PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ

1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ

“PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ VÀ ỨNG DỤNG”

2

MỤC LỤC

1. ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ KHÍ

1.1 Khái niệm và phân loại………4

1.2. Vài nét lịch sử………...4

1.3 Cơ sở lý thuyết chung của sắc ký khí………..4

1.3.1 Quá trình sắc kí………...4

1.3.2 Các phương pháp tiến hành tách sắc kí………..5

1.3.4 Sự doãng rộng của pic và hiệu lực tách………11

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực tách của cột………...13

1.3.6 Độ phân giải của cột ……….17 2. HỆ THỐNG SẮC KÝ KHÍ 2.1.Thiết bị………20 2.2 Hệ thống cấp khí mang……….20 2.2.1 Hệ thống cấp khí mang………20 2.2.2 Khí mang………..21 2.3 Hệ thống tiêm mẫu……….22

2.3.1 Buồng tiêm dùng cho cột nhồi………23

2.3.2 Buồng tiêm dùng cho cột mao quản………..23

2.4. Cột sắc ký……….25 2.4.1 Cột nhồi………..26 2.4.2 Cột mao quản……….29 2.4.3 Pha tĩnh ………..33 2.5 Lò cột ………42 2.6. Đầu dò……….………….44

2.6.1 Dectector dẫn nhiệt (thermal conductivity dectector)……….45

2.6.2 Detector ion hóa ngọn lửa (flame-ionization detector) ………..47

2.6.3 Detector cộng kết điện tử (electron capture dtector) ………..49

2.6.4 Detector phát xạ nguyên tử (atomic-emission detector) ………52

2.6.5 Detector quang kế ngọn lửa (flame photometric GC detector) …….53

2.6.6 Detector quang hóa ion (photoionization detector) ………...54

2.6.7 Chemiluminescence Spectroscopy………..55

2.6.8 Detector Nitơ-photpho NPD ………56

3

2.6.10 Các thông số quan trọng của detector………..59

2.7. Hệ thống ghi nhận và xử lý số liệu……….61 3. TIẾN TRÌNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ 3.1 Xác định mục tiêu phân tích………...61 3.2 Chuẩn bị mẫu………62 3.3 Chọn Detector………62 3.4 Chọn cột……….63 3.5 Chọn phương pháp tiêm mẫu………64

3.6 Chương trình hóa nhiệt độ và áp suất………..64

4. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG BẰNG GC 4.1 Phân tích định tính………67

4.2 Phân tích định lượng……….67

4.2.1 Một số nguyên nhân gây ra sai số……….68

4.2.2 Các phương pháp tính toán định lượng……….68

5. ỨNG DỤNG CỦA GC 5.1 Ứng dụng của GC tại CASE ………70

5.2 Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ đầu dò Ion Trap(CASE)………71

5.2.1. Nguyên tắc hoạt động GCMS………..71

5.2.2. Cấu tạo đầu dò khối phổ đầu dò bẫy ion (Ion trap)………..72

5.2.3. Ứng dụng hệ thống Thermo Polaris Q………73

5.3 GCMS với độ phân giải cao (HRGC/HRMS)-CASE……….74

5.4 Xác định hàm lượng Diethylene Glycol, Ethylene Glycol có trong kem đánh răng bằng phương pháp GC-MS………75

5.4.1 Mở Đầu………75

5.4.2 Nội dung tiến hành……….75

5.4.3 Kết Luận………..80

4 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ KHÍ

1.1 Khái niệm và phân loại

Sắc kí (IUPAC-1993): là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách

được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định.

Sắc ký khí (GC- Gas Chromatography) là một phương pháp sắc ký mà pha

động là chất khí hoặc ở dạng hơi và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên bề mặt chất mang dạng rắn hay phủ đều lên thành phía trong của cột tạo lớp màng phim mỏng.

Cơ sở tách bằng sắc kí khí là sự phân bố của mẫu giữa hai pha: pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha động là khí thấm qua toàn bề mặt tĩnh đó. GC chia làm 2 loại:

- Sắc kí khí-rắn(GSC- Gas Solid Chromatography): pha tĩnh là chất rắn. Chất rắn nhồi cột thường là silicagel, rây phân tử hoặc than hoạt tính. Cơ chế tách chủ yếu là hấp phụ.

- Sắc kí khí-lỏng(GLC- Gas Liquid Chromatography): pha tĩnh là lỏng. Chất lỏng bao bọc quanh bề mặt một chất rắn trơ, gọi là chất mang, tạo nên một lớp phim mỏng. Cơ chế tách là sự phân bố của mẫu trong và ngoài lớp phim mỏng. Mỗi thành phần của hỗn hợp trong pha động khi đi qua pha tĩnh sẽ tương tác với pha tĩnh bằng ái lực, ái lực của mỗi chất với pha tĩnh là khác nhau, chất có cái lực yếu với pha tĩnh sẽ thoát ra khỏi cột trước và chất có ái lực mạnh với pha tĩnh sẽ ra khỏi cột sau. Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động.

1.2 Vài nét lịch sử

1905 Ramsey tách hỗn hợp khí và hơi dựa trên cơ sở hấp phụ của than hoạt tính. 1906 Tswett tách các sắc tố thực vật trên cột và gọi quá trình tách là ‘sắc kí’.

1941 Martin và Synge (giải thưởng Nobel) trình bày lý thuyết đĩa trong chưng cất và chiết suất ngược dòng. Trên cơ sở đó James và Martin đề xuất ra sắc kí khí-lỏng (1952).

Từ đó đến nay GC ngày càng hoàn thiện. Đến năm 1968 đã có khoảng 18000 công trình về GC. Những năm gần đây được sự hỗ trợ của công nghệ điện tử và tin học, GC đạt được nhiều thành tựu hơn nữa.

1.3 Cơ sở lý thuyết chung của sắc ký khí 1.3.1 Quá trình sắc kí

Sắc kí là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu được vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh. Mẫu đi vào tướng động được mang theo dọc hệ thống sắc kí (cột, bản phẳng) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp.

5

Pha động có thể là pha lỏng hoặc khí, pha tĩnh có thể là một lớp phim được phủ trên bề mặt của chất mang trơ hoặc một bề mặt rắn. Sự tương tác xảy ra giữa các cấu tử với pha tĩnh nhờ đó các cấu tử sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh.

Sự ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với những vận tốc khác nhau trong pha động của hệ thống sắc kí. Kết quả là chúng được tách thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình các cấu tử lần lượt hiện ra theo trật tự tương tác với pha tĩnh.

Cấu tử di chuyển chậm (tương tác yếu) ra trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn ra sau dưới dạng các đỉnh (pic) tách riêng rẻ (hoặc bậc thang) tùy thuộc vào cách tiến hành sắc kí và được hiển thị dưới dạng sắc kí đồ.

Hình minh họa một quá trình tách một hỗn hợp đơn giản gồm hai chất A và B (lực tương tác với pha tĩnh của A < B) theo thời gian. Mẫu chứa A và B được tiêm vào cột. Khi cho một chất rửa giải bắt đầu chảy qua cột, phần của mẫu được hòa tan trong

pha động được di chuyển tại phần đầu của cột (tại thời điểm t0). Ở đây các cấu tử A và

B tự phân bố giữa hai pha.

Tiếp tục cho pha động đi qua cột thì nó sẽ đẩy phần hòa tan này chạy xuống dưới và một sự phân bố mới giữa pha động và pha tĩnh sẽ xảy ra (thời điểm t1). Đồng thời sự phân bố giữa dung môi mới và pha tĩnh cũng diễn ra tại vị trí của mẫu lúc đầu.

Việc thêm tiếp dung môi sẽ mang các phân tử hòa tan chạy xuống cột trong một loạt liên tiếp các chuyển biến giữa hai pha. Bởi vì sự di chuyển của chất tan chỉ xảy ra trong pha động, nên tốc độ trung bình của sự di chuyển chất tan phụ thuộc vào phần thời gian chất tan ấy nằm trong pha đó. Phần thời gian này là nhỏ đối với chất tan bị lưu giữ mạnh bởi pha tĩnh (cấu tử B trong ví dụ trên) và lớn đối với chất tan (cấu tử A) có sự lưu giữ trong pha động mạnh hơn. Sau một thời gian các phân tử chất A và B dần dần được tách khỏi nhau.

Nếu đặt một detector có khả năng phát hiện được các chất tan (cấu tử A và B) tại cuối cột tách và tín hiệu của nó được vẽ lại như một hàm của thời gian (hoặc thể tích được thêm vào) thì một loạt pic đối xứng sẽ được ghi lại và được gọi là sắc kí đồ.

