β-LAPACHONA INDUZ APOPTOSE INTRÍNSECA EM CÉLULAS DE
OSTEOSSARCOMA CANINO IN VITRO
Thais Poltronieri dos SANTOS1; Vanessa de Souza Cruz PIMENTA2; Karla Márcia da Silva BRAGA3; Fernanda Almeida RODRIGUES3; Patrícia de Almeida
MACHADO4; Eugênio Gonçalves de ARAÚJO5
1 Graduanda em Medicina Veterinária, Universidade Federal de Goiás, [email protected] 2 Pós doutoranda, Laboratório Multiusuário de Cultivo Celular, Universidade Federal de Goiás
3 Doutoranda em Ciência Animal, Universidade Federal de Goiás 4 Mestranda em Ciência Animal, Universidade Federal de Goiás
5 Professor Doutor do Setor de Patologia Veterinária, Universidade Federal de Goiás
Resumo
O osteossarcoma é a neoplasia maligna de célula óssea mais diagnosticada em cães e humanos. Caracteriza-se por alto potencial metastático, razão de uma reduzida taxa de sobrevivência dos pacientes. A β lapachona é obtida por meio da extração da serragem da madeira do ipê, uma árvore nativa do cerrado brasileiro, que possui potencial citotóxico, genotóxico e capacidade de induzir o estresse oxidativo. Há necessidade de medicamentos mais efetivos, com reduzidas consequências adversas, o que tem gerado esforços para o desenvolvimento de agentes quimioterápicos compostos por plantas e outras fontes naturais. O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos intracelulares da β lapachona sobre células do osteossarcoma canino de cultura estabelecida, submetidas ao tratamento de acordo com as diferentes concentrações. Os resultados foram obtidos por meio do ensaio de marcação com o corante JC-1. A despolarização mitocondrial ocorreu de maneira dose dependente, caracterizando a apoptose intrínseca.
Palavras-chave: cães, cultivo celular, métodos moleculares, neoplasia óssea,
quinonas.
Keywords: dogs, cell culture, molecular methods, bone cancer, quinones.
Introdução
O sarcoma osteoblástico ou osteossarcoma é a neoplasia óssea mais frequente, correspondendo a 6% de todos os tumores caninos. Compreende um tumor ósseo primário maligno, com padrões histológicos distintos, constituído por vários tipos celulares que produzem matriz óssea. Caracteriza-se por infiltração local agressiva dos tecidos subjacentes e rápida disseminação hematógena, em razão disso, o paciente apresenta taxa de sobrevivência em longo prazo entre 10% e 30% (OUYANG et al., 2013; OSBORNE et al., 2012).
O tratamento cirúrgico da lesão primária associado à quimioterapia pode prolongar a sobrevida dos pacientes, contudo os resultados ainda são pouco satisfatórios. Os agentes antineoplásicos atualmente utilizados apresentam efeitos adversos acentuados e, além disso, a proteína p53 pode estar associada a resistência à quimioterapia (CAVALCANTI, 2007).
A β lapachona é derivada das naftoquinonas e apresenta potencial citotóxico e genotóxico, devido ao fato de interagir com as biomoléculas e interferir na ação das enzimas celulares envolvidas no processo de proliferação celular (KLAUS et al., 2010). Possui também a capacidade de induzir o estresse oxidativo na via da enzima P450 redutase, promovendo a cisão do DNA (FERRAZ et al., 2001). Trata-se de substância com a capacidade de inibir o complexo das topoisomeraTrata-ses, induzindo a morte das células malignas. Por se multiplicarem com rapidez, as células neoplásicas se tornam um alvo mais sensível aos inibidores da topoisomerase (SILVA et al., 2003).
Em 1960 ocorreu a primeira descrição da morte celular programada e, desde então, inúmeras classificações têm sido feitas por meio das características morfológicas. Em 2009, a terminologia relacionada com a morte celular compreendia apoptose, necrose e catástrofe mitótica. Desde 2012, para a morte celular, in vitro e in vivo, incluiu-se os termos apoptose extrínseca, apoptose intrínseca, necrose regulamentada, morte celular autofágica e catástrofe mitótica. Existe, também, os termos Anoikis, Entosis, Parthanatos, Pyroptosis, Netosis e Cornificação (GALLUZZI et al., 2012).
