JuLiana andréa de OLiVeira geOrges
Durante o desenvolvimento embrionário, as células derivadas do zigoto passam por um processo de sucessivas especializações de forma a originar todos os tipos celulares encontrados no indivíduo adulto (Figura 1A). No estágio de blastocisto, dividem-se em dois grupos: as do trofectoderma, que darão origem aos tecidos extraembrionários, e as da massa celular interna (MCI), que darão origem a todos os tecidos do indivíduo adulto. Com a progressão do desenvolvimento, essas últimas células se compro-meterão com um dos três folhetos embrionários (endoderma, ectoderma e mesoderma) e, eventualmente, com um órgão/tecido específico.
No indivíduo adulto, ainda se encontram células com alguma plasticidade, as chamadas células-tronco (CTs), capazes de dar origem a outros tipos de células mais especializadas. As CTs conhecidas há mais tempo são as he-matopoéticas, localizadas na medula óssea, que dão origem a todos os tipos de células do sangue. Essas CTs hematopoéticas são capazes de regenerar o sangue após a destruição do tecido por irradiação. Além disso, CTs presentes em outros órgãos participam da homeostase tecidual normal, como aquela necessária para manutenção da pele e do intestino, por exemplo. Porém, todas essas CTs encontradas no adulto têm capacidade de diferenciação limitada.
Em contraste, as células da MCI do blastocisto são pluripotentes, ou seja, têm a capacidade de se diferenciar em tecidos dos três folhetos embrionários. A partir da década de 1980, essas células passaram a ser cultivadas em la-boratório, dando origem às chamadas células-tronco embrionárias (CTEs).
CLOnageM
teraPêutiCa/
As CTEs têm de fato a capacidade de gerar células de qualquer tecido do indivíduo adulto e, por isso, são uma fonte potencial de tecidos para transplan-tes. Neste capítulo, serão discutidas as vantagens e limitações do uso das CTEs em pesquisas e em te-rapias, e como a clonagem, repudiada como forma de reprodução humana, pode ser utilizada para fins terapêuticos.
células-tronco
embrionárias
Se as células da MCI do blastocisto de camun-dongo são retiradas do embrião e dissociadas, sob condições apropriadas podem manter-se indife-renciadas, multiplicar-se indefinidamente e man-ter o potencial de contribuir para todos os tipos celulares adultos. Essas células derivadas da MCI são chamadas de CTEs.
Linhagens de CTEs têm como característica principal sua pluripotência, ou seja, quando
reintro-duzidas em um blastocisto, possuem a capacidade de retomar o desenvolvimento normal colonizando diferentes tecidos do embrião. Outra forma de se demonstrar a pluripotência das CTEs é injetando-as em camundongos imunodeficientes. No ambien-te in vivo, essas células respondem aos diferenambien-tes estímulos, levando à formação de teratomas.
As CTEs também podem ser induzidas a iniciar um programa de diferenciação in vitro (Figura 1B). Em condições específicas de cultivo, as CTEs for-mam espontaneamente agregados de células dife-renciadas chamados “corpos embrioides” (embryoid
bodies [EBs]), simulando o desenvolvimento de um
embrião pré-implantado. Uma grande variedade de linhagens embrionárias pode ser identificada den-tro dos EBs – hematopoética, neuronal, endotelial, cardíaca e muscular1-3. Assim, as CTEs são utili-zadas como modelo in vitro de desenvolvimento embrionário. Nelas, podem ser estudados os meca-nismos de diferenciação celular, o processo de
ini-Figura 1. Diferenciação in vivo e in vitro. A) Desenvolvimento embrionário. B) Diferenciação in vitro das CTEs em tipos celulares específicos7.
ciação da inativação do cromossomo X e os efeitos de substâncias tóxicas e biologicamente ativas no desenvolvimento embrionário in vitro4-6.
Porém, para utilizar CTEs em terapias, é funda-mental diferenciá-las em tipos celulares específicos a ser transplantados no paciente. Nos mais de 25 anos de pesquisa com as CTEs murinas, foram desenvolvi-dos diversos protocolos de diferenciação in vitro dessas células em cardiomiócitos, neurônios dopaminérgi-cos, células produtoras de insulina, entre outras. Essas células diferenciadas foram utilizadas com sucesso em modelos animais de diversas doenças, como infarto do miocárdio, doença de Parkinson e diabetes7.