Vị trí của các pic theo thời gian được dùng để nhận diện định tính và diện tích của peak được dùng cho phép phân tích định lượng của cấu tử đang xét.

6

Hình 1. Quá trình tách sắc kí trên cột của hai chất A và B

1.3.2 Các phương pháp tiến hành tách sắc kí

Để thực hiện tách sắc kí người ta có thể sử dụng một trong ba phương pháp sau:

1.3.2.1. Phương pháp rửa giải

Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi nhất trong các phương pháp sắc kí hiện nay. Một lượng nhỏ hỗn hợp mẫu được giới thiệu vào cột với pha động có ái lực với pha tĩnh bé hơn so với bất kì cấu tử cần tách có trong mẫu. Vì thế các cấu tử cần tách di chuyển với tốc độ chậm hơn so với chất rửa giải. Tốc độ này được xác định bởi ái lực tương đối của mỗi cấu tử lên pha tĩnh so với pha động, đó chính là hệ số phân bố K = Csp/Cmp. Ở đây Csp, Cmp là nồng độ của cấu tử đang xét trên pha tĩnh và trong pha động.

Các cấu tử được rửa giải theo trật tự ái lực của chúng nhưng tốc độ di chuyển tương đối của chúng phụ thuộc vào tương tác 3 thành phần giữa chúng với pha động, với pha tĩnh và giữa pha động với pha tĩnh. Bởi vì các cấu tử được tách khỏi nhau với một vùng pha động ở giữa chúng nên phương pháp này được sử dụng trong các phép tách với mục đích phân tích.

Pha động có thể không thay đổi thành phần dung môi trong suốt quá trình rửa giải; có thể thay đổi dung môi rửa giải sau một thời gian định trước (rửa giải theo từng giai đoạn); cũng có thể không thay đổi các dung môi tạo nên pha động nhưng thay đổi nồng độ của các thành phần có trong pha động sau một thời gian định trước (rửa giải gradient).

7

1.3.2.2. Phương pháp tiền lưu

Hỗn hợp cần tách gồm các chất A, B và C được cho chảy liên tục vào phần trên của cột, trong đó A là cấu tử có ái lực yếu nhất với pha tĩnh. Do các cấu tử A, B và C bị lưu giữ trên cột, nên trước hết từ cột chảy ra chỉ có dung môi. A do có lực tương tác trên cột yếu nhất sẽ di chuyển xuống dưới còn các cấu tử có ái lực mạnh hơn A bị pha tĩnh giữ ở phần trên của cột.

Do dung dượng có hạn của pha tĩnh nên khi vượt dung lượng này thì cấu tử A sẽ di chuyển dọc theo cột và ra khỏi cột ở dạng nguyên chất sau đó là hỗn hợp của các thành phần tiếp theo A+B rồi A+B+C.

Phương pháp tiền lưu ít được dùng do không thực hiện được việc tách hoàn toàn các cấu tử, đặc biệt khi sử dụng sự tách sắc kí vào mục đích phân tích.

1.3.2.3. Phương pháp thế đẩy

Mẫu được cho vào cột, dùng dung môi rửa giải có ái lực với pha tĩnh mạnh hơn bất kì một cấu tử nào của hỗn hợp tách để đẩy các cấu tử cần tách thoát ra khỏi cột. Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác yếu nhất với pha tĩnh, sau đó đến các cấu tử khác có ái lực với pha tĩnh tăng dần.

Phương pháp này tạo nên các dải rửa giải không hoàn toàn được tách khỏi nhau: có dải thu được chất nguyên chất nhưng có dải giữa các dải nguyên chất thì gồm hỗn hợp của chúng. Trong thực hành phòng thí nghiệm để tách các hỗn hợp phức tạp người ta thường hay dùng hơn cả là phương pháp rửa giải.

8 1.3.3 Đặc tính sắc kí của chất tan

1.3.3.1. Tính chất lưu giữ

Tính chất lưu giữ phản ánh sự phân bố của chất tan giữa pha tĩnh và pha động và được biểu thị bằng các đại lượng thể tích lưu hay thời gian lưu.

- Thể tích lưu VR là thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan i từ thời

điểm đưa mẫu vào, đi qua cột và đến detectơ (trên sắc kí đồ là điểm cực đại của peak).

- Thời gian lưu tR là thời gian từ lúc chất tan i được nạp vào cột tách ở bộ phận

tiêm mẫu cho đến lúc chất ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại.

Thể tích lưu có thể nhận được trực tiếp từ thời gian lưu tR trên sắc kí đồ bằng cách nhân với tốc độ thể tích dòng Fc (thể tích của pha động trên một đơn vị thời gian):

Tốc độ dòng được tính theo các thông số của cột như sau: - dc là đường kính của cột,

- L là chiều dài cột,

- εt là độ rỗng toàn phần của chất nhồi cột (độ rỗng của chất nhồi cột biểu thị tỉ số thể tích kẽ hở của chất nhồi và thể tích khối toàn phần của nó: đối với chất nhồi rắn = 0.35 - 0.45, chất nhồi xốp = 0.70 - 0.90, cột mao quản = 1.0),

- Vc là thể tích bên trong cột.

Tốc độ tuyến tính trung bình u của sự dịch chuyển chất tan là: Tốc độ tuyến tính trung bình u của pha động là:

Ở đây tM hay to là thời gian không bị lưu giữ của chất tan (thời gian chất tan lưu

trong pha động). Trong sắc kí khí, tM được lấy bằng thời gian cần thiết cho CH4 di

chuyển đi qua cột. Tương ứng tM hay to có thể tích VM (hoặc Vo) biểu thị thể tích trống

của cột (bao gồm cả thể tích của bộ phận tiêm mẫu (injector), thể tích các đoạn ống nối, thể tích rỗng của chính cột và thể tích detector).

Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R hoặc thời gian lưu hiệu chỉnh t’R được cho bởi:

V’R = VR –VM hoặc t’R = tR – tM

(thời gian không bị lưu giữ của chất tan gần đúng được xem như là thời gian lưu của pha động).

9

Hình 3. Sắc kí đồ minh họa các thời gian lưu t (hoặc thể tích lưu) và độ rộng của đáy peak W của chất tan không bị lưu giữ M và của 2 chất bị lưu giữ 1 và 2

1.3.3.2. Hệ số phân bố K (Partition coefficient)

Mỗi cấu tử hoặc chất tan được phân bố giữa 2 pha với một cân bằng được thiết lập và tất cả các quá trình tách sắc kí được dựa trên sự khác nhau về khả năng phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh.

Khi chất tan đi vào hệ thống sắc kí, nó ngay lập tức phân bố giữa các pha động và pha tĩnh. Giả thiết nếu pha động dừng lại vào bất kì một thời gian nào, chất tan có một sự phân bố cân bằng giữa hai pha, và nồng độ của chất tan ở trong mỗi pha được cho bởi hệ số phân bố nhiệt động:

Ở đây Cs và CM là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động tương ứng.

Trường hợp khi K = 1 thì chất tan được phân bố bằng nhau giữa hai pha.

Hệ số phân bố xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan (chính xác là tâm vùng) do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột. Đối với peak đối xứng, khi cực đại pic xuất hiện ở lối ra của cột, một nửa lượng chất tan đã được rửa khỏi cột trong

thể tích lưu VR và một nửa còn lại được phân bố giữa thể tích pha động VM và thể tích

pha tĩnh Vs:

VRCM = VMCM + VsCs

hay VR = VM + KVs hay VR – VM = KVs

Phương trình này đúng với cột phân bố lỏng, còn đối với cột hấp phụ, Vs phải thay

bằng Ss là diện tích bề mặt của chất hấp thụ.

1.3.3.3. Hệ số dung lượng k’ (The capacity factor)

Hệ số dung lượng k’ là thông số thực nghiệm quan trọng trong sắc kí cột được sử dụng rộng rải để mô tả các tốc độ dịch chuyển của các chất tan trên cột. Cho một chất tan, hệ số dung lượng k’ được định nghĩa như là tỉ số mol chất tan trong pha tĩnh và số mol chất tan trong pha động:

10

Tỉ số VM/Vs được gọi là tỉ số thể tích pha

Hệ số dung lượng còn được định nghĩa là tỉ số giữa thời gian của chất tan lưu lại trên pha tĩnh và thời gian cần để chất tan đó di chuyển trong pha động suốt chiều

dài của cột nếu không bị lưu giữ tM.

Khi k’ cho một chất tan nhỏ hơn 1 nhiều, sự rửa giải xảy ra rất nhanh nên việc xác định thời gian lưu là rất khó. Còn khi k’ khoảng 20 đến 30 thì thời gian rửa giải sẽ bị kéo dài. Vì vậy các phép tách nên được thực hiện ở những điều kiện mà các k’ của các chất tan nằm trong khoảng giá trị từ 1 đến 5.

