' ( ! " # " $ % ! % & ' & ' ( ) ( * $ 1' 2 15 $ +2 +, -. & ' * * & ' /

(1)

!

" # #$ #

"$% &$

"%$

'

(

• • • • ! " # " $ %

( ) ( )

E S

( )

ES K

( ) ( )

E P K K + →   ← →  + 3 2 1 ! % & ' & ' ( ) ( * +, - . & ' * * & ' / 0 1 2 3 4 $ 1' 2 15 $ +2

(2)

1 2 & ' " # " 1 2 # " * 6 * * $ * % ] [ ] .[ max S Km S V V + = max 1 max 1 1 V V Km S V = + * 4 * ( 0 7 6 ( ! * " 8 & ( 0 * 6 8 8 $ ' ( 9 % * " : 1 2 $ 6 ! " # $ % & ' ( ! " 8 $ * : 6 & $

Figura 1 - Efeito da concentração de enzima na velocidade inicial de reação.

(3)

" 8 : $ " * ) & # $ % ; 6 1 2 * * * (% + & % , ( # $ % ) <= $ 1 5 " 2 -<= 8 = +< # " ( .> !_? _{@ "} _$ 8 ? $ -= . <== ( * ( " * 15 2 ? $ 1A !_{? 2} $ ) 1+%+==2 * ( & % % + - % % % . +

[

substrato

] [

enzima

]

[

produtos

]

frutose

-D

glucose

D

Sacarose

pH=

→

4,7e25C

α

−

+

β

invertase * " 8 1 6 α( ($ B β( ( $ $ $ 6 α 1+ → -2 / " * $ 6 & $ % ( ' % (/ " 8 " ( ' % ( 0 α( ($ β( ( & : * & 1 * $ . <( ( ( .( (<( ( ; * * : % 1 2 ' . <C C * < $ . <C C 6 +== / ! - / ' * +<= $ 8 -<= $ # 0 <== $ ' - = # ) @D $ + === ! % 0 6

(4)

/ % % & & ( # $ % & " + / E % 2 & 1= + $ 6 , 2 2 F = =< # A > 2 ' % = - # 2 E % . <C C C 1G2 % 2 ! + F + C E $ * F E + - . A < @ F = =< # A > 1 2 + = + = + = + = + = + = H $ 1 2 + = = I = D = @ = - ( ' = - # 1 2 = < = < = < = < = < = < 1G2 9 = + $ , 1 2 ( = + = - = A = D + = 9 % -<J ? < . <C C C 1 2 + = + = + = + = + = + = * +==J ? < -! 1 2 @ < @ < @ < @ < @ < @ < K % <A= 1 2 8 L 6 J + " $ L 9 / % % + % & ' ) # $ % / E % 2 & 1= + $ ) 6 , 2 2 F = =< # A > 2 ' % = - # 2 E % . <C ( F - C E $ * F E + - . A < F = =< # 1 2 A > + = + = + = + = + = H $ 1 2 + = = D = D = D = D ' = - # 1 2 = < = < = < = < = < 9 1 2 ( = - = - = - = -9 -<J ? . <C C F 1 2 ( < += +< . <C C 1 2 + = + = + = + = + = * +==J ? < H $ 1 2 @ < @ < @ < @ < @ < K % <A= 1 2

(5)

8 L 6 J + " $ L / % % 3 / 2 & 1= + $ 6 , 2 2 F ( = =< # - = F = < # A = F = =< # < = E % F = =< # @ = F = =< # > = F = =< # D = F = =< # I = 2 ' = - # 2 E . <( C C F . C E $ * F E + - . A < @ > D F = =<# - = + = + = ( ( ( ( ( ( F = =<# A = ( ( + = ( ( ( ( ( F = =<# < = ( ( ( + = ( ( ( ( F = =<# @ = ( ( ( ( + = ( ( ( F = =<# > = ( ( ( ( ( + = ( ( F = =<# D = ( ( ( ( ( ( + = ( F = =<# I = ( ( ( ( ( ( ( + = H $ + = = D = D = D = D = D = D = D ' = - # = < = < = < = < = < = < = < = < 9 = + $ , ( = - = - = - = - = - = - = - = -9 % -<J ? < . <C C C + = + = + = + = + = + = + = + = * +==J ? < -! @ < @ < @ < @ < @ < @ < @ < @ < K % <A= 1 2 8 6 1 " J +2 $ L 9 / % % & & ( # $ % % ' ) ( % E % 2 & 1= + $ 6 , 2 2 F = =< # A > 2 = =+ # = =- # = =< # = + # = - # 2 E . <( C C