Em 1998, estabeleceram-se as primeiras linhagens de CTEs humanas, derivadas de embriões frescos ou congelados obtidos por fertilização in vitro para fins clínicos8. Equivalentes às CTEs de camundongos, quando injetadas em camundongos imunodeficien-tes, as CTEs humanas formam teratomas contendo diferentes tecidos, como epitélio intestinal (endo-derma), cartilagem, osso, músculos liso e estriado (mesoderma) e epitélio neural (ectoderma), certifi-cando-as como células pluripotentes.
Desde então, todo o conhecimento sobre diferen-ciação in vitro de CTEs murinas vem sendo apli-cado às CTEs humanas, que já foram diferenciadas
in vitro em uma variedade de tipos celulares
deri-vados das três camadas germinativas: neurônios e pele (ectoderma)9-11; sangue, músculo, cartilagem, células endoteliais e cardíacas (mesoderma)12-14; e células pancreáticas (endoderma)15, entre outras16. Além disso, como em camundongos, os tecidos de-rivados das CTEs humanas têm efeitos terapêuti-cos significativos quando transplantados em mode-los animais de diferentes doenças, incluindo lesão de medula espinhal, diabetes e degeneração macu-lar. Assim, essas células apresentam um grande po-tencial em medicina regenerativa, tanto como fonte de tecidos para transplantes quanto como modelo para o estudo da embriogênese humana.
clonagem terapêutica
Uma questão fundamental em qualquer tipo de transplante é a histocompatibilidade entre doador e receptor. Em geral, a probabilidade de duas pessoas não aparentadas serem imunocompatíveis é de apro-ximadamente 1 em 50.000. Ainda assim, indivíduos submetidos a transplantes de órgãos passam a ter de ingerir fármacos imunossupressores para que o en-xerto não seja rejeitado, o que representa um risco para a saúde. Por isso, um grande obstáculo para uti-lizar as CTEs como fonte de tecidos para transplan-tes diz respeito à compatibilidade entre o embrião de onde as células são derivadas e o paciente.
Estratégias para prevenir a rejeição imunológica dos tecidos transplantados incluem a geração de bancos de linhagens de CTEs, equivalentes a ban-cos de sangue de cordões umbilical e placentário17 _ esses bancos poderiam ser triados para se identi-ficar uma amostra compatível com o paciente.
Outra possibilidade para se evitar a questão da imunocompatibilidade entre o enxerto e o pacien-te seria a geração de CTEs geneticamenpacien-te idênti-cas ao paciente por meio da transferência nuclear (Figura 2). Um núcleo somático do paciente seria transferido para um óvulo enucleado. O embrião clonado seria cultivado in vitro até o estágio de
Figura 2. Clonagem terapêutica. A transferência do núcleo de uma célula somática para um óvulo enucleado gera um embrião clonado. A partir deste, estabelece-se uma linhagem de CTEs geneticamente idêntica ao paciente, que pode ser diferenciada em tecidos específicos, de acordo com a doença a ser tratada.
blastocisto, quando, então, seria dissociado para a obtenção das CTEs. Essa estratégia denomina-se clonagem terapêutica.
Até 2009, a clonagem terapêutica havia sido re-alizada com sucesso em três modelos animais _ ca-mundongos7, bovinos18 e, mais recentemente, em macacos19_, demonstrando a viabilidade dessa es-tratégia de geração de tecidos imunocompatíveis. Em humanos, ainda não se realizou com suces-so a clonagem terapêutica. O mais próximo que se chegou foi em 2008, quando um grupo relatou a produção de blastocistos humanos por transfe-rência nuclear20. Utilizando 29 ovócitos doados, o grupo realizou a transferência do núcleo de fibro-blastos masculinos, gerando três blastocistos clo-nados. Porém, não relatou a geração de linhagens de CTEs a partir dos embriões clonados.
É importante notar que, por princípio, a clo-nagem terapêutica não seria adequada para o tratamento de doenças genéticas, uma vez que as CTEs derivadas do paciente possuiriam a mu-tação causadora da doença. Nesse caso, a melhor opção seria gerar CTEs por clonagem terapêutica a partir de células de um doador compatível com o paciente, obtendo assim tecidos funcionais.
Desafios para a terapia
celular com ctes
A capacidade de as CTEs se diferenciarem em di-versos tipos celulares em cultura permite que essas células sejam vistas como uma fonte teoricamente ilimitada de tecidos para transplante no tratamen-to de diferentes doenças. Porém, alguns obstáculos importantes devem ser superados para que toda a promessa terapêutica das CTEs seja cumprida.
segurança
Um deles diz respeito ao risco de as células derivadas das CTEs virem a formar tumores in vivo. De fato, sabe-se que, quando indiferenciadas, essas células
têm a capacidade de formar teratomas em animais imunossuprimidos. Assim, qualquer protocolo de diferenciação in vitro dessas células para fins tera-pêuticos deverá ser robusto o suficiente para gerar uma população celular segura para transplante. Em geral, os estudos em modelos animais não reportam a geração de tumores com frequência. Mesmo as-sim, deve-se sempre considerar esse risco.
iMunOCOMPatibiLidade
Apesar de ainda não estar claro quão imunogê-nicos os tecidos derivados das CTEs serão, esta é uma questão importante para se viabilizar o uso terapêutico dessas células. A clonagem terapêu-tica discutida anteriormente é uma opção, porém requer um número grande de ovócitos, tipo celular de difícil obtenção.
Mais recentemente, um grupo de pesquisadores japoneses conseguiu induzir a formação de células pluripotentes (induced pluripotent stem cells [iPS]) a partir de células diferenciadas humanas21. A in-trodução em fibroblastos adultos de quatro fatores de transcrição, que participam de vias que mantêm células em estado indiferenciado, induziu a repro-gramação dessas células para um estado pluripo-tente, semelhante ao das CTEs. A técnica de ge-ração das iPS vem sendo aprimorada desde então, com o objetivo de tornar essas células adequadas ao uso clínico. A descrição das iPS representou um enorme avanço na busca por terapias baseadas em células, uma vez que a reprogramação pode ser feita a partir de células dos próprios pacientes, eli-minando assim o risco de rejeição.
LegisLaçãO
Apesar de todo seu potencial terapêutico, as CTEs são polêmicas no mundo todo devido à necessidade de se destruir embriões humanos para sua obten-ção22-24. No Brasil, o uso de embriões humanos para a pesquisa foi definido na Lei de Biossegurança
(Lei no 11.105), de 24 de março de 2005, que diz: “Art. 5o É permitida, para fins de pesquisa e te-rapia, a utilização de células-tronco embrionárias obtidas de embriões humanos produzidos por fer-tilização in vitro e não utilizados no respectivo procedimento, atendidas às seguintes condições: I – sejam embriões inviáveis; ou
II – sejam embriões congelados há 3 (três) anos ou mais, na data da publicação desta Lei, ou que, já congelados na data da publicação desta Lei, depois de completarem 3 (três) anos, contados a partir da data de congelamento.
§ 1o Em qualquer caso, é necessário o consenti-mento dos genitores.
§ 2o Instituições de pesquisa e serviços de saúde que realizem pesquisa ou terapia com células-tronco embrionárias humanas deverão sub-meter seus projetos à apreciação e aprovação dos respectivos comitês de ética em pesquisa. Art. 6o Fica proibido:
...
IV – clonagem humana”.
A aprovação do uso de embriões congelados para pesquisa permite o desenvolvimento de novas li-nhagens de CTEs humanas no Brasil. De fato, em 2008 nosso grupo gerou a primeira linhagem de CTEs brasileira, BR-1, o que foi fundamental para a consolidação dessa área de pesquisa no país. Porém, a proibição ampla da clonagem humana torna ilegal a clonagem terapêutica. Assim, en-quanto essa lei vigorar, novas estratégias deverão ser desenvolvidas para gerar tecidos imunocom-patíveis a partir de CTEs humanas, de forma a viabilizar seu uso terapêutico.
Pode-se afirmar que as pesquisas com os dife-rentes tipos de CTs devem ser acompanhadas com entusiasmo e cautela. É inerente de toda área de pesquisa em desenvolvimento avanços e retro-cessos, e ainda não se sabe quais tipos de células cumprirão a promessa terapêutica e se serão as
mais adequadas para o tratamento de quais doen-ças. Mesmo assim, as CTs devem ser vistas não só como um agente terapêutico, mas também como um modelo de pesquisa em que se pode estudar os mecanismos por trás da diferenciação celular, desenvolvimento embrionário, câncer e alterações epigenéticas, entre outros. Esses conhecimentos de biologia básica poderão, por sua vez, levar a uma melhora da qualidade de vida humana.
referências
bibliográficas
Bautch VL, Stanford WL, Rapoport R, Russel S, Byrum RS, 1.
Futch TA. Blood island formation in attached cultures of mu-rine embryonic stem cells. Dev Dynamics. 1996;205:1-12. Fraichard A, Chassande O, Bilbaut G, Dehay C, Savatier 2.
P, Samarut J. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J Cell Sci. 1995;108:3181-8.
Ling V, Neben S. In vitro differentiation of embryonic stem 3.
cells: immunophenotypic analysis of cultured embryoid bo-dies. J Cell Physiol. 1997;171(1):104-5.
Heard H, Mongelard F, Arnaud D, Chureau C, Vourc`h C, Avner 4.
P. Human XIST yeast artificial chromosome transgenes show partial X inactivation center function in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96:6841-6. Keller GM. In vitro differentiation of embryonic stem cells. 5.
Current Opinion in Cell Biology. 1995;7:862-9.
Scholz G, Ponl I, Genschow E, Klemm M, Spielmann H. Em-6.
bryotoxicity screening using embryonic stem cells in vitro: correlation to in vivo teratogenicity. Cells Tissues Organs. 1999;165:203-11.
Guasch G, Fuchs E. Mice in the world of stem cell biology. 7.
Nature Genetics. 2005;37:1201-6.
Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swie-8.
giel JJ, Marshall VS, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998;282:1145-7. Reubinoff BE, Itsykson P, Turetsky T, Pera MF, Reinhartz E, 9.
Itzik A, et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat Biotech. 2001;19:1134-40.
Zhang S-C, Wernig M, Duncan ID, Brustle O, Thomson 10.
JA. In vitro differentiation of transplantable neural pre-cursors from human embryonic stem cells. Nat Biotech. 2001;19:1129-33.
Schuldiner M, Yanuka O, Itskovitz-Eldor J, Melton DA, Ben-11.
venisty N. Effects of eight growth factors on the differen-tiation of cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97:11307-12.
Kaufman DS, Hanson ET, Lewis RL, Auerbach R, Thomson JA. He-12.
matopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98:10716-21. Kehat I, Kenyagin-Karsenti D, Snir M, Segev H, Amit M, 13.
Gepstein A, et al. Human embryonic stem cells can differen-tiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 2001;108:407-14. Levenberg S, Golub JS, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Langer R. 14.
Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99:4391-6.
D’Amour KA, Bang AG, Eliazer S, Kelly OG, Agulnick AD, 15.
Smart NG, et al. Production of pancreatic hormone expres-sing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotech. 2006;24:1392-401.
Assady S, Maor G, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Skorecki KL, 16.
Tzukerman M. Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes. 2001;50:1691-7.
Rubinstein P, Stevens CE. The New York Blood Center’s 17.
Placental/Umbilical Cord Blood Program. Experience with a ’new’ source of hematopoietic stem cells for transplantation. Ernst Schering Res Found Workshop. 2001;33:47-70.
Stice SL, Strelchenko NS, Keefer CL, Matthews L. Pluripo-18.
tent bovine embryonic cell lines direct embryonic develo-pment following nuclear transfer. Biology of Reproduction. 1996;54:100-10.
Byrne JA, Pedersen DA, Clepper LL, Nelson M, Sanger WG, 19.
Gokhale S, et al. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature. 207;06357:1-9. Wun IC, Dittman RE. Human somatic cell nuclear transfer. 20.
Chin J Physiol. 2008;51(4):208-13.
French AJ, Adams CA, Anderson LS, Kitchen JR, Hughes 21.
MR, Wood SH. Development of human cloned blastocysts following somatic cell nuclear transfer with adult fibro-blasts. Stem Cells. 2008;26:485-93.
Knoppers BM, Bordet S, Isasi R. The human embryo: ethical 22.
and legal aspects. Methods Mol Biol. 2009;550:281-5. Robertson JA. Ethics and policy in embryonic stem cell re-23.
search. Kennedy Inst Ethics J. 1999;9(2):109-36.
Doerflinger RM. The ethics of funding embryonic stem 24.
cell research: a Catholic viewpoint. Kennedy Inst Ethics J. 1999;9(2):137-50.