Giá trị k’ trong sắc kí khí có thể được thay đổi bởi việc thay đổi nhiệt độ và cách nhồi cột. Còn trong sắc kí lỏng, k’ thường được điều khiển để cho phép tách tốt hơn bởi thay đổi thành phần pha động và pha tĩnh.

1.3.3.4. Hệ số chọn lọc (The selectivity factor)

Khả năng của một pha tĩnh tách 2 cấu tử A và B (B là cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn) được xác định bởi tỉ số phân bố tương đối của chúng và cũng là những hệ số lưu giữ của chúng đối với một pha tĩnh đã cho.

Hệ số chọn lọc α là một hàm của sự lưu giữ tương đối của mỗi cấu tử trên pha tĩnh

Hệ số chọn lọc của một cặp dải (pic) gần nhau là một hàm phụ thuộc vào loại pha tĩnh được sử dụng, pha động và nhiệt độ của cột. Để cho một sự tách được tốt thì α nên có gía trị lớn hơn 1. Hai chất cần tách càng tách ra xa khỏi nhau khi α càng lớn nhưng nếu quá lớn thì thời gian phân tích càng kéo dài, α nên trong khoảng từ 1,05 đến 2,0.

1.3.3.5. Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ

Tốc độ di chuyển của một dải chất tan qua một cột hay một đĩa sắc kí lớp mỏng phụ thuộc vào sự phân bố của các phân tử chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Những nhân tố ảnh hưởng đến sự phân bố hay sự lưu giữ là:

- Thành phần và tính chất của pha động - Kiểu và tính chất của pha tĩnh

- Các lực tương tác các phân tử giữa các cấu tử của pha động và pha tĩnh - Nhiệt độ

11

Sự khác nhau về thời gian phân bố của chúng trong 2 pha: nếu sự khác nhau càng lớn thì sự tách chúng càng tốt. Độ doãng rộng của các pic nếu càng rộng thì sự tách chúng càng kém.

1.3.4 Sự doãng rộng của pic và hiệu lực tách

1.3.4.1. Mở đầu

Hiệu lực của một cột tách chịu tác động bởi độ lớn của sự doãng rộng pic xảy ra khi một chất chuyển động dọc theo cột. Chất tan khi chạy dọc theo cột có khuynh hướng phân bố như một hình phân bố chuẩn Gaussian với độ lệch chuẩn σ.

Nếu chất tan tiêu tốn nhiều thời gian khi dịch chuyển dọc xuống cột thì pic càng bị doãng rộng. Độ doãng rộng của một pic thường được biểu diễn thông qua các giá trị:

- W1/2 là độ rộng của của pic được đo ở ½ chiều cao của peak,

- W là độ rộng của đáy pic được xác định tại hai điểm cắt của hai đường tiếp tuyến của hai bên thân pic với đường nền.

Hình 4. Sơ đồ của một dải chất tan và sự đánh giá của dải sắc kí đồ cho hiệu lực cột.

1.3.4.2. Sự khuếch tán

Nguyên nhân chính dẫn đến sự doãng rộng của peak là sự khuếch tán. Hệ số khuếch tán D đo tốc độ J tại đó một chất di chuyển một cách ngẫu nhiên từ một vùng có nồng độ cao đến vùng có nồng độ thấp.

D là hệ số khuếch tán c là nồng độ

12

Sự khuếch tán trong chất lỏng thấp hơn trong chất khí khoảng 104 lần, còn các phân tử lớn thì khuếch tán chậm hơn các phân tử nhỏ từ 10 đến 100 lần.

Độ rộng của dải sắc kí do khuếch tán được biểu diễn qua phương trình sau:

c là nồng độ (mol/cm3), t là thời gian,

x là khoảng cách di chuyển được dọc theo cột, D là hệ số khuếch tán,

m là số mol chất tan dịch chuyển qua một đơn vị diện tích tiết diện ngang của cột. Phương trình trên cho biết độ lệch chuẩn của dải sắc kí:

1.3.4.3 Chiều cao đĩa lý thuyết H

Chiều cao đĩa lý thuyết H là một hằng số giữa phương sai σ2 của dải chất tan và khoảng cách x mà nó di chuyển. Tên gọi này là từ lý thuyết chưng cất trong đó sự tách được thực hiện trong những giai đoạn rời rạc được gọi là đĩa tách.

H = σ2/L L là chiều dài của cột nhồi

Có thể giả định cột sắc kí được chia thành N phần mỏng hay N lớp hay N đĩa tách. Ở mỗi đĩa sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới (sắc kí là một quá trình động, thực ra pha động chảy liên tục và thời gian không đủ để thiết lập trạng thái cân bằng).

Chiều cao của đĩa tách cũng được gọi là chiều cao đĩa lý thuyết. Mặc dù trong cột sắc kí không có các đĩa thực nhưng người ta vẫn sử dụng khái niệm này để chỉ mối quan hệ giữa độ rộng của dải sắc kí và khoảng cách dịch chuyển dọc theo cột sắc kí.

Nếu chiều cao đĩa lý thuyết càng nhỏ (tức số đĩa lý thuyết càng nhiều) thì độ rộng hay sự doãng rộng của pic càng nhỏ. Khả năng tách các cấu tử của một hỗn hợp của một cột được cải thiện nếu giảm chiều cao một đĩa lý thuyết. Các chất tan khi dịch chuyển qua cùng một cột tách có chiều cao đĩa lý thuyết khác nhau bởi vì chúng có hệ số khuếch tán khác nhau.

Chiều cao một đĩa lý thuyết khoảng từ 0.1 đến 1 mm trong sắc kí khí và khoảng 10 μm trong săc kí lỏng hiệu năng cao và nhỏ hơn 1μm trong sắc kí điện di mao quản.

1.3.4.3 Số đĩa lý thuyết N

L là chiều dài cột, với

13

W là độ rộng của peak ở đáy,

W1/2 là chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao từ đỉnh đến đáy pic. Công thức này được sử dụng để xác định thực nghiệm số đĩa lí thuyết của một cột tách. Hiệu lực của cột tách sẽ tăng lên khi số đĩa lí thuyết càng lớn và khi chiều cao đĩa càng nhỏ.

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực tách của cột

1.3.5.1 Ảnh hưởng của tốc độ của pha động

Mức độ ảnh hưởng động học lên hiệu lực của một cột rõ ràng phụ thuộc vào độ dài thời gian của pha động tiếp xúc với pha tĩnh tức phụ thuộc vào tốc độ pha động. Nghiên cứu về hiệu lực cột nói chung được thực hiện bởi việc xác định chiều cao H như là một hàm phụ thuộc vào tốc độ pha động.

Kết quả cho thấy cả sắc kí khí lẫn sắc kí lỏng đều có chiều cao đĩa lí thuyết đạt cực tiểu ở trong vùng tốc độ dòng thấp của pha động và nói chung tốc độ đó của sắc kí lỏng thấp hơn so với sắc kí khí.

1.3.5.2 Lí thuyết về sự doãng rộng peak

Hơn 40 năm qua, rất nhiều công trình nghiên cứu về thực nghiệm lẫn lý thuyết về mối quan hệ định lượng để giải thích ảnh hưởng của các thông số như: vận tốc tuyến tính của pha động, hệ số khuếch tán trong pha động và trong pha tĩnh, tỉ số phân bố, đường kính của hạt nhồi, bề dày của lớp chất lỏng phủ trên hạt… đến chiều cao đĩa lý thuyết cho các loại cột khác nhau.

Những yếu tố ảnh hưởng này được phản ánh qua phương trình của Van

Deemter như sau: H A B/u CAu CMu

H là chiều cao đĩa lý thuyết (cm);

u là vận tốc tuyến tính của pha động (cm/s);

A là hệ số mô tả ảnh hưởng đến H của sự khuếch tán xoáy;

B là hệ số khuếch tán dài;

14

Hình 5. Đường cong H-u (Van Deemter) cho một cột sắc kí khí

1.3.5.3 Sự khuếch tán xoáy

Thành phần A mô tả sự khuếch tán xoáy của các cấu tử và các đường đi khác nhau của pha động chạy xuyên qua pha tĩnh được nhồi trong cột. Vì thế các cấu tử phải di chuyển với những khoảng cách đường đi khác nhau qua một đơn vị chiều dài của cột.