(6)

F A C E $ * F E + - . A < @ F = =< # A > 1 2 + = + = + = + = + = + = H $ 1 2 + . = . = . = . = . = . ' = =+ # 1-A #2G 1 2 ( + = ( ( ( ( ' = =- # 1-A #2G 1 2 ( ( + = ( ( ( ' = =< # 1-A #2G 1 2 ( ( ( + = ( ( ' = + # 1-A #2G 1 2 ( ( ( ( + = ( ' = - # 1-A #2G 1 2 ( ( ( ( ( + = 9 = + $ , 1 2 = - = - = - = - = - = -9 % -< ? < 1G2 ( 4 0 . <( C C 1 2 + = + = + = + = + = + = * +== ? < 1 " ( 2 -! 1 2 @ < @ < @ < @ < @ < @ < K % <A= 1 2 8 6 1 " +2 $ L 1A # D # -= # A= # D= # - @ 2 & $ 1 # " 2 9 4 5 6 M+N (((( O * 6 % / - ? % ' K 1P 5 ) E2 +IDD

M-N Q / 9/ R # / & 9FQ & K 9 # ? ! / E ? 5 K 8 & $ " 3 6 999

1/ 2 & $ " 3 6 C P & # # $ +IID

(7)

)

!

" # #$ #

"$% &$

"%$

')

(

• $ ; * 4 7 * 4 ! ; ; $ 7 * P $ 5 $ =+ : 5+ 5- 5 E+ E- E ! ; E * 6 . ' ( 8 9 % P 1 6 " 2 $ 1 2 4 1 6 2 P ; ; $ 6 * 1 0 * 2 P ; * 0 6 6 9 6 P ; * 6 ; 6 * / ; . - 6 F =+

(8)

F O & K =+% 5 6 ; 6 % ( ! :; 9 < ! :=9 < F F+ F -+ -? M& +N M& -N 4 5 ! ; 1-.₂ $ F =- F O & K =-% & ;

& % + ( ' ( 3 % & / & " +

=+ 1(+2 1(+2 1(+2 =- 1B +2 1(+2 1(+2 =. 1(+2 1B +2 1(+2 =A 1B +2 1B +2 1(+2 =< 1(+2 1(+2 1B +2 =@ 1B +2 1(+2 1B +2 => 1(+2 1B +2 1B +2 =D 1B +2 1B +2 1B +2 <= K <S , * Glucose e Frutose (µmoles) tempo (min) # 9 E O F ? 6 . ' ( > ? # * +2 ? <= K $ ; -2 F = < K A < K

(9)

$ 1 +%+=2 < & $ $ & .2 T A2 . -+ = < K A < K $ / ( " $ ( < F $ $ <2 : / ' ? 4 @ (+ & # $ % # 2 ( ' % ( = - % % % = (A ! B = % % 0 ! / ' M+ -N ( . < ( 6 .( (<( 6 * $ 6 : $ 6 " <A= ! / ' : ' M+N $ $ % . <( ( 6 E " 8 " 8 8 * 6 ( ' E " 1 8 _{( ? A A!@ / A -!2} $ $ 7 ( 5 ( * ( O ( ( 8 8 ( $ ( 6 * ( ( # $ % ' ( * ($ % 5 ! % ; 6 (' % =9 . C4 0 1 2 $ B + = - = $ $ B , ) = <$ : $ $ 6 . " 1 2 $ B $ 3 + 0 + $ ,K / 0 $ - $ ,K ( ( * $ B 1 A2 3 + A - 1 = =< - U = += $ , K 2 1 2 1+ -+2 = < K * 5 1+ ( -+2 ' ! 1 2 6 = < K / ' 1 2 1 2 K " $ * $ ; T < 1 2 E " " $ 4 = ? . ( < 1 2 6 D K

(10)

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

(11)

