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Hidrólise de quitosana a partir de quitosanases e enzimas não-específicas imobilizadas

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Academic year: 2021

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Tecnologia

Departamento de Engenharia Química

Programa de Pós-graduação em Engenharia Química

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

HIDRÓLISE DE QUITOSANA A PARTIR DE QUITOSANASES E

ENZIMAS NÃO-ESPECÍFICAS IMOBILIZADAS

Julia Maria de Medeiros Dantas

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos Co-orientadora: Prof. Dra. Nathália Kelly de Araújo

Natal/RN Novembro 2019

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Julia Maria de Medeiros Dantas

HIDRÓLISE DE QUITOSANA A PARTIR DE QUITOSANASES E

ENZIMAS NÃO-ESPECÍFICAS IMOBILIZADAS

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Química sob a orientação do Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos e coorientação da Profª. Dra. Nathália Kelly de Araújo

Natal/RN Novembro, 2019

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede

Dantas, Julia Maria de Medeiros.

Hidrólise de quitosana a partir de quitosanases e enzimas não-específicas imobilizadas / Julia Maria de Medeiros Dantas. - 2019.

84f.: il.

Dissertação (Mestrado)-Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Tecnologia, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, Natal, 2019.

Orientador: Dr. Everaldo Silvino dos Santos. Coorientadora: Dra. Nathália Kelly de Araújo. 1. Adsorção - Dissertação. 2. Ligações covalentes - Dissertação. 3. Estabilidade enzimática - Dissertação. 4. Quitoligossacarídeos - Dissertação. 5. Celulases - Dissertação. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Araújo, Nathália Kelly de. III. Título.

RN/UF/BCZM CDU 54-183 Elaborado por Raimundo Muniz de Oliveira - CRB-15/429

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DANTAS, Julia Maria de Medeiros– Hidrólise de quitosana a partir de quitosanases e

enzimas não-específicas imobilizadas. Dissertação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de Concentração: Engenharia Química. Linha de Pesquisa: Processos Químicos, Biotecnológicos e Catálise. Natal/RN. Brasil.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos

Co-Orientadora: Profa. Dra. Nathália Kelly de Araújo

RESUMO: Os quitooligossacarídeos (QOS), produtos da hidrólise da quitosana, possuem um

alto valor agregado devido às suas atividades biológicas. A hidrólise pode ser realizada por via ácida, no entanto este método requer altas temperaturas e não possui uma grande seletividade no que concerne o tamanho dos oligômeros, característica chave para que estes apresentem atividades bioativas. Portanto, a utilização de enzimas para a hidrólise torna-se uma opção vantajosa por operar em condições brandas e por terem uma especificidade no mecanismo de clivagem. No entanto, processos com enzimas tendem a ser onerosos, sendo necessária a implementação de estratégias para diminuir os custos destas. Nesse contexto, o método de imobilização das enzimas se destaca pois, no geral, aumenta a estabilidade térmica e amplia a faixa de pH, além de proporcionar o reciclo da enzima. O uso de enzimas não-específicas (e mais baratas) pode ser outra estratégia de diminuição de custos. Assim, o presente estudo investigou a imobilização de celulase, β-glicosidase e quitosanases para hidrólise de quitosana. Previamente aos estudos de imobilização, as enzimas não-específicas tiveram sua atividade quitosanolítica avaliada em diferentes condições. A celulase demonstrou atividade mais alta no pH 6,0 e a β-glicosidase em pH 4,0, ambas a 55 oC. No sentido de avaliar o potencial das técnicas de imobilização de enzimas, experimentos foram realizados usando adsorção em resina catiônica Streamline SP e ligações covalentes em micropartículas de sílica-gel ativadas com glutaraldeído. Com relação à adsorção, o pH 5,0 favoreceu a imobilização de todas as enzimas, sendo que em termos de carga enzimática, a celulase e a quitosanase foram favorecidas pela menor carga enzimática (25 U/g de suporte), e a β-glicosidase favorecida pela carga enzimática mais alta (50 U/g de suporte). Em relação às ligações covalentes, as enzimas seguiram a mesma tendência apresentada para a carga enzimática. Entretanto, com relação à concentração de glutaraldeído utilizado, a celulase e a β-glicosidase foram favorecidas pela maior concentração (1%), enquanto a quitosanase apresentou o melhor resultado com a menor concentração (0,5%). Destaca-se que testes de estabilidade térmica, pH e reciclo foram realizados para determinar qual a melhor estratégia de imobilização para cada enzima. Assim, a melhor estratégia para imobilização da celulase e da β-glicosidase foi a de ligações covalentes, uma vez que a estratégia de ligações covalentes favoreceu a estabilidade de ambas as enzimas durante os reciclos (apresentando 40,00% de atividade final, comparada com 20,00% da adsorção para celulase, e 14,75% contra apenas 5,75% no sistema de adsorção para a β-glicosidase após 6 ciclos de 30 min). Por fim, ambas as estratégias de imobilização foram viáveis para o aumento da estabilidade da quitosanase, mas a adsorção apresentou um aumento marcante de desempenho quando comparada com a estratégia de ligações covalentes ao se considerar a estabilidade durante os reciclos, retendo 65,00% da atividade inicial ao final do reciclo, contra 44,42% do sistema de ligações covalentes. Ao fim, todas as três enzimas imobilizadas foram bem sucedidas na hidrólise de quitosana.

