam comprimentos, áreas,

ân-gulos etc. Nunca esquecer de calibrar adequadamen-te o programa com micrômetros objetos aferidos, senão os cálculos estarão errados (isso é tão co-mum…). Um bom exemplo de aplicação de análise de imagens ao estudo morfométrico do glomérulo renal está em Masseroli et al.23

A estereologia é um método muito mais podero-so.5 Estereologia é para ser feita pelo observador. A

morfometria também, mas pode ser feita por um pro-grama do tipo “ImagePro” ou “Sigmascan”. Mas, mes-mo quando se utilizam programas desse tipo, todas as premissas do estudo estereológico devem ser res-peitadas, ou seja, obtenção de cortes AUI, princípio de Delesse, número de pontos a serem contados, ta-manho da amostra, etc.

R e f e r ê n c i a s

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Referências

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