Số hạng A độc lập với tốc độ của pha động nhưng phụ thuộc vào: Đường kính hạt nhồi trong pha tĩnh dp,

Cách chúng được nhồi trong cột hoặc được phủ trên bản mỏng được biểu diễn qua λ là hàm số phụ thuộc vào độ đồng thể của chất nhồi, dạng hình học và kích thước của cột:

A = λ.dp

Một số phân tử chất tan có đường đi gần với thành cột sẽ di chuyển nhanh hơn so với những phân tử khác do ở đó mật độ nhồi tương đối thấp, tốc độ nhanh hơn. Các phân tử đi theo đường ngắn hơn được rửa giải ra trước những phân tử đi theo những đường quanh co dài hơn dẫn đến doãng rộng pic của mỗi chất tan.

Một sự tách và độ rộng của pic tối thiểu sẽ đạt được nếu dùng các hạt nhồi có đường kính trung bình đủ nhỏ và được nhồi đồng thể vào trong cột. Tuy nhiên, hạt càng nhỏ thì áp suất cần để pha động dịch chuyển qua cột càng cao, đặc biệt sẽ gặp khó khăn để nhồi cột đồng thể. Trong sắc kí khí cột nhồi người ta nhồi cột với các hạt có kích thước tối ưu khoảng 0.15 μm. Trong sắc kí khí – lỏng khi sử dụng màng mỏng trên thành cột mao quản thì số hạng A = 0.

15

Hình 6. Ảnh hưởng của khuếch tán xoáy (a), khuếch tán dọc (b) sự truyền khối (c) đến phương trình Van Deemter.

1.3.5.4 Sự khuếch tán dọc

Khuếch tán là quá trình chất di chuyển từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp hơn với tốc độ tỉ lệ với sự chênh lệch nồng độ và hệ số khuếch tán của chất đang xét.

Trong sắc kí, khuếch tán dọc được dùng để mô tả sự khuếch tán diễn ra dọc theo trục của cột và song song với đường đi của pha động. Nó dẫn đến sự dịch chuyển của chất tan từ trung tâm nồng độ của một dải chất tan đến những vùng loãng hơn về hướng phía trước hoặc sau của dòng chảy.

Khuếch tán dọc là một nguồn của sự doãng rộng của pic trong sắc kí khí do tốc độ khuếch tán cao trong pha khí. Hiện tượng này ít hơn trong sắc kí lỏng. Độ lớn của B trong phương trình Van Deemter được xác định phần lớn bởi hệ số khuếch tán DM của chất phân tích trong pha động và tỉ lệ thuận với hằng số này:

B = 2γ. DM

γ là hệ số trở kháng của chất nhồi cột đến khuếch tán dọc, DM là hệ số khuếch tán của chất tan trong pha động.

Trong các cột mao quản thì γ có giá trị bằng 1 còn trong cột nhồi thì khoảng 0.7. B ảnh hưởng lớn trong phương trình V-D khi tốc độ pha động thấp nên trong sắc kí lỏng ảnh hưởng này ít hơn nhiều bởi vì pha động có tốc độ thấp hơn nhiều so với của sắc kí khí.

16

1.3.5.5 Sự truyền khối trong pha tĩnh

Khi pha tĩnh là chất lỏng: hệ số truyền khối Cs tỉ lệ thuận với bình phương

chiều dày của lớp phim trên bề mặt chất mang và tỉ lệ nghịch với hệ số khuếch tán Ds của chất tan trong lớp phim.

Với lớp phim dày các phân tử chất tan phải di chuyển trung bình xa hơn để tiến đến bề mặt, và với hệ số khuếch tán nhỏ hơn, chúng sẽ di chuyển đến chậm hơn. Hậu quả là tốc độ truyền khối chậm hơn và chiều cao đĩa lý thuyết tăng lên.

Khi pha tĩnh là một bề mặt rắn: hệ số truyền khối pha tĩnh Cs tỉ lệ thuận với

thời gian được đòi hỏi cho những cấu tử bị hấp phụ hoặc giải hấp, hay tỉ lệ nghịch hằng số tốc độ bậc nhất của các quá trình này.

Sự chuyển động của phân tử trong pha tĩnh tiêu tốn một thời gian dài hơn, trong khi những phân tử khác chuyển động về phía trước cùng với pha động, sẽ dẫn đến peak sẽ doãng rộng. Pha động đi qua cột càng nhanh và tốc độ truyền khối trong pha tĩnh càng nhỏ thì peak càng doãng rộng hơn.

Khắc phục: những chất lỏng ít nhớt hơn có thể được chọn làm pha tĩnh để tăng

hệ số khuếch tán. Có thể giảm chiều dày của pha tĩnh nhưng dung lượng của cột sẽ bị giảm xuống.

1.3.5.6 Sự truyền khối trong pha động

Các quá trình truyền khối trong pha động rất phức tạp. Sự hiểu biết tốt về mặt định tính của những yếu tố từ nguyên nhân này tác động đến sự doãng rộng của pic dẫn đến sự cải thiện lớn lao trong tất cả các loại cột sắc kí.

Hệ số truyền khối trong pha động CM:

- tỉ lệ nghịch với hệ số khuếch tán của chất tan trong pha động DM

- tỉ lệ thuận với bình phương đường kính của hạt nhồi,

- tỉ lệ thuận với bình phương của đường kính cột và tốc độ chảy của pha động. Sự doãng rộng của dải trong pha động là do một phần vào số đông các đường đi nhờ đó một phân tử hoặc ion có thể tìm được cách của nó để đi qua cột nhồi. Trên bề mặt của pha tĩnh có thể chứa các lỗ khích thước khác nhau nên một số các phân tử chất tan có thể chuyển động vào ra các lỗ này dẫn đến sẽ bị chậm so với những phân tử khác. Các dòng chất lỏng của pha động ở gần các hạt chuyển động chậm hơn dòng chất lỏng ở giữa khoảng cách các hạt.

Như vậy thời gian lưu trong cột cho các phân tử của cùng một chất cũng khác nhau. Các phân tử này đi đến cột qua những khoảng thời gian khác nhau dẫn đến sự doãng rộng pic. Ảnh hưởng này thỉnh thoảng được gọi là khuếch tán xoáy, độc lập với tốc độ của dung môi.

17

Hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của cột là đường kính của các hạt nhồi và đường kính của cột:

- Nếu sử dụng các hạt nhồi có đường kính càng nhỏ thì càng giảm chiều cao đĩa lý thuyết.

- Trong khi đó lợi dụng ảnh hưởng của đường kính cột, các cột ngày càng hẹp hơn được sử dụng trong những năm gần đây.

Với pha động khí, tốc độ của khuếch tán dọc có thể được giảm một cách đáng kể bởi hạ thấp nhiệt độ và như vậy làm giảm hệ số khuếch tán DM. Điều này dẫn đến chiều cao đĩa lý thuyết sẽ nhỏ hơn tại nhiệt độ thấp. Ảnh hưởng này không đáng kể trong trường hợp sắc kí lỏng bởi vì sự khuếch tán là đủ chậm nên sự khuếch tán dọc có ảnh hưởng rất nhỏ đến chiều cao đĩa lý thuyết.

Đối với pha tĩnh lỏng, chiều dày của lớp chất lỏng hấp thụ nên càng mỏng càng

tốt bởi vì Cs trong phương trình Van-Deemter tỉ lệ thuận với bình phương của đại

lượng này.

1.3.6 Độ phân giải của cột (Column resolution)

1.3.6.1 Định nghĩa

Trong sắc kí, độ phân giải Rs của hai pic được xác định như sau:

18

Hình 7. Sự phân giải peak

Độ phân giải của một cột tách cho biết khả năng tách hai chất phân tích bởi cột. Nếu cột tách có độ phân giải khoảng 1.5 thì phép tách A và B gần như hoàn toàn (sự xen phủ chỉ còn khoảng 0.3%), trong khi nếu độ phân giải 0.75 thì không tách được còn độ phân giải bằng 1 thì sự xen phủ của hai pic còn khoảng 4%.

Độ phân giải cho một pha tĩnh đã chọn có thể được cải thiện bởi tăng chiều dài của cột tách (tức tăng số đĩa l í thuyết N của cột tách) nhưng như vậy sẽ làm kéo dài thời gian phân tích.

1.3.6.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ phân giải

19

Độ phân giải

N là số đĩa lý thuyết,

k’2 là hệ số dung lượng của cấu tử thứ hai

Nếu số đĩa lý thuyết của 2 peak không giống nhau thì thay thế N bằng 1 2 N N và thay k’2 bằng k’av.

Cải thiện Rs nhờ chiều cao đĩa lý thuyết

Một chi tiết quan trọng trong phương trình trên là độ phân giải tỉ lệ thuận với N . Vì vậy nếu tăng gấp đôi chiều dài cột thì tăng độ phân giải lên 2 lần. Tuy nhiên khi tăng số đĩa lý thuyết lên do tăng chiều dài cột thì quá trình sắc kí phải tiêu tốn nhiều thời gian hơn trừ khi sự tăng số đĩa là do giảm chiều cao mỗi đĩa và không tăng chiều dài của cột, nhiệt độ của cột (cho trường hợp sắc kí khí) và chiều dày của lớp phim (cho sắc kí lỏng). Việc tối ưu hóa tốc độ pha động cũng có ích.

Cải thiện Rs nhờ hệ số chọn lọc α

Khi tăng α hay khi tăng tỉ số phân bố thì độ phân giải cũng tăng theo. Cách để

thay đổi α là thay đổi pha tĩnh hoặc thay đổi cả pha tĩnh lẫn pha động trong sắc kí lỏng bởi vì thay đổi bản chất của các pha sẽ dẫn đến thay đổi α.

Khi tỉ số phân bố =2 thì đảm bảo cho sự phân giải tốt. Tuy nhiên sự tối ưu này là cho một cặp cấu tử. Trong trường hợp hỗn hợp chứa nhiều cấu tử thì cần phải thay đổi k’ để có sự phân tách giữa các cấu tử.

Trong sắc kí khí, giá trị tối ưu hóa của k’ có thể đạt được bằng chương trình hóa nhiệt độ còn trong sắc kí lỏng thì bằng chương trình hóa thành phần pha động tức thay đổi tỉ lệ giữa các dung môi của pha động.

Cải thiện Rs nhờ hệ số dung lượng

Thường sự tách có thể được cải thiện một cách đáng kể bằng việc thay đổi hệ số dung lượng k’. Nói chung, sự tăng giá trị k’ làm tăng độ phân giải. Để xác định khoảng tối ưu của giá trị k’, phương trình được viết dưới dạng:

Ở đây Q chứa phần còn lại của phương trình.

Thường giá trị của k’ > 10 nên tránh vì dù tăng lên chút ít độ phân giải nhưng thời gian đòi hỏi cho sự tách tăng lên rất đáng kể. Giá trị tối ưu của k’ trong khoảng từ 1 đến 5.Cách dễ nhất để cải thiện độ phân giải là tối ưu hóa k’:

- Đối với pha động là khí, k’ thường có thể được cải thiện bởi sự thay đổi nhiệt độ.

20

- Các phương pháp để giảm chiều cao của đĩa lý thuyết được đề cập bên dưới, bao gồm giảm kích thước hạt nhồi, đường kính của cột

2. HỆ THỐNG SẮC KÝ KHÍ 2.1 Thiết bị

 Hiện nay, hơn 30 nhà sản xuất cung cấp ra thị trường khoảng 150 mẫu khác nhau của thiết bị sắc kí khí.

 Trong thập niên 70, các bộ tích phân kế điện tử và xử lý số liệu dựa trên máy tính trở nên thông dụng.

 Thập niên 80 đã xuất hiện các thiết bị sắc kí khí với các thông số như nhiệt độ của cột, tốc độ dòng, tiêm mẫu, được điều khiển bằng máy tính với giá cả vừa phải; và có lẽ quan trọng nhất là sự phát triển của các cột có khả năng tách những mẫu phức tạp có chứa nhiều cấu tử trong một khoảng thời gian ngắn.

Hình 8. Sơ đồ khối của một máy sắc ký khí

2.2 Hệ thống cấp khí mang

2.2.1 Hệ thống cấp khí mang

Hệ thống cung cấp khí mang bao gồm các bộ điều chỉnh áp suất (pressure

regulators), các thiết bị đo áp suất (gauges), và thiết bị đo tốc độ dòng (flowmeter). Hệ

thống khí mang còn chứa một hệ thống lọc phân tử để tách nước và các chất nhiễm bẩn khác. Tốc độ dòng được kiểm soát bởi các bộ điều chỉnh áp suất hai giai đoạn được lắp vào các bình chứa khí mang.

Áp suất của khí vào thiết bị nằm trong khoảng từ 10 đến 50 psi để có tốc độ dòng từ khoảng 30 đến 150 ml/ph đối với cột nhồi và khoảng từ 1 đến 25 ml/ph đối với cột mao quản. Nói chung, nếu áp suất đi vào thiết bị không đổi thì tốc độ dòng sẽ

21

không đổi. Để đo tốc độ dòng khí người ta dùng thiết bị đo tốc độ dòng (flowmeter) với bọt xà phòng và đồng hồ bấm giây.

2.2.2 Khí mang

Khí mang lý tưởng dùng cho sắc ký phải là khí trơ (He, Ar, N2, CO2 và H2), có

độ tinh khiết cao.

Độ giảm áp suất tỉ lệ với độ nhớt khí mang nên cần chọn khí mang có độ nhớt thấp cho cột mao quản và cột nhồi chặt.

Bảng 1. Độ dẫn điện và độ nhớt của một số khí mang

Khí mang thường dùng là tùy thuộc vào detector sử dụng. Khi lựa chọn cần chú đến detector đang sử dụng như sau:

- Detector đo độ dẫn : khí mang có độ dẫn cao như H2, He. Khí He có ưu điểm

không nguy hiểm.

- Detector ion hóa ngọn lửa : khí mang N2 do rẻ và không nhuy hiểm nhưng trong

trường hợp ghép nối với các thiết bị khác, ví dụ ghép nối với khối phổ phải dùng khí mang là He.

- Detector cộng kết ngọn lửa thường dùng khí mang là N2.

Đặc điểm một vài loại khí mang phổ biến:

He, Ar: là khí trơ hóa học rất thích hợp cho sắc kí ở nhiệt độ cao. Trong đó He

là khí mang thông dụng nhất và thích hợp với hầu hết các detector dùng cho sắc ký khí.

H2 : Hiệu suất tách lớn và thời gian phân tích ngắn, khi tăng tốc độ dòng lớn

hơn nhiều tốc độ dòng tối ưu nhưng hiệu suất (chiều cao đĩa lý thuyết) giảm rất ít. Tuy

nhiên dùng khí mang H2 khá nguy hiểm vì hydro có thể gây nổ khi tiếp xúc với oxy

không khí, không dùng được cho detector khối phổ và là tác nhân phản ứng với các

hợp chất không bão hòa trên bề mặt kim loại. Khí H2 khi sử dụng làm khí mang cần

dùng khí nitơ làm khí bảo vệ thổi qua cột trước. Trong các phòng thí nghiệm người ta đã dùng phổ biến máy sản xuất khí hydro với công suất từ 125 ml/ph đến 225 ml/ph.

Khi dùng H2 trong phòng thí nghiệm phải có mày dò chỗ hở H2 và cấm lửa.

N2 : Hiệu suất tách tốt chỉ trong trường hợp nhiệt độ cột tách thấp và tốc độ

dòng thấp. Giới hạn phát hiện đối với detector ion hóa ngọn lửa hơi thấp hơn He nhưng thời gian phân tích kéo dài hơn. Khí nitơ do không nguy hiểm, giá rẻ và dễ

22

của N2 rất gần với độ dẫn của nhiều khí và nhiều chất hữu cơ nên có trường hợp peak

sắc kí có thể bị ngược.

Độ tinh khiết là yếu tố rất quan trọng của khí mang đối với sắc ký khí, tạp chất

có trong khí mang như các hydrocarbon, oxy, nước... không chỉ làm tăng tín hiệu nhiễu đường nền mà còn ảnh hưởng đến detector và tương tác với pha tĩnh làm hỏng cột, do đó khí mang cần phải qua các bộ lọc để loại bỏ oxy, nước và vết các chất hữu cơ trước khi vào cột tách. Độ tinh khiết của khí mang tốt nhất phải lớn hơn 99,995%.

Thiết bị sử dụng để cung cấp khí mang có thể là bình chứa khí hoặc các thiết bị

sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất,…).

2.3 Hệ thống tiêm mẫu (Sample Injection system)

Có 2 cách đưa mẫu vào cột là tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động

(Autosampler) có hoặc không có bộ phận hóa hơi – headspace.

Cách thông dụng nhất để đưa mẫu vào cột là sử dụng một bơm tiêm mẫu vi lượng (microsyringe) để tiêm một mẫu lỏng hoặc khí qua một đệm cao su silicon

(septum) chịu nhiệt vào một buồng hóa hơi (injector). Buồng này được đốt nóng với

nhiệt độ thích hợp và được nối với cột tách. Đối với các cột tách thông thường, cỡ mẫu thường thay đổi từ 1 vài đến 20μl. Cột mao quản đòi hỏi lượng mẫu đưa vào nhỏ hơn nên trong trường hợp này hệ thống chia dòng mẫu được thiết kế trong bộ tiêm mẫu được sử dụng để chỉ một phần nhỏ lượng mẫu được tiêm đi vào cột, phần còn lại được thải ra ngoài.

Kỹ thuật sử dụng bơm tiêm:

- Hút dung dịch mẫu vào bơm tiêm và điều chỉnh dung dịch đến vạch rồi kéo ngược pittông ra sau để lượng mẫu đó chuyển hết vào thân bơm tiêm (đầu kim rỗng).

- Sau khi xuyên kim qua lớp đệm cao su silic của injector để yên khoảng 3 đến 5 giây để kim được cân bằng nhiệt độ trong injector rồi mới đẩy pittong.

- Cách này giúp tránh một số cấu tử khó bay hơi còn đọng lại ở đầu kim gây sai số khi địnhlượng những cấu tử này.

Buồng tiêm gồm có 2 loại cơ bản là buồng tiêm cho cột nhồi và buồng tiêm cho

cột mao quản. Cấu tạo của chúng khác nhau chủ yếu về liner trong buồng tiêm. Với

mỗi loại cột và kỹ thuật tiêm có 1 loại liner riêng tùy thuộc vào cơ chế hoạt động của buồng tiêm.

23

Cột mao quản Cột nhồi

Hình 9. Hệ thống tiêm mẫu cho cột nhồi và cột mao quản

2.3.1 Buồng tiêm dùng cho cột nhồi: là buồng tiêm trực tiếp, cấu tạo khá đơn

giản: mẫu được tiêm qua septum vào buồng tiêm, mà cụ thể hơn là liner. Ở đây mẫu phân tích được làm nóng, hóa hơi và được “cuốn theo” dòng khí mang đi thẳng vào cột.

2.3.2 Buồng tiêm dùng cho cột mao quản: chia làm 2 loại cơ bản dựa trên kỹ thuật

tiêm

- Buồng tiêm chia dòng (split) /không chia dòng(splitless)

24

a/ Tiêm chia dòng (split) /không chia dòng(splitless) là kỹ thuật tiêm phổ biến nhất

và thích hợp nhất dùng cho cột mao quản nhằm làm giảm lượng mẫu đưa vào cột, đặc biệt là với những cột có đường kính trong rất nhỏ.

Buồng tiêm ở chế độ chia dòng(split):

Thích hợp cho mẫu có các cấu tử phân tích có nồng độ lớn hơn 0.1% mẫu. Với các phân tích có độ phân giải cao, các kết quả tốt nhất thu được khi cho lượng nhỏ nhất của mẫu (≤ 1μl) tiêm vào có thể được dò tìm khoảng ≤ 1ng cho mỗi cấu tử. Việc tiêm toàn bộ mẫu sẽ làm quá tải cột có đường kính 0.32 mm hoặc nhỏ hơn. Trong khi đó tiêm mẫu có chia dòng chỉ đưa vào cột khoảng 0.2 đến 2% lượng mẫu.

Mẫu được tiêm nhanh (< 1s) qua lớp đệm cao su silic (septum) vào vùng hóa

hơi của hệ thống tiêm mẫu (injector) được giữ ở nhiệt độ cao (ví dụ ở 350oC) để quá

trình bay hơi mẫu được diễn ra nhanh. Dòng khí mang lôi kéo mẫu qua buồng trộn, ở đó có sự hóa hơi hoàn toàn và hòa trộn tốt.

Tại điểm chia dòng, một phần nhỏ của hơi đi vào trong cột sắc kí còn phần lớn đi qua van chia dòng đến lỗ thông khí thải. Tỉ lệ của mẫu không được đưa vào cột được gọi là tỉ số chia dòng (split ratio) có giá trị từ 50:1 đến 600:1. Sau khi mẫu bị sục ra khỏi buồng tiêm mẫu (khoảng 30s), van chia dòng đóng lại và khí mang được giảm tương ứng.

Một μl chất lỏng được tiêm vào sẽ tạo khoảng 0.5 ml thể tích khí và nhanh chóng làm đầy buồng tiêm mẫu. Vài khí có thể thoát ra trở lại theo đường của đệm cao su silicon.

Các cấu tử có nhiệt độ sôi thấp sẽ thoát ra đầu tiên rồi đến các cấu tử có nhiệt độ sôi cao hơn. Nhiệt độ của buồng tiêm mẫu nên đủ lớn để giảm thiểu phần mất này của mẫu. Tuy nhiên nếu nhiệt độ quá cao, sự phân hủy mẫu có thể xảy ra.

Trong suốt quá trình tiêm mẫu và sắc kí, có dòng khí 1ml/ph làm sạch lớp đệm cao su silicon để tách hơi mẫu dư và các khí thoát ra từ lớp đệm cao su này (septum

purge).

Buồng tiêm ở chế độ tiêm không chia dòng (splitless):

Thích hợp cho phân tích lượng vết những cấu tử có nồng độ nhỏ hơn 0.01% mẫu và cách tiêm này có khoảng 80 % mẫu được đưa vào cột.

Hệ thống tiêm mẫu tương tự như trường hợp tiêm mẫu chia dòng, nhưng ống thủy tinh trong buồng tiêm mẫu là thẳng, trống và không có buồng trộn mẫu.

Một thể tích lớn (khoảng 2 μl) của dung dịch được pha loãng trong dung môi có nhiệt độ sôi thấp được tiêm chậm (khoảng 2s) vào trong ống thủy tinh của buồng tiêm mẫu với lỗ thoát chia dòng bị đóng.

25

Nhiệt độ của buồng tiêm mẫu cho chế độ không chia dòng giữ thấp hơn

(khoảng 220oC) so với chế độ chia dòng vì mẫu bị lưu giữ lâu hơn trong buồng tiêm

mẫu và tránh mẫu bị phân hủy nhiệt.

Hình 10. Hệ thống tiêm mẫu có chia dòng, không chia dòng và tiêm mẫu vào cột

b/ Tiêm trên cột (on-column):Có thể dùng cho cột đường kính trong tương đối lớn

0,32 mm (wide-bore). Mẫu phân tích được tiêm trực tiếp vào cột mà không có sự hóa hơi ở buồng tiêm, do đó thành phần của mẫu vào cột ít thay đổi so với mẫu ban đầu và độ lặp lại cao.

Tiêm trên cột hạn chế tối đa sự phân hủy và sự phân biệt các thành phần trong mẫu, nên được áp dụng cho phân tích các hợp chất không bền nhiệt, dễ bị phân hủy ở gần nhiệt độ sôi của nó và mẫu đa thành phần có khoảng nhiệt độ sôi lớn.

Tiêm trên cột có thể gây quá tải cột, làm giảm hoạt tính của pha tĩnh và gây nhiễm bẩn cột do sự tích lũy của các hợp chất ít bay hơi, vì vậy không thích hợp với mẫu chứa các hợp chất có nhiệt độ sôi cao.

Yêu cầu loại bơm tiêm chuyên dụng với đầu kim nhỏ để có thể đưa vào cột, buồng tiêm mẫu cũng phải được thiết kế đặc biệt, phải dùng cột có đường kính trong tương đối lớn. Dùng tiền cột không chỉ bảo vệ cột tách mà còn giúp cho việc tiêm mẫu dễ dàng hơn, tránh cho mẫu bị ngưng tụ trong cột, do đó làm giảm độ rộng của peak sắc ký.

Hiện nay, buồng tiêm PTV (Programmable temperature vaporizing) là buồng tiêm lý tưởng với sự kết hợp của tất cả các loại buồng tiêm nói trên, bao gồm cả tiêm chia dòng/không chia dòng và tiêm trên cột. Buồng tiêm có thể thay đổi nhiệt độ, thời gian tiêm mẫu, lưu lượng khí chia dòng và khí làm sạch... Tuy nhiên cấu tạo, chương trình điều khiển khá phức tạp và phải tối ưu hóa nhiều thông số.

26

Trong thực tế có nhiều dạng cột tách khác nhau nhằm thỏa mãn các mục đích phân tích. Nói chung, cột tách sắc kí cần thỏa mãn các yêu cầu sau:

- Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha động và pha tĩnh nhờ việc tối ưu hóa các

thông số của phương trình Van Deemter.

- Độ thấm cao tức có độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định.

- Khả năng tải trọng cao của cột.

- Có khoảng nhiệt độ sử dụng rộng và chịu được nhiệt độ cao.

Sắc ký khí sử dụng 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản. Tùy theo loại mẫu, độ phức tạp của mẫu và loại máy sắc ký mà chọn cột nhồi hay cột mao quản. Tùy theo loại cột tách sử dụng mà bộ phận tiêm mẫu (Injector) và đầu dò(Detector) cũng khác nhau.

Hình 11. Cột nhồi và cột mao quản

2.4.1 Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột.

Hình 12. Cấu tạọ của một số cột sắc ký

Đường kính cột: 2-4mm (1/8 – ¼ inch). Chiều dài: 1-5m. Chất liệu: Thép không rỉ, thủy tinh Pyrex, Ni.

27

Cột nhồi chứa các hạt chất mang rắn được phủ một lớp pha tĩnh lỏng hoặc bản thân hạt rắn là pha tĩnh. Chất mang rắn thường là diatomite đã được silan hóa để giảm liên kết hydro với các chất phân cực:

Kích thước hạt đồng nhất sẽ làm giảm chiều cao cột và tăng độ phân giải. Cở hạt nhỏ sẽ làm giảm thời gian cân bằng hòa tan nhờ vậy làm cải thiện hiệu quả của cột. Tuy nhiên, nếu kích thước hạt càng nhỏ thì càng ít không gian trống giữa các hạt và áp suất để ép pha động qua cột phải càng cao. Kích thước hạt được biểu diễn theo micromet hoặc cở mesh, tức là cỡ lưới mà hạt có thể đi qua hoặc bị giữ lại trên sàng. Ví dụ các hạt cở 80/100 mesh đi qua được cở sàng 80 mesh (170μm) nhưng không đi qua được cở 100 mesh (150 μm).

Yêu cầu của chất mang rắn là không tham gia vào sự tách và có khả năng giữ được pha tĩnh (không ít hơn 10 %)

Một số loại chất mang rắn:

Có hai điều quan trọng cần chú ý khi chọn một chất mang là: cấu trúc và đặc tính bề mặt.

- Cấu trúc góp phần vào hiệu quả của chất mang, trong khi các đặc trưng bề mặt

chi phối sự tham gia của chất mang vào kết quả của việc tách.

- Các chất mang phải là các chất trơ về mặt hóa học với tất cả các loại mẫu. Nó

nên có diện tích bề mặt lớn để pha lỏng có thể trải thành một lớp phim mỏng và cấu trúc bề mặt phải thích hợp để lưu giữ lớp phim mỏng đó. Tuy nhiên, diện tích bề mặt lớn không là điều đảm bảo cột hiệu quả.

Hầu hết các chất mang trong sắc ký cột nhồi được tạo từ diatomite. Loại chất mang đầu tiên dùng trong sắc ký khí do hãng Johns Manville chế tạo có tên thương mại là Chromosorb. Sau đây là một số loại chất mang thông dụng.

Chromosorb A dùng ở qui mô điều chế, có khả năng giữ tốt pha lỏng (tối đa đến 25%), có cấu trúc khó bị phá vở và có bề mặt khá trơ. Thường được sản xuất ở kích thước 10/20, 20/30 và 30/40 mesh. Sử dụng cho những cột dài, chênh lệch áp suất thấp.

Chromosorb G dùng để tách các hợp chất phân cực. Nhờ có diện tích bề mặt thấp, độ cứng, tỉ trọng cao nên nó được sử dụng cho các trường hợp tẩm pha lỏng hàm lượng thấp. Tẩm 5% trên Chromosorb G tương ứng với tẩm 12 % trên Chromosorb W.

28

Chromosorb P được chế tạo từ gạch chịu lửa C-22 có màu hồng (nên có kí hiệu P-pink) và tương đối cứng. Bề mặt ít hấp thụ hơn so với các loại Chromosorb khác, được dùng cho những việc tách hydrocacbon.

Chromosorb W được chế tạo từ Celite 545, màu trắng và dễ vỡ hơn so với loại G. Bề mặt tương đối không hấp thụ và được dùng để tách các hợp chất hữu cơ phân cực.

Có hai vấn đề chung của các chất mang:

Thứ nhất, tương tác bề mặt chất mang (hấp phụ hoặc xúc tác) chính là nguyên

nhân gây ra những peak có đuôi hoặc biến dạng. Chính những nhóm -OH hay oxit trên bề mặt chất mang là nguyên nhân của những tương tác đó. Có thể che các nhóm này bằng một lượng nhỏ pha lỏng phân cực. Nhưng cách tốt nhất hiện nay là silan hóa với các thuốc thử DMCS (dimethyl dichorosilan) hoặc HMDS (hexamethyl disilazane).

Thứ hai, kích thước hạt càng nhỏ thì số hạng A trong phương trình Van

Deemter càng nhỏ, nhưng sự chệnh lệch áp suất trong cột sẽ tăng vượt khỏi giới hạn làm việc thực tế. Hiệu suất cột chỉ có thể cải thiện nếu dùng các hạt có kích thước như nhau.

Tỉ lệ phần trăm pha lỏng

Lượng chất lỏng cần phải đủ để bao bọc các hạt bằng một lớp mỏng đồng nhất. Pha lỏng quá nhiều sẽ đọng lại ở những chỗ trống giữa các hạt làm giảm hiệu suất cột. Trên chất mang Chromosrb khi tỉ lệ pha lỏng lớn hơn 30% hiệu quả của cột giảm đi rất nhiều. Trước đây người ta hay tẩm 15-30% chất lỏng, nhưng hiện nay có khuynh hướng chỉ tẩm 2-10%.

Vì thời gian lưu tỉ lệ với lượng pha lỏng trong cột nên phép phân tích càng nhanh khi cột có lượng pha lỏng phủ lên càng nhỏ. Khi tải chất lỏng quá thấp sẽ xuất hiện những tâm hấp phụ trên chất mang. Muốn tránh điều này cần phải dùng những chất mang trơ.

Độ bay hơi của mẫu thử cũng phải tính đến khi chọn lượng pha lỏng. Các chất khó bay hơi như steroit cần phải được phân tích trong những cột có tải thấp (khoảng 3% hay thấp hơn). Các chất rất dễ bay hơi như các hydrocacbon nhẹ thì cần có cột tải cao (20-30%) vì lượng chất lỏng càng nhiều thời gian các chất có trong pha lỏng càng lâu, sự phân bố càng tốt.

Mật độ nhồi

Mật độ nhồi có một sự ảnh hưởng rõ rệt đến sự lưu giữ trên pha tĩnh. Pha tĩnh được phủ trên một chất mang trên cơ sở phần trăm trọng lượng, trong khi vật liệu nhồi được đặt trong cột trên cơ sở thể tích. Nếu mật độ nhồi của chất mang tăng lên, khối lượng tổng của pha tĩnh trong cột tăng lên.

29

Tẩm pha tĩnh lên chất mang có nhiều cách, một trong số đó là dùng máy cất quay chân không.

Lấy một lượng pha tĩnh tính toán sẵn hòa tan vào trong một dung môi thích hợp trong một bình đáy tròn, cho tiếp chất mang rắn với lượng tính toán thích hợp vào. Lắp bình vào máy cất quay. Quay bình cho đến khi dung môi bay hết. Đun nóng bình bằng cách thủy hoặc bằng đèn hồng ngoại.

Lấy đoạn ống thẳng có chiều dài và đường kính mong muốn, nút một đầu bằng bông thủy tinh, đầu kia lắp một cái phểu, đổ đầy chất mang đã tẩm pha lỏng vào phểu. Lắc cột bằng máy lắc hoặc đập nhẹ vào cột đến khi không thấy giảm thể tích chất mang trên phểu nữa thì cột đã nạp đầy. Nút đầu còn lại bằng bông thủy tinh và cuộn ống lại cho thích hợp với lò ổn nhiệt của máy GC.

Luyện cột:

Cột cần phải đặt ít nhất 2 giờ ở 25 oC trên nhiệt độ tối đa mà cột sẽ sử dụng nhưng không được quá giới hạn trên của nhiệt độ bay hơi của pha lỏng.

Một luồng khí mang nhỏ (5-10 ml/ph) được cho qua cột. Đầu ra của cột hở không nối với detector để tránh làm bẩn nó.

Ưu điểm cột nhồi:

- Nạp mẫu đơn giản, độ chính xác cao.

- Hệ số lưu trữ cao giúp peak đối xứng ngay cả khi nồng độ lớn và số đĩa lý

thuyết hiệu dung cao.

- Đường kính cột lớn nên ít chịu ảnh hưởng của tạp chất.

- Mẫu không đòi hỏi phải tinh chế kỹ.

- Mẫu thường bơm với thể tích lớn nên sai số giữa các lần bơm nhỏ (trong trường

hợp bơm mẫu bằng tay)

Nhược điểm cột nhồi: Cột nhồi thường dùng với các máy sắc ký khí thế hệ cũ hoặc

các máy dành cho mục đích đặc biệt. Hiệu quả thấp do số đĩa lý thuyết thường nhỏ hơn 8000. Nhưng nếu tăng chiều dài cột quá dài có thể gây áp suất đầu cột quá lớn. Vì vậy mà cột không thể quá dài dẫn đến số đĩa lý thuyết nhỏ.

Hiện nay có một số loại cột nhồi mới có đường kính nhỏ (< 1mm) cho phép nâng chiều dài cột lên vài chục mét. Cột này thường dùng trong một số loại ứng dụng đặc biệt mà cột mao quản không đáp ứng được, như trong các phép phân tích cần độ phân giải cao hoặc cơ chế hấp thụ đặc biệt; hoặc dùng trong phân tích khi nhiệt độ rất cao; hoặc tốc độ tăng giảm nhiệt độ rất nhanh.

2.4.2 Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong cột. Việc nạp

mẫu khó khăn. Tuy nhiên tốc độ phân tách nhanh với số đĩa cực lớn (đến 300.000 đĩa)

30

Trong trường hợp cần tăng hiệu quả tách người ta có thể chế tạo các cột có chiều dài đến 100-150m.

Chất liệu cột: Thủy tinh hoặc Fused Silica có tính bền vât lý rất cao và trơ về hóa học. Thủy tinh oxit tinh khiết nấu chảy có mức độ liên kết ngang cao hơn nhiều so

với thủy tinh thường nên bền và chịu được nhiệt độ cao đến 350oC. Lực căng cao của

ống thủy tinh cho phép chế tạo các cột có thành mỏng và dễ uốn.

Các cột mao quản mở có lớp phim mỏng tráng trên thành ống cung cấp độ phân giải cao hơn, thời gian phân tích ngắn hơn và độ nhạy cao hơn cột nhồi nhưng chúng có dung lượng thấp hơn cho các mẫu. Cột mao quản mở hẹp cung cấp độ phân giải cao hơn cột mao quản mở rộng hơn nhưng chúng đòi hỏi áp suất cao hơn để hoạt động và có dung lượng cho mẫu nhỏ hơn.

Lớp phim mỏng lỏng pha tĩnh dày khoảng từ 0.1 đến 5 μm trên bề mặt bên trong.Nếu giảm độ dày của lớp phim này sẽ làm tăng độ phân giải, giảm thời gian lưu và giảm dung lượng cho mẫu.

Một loại khác là các cột mao quản có các hạt rắn chất mang phủ một lớp pha tĩnh lỏng được gắn trên bề mặt bên trong của cột. Bởi vì diện tích bề mặt của loại này tăng lên, cột này có thể xử lý những mẫu lớn hơn cột phủ lớp phim mỏng trên thành cột. Loại cột này là trung gian giữa cột mao quản phủ phim mỏng trên thành và cột nhồi.

31

Hình 14. Minh họa cấu trúc bên trong của các cột nhồi và cột mao quản

Cột mao quản được chia làm hai loại chính:

 WCOT (Wall Coated Open Tubular)  PLOT (Porous Layer Open Tubular)

Cột PLOT: Là cột trung gian giữa cột mao quản và cột nhồi nên thường dùng

để thay thế cột nhồi do pha tĩnh giống hệt cột nhồi. Pha tĩnh là một lớp hạt xốp được phủ lên thành ống mao quản Fused Silica, có bề dày 5-50 µm.

Cột WCOT: Tại thành ống mao quản Fused Silica được phủ trực tiếp một lớp

pha tĩnh, lớp này thường ở dạng sệt gần như đặc nên cột WCOT là cột dùng trong sắc ký Lỏng-Khí.

32

Nếu pha tĩnh không gắn trực tiếp lên thành cột mà qua một lớp trung gian thì gọi là cột SCOT (Support Coated Open Tulular). Bề dày của lớp pha tĩnh quyết định hệ số lưu giữ và dung lượng mẫu của cột.

Cột WCOT được chia làm 3 loại:

- Cột ống hẹp (Narrow bore): đường kính trong 0.05-0.1 mm và thường được

dùng trong Fast-GC

- Cột thông thường (Coventional): đường kính trong 0.18-0.32 mm và thường

được dùng trong các phép phân tích thông thường hiện nay.

- Cột ống rộng (Mega bore/Wide bore): thường được dùng với các máy GC đang

sử dụng cột nhồi, do lượng mẫu và tốc độ dòng khí mang khá lớn.

Bảng 2. So sánh cột nhồi và cột mao quản

Bảng 3. So sánh số đĩa lý thuyết trên đường kính cột.

Bảng 4. So sánh cột nhồi và cột WCOT

33

Hình 15. Khả năng tách trên 3 cột

(i) cột nhồi – 2m x ¼ inch;

(ii) cột wide bore 10m x 0.53mm x 2.5um HP 50;

(iii) cột narrow bore 25m x 0.25mm x 0.25um Cabowax -20M

2.4.3 Pha tĩnh

Pha tĩnh chia làm 2 loại: pha tĩnh rắn và pha tĩnh lỏng. Hai loại hạt được nhồi vào trong cột, là chất hấp phụ (Adsorbent)và chất mang (Support) phủ pha tĩnh. Các hạt phải đồng nhất và thường có đường kính 30/40 Mesh hay 100/120 Mesh. Yêu cầu chung cho pha tĩnh là ít bay hơi, bền nhiệt, trơ về mặt hóa học.

2.4.3.1 Pha tĩnh rắn

Pha tĩnh rắn cho cột nhồi: thường dùng là Diatomic, Molecular sieve, Prorapak,

Chromosorb, Tenax…Pha tĩnh rắn có vài ưu điểm hơn pha tỉnh lỏng:

- Chất hấp phụ rắn bền và ổn định trong một khoảng nhiệt độ lớn.

- Không xảy ra hiện tượng chảy máu cột (Bleeding), đặc biệt là đối với các chất

hâp phụ vô cơ và rây phân tử (Molecular Sieve)

34

Pha tĩnh rắn cho cột PLOT: về căn bản giống như pha tĩnh trong cột nhồi. Tuy nhiên

kích thước hạt nhỏ hơn (≤ 1µm) và có độ đồng nhất cao hơn nên dễ phủ lên bề mặt cột mao quản Fused Silica.

S bề mặt và hệ số tải lớn (như cột nhồi) nhưng độ dài cột dài hơn nên hiệu quả

tách, độ ổn định và độ lặp lại cao hơn cột nhồi. Đồng thời vho phép phân tích những hợp chất rất phân cực mà cột WCOT không phân tích được hoặc rất khó phân tích.

Các chất hấp phụ thường sử dụng

- Alumina (Al2O3): Hoạt hóa ở 200°C – 1h, tách khí và các hyrocacbonđến C5,

kích thước hạt: 100/120 mesh, kích thước lỗ xốp:1 Å - 100 Å.

- Silica (SiO2): dùng khi tách các khí có M nhỏ và các Hydrrocacbon nhẹ

Bề mặt riêng750 m2/g, kích thước lỗ xốp trung bình: 22 Å

Bề mặt riêng 100m2/g kích thước lỗ xốp trung binh: 300 Å.

- Zeolite: Tách các khí có M nhỏ bằng phương pháp loại trừ (exclusion):Rây

phân tử (molecular sieves).Các zeolite kí hiệu5A và 13Xthường được sử dụng

để tách H2, O2,N2, CH4, CO, Ar, Ne…

- Các hợp chất cao phân tử:là co-polymer của polystyrene và divinylbenzene,

có bề mặt riêng lớn và độ xốp cao (macropore và micropore), tương tác đa dạng với các dung môi và chất tan tiếp xúc với nó

- Cacbon:Cacbon hoạt tính: bề mặt riêng ∼1000 m2/g

Cacbon Graphit: bề mặt riêng 5 - 100 m2/g

Các chất mang sử dụng cho GLC:

- Celite (một dạng đặc biệt của khoáng diatomic), Celite nung, Celite nung hoạt

hóa bởi Ag hoặc Au, các hạt vi cầu thủy tinh, polymer, teflon…

- Biến tính Celite:Nung ở 900°C với Na2CO3 và trợ dung silica ⇒cristobalite, các

vết kim loại tác dụng với Silica ⇒gây màu (hồng) cho vật liệu.

- Vi cầu Polystyren

Sử dung các nhóm Silanol (≡Si-OH) và dùng phương pháp tẩm (slurry method of

coating) để chuyển chất hấp phụ lên chất mang

35

Hình 16. Quá trình Silan hóa của chất mang pha tĩnh

Biến tính bề mặt fused silica

Độ phân cực (polar) của các gốc Silanol trên bề mặt

- Phân cực: -CN, -CO và –OH

- Không phân cực: Hydrrocacbon (dialkyl siloxane)

- Phân cực lớn: Polyester