Palavras-chave: Adsorção. Ligações covalentes. Estabilidade Enzimática. Quitooligossacarídeos. Celulase. β-Glicosidase.

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Julia Maria de Medeiros Dantas

Hidrólise de quitosana a partir de quitosanases e enzimas não-específicas imobilizadas

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química - PPGEQ, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Engenharia Química.

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DANTAS, Julia Maria de Medeiros– Chitosan hydrolysis by immobilized chitosanases and

non-specific enzymes. Master dissertation, UFRN, Postgraduate Program in Chemical Engineering. Research area: Chemical Engineering. Research Focus: Chemical and Biotechnologic Process and Catalysis. Natal/RN. Brazil.

Supervisor: Prof. Dr. Everaldo Silvino Santos.

Co-Supervisor: Dr. Nathália Kelly de Araújo.

ABSTRACT: Chitooligosaccharides (COS) are products of the chitosan hydrolysis, which are

high value-added because of their biological activities. The chitosan hydrolysis can be catalyzed by acid, although this method requires high temperature and does not have a large selectivity regarding the size of the COS chains, a key feature for the expression of biological activities. Alternatively, the use of enzymes as catalysts for the hydrolysis becomes an interesting option because it requires mild conditions and the enzymes cleave specific bonds. However, processes involving enzymes are quite costly, so it is necessary to implement strategies to reduce the operational costs. Among these strategies, the immobilization of enzymes stands out as a technique that usually increases thermal and pH stability, besides allowing enzyme recycle. The use of non-specific enzymes can be highlighted as another strategy. Thus, the present study investigated the immobilization of cellulase, β-glucosidase, and chitosanases for chitosan hydrolysis. Prior to this study, the chitosanolytic activity of non-specific enzymes was evaluated under different conditions. The highest activity for cellulase was obtained at pH 6.0 , whereas for β-glucosidase, at pH 4.0, both at 55 oC. In order to evaluate the potential of the immobilization techniques, experiments were carried out with adsorption on the cationic resin Streamline SP and covalents bonds on silica-gel microparticles activated with glutaraldehyde. Regarding the adsorption, pH 5.0 favored the immobilization of all enzymes, and in terms of enzyme load, cellulase and quitosanase were favored by the lowest enzymatic load (25 U/g) while β-glucosidase was favored by the highest enzymatic load (50 U/g). When analyzing the covalent bond assays, the enzymes followed the same trend for enzimatic load, while in terms of glutaraldehyde concentration, cellulase and β-glucosidase were favoured by the highest concentration (1.00%), while the chitosanase yielded the best result with the lowest concentration (0.50%). It is noteworthy that thermal stability, pH, and recycle tests were performed to determine the best immobilization strategy for each enzyme. Thus, the best immobilization strategy for cellulase and β-glucosidase was the covalent bonds, compared to the adsorption, since it favored the stability of both enzymes during recycles (conserving 40.00% of the initial activity, compared to 20.00% of adsorption for cellulase, and 14.75% against only 5.75% in the adsorption system for β-glucosidase). Finally, both immobilization strategies succeeded in increasing the stability of the chitosanase, but adsorption showed a marked increase in performance compared to the covalent bond strategy, maintaining 65.00% of the initial activity at the end of the recycles against 44.42% for the covalent system. In conclusion, all three immobilized enzymes were successful in chitosan hydrolysis.

Keywords: Adsorption. Covalent bonds. Enzymatic stability. Chitooligosaccharides.

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DEDICATÓRIA

A Maria Zilar Santana de Medeiros, por ser minha maior referência de amor na minha vida e por me ensinar tanto, mesmo sem saber.

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AGRADECIMENTOS

A realização desta dissertação só foi possível graças à cooperação de diversas pessoas. Gostaria de agradecer primeiro a Deus, Jesus e Maria, pois sem a benção divina este trabalho não teria sido concluído com sucesso e os caminhos da minha vida não teriam se aberto, mesmo quando tudo parecia sem saída.

Assim, tenho que agradecer também a quem me ensinou a ter tanta fé e a acreditar nos caminhos do senhor, minha mãe Patricia Maria de Medeiros Dantas. Obrigada, mãe, por todo amor, suporte, brigas e risadas que damos na nossa caminhada, a senhora é minha melhor amiga. Também agradeço ao amor da minha avó, que mesmo não estando mais consciente, ainda está aqui neste plano para me ensinar a ser um pouco mais forte a cada dia. Agradeço também ao meu padrasto, Antônio Alexandre Confessor, por ser meu pai de coração, aos meus irmãos, sobrinhos e cunhadas por todo amor e carinho. Por fim, agradeço a Henrique Borges de Moraes por todo amor, apoio, paciência e dedicação, mesmo quando eu não retribuo, mesmo quando eu digo que não quero, mas, no fundo, preciso sim.