4 4 L * $ B 1 $ , K 2 6 $ B $ B 6 1 2 ' $ % W U X % W U L U ? ; U ? $ ; U ? $ 1 $ , K 2 * $ % #R U U 1W X 2 , 1 $ , K 2 ? U #R ( #O 1 $ , K 2 1=+2 3 P E! . ( & # 9 & K F E 1 2 1 K 2 + -R B 5 ) 1#$ , K 2 R B 5 5 1& * =+2 µ R 1& * =-2 = . @ I +-+< +D -+ .= <+ == <= <= <= == AI <= AI == AD <= AD == A> <= A> == +%+= = = 1 2 P , K P U Y $ , + 1Y $ 2 U Z  1P , K 2 1=-2 K K 6 1 2 P , $ 6 % + 1Y $ 2 U  1P , $ 2 1=.2 $ 6 $

(12)

4 +2 ? F =- -2 ? 0 .2 ! 6 6 6 A2 ! <2 E 5 4 5 6 + ' P ##& E [ O W E $ " & ' $ / P

( [ O ? " W A> A-@ +I<I

- ! & 999 R O \ 9K & ? E O K / ? \ V) ' " & "

E W ? ? W W V ( # " K ] O ^ W K W

P ? O ^ W +ID+

. ' ? 9 # / 5 ? 0 ) 1+IDA2

A Q / 9/ R # #!E & ' 5 5 ( F $ 9 ? & 4

) H O ( E 8 J - ; " ,D> .+<(.-+

< K !\ E_ ! E!' & O E!P R / [ 5 EE K E / K K E [ ) # \ " "

5 ) " E $ ( [ O $ ? " W +I. -@< +I<+

@ (((( O * 6 % - ? % ' K 1P 5 ) E2 +IDD

> Q / 9/ R # / & 9FQ & K 9 # ? ! / E ? 5 K 8 & $ " 3 6 999

(13)

*

!

$ $%

+,- #

- &

$ #$

. $/&

$

$ 0

1 +,- $

"$ $

$ - #$

$

&

• E ; $ • # " (# " 8 • * * " ; • ) P * 0 1 : 2 %

"

%,,] ] ]

W " ,

W

,

+_{1& ? . < + <2} _* _" ₈ _T ₈ $ $ 6 / * $ " $ 7 $ * $ & * T 8 T 0 % + $ ( & ' * 6 % / -? !/ -B  ← →  2 1 K K M/ -? !/ - NG M+N - ! & ' $ $ T ? !- % M/ -? !/ - NG B -! →K3 - / . B ? !- B M-N

(14)

& * % - / .B - -! → - / A! 1" 8 T 2 ? !-B -! → -? !. 1 T 2 -? !. B - / A! → 1/ A2-? !. B -! 1 T 2 T * ; ( " $ 6 ; 1 2 T " 6 0 " 6 D # " (# 0 ( * & ' & 0 ) M.N 0 * # " (# * 1 2 1 C 2 1' 2 * =+ MAN ! # ` #- * $ # ` 4 5 , ( # $ % & " + ) +< $ ; $ ( $ A " ( W -<= +== $ >< S " W $ +< ? $ $ 5

(15)

$ $ @ 1 2 * $ ( ( " # $ % ( ! + & ( & " + ) 8 ( * * % + # $ % % ) ' ( % / & 6 6 1 6 2 & - $ ; - $ $ - ._# _& _O _- _$ - # ? 6 : 1 2 - & " + / / ( " * " P O / . = ==+ # > = 1 +S 2 - $ / O 1 2 . > = 1 2 - $ + $ " A _$ _" ₈ _< _? ! % ( " .>!_? # $ % ' (- % + ' ( • O " • E ; * • $ $ • ? 6 • ? T $ • ' • ' +S 1= < $ $ / !. AI < $ $ 2 • ' + @ S = D S = A S = - S = + S = =< S = =-< S = =+-< S % !' # $ % ' (- 9 EF G 0 A == $ W <== ( -A@ $ $ 1 * 2 % !' # $ % ' (- 8 EH G 0 <= * W -<= <= $ % !' # $ % ' (- 8 EI G 0 <= = D S W -<= <= $ % !' # $ % ' (- 8 E> G 0 <= = A S W -<= <= $ % !' # $ % ' (- 8 E9 G 0 <= = - S W -<= <= $ % !' # $ % ' (- 8 E8 J G 0 <= = + S W -<= <= $ % !' # $ % ' (- 8 E8 > J G 0 <= = =< S W -<= <= $ % !' # $ % ' (- 8 E8 9 > J G 0 <= = =-< S W -<= <= $