O desenvolvimento de medicamentos compostos por plantas e outras fontes naturais pode caracterizar uma estratégia terapêutica eficaz. O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos intracelulares da β lapachona sobre células do osteossarcoma canino de cultura estabelecida.
Metodologia
As células de osteossarcoma, linhagem D-17, foram adquiridas do Banco de Células do Rio de Janeiro, originárias da ATCC (American Type Culture Collection - Manassas, VA, USA). As células foram mantidas em incubadora umidificada a 37ºC com uma atmosfera de 5% de CO2, e cultivadas em meio Dulbecco modificado de
(10.000 U.I./ml - 10 mg/ml), anfotericina B e L glutamina, de acordo com adaptação de Yu et al. (2014).
A β lapachona (βLP) foi adquirida da Santa Cruz Biotechnology. Os compostos de teste foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) e as soluções de estoque foram preparadas com 1 mM e armazenadas a -20ºC.
As células foram cultivadas por 24 horas em placas de doze poços, com a concentração de 5x105 células/poço. Os tratamentos com β lapachona foram feitos
com as dosagens de 1 μM, 0,3 μM, 0,1 μM e grupo controle negativo por 24 h. Ao final do período de tratamento, as células foram incubadas com o corante JC-1 e ressuspensas em tampão de ensaio. Os resultados foram obtidos por meio do citômetro de fluxo e analisados pelo programa de gráficos estatísticos GraphPad Prism. Para o ensaio foram realizados três experimentos independentes em triplicata.
Resultados e Discussão
O efeito da β lapachona sobre o potencial de membrana mitocondrial foi medido durante 24 horas, por meio do corante lipofílico JC-1. O produto penetrou nas células, acumulou-se no interior das organelas e emitiu fluorescência vermelha em mitocôndrias funcionais, indicando viabilidade celular. As mitocôndrias com menor potencial de atividade de membrana permaneceram na forma monomérica, indicando apoptose.
A despolarização mitocondrial ocorreu de maneira dose dependente. A apoptose foi menor na concentração de 0,1 μM (14,86%) e maior na concentração de 1,0 μM (88,13%). Os dados indicaram que a apoptose desencadeada pela β lapachona pode estar relacionada com a ruptura da integridade do potencial de membrana mitocondrial. Em conformidade com esse resultado, Pardee et al.(2002) relataram que a β lapachona causa liberação de citocromo c, proteína associada à membrana interna da mitocôndria, que inibe o ciclo celular. Dessa forma, a β lapachona desempenha uma ação antineoplásica seletiva nas mutações mitocondriais, frequentes em células tumorais. Galluzi et al. (2012) descrevem como apoptose intrínseca a morte celular que inicia na membrana mitocondrial externa ou pode resultar da transição da permeabilidade mitocondrial.
Não houve diferença estatística significativa entre os valores das repetições e triplicatas em cada concentração (p=0,9583). No entanto, houve diferença estatística significativa entre os resultados encontrados nas concentrações utilizadas (p<0,0001). A despolarização mitocondrial foi menor no grupo tratado com 0,1 μM de β lapachona (3,47%) e maior no grupo tratado com 1,0 μM de β lapachona (83,45%). A indução da perda da integridade do potencial de membrana mitocondrial também ocorreu em células de osteossarcoma canino tratadas por 3 horas, com 30 μg/ml de α mangostin, substância extraída do mangostão, fruta tropical encontrada no sudeste da Ásia(Krajarng et al., 2012).
Este estudo é o primeiro a avaliar os efeitos da β lapachona no processo da morte celular em linhagem de osteossarcoma canino. A apoptose foi o tipo de morte celular relacionada com a ruptura da integridade do potencial de membrana mitocondrial, indicando a ocorrência de apoptose intrínseca. Os resultados desta pesquisa apontam para novas perspectivas no tratamento do osteossarcoma canino.
Conclusão
A β lapachona induz apoptose intrínseca nas células de osteossarcoma canino “in vitro”.
Referências
CAVALCANTI, J.N. Osteossarcoma canino: estudo histopatológico,
imunohistoquímico e da atividade proliferativa. Universidade Federal de
Campinas, 2007.
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Piacentini, M.; Rubinsztein, D. C.; Shi, Y.; Simon, H. U.; Vandenabeele, P.; White, E.; Yuan, J.; Zhivotovsky, B.; Melino, G.; Kroemer, G. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation, v. 19, p. 107-120, 2012.
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