Este mestrado seria muito mais díficil se não fosse a convivência diária com os meus amigos. Agradeço a Fábio, Carolina e Gabriel por todas as risadas, choros e almoços compartilhados. Agradeço a todos da familía LEB pelo apoio técnico e moral, seja para tirar uma dúvida de metodologia ou dividir a bolacha do café, são seis anos nos quais tive a oportunidade de me formar pesquisadora em um dos melhores laboratórios do Brasil. Seria injusto não mencionar o meu agradecimento especial a Waleska, Willyan, Vitor, Ana Laura, Catherine, Sinara, Carlos, Cleitiane e todos os outros ICs, mestrandos e doutorandos que fazem o ambiente de trabalho muito mais leve e prazeroso. É necessário o agradecimento também a toda a equipe do LEA por sempre ter me acolhido tão bem e me dado oportunidade de conhecer outras áreas de conhecimento, além dos cafés diários à tarde.

À Nathália Kelly de Araújo, o meu muito obrigada por todos estes anos trabalhando juntas. Obrigada por todos os ensinamentos e orientação durante estes quatro anos de muita ciência. Você é uma inspiração profissional e como mulher, que façamos muito mais pela ciência e pelo nosso País.

Ao professor Everaldo S. dos Santos por todos estes anos de orientação e por toda a confiança. O senhor me ensina a nunca me dar por satisifeita com o trabalho e a sempre sonhar e trabalhar para ir além do que se achava possível. Sua ética, responsabilidade, garra e ousadia

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no trabalho são modelo de inspiração para mim e a cada ano que passa, o meu respeito pelo grande profissional que és só aumenta.

À UFRN por esses seis anos de estudo, instituição de excelência que me proporcionou toda a estrutura e profissionais capacitados para que realizasse a minha formação como engenheira química.

Ao Programa de Pós Graduação em Engenharia Química e todo o seu corpo docente, por ter me proporcionado aprofundar meus conhecimentos sobre o mundo vasto que é a engenharia química.

Ao professor Eduardo Lins, pela atenção e carinho em todos os momentos. Ao CNPq, pelo apoio financeiro a esta pesquisa.

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“Ostra feliz não faz pérola”

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Lista de Figuras

Figura 2.1. Estrutura molecular da quitosana (A) e da celulose (B). ... 20 Figura 2.2. Classificação das quitosanases baseado na sua especificidade de clivar a molécula

de quitosana de acordo com a presença de unidade acetiladas (cor branca) ou desacetiladas (cor azul). ... 23

Figura 2.3. Comparação das estruturas terciárias de quitosanases produzidas por diferentes

microrganismos: polimorfismo do comprimento da alça do lóbulo principal de quitosanase produzida por Streptomyces sp. (a) e Kitasatospora setae (b) e do comprimento da alça do lóbulo menor de quitosanases produzidas por Bacillus circulans (c) e Streptomyces sp. (d) .. 24

Figura 2.4. Mecanismos de (a) retenção e (b) inversão da hidrólise enzimática das ligações

glicosídicas ... 25

Figura 2.5. Ilustração de tipos de imobilização de enzimas, sendo (a) adsorção física, (b)

adsorção física de alta afinidade, (c) encapsulação, (d) aprisionamento (entrapment), (e) ligação covalente em um suporte insolúvel, (f) cross-linking, (g) nano-gel, (h) a combinação de e e f, (i) uma combinação de d e f e (j) uma combinação de cross-linkings... 28

Figura 2.6. Processo de ativação de materiais inertes para a realização de ligações covalentes.

... 30

Figura 4.1. SDS-PAGE das frações recuperadas por precipitação e do caldo de fermentação

produzido por B. toyonensis a partir de precipitação. Faixas: MM – marcador molecular; Et30 – amostra com etanol 30%; Et50 – amostra com etanol 50%; Ac30 – amostra com acetona 30%; Ac50 – amostra com acetona 50%; EB – caldo bruto. ... 44

Figura 4.2. Perda da atividade quitosanolítica a 70 oC da celulase em seu estado livre (linha contínua), imobilizada por adsorção (linha tracejada) e imobilizada por ligações covalentes (linha pontilhada) em função do tempo. ... 51

Figura 4.3. Perda da atividade quitosanolítica da amostra G em seu estado livre (linha

contínua), imobilizada por adsorção (linha tracejada) e imobilizada por ligações covalentes (linha pontilhada) durante 60 minutos a 70 oC. ... 53

Figura 4.4. Perda da atividade quitosanolítica da amostra Q em seu estado livre (linha

contínua), imobilizada por adsorção (linha tracejada) e imobilizada por ligações covalentes (linha pontilhada) durante 60 minutos a 70 oC. ... 54 Figura 4.6. Perda de atividade quitosanolítica da amostra C nos pHs 4, 5, 6, 7 e 8 após 3 h em temperatura ambiente nas formas livre (cinza escuro), imobilizada por adsorção (cinza médio)