3_{Mistura de solução de NaOH 2,5 N a uma solução de sulfato de cobre a 1%, na proporção 5:3.}

(16)

? >= K $ 6 $ * .> ? - K T E $ +< .= .= $ E 0 E 8 + K +S 4 + & * . * A 7 ( [ * / + $ +A - # * & * A +, +,M' N 1$ K ] ( O ^ 2 . ? # " (# * F& / a b !% # " (# ? A ? * < ? " * L ; 6 @ 9 T > ? D=S T 8 = < . _{= +} _, . = ==+ $ , . 4 5 6 + (((( O * 6 % / - ? % ' K 1P 5 ) E2 +IDD

- (((( K W & % ? & #9' FE_ R c $ ) _ \ &

. 5 !R K & E ' & ? " E & $ $ . P ' % ) (

+III

A literatura fornece os seguintes valores [3] (Vmáx e Km dependem da

concentração de enzima utilizada):

[uréia], kmol/m3 0,2 0,02 0,01 0,005 0,002 -ruréia, kmol/m3.s 1,08 0,55 0,38 0,2 0,09

Para concentração de urease [E] de 5 g/dm3.

Em outra fonte [2]: Km = 4,86.10-3_mol.l-1_{, para urease em 50% de glicerina,}

(17)

2

3

4

5

6

7

3

4

7

OBJETIVOS:

Determinar a estabilidade térmica da enzima urease na forma solúvel e imobilizada a 60o_C.

INTRODUÇÃO:

A determinação da estabilidade térmica da enzima é um fator de grande importância prática, uma vez que, do ponto de vista industrial deseja-se ter um catalisador com alta atividade e um longo tempo de meia vida.

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA:

A Atividade catalítica das enzimas depende da temperatura, e como no caso dos catalisadores convencionais, à medida que se aumenta a temperatura a taxa de reação aumenta, porém, a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica.

A desnaturação da enzima pelo efeito da temperatura, normalmente é obtida incubando-se a enzima em água, solução tampão ou em presença do substrato por um certo período de tempo e, em seguida, determinando-se a atividade residual. Neste caso os gráficos são construídos relacionando-se a atividade relativa em função do tempo.

A relação entre a atividade inicial (Ainicial) e a residual (Aresidual) num determinado

tempo é do tipo exponencial (Dixon & Webb citado por ZANIN, 1996)

Ainicial = Aresidual.exp (Kd . t) (1)

Onde,

Ainicial – atividade enzimática inicial observada no reator sem incubação da enzima.

Aresidual – atividade enzimática residual observada no reator, após um certo período de

incubação.

Kd – constante de desnaturação da enzima em uma determinada temperatura, modelo

exponencial (h-1_).

t – tempo de incubação.

A partir da curva de ln (Aresidual/Ainicial) em função do tempo pode-se obter o valor da

constante de desnaturação (Kd).

Outra característica importante da estabilidade da enzima, é o tempo de meia-vida (t1/2) que representa o tempo necessário para que a atividade seja reduzida à metade do seu

(18)

1, há uma relação inversamente proporcional entre o tempo de meia-vida e o coeficiente de desnaturação ou inativação (modelo exponencial).

t1/2 = ln 0,5/Kd = 0,693/Kd (2)

METODOLOGIA:

a) ENZIMA SOLÚVEL:

Colocar a solução de enzima em um banho a 60o_{C e acionar o cronômetro. Esta}

solução estoque de enzima deve permanecer incubada a 60oC, sendo que em intervalos de 30 minutos, uma alíquota de 3 mL é retirada para a determinação da atividade residual a 37oC.

A atividade residual é determinada, pelo método das atividades iniciais e de acordo com a metodologia descrita na prática 12 (Cinética enzimática:determinação da constante de Michaelis-Menten).

b) ENZIMA IMOBILIZADA

Colocar as 4 cestas numeradas no banho a 60oC, e a cada 30 minutos determinar a atividade residual da urease, procedendo como no caso da enzima solúvel.

RESULTADOS: