Objetivos
Objetivos
Con
Conhecehecer r as as propropripriedaedades des físifísico-qco-químuímicas icas funfundamdamententais ais do do DNA atravDNA através és de de suasua extração do material genético da cebola a partir dos tecidos do bulbo e de suas propriedades extração do material genético da cebola a partir dos tecidos do bulbo e de suas propriedades !ticas"
!ticas"
Parte experimental
Parte experimental
#xtração do DNA da cebola$ #xtração do DNA da cebola$
Resultados e discussão
&ara que se retire o DNA do n'cleo das células deve-se primeiramente reali%ar a lise da membrana celular" () diversos protocolos na literatura alguns mais eficientes que outros entretanto o nível de complexidade é elevado" A maneira mais simples e r)pida para sua lise é propiciar um choque térmico na amostra pois dessa forma existe a ruptura da membrana celular e posteriormente a liberação do DNA" #sse é um método limitado a pequenas quantidades de DNA *+,"
#m seguida a camada fosfolipídica da biomembrana é eliminada pela presença de um detergente no presente caso o dodecil sulfato de s!dio .D./ o qual também auxilia na inativação en%im)tica e dissocia o DNA das proteínas mantendo seu enovelamento *0,"
1mportante ressaltar que o sal cloreto de s!dio também auxilia a dissociação do DNA das proteínas" 2 #D3A por sua ve% é respons)vel por prevenir que o processo de apoptose *45,
ocorra uma ve% que íons de c)lcio Ca06/ e magnésio 7g06/ os quais fa%em parte e são
essenciais para tal processo se encontram complexados em sua presença"
8sualmente a precipitação do DNA é reali%ada na presença de )lcoois" No presente caso utili%ou-se uma solução de etanol 9:; a qual foi adicionada lentamente de maneira a não perturbar o sistema em grande extensão e portanto promover a precipitação do DNA de maneira cuidadosa uma ve% que outas macromoléculas como por exemplo <NA proteínas lipídeos polifen!is e polissacarídeos também podem ser precipitados *:, contaminando a
amostra" 2 etanol promove a transição estrutural nas moléculas de )cidos fa%endo-as se agregarem com consequente precipitação e ele se torna menos denso que a solução aquosa obtida"= >ernanda? e companheiros demonstraram em seu trabalho a efici@ncia da
precipitação do DNA tanto pelo etanol quanto pelo isopropanol além de misturas desses dois )lcoois"
A amostra de DNA obtida pode então ser avaliada quanto a sua pure%a e concentração por meio da técnica de espectroscopia na região do ultravioleta uma ve% que o DNA apresenta grupos em sua estrutura que possibilitam a absorção de radiação nessa região do espectro" ale ressaltar que proteínas também apresentam grupos que proporcionam tal propriedade" #xemplos de bases nitrogenadas que constituem o DNA e de amino)cidos que
constituem as proteínas e que absorvem na região do ultravioleta são apresentados na >igura B"
>igura B$ <epresentação da estrutura das 5 bases nitrog@nadas que constituem o DNA e de amino)cidos que constituem as proteínas que apresentam anéis arom)ticos em sua estrutura"
Compostos que são constituídos por anéis arom)ticos normalmente absorvem lu% na região do ultravioleta como consequ@ncia das ligaçes conEugadas" #ntretanto para cada tipo de composto sua absorção se apresenta em comprimentos de onda característicos$ enquanto para as bases nitrogenadas se verifica uma absorbFncia na região de 0=G nm os resíduos de amino)cidos são caracteri%ados por absorverem na região de 0HG nm" 2utra ligação presente que também absorve nessa região do espectro é a ligação peptídica" &orém é deslocado para menor comprimento de onda aproximadamente em 04G nm *H,"
Dessa forma as relaçes entre as absorbFncias nos diferentes comprimentos de onda A0=GIA0HG e A04GIA0=G fornecem uma ideia da pure%a da amostra isto é quanto menor for a
absorbFncia em 0HG nm e 04G nm maior é a pure%a da amostra e consequentemente maior é o valor da primeira relação e menor o valor da segunda relação" Normalmente amostras cuEos valores de A0=GIA0HGinferiores a +H são consideradas contaminadas *H,"
A concentração é estimada pela seguinte relação$ uma absorbFncia de +G em 0=G nm indica uma concentração de :G Jg da dupla hélice do DNA por mK de solução" A concentração é então calculada pela seguinte equação$
Concentração DNA= A260 x50 x fator de diluição
8ma ve% que o valor de abosrbFncia obtido para a amostra foi de G+49 e considerando-se a diluição reali%ada a concentração de DNA é de :9G Lg mK-+" 8ma ve% que
a amostra de DNA foi solubili%ada em : mK da solução de solubili%ação então a quantidade de DNA extraída da cebola foi de 09:G Lg"
Na 3abela + é possível encontrar os valores de absorbFncia nos comprimentos de onda de 0=G nm e 0HG nm para as soluçes de DNA as quais foram tratadas de maneiras distintas$ a primeira não foi aquecida a segunda aquecida e resfriada lentamente a temperatura ambiente e a terceira aquecida e resfriada rapidamente"
3abela +$ alores de absorbFncia para as diferentes soluçes de DNA nos comprimentos de onda de 0=G nm e 0HG nm"
AbsorbFncia 0=G nm/ AbsorbFncia 0HG nm/ <a%ão A0=GI0HG
&rimeira solução G5H5 G4?+ +4G
.egunda solução G5=G G45? +40
3erceira solução G:94 G5H9 +0+
Dessa maneira todas as soluçes investigadas são consideradas contaminadas uma ve% que a relação A0=GI0HGé inferior a +H" &ossivelmente o processo de extração do DNA não
foi reali%ado com o devido cuidado além de sua retirada da superfície do líquido ser bastante dificultada"
A massa molecular do DNA também pode ser determinada entretanto pela técnica eletroforética a qual é baseada simplificadamente pela locomoção em gel de moléculas possuidoras de cargas residuais na presença de um campo elétrico externo +GG M ++G /" No presente caso utili%ou-se o gel de agarose GH; com tampão 3A# b)sico p( H/" Assim
as moléculas de DNA se encontravam com carga residual negativa presença dos grupos fosfato/ e migraram para a direção do polo positivo do campo elétrico"
#xiste a necessidade da adição de um corante uma ve% que essa técnica é reali%ada de maneira comparativa na presença de diversos padres analíticos de massas conhecidas e a solução é incolor" A >igura O apresenta o resultado da eletroforese em gel de agarose mostrando a migração da amostra de DNA considerada evidenciada com uma seta/ devido a presença do campo elétrico" Comparando-se com a escala migração M 77/ presente no equipamento pode-se estimar a massa molar do DNA avaliando-se sua migração no gel" .abendo que"""
>igura O$ #letroforese em gel de agarose utili%ando-se tampão 3A# e o corante Plue Qreen Koading DRe 1 da amostra de DNA extraída da cebola"
Conclusão
Notou-se que a técnica de extração do DNA em geral necessita de condiçes específicas além de cautela experimental M em especial na retirada do DNA da superfície da solução uma ve% que ele se encontra gelatinoso M" Na solução extratora a presença de uma espécie solubili%adora das membranas celulares dodecil sulfato de s!dio/ e também uma espécie cloreto de s!dio/ que promove a dissociação do DNA das proteínas é imprescindível" #m especial o #D3A possui um papel bastante importante considerando seu car)ter complexante$ prevenção do início da apoptose"
A caracteri%ação do DNA é bastante relativa considerando que outras macromoléculas também podem ser extraídas Euntamente com ele" Dentre essas macromoléculas é possível citar proteínas e <NA como exemplo" Dessa forma a pure%a do DNA é obtida pela ra%ão da absorbFncia da amostra na região do ultravioleta 0=G nm e 0HG nm A0=GIA0HG/ sendo a primeira relacionada as bases nitrogenadas do DNA e a segunda dos
resíduos de amino)cidos das proteínas" A amostra investigada no presente trabalho se mostrou impura pois o valor da ra%ão anterior encontrado foi inferior a +H M média +4 M para todas as tr@s soluçes" &ortanto a devida cautela durante a extração não foi atingida de
maneira satisfat!ria"
A determinação da massa levando em conta o que foi exposto no par)grafo anterior não agrega para a caracteri%ação da amostra pois parte dela é proveniente da presença de proteínas e não somente de DNA"
Questões
+ - &or que a presença de .D. #D3A e NaCl nesta pr)ticaS
2 .D. dodecil sulfato de s!dio é respons)vel por solubili%ar as membranas celulares e auxiliar na inativação de algumas en%imas considerando seu car)ter de detergente além de assim como o cloreto de s!dio promover a dissociação do DNA das proteínas mantendo seu enovelamento" &or sua ve% o #D3A é um agente complexante o qual previne a apoptose se processar ao se ligar com íons magnésio e c)lcio"
0 - #xplique o efeito observado pelo aquecimento da solução aquosa do DNA"
Ao medir-se a absorbFncia da solução aquecida de DNA notou-se que houve o aumento da absorbFncia no comprimento de onda em que o DNA absorve naturalmente 0=G nm/" 3al efeito pode ser explicado pelo fato do DNA ser sensível a mudanças de temperatura pois com o aumento dela h) seu desenovelamento e consequentemente as bases
nitrogenadas se tornam mais expostas ao meio facilitando a absorção de lu% 8"
Tuando a solução que fora aquecida foi resfriada lentamente o DNA pUde se enovelar novamente de forma a reconstruir sua estrutura inicial o que não foi observado quando a solução foi resfriada rapidamente"
4 - &or que o uso de lu% 8 para revelar as amostras de DNA presentes no gel de agaroseS
&ois o gel utili%ado foi corado com uma espécie que pode ser visuali%ada apenas em lu% ultravioleta"
Referências Bibliográficas
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