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e imobilizada por ligações covalentes (cinza claro). Letras maiúsculas diferentes representam valores que são significativamente diferentes em p ≤ 0,05 da mesma estratégia de imobilização para diferentes enzimas. Letras minúsculas diferentes representam valores significativamente diferentes em p ≤ 0,05 entre as três formas de uma mesma enzima. ... 56

Figura 4.7. Perda de atividade quitosanolítica de G nos pHs 4, 5, 6, 7 e 8 após 3 h em

temperatura ambiente nas formas livre (cinza escuro), imobilizada por adsorção (cinza médio) e imobilizada por ligações covalentes (cinza claro). Letras maiúsculas diferentes representam valores que são significativamente diferentes em p ≤ 0,05 da mesma estratégia de imobilização para diferentes enzimas. Letras minúsculas diferentes representam valores significativamente diferentes em p ≤ 0,05 entre as três formas de uma mesma enzima. ... 57

Figura 4.8. Perda de atividade quitosanolítica da Q nos pHs 4, 5, 6, 7 e 8 após 3 h em

temperatura ambiente nas formas livre (cinza escuro), imobilizada por adsorção (cinza médio) e imobilizada por ligações covalentes (cinza claro).Letras maiúsculas diferentes representam valores que são significativamente diferentes em p ≤ 0,05 da mesma estratégia de imobilização para diferentes enzimas. Letras minúsculas diferentes representam valores significativamente diferentes em p ≤ 0,05 entre as três formas de uma mesma enzima. ... 59

Figura 4.9. Perda de atividade quitosanolítica da celulase imobilizada por adsorção (●) e

imobilizada por ligações covalentes (■) durante ciclos de 30 minutos consecutivos. ... 60

Figura 4.10. Perda de atividade quitosanolítica da β-glicosidase imobilizada por adsorção (●)

e imobilizada por ligações covalentes (■) durante ciclos de 30 minutos consecutivos. ... 61

Figura 4.11. Perda de atividade quitosanolítica da quitosanase imobilizada por adsorção (●) e

imobilizada por ligações covalentes (■) durante ciclos de 30 minutos consecutivos. ... 62

Figura 6.1. Potencial zeta e atividade quitosanolítica do precipitado do coquetel C em

diferentes pHs. ... 79

Figura 6.2. Potencial zeta e atividade quitosanolítica do precipitado do coquetel G em

diferentes pHs. ... 79

Figura 6.3. Potencial zeta e atividade quitosanolítica do precipitado do coquetel Q em

diferentes pHs. ... 80

Figura 6.4. Gráficos de Pareto dos efeitos das variáveis estudadas nas respostas Y e ar nas

enzimas Celulase, β-Glicosidase e Quitosanase utilizando a técnica de adsorção. ... 81

Figura 6.5. Gráficos de Pareto dos efeitos das variáveis estudadas nas respostas Y e ar nas

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Lista de Tabelas

Tabela 3.1. Parâmetros para análise da capacidade de hidrólisar a quitosana das amostras C e

G. ... 35

Tabela 3.2. Níveis de variação de parâmetros para a imobilização por adsorção de Q, C e G.

... 36

Tabela 3.3. Níveis de variação de parâmetros para a imobilização por ligações covalentes de

C, G, e Q. ... 37

Tabela 4.1. Atividade específica, fator de purificação e rendimento da quitosanase precipitada

com Etanol a 30% (Et30), 50% (Et50) e 70% (Et70) (v/v), Acetona a 30% (Ac30), 50% (Ac50) e 70% (Ac70) (v/v), e Sulfato de amônio a 30% (Sa30), 50% (Sa50) e 70% (Sa70) (v/v). Os valores apresentados correspondem à media dos experimentos realizados em duplicata ± desvio padrão ... 42

Tabela 4.2. Atividade quitosanolítica de C e G em diferentes temperaturas e pH. ... 45 Tabela 4.3. Rendimento (Y) e atividade recuperada (ar) das amostras C, G e Q imobilizadas

por adsorção na resina Streamline SP. ... 47

Tabela 4.4. Rendimento (Y) e atividade recuperada (ar) de C, G e Q imobilizadas em sílica-gel

por ligações covalente usando Glutaraldeído (Ga). ... 49

Tabela 4.5. Tempo de meia-vida (t1/2) em minutos das amostras enzimáticas nas diferentes

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Lista de Abreviaturas e Siglas

ANOVA Análise de Variância

APTES (3-Aminopropil)trietoxisilano

ao Atividade enzimática inicial do sobrenadante

af Atividade enzimática final do sobrenadante

at Atividade enzimática teórica que o complexo deveria apresentar

ac Atividade enzimática que o complexo apresentou depois da imobilização

ar Atividade enzimática recuperada

C Coquetel de celulases DNS Ácido 3,5-Dinitrosalicílico FP Fator de purificação G Coquetel de β-glicosidases

Ga Porcentagem de glutaraldeído utilizado GD Grau de desacetilação

GlcN Glicosamina

GP Grau de polimerização

kd Constante da taxa de desnaturação enzimática

M Molar

Q Coquetel de quitosanases QOS Quitooligossacarídeo rpm Rotações por minuto

t1/2 Tempo de meia vida da enzima

U/gsuporte Unidades de enzima por grama de suporte

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SUMÁRIO

Lista de Figuras ... i

Lista de Tabelas ... i

Lista de Abreviaturas e Siglas ... i

1. Introdução ... 16

2. Revisão Bibliográfica ... 20

2.1 Quitooligossacarídeos ... 20

2.2 Quitosanases ... 22

2.3 Enzimas não específicas para hidrólise da quitosana ... 24

2.4 Imobilização de enzimas ... 26

2.4.1 Imobilização por adsorção ... 28

2.4.2 Imobilização por ligações covalentes... 29

3. Materiais e Métodos ... 32

3.1 Reagentes ... 32

3.2 Produção das quitosanases ... 32

3.3 Precipitação das quitosanases ... 33

3.4 Atividade enzimática ... 33

3.5 Quantificação de proteínas totais ... 33

3.6 Eletroforese em gel de Poliacrilamida com Dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) ... 34

3.7 Padronização da atividade quitosanolítica das enzimas não específicas ... 35

3.8 Determinação do Ponto isoelétrico das amostras C, G e Q ... 35

3.9 Imobilização das enzimas ... 36

3.9.1 Imobilização por adsorção ... 36

3.9.2 Imobilização por ligações covalentes... 37

(16)

3.11 Estudo de estabilidade térmica ... 38

3.12 Estudo de estabilidade de pH ... 39

3.13 Estabilidade operacional ... 39

3.14 Análise estatística ... 40

4. Resultados e discussão ... 42

4.1 Purificação parcial de quitosanases por precipitação ... 42

4.2 Condições ótimas de hidrólise de quitosana para os coquetéis de Celulase e β-Glicosidase ... 44

4.3 Imobilização por adsorção ... 45

4.4 Imobilização por ligações covalentes ... 48

4.5 Estabilidade térmica ... 50

4.6 Estabilidade à mudança de pH ... 55

4.7 Estabildade operacional ... 59

5. Conclusão ... 64

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Capítulo 1

Introdução

(18)

1. Introdução

A quitina é um biopolímero abundante na natureza (QIN et al., 2018a) e no processamento de crustáceos, sendo considerada um rejeito do beneficiamento desses animais (LIN; LIN; CHEN, 2009). Quando parcialmente desacetilada, a quitina converte-se em quitosana e passa a apresentar propridades físicas e biológicas relevantes (WU; WU; TSAI, 2015), como para a formação de filmes (SHANKAR; RHIM, 2018), uso em tratamento de efluentes (BILAL et al., 2016) e como agente anti-microbiano (BENHABILES et al., 2012; CASTILLO et al., 2017; SHANKAR; RHIM, 2018). Contudo a sua aplicação para fins farmacológicosé limitada por sua baixa solubilidade em pH próximo ao neutro, alta massa molecular e alta viscosidade (ZHANG et al., 2014). Assim, uma maneira de melhorar a solubilidade da quitosana é diminuindo o grau de polimerização da molécula, produzindo os quitooligossacarídeos (QOS), cujas atividades biológicas podem se apresentar de forma mais intensa (LI et al., 2016). Na produção dos QOS, a hidrólise enzimática possui diversas vantagens frente à hidrólise ácida, como, por exemplo, a produção controlada de oligômeros além do fato das reações serem conduzidas em condições brandas de temperatura e pressão (THADATHIL; VELAPPAN, 2014).

As enzimas específicas que hi drolisam a quitosana são as chamadas quitosanases e são amplamente produzidas por diversos microrganismos, como fungos (DA SILVA et al., 2012; EMBABY et al., 2018; SANTANA et al., 2015) e, principalmente, bactérias (ARAÚJO et al., 2016a; DOAN et al., 2018; PECHSRICHUANG et al., 2018; QIN et al., 2018b; SUN et al., 2006; ZITOUNI et al., 2013). A quitosana também pode ser hidrolisada por algumas enzimas não-específicas como as celulases (LIN; LIN; CHEN, 2009), as amilases (SANTOS-MORIANO; WOODLEY; PLOU, 2016) e as lipases (LEE; XIA; ZHANG, 2008). Portanto, o desenvolvimento de bioprocessos que utilizam enzimas de interesse industrial e que permitem um custo associado à sua produção mais baixo, destacando-se aquelas que podem hidrolisar quitosana, é uma importante estratégia para tornar o processo de produção dos QOS viável economicamente (MA; QIAN; ZHOU, 2015).

Destaca-se que a utilização de enzimas de forma industrial pode vir a ser muito onerosa, principalmente devido aos elevados custos de recuperação e purificação (SATYAWALI; VANBROEKHOVEN; DEJONGHE, 2017). Dessa forma, é preciso buscar alternativas para

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Capítulo 1 – Introdução 17

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado mitigar esse gargalo e utilizar todo o potencial que as enzimas têm a oferecer. Assim, uma das estratégias para tornar a utilização de enzimas viável é a imobilização (DATTA; CHRISTENA; RAJARAM, 2013). Essa possibilita a reutilização das enzimas e aumenta a estabilidade em relação às variações do ambiente e tempo de armazenamento, além de viabilizar o aumento de escala (DOSADINA; SAVELYEVA; BELOV, 2018).

Nesse contexto, a adsorção desponta como uma técnica tradicionalmente utilizada tanto para a purificação (ARAÚJO et al., 2016a; SANTANA et al., 2015; DE SOUSA JUNIOR et al., 2015) quanto para a imobilização de enzimas (AHMED et al., 2018; DE ANDRADES et al., 2019; ROMO-SÁNCHEZ et al., 2014). Seu principal mecanismo de ação consiste na ligação do substrato (nesse caso, a enzima) ao suporte devido às cargas eletrostáticas e interações hidrofóbicas entre eles de acordo com as condições impostas no processo, como pH, condutividade e matriz do suporte (DATTA; CHRISTENA; RAJARAM, 2013). Assim, ela vem sendo aplicada com sucesso na imobilização de diversar enzimas como as celulases (AHMED et al., 2018), as amilases (SINGH; KAYASTHA, 2014) e as β-glicosidases (YAN et al., 2010) destacando-se o fato de ser uma técnica simples, rápida e que utiliza poucos reagentes químicos.

Entretanto, a técnica de adsorção possui algumas desvantagens como, por exemplo, a baixa estabilidade das proteínas quando comparada com outros processos de imobilização, principalmente por se tratar de uma ligação física (DE ANDRADES et al., 2019). Desse modo, a implementação de outras técnicas de imobilização, como aquelas que utilizam ligações químicas, pode ser mais interessantequímicas, que é o caso das ligações covalentes covalente(cross-linking). Essa técnica promove reações químicas covalentes entre enzima-enzima e suporte-enzima-enzima (DATTA; CHRISTENA; RAJARAM, 2013). As ligações covalentes são utilizadas com sucesso para a imobilização de diversas enzimas e, notadamente, promovem um ganho de estabilidade térmica, de meia-vida e de reusabilidade (DE OLIVEIRA et al., 2018; RIOS et al., 2018; ZHAO; SALDAÑA, 2019).

Estudos anteriores do grupo de Engenharia de Bioprocessos do Programa de Pós-Graduação em Engeharia Química da UFRN investigaram a produção e a purificação de quitosanases para a produção dos QOS (ARAÚJO et al., 2016a, 2016b, 2013). O presente estudo, portanto, tem como objetivo avançar no processo de viabilização da produção de QOS através da imobilização da quitosanase produzida pelo Bacillus toyonensis, anteriormente identificado como Bacillus cereus (ARAÚJO et al., 2016a) e dois coquetéis comerciais de

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enzimas não-específicas (celulases e β-glicosidases) para a hidrólise da quitosana. Após a produção da quitosanase por fermentação em cultivo submerso, foi realizada uma pré-purificação e concentração dessa enzima usando a técnica de precipitação. Houve também a avaliação da melhor condição de imobilização por meio de adsorção e ligações covalentes para cada uma das três enzimas. Assim, uma vez determinada a condição mais favorável, suas respectivas estabilidades frente a mudanças de temperatura, de pH e reuso (reciclo) foram avaliadas para determinar a melhor estratégia de imobilização visando a hidrólise de quitosana. A presente dissertação está dividida em capítulos, no qual o primeiro é este que apresenta a introdução ao assunto abordado; o segundo capítulo irá discutir o embasamento teórico de todos os tópicos utilizados para compor esta dissertação; o terceiro capítulo possui a descrição da metodologia empregada para realizar o trabalho experimental; no quarto capítulo, os resultados obtidos neste trabalho são apresentados e discutidos; e finalmente, o quinto capítulo apresenta as conclusões acerca do estudo realizado.

(21)

Capítulo 2

(22)

2. Revisão Bibliográfica

O presente capítulo discorre sobre os principais pontos teóricos envolvidos nesta dissertação. Ele se inicia com o tópico que justifica o esforço científico para torna a produção dos oligossacarídeos de quitosana – seu alto potencial farmacêutico – e discorre até o contexto teórico que justifica a escolha das técnicas a serem utilizadas.

2.1 Quitooligossacarídeos

A quitina é um carboidrato estrutural que está presente na parede celular de microrganismos, como fungos e leveduras, e no exoesqueleto de artrópodes (MAHATA et al., 2014). Isso faz com que ela seja um dos biopolímeros mais presente na natureza (DIAS et al., 2013). É um polímero linear de alta massa molecular, formada por monômeros de N-acetil-D-glicosamina (GlcNAc) unidos por ligações β(14) (AAM et al., 2010). A desacetilação da quitina produz a quitosana, sendo que a única diferença estrutural entre elas é o grau de acetilação, ou seja, a quantidade de grupos amino-acetilados presente na molécula (THADATHIL; VELAPPAN, 2014). A molécula de quitina, e consequentemente de quitosana, é bem similar à de celulose, tendo como única diferença a substituição do grupo hidroxila no carbono 2 por um grupo amino, o qual pode ser acetilado ou não (LODHI et al., 2014), no caso da Figura 2.1., uma quitosana completamente desacetilada está sendo representada.

Figura 2.1. Estrutura molecular da quitosana (A) e da celulose (B).

Fonte: Autoria própria.

A quitosana é solúvel em soluções com pH < 6,0 e possui propriedades físicas interessantes, as quais irão mudar de acordo com o grau de acetilação (GA) da quitosana (HAMDI et al., 2019). Assim, agregando tais propriedades com a sua biocompatibilidade, esse

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Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 21

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado material pode ser utilizado para diversos fins nas indústrias de alimentos (MUJTABA et al., 2019) e farmacêutica (CHYLIŃSKA; KACZMAREK; BURKOWSKA-BUT, 2019; DOSADINA; SAVELYEVA; BELOV, 2018; LIU et al., 2016).

Além das propriedades físicas interessantes, a quitosana também possui importantes propriedades biológicas, como atividade antimicrobiana e antioxidante (FRIEDMAN e JUNEJA, 2010; SHANKAR e RHIM, 2018; THADATHIL e VELAPPAN, 2014). Porém, por ser pouco solúvel em pHs próximos ao neutro, é difícil utilizá-la diretamente como um bioativo para consumo humano. Uma alternativa para aumentar sua solubilidade em água é a diminuição da sua cadeia de carbono através de reações de hidrólise, principalmente com enzimas. Se a hidrólise é tal que a molécula alcança um grau de polimerização (GP) menor que 20 e uma massa molecular média menor que 3900 Da, têm-se os chamados Quitooligossacarídeos (QOS) (MOURYA; INAMDAR; CHOUDHARI, 2011). Além do GP, o GA é outro fator que vai interferir nos tipos de QOS produzidos (PHIL et al., 2018), pois o padrão de acetilação apresentado pela molécula irá refletir em onde ocorrerá a clivagem, a depender do tipo de enzima utilizada (WEIKERT et al., 2017).

Os QOS são oligômeros com propriedades biológicas amplamente estudadas. Há relatos na literatura de sua ação anti-inflamatória (AZUMA et al., 2015), sendo que um dos mecanismos descritos na literatura é através da inibição da expressão de citocinas pró-inflamatórias; antifúngica (SEKI; NISHIYAMA; MITSUTOMI, 2019a), antibacteriana (LAOKULDILOK et al., 2017), na qual os QOS de baixa massa molecular atravessam a membrana plasmática, interferindo no seu metabolismo; antioxidante (YANG et al., 2017) por meio da capacidade de doação de átomos de hidrogênio para radicais livres (quando os grupos NH2 se transformam em NH3+); e antitumoral (ZOU et al., 2019) sendo reportado que os QOS

suprimiram a expressão gênica anti-apoptótica. Os QOS possuem grande potencial para serem aplicados na medicina, como no tratamento de doenças relacionadas ao envelhecimento, como diabetes, câncer e doenças cardiovasculares, tendo em vista que essas doenças são provenientes de processos inflamatórios e estresse oxidativo (KERCH, 2015). Eles também podem ser utilizados como bioativos na indústria de alimentos, sendo aplicados diretamente no produto como aditivos, como antioxidante de cerveja (YANG et al., 2017), como componentes de embalagens funcionais (CASTILLO et al., 2017) e adicionados a produtos lácteos, como iogurte, para enriquecimento das propriedades biológicas (VELA GUROVIC et al., 2015). Outra aplicação que merece destaque é a utilização em plantações como biofortificante ou biorremediador (CHATELAIN; PINTADO; VASCONCELOS, 2014).

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Entretanto, para ser utilizado nas indústrias alimentícia e farmacêutica, é necessário que os QOS sejam produzidos com o mínimo de contaminantes (LODHI et al., 2014). Portanto, entende-se que a hidrólise mais adequada para a produção desses compostos seria a enzimática, ao passo que a ácida tem a possibilidade de gerar subprodutos tóxicos, como o próprio catalisador da reação (LIAQAT; ELTEM, 2018). Outro desafio é a geração controlada de tamanhos específicos de QOS, pois diferentes tamanhos destes oligômeros possuem propriedades biológicas diferentes (LIN; HSIAO; CHIANG, 2009).

2.2 Quitosanases

Quitosanases são enzimas cujo substrato específico é a quitosana e realizam a hidrólise desse biopolímero através da clivagem das ligações glicosídicas β-1,4 (POSHINA et al., 2018). A produção de quitosanases como mecanismo para a utilização de quitosana como fonte de carbono por diversos microrganismos, principalmente bactérias e fungos, vem sendo reportada na literatura (THADATHIL; VELAPPAN, 2014). Muitas cepas do gênero Bacillus são capazes de produzir quitosanases como o B. subtilis (SU et al., 2017; THADATHIL; VELAPPAN, 2014) e o B. cereus (ARAÚJO et al., 2016b; CHEN; SU; CHIANG, 2006; LIANG et al., 2014; LIN; HSIAO; CHIANG, 2009; SEO et al., 2014). Outros genêros como o Janthinobacterium (JOHNSEN; HANSEN; STOUGAARD, 2010), Paenibacillus (ZITOUNI et al., 2013),

Streptomyces (JIANG et al., 2012) e Microbacterium (SUN et al., 2006) também demonstraram

capacidade de produzir quitosanases.

Destaca-se que, em todos esses estudos, a produção da enzima se dá majoritariamente de forma extracelular, o que é vantajoso para o processo, pois não haveria a necessidade de existir uma etapa de rompimento das células, simplificando a etapa de purificação. Quanto à produção de quitosanases a partir de fungos, o genêro Aspergillus vem sendo o mais estudado (CHEN, XIA e YU, 2005; CHIANG et al., 2003; EMBABY et al., 2018; LIU et al., 2016). Outros genêros como o Trichoderma são também relatados (DA SILVA et al., 2012), entretanto, com informações mais escassas na literatura.

Weikert e colaboradores (2017) relataram que as quitosanases podem ser classificadas em quatro classes. Sendo que a Classe I representa enzimas capazes de atuar em ligações do tipo glicosamina-glicosamina (GlcN-GlcN) e GlcNAc-GlcN, a Classe II compreende enzimas com preferência apenas por ligações GlcN-GlcN, as enzimas da Classe III são capazes de clivar GlcN-GlcN e GlcN-GlcNAc e, finalmente, as pertencentes a Classe IV são capazes de clivar

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Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 23

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado GlcN-GlcN e GlcNAc-GlcNAc, como exemplificado pela Figura 2.2. Assim, um mesmo microrganismo pode produzir quitosanases de diferentes classes (ARAÚJO et al., 2016b).

Figura 2.2. Classificação das quitosanases baseado na sua especificidade de clivar a molécula

de quitosana de acordo com a presença de unidade acetiladas (cor branca) ou desacetiladas (cor azul).

Fonte: Modificada de Weikert et al., 2017.

As diferentes formas de atuação das quitosanases podem ser relacionadas com as diferentes formas que elas podem possuir, o que pode ser relacionado com a vasta gama de massas moleculares atribuídas a elas na literatura, entre 20-75 kDa (THADATHIL; VELAPPAN, 2014). A Figura 2.3. exemplifica as diferenças estruturais presentes entre quitosanases produzidas por microrganismos diferentes, justificando a vasta faixa de massas moleculares que é registradaregistrada para essas enzimas. Como alguns exemplos da literatura, pode-se citar o estudo efetuado por Sun et al. (2006), que isolaram duas quitosanases produzidas por Microbacterium sp., uma de 81 kDa e outra de 30 kDa. Gao et al. (2008) identificaram uma quitosanase com 41 kDa produzida por B. cereus, Zitouni et al. (2013) identificaram uma com 40 kDa produzida por Paenibacillus sp. Destaca-se, também, o estudo reportado por Su et al. (2017), que utilizaram Bacillus subitilis para produção de uma quitosanase com massa molecular de 28 kDa.

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Figura 2.3. Comparação das estruturas terciárias de quitosanases produzidas por diferentes

microrganismos: polimorfismo do comprimento da alça do lóbulo principal de quitosanase produzida por Streptomyces sp. (a) e Kitasatospora setae (b) e do comprimento da alça do lóbulo menor de quitosanases produzidas por Bacillus circulans (c) e Streptomyces sp. (d)

Fonte: Adaptado de Viens; Lacombe-Harvey; Brzezinski, (2015).

2.3 Enzimas não específicas para hidrólise da quitosana

As quitinases e quitosanases apresentam uma alta formação de monômeros durante a hidrólise, o que não é interessante economicamente, tendo em vista que os mesmos não apresentam atividades biológicas pronunciadas (LIN; LIN; CHEN, 2009). Somando isso ao fato de que tais enzimas ainda possuem uma disponibilidade restrita (LAOKULDILOK et al., 2017) e que os meios de produção de quitosanases ainda são bem onerosos (lee; xia; zhang, 2008), o uso de enzimas comerciais bem estabelecidas torna-se uma alternativa interessante para viabilizar economicamente a produção de QOS.

Assim, ao se pensar em utilizar enzimas não-específicas para a hidrólise de quitosana, o caminho mais lógico é tentar aplicar enzimas específicas para polímeros parecidos estruturalmente com a mesma. Polímeros como a celulose e a pectina merecem destaque e suas enzimas específicas já demonstraram capacidade quitosanolítica (LAOKULDILOK et al.,

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Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 25

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado 2017; XIE et al., 2011). A hidrólise das ligações glicosídicas acontece basicamente pelo mesmo mecanismo, pelas hidrolases glicosídicas (HG) (POSHINA et al., 2018). Na Figura 2.4. é possível observar a representação da reação na qual o oxigênio glicosídico é protonado pelo aminoácido presente no núcleo catalítico, que é a forma de atuação generalizada das HGs. Segundo Poshina e colaboradores (2018), esta reação pode ser representado por dois mecanismos, sendo o primeiro o de retenção, no qual a enzima – após a clivagem – retém os elétrons da ligação para então doar esses elétrons para uma molécula de água, a qual irá doá-los de volta para a molécula de quitosana. O segundo mecanismo é o de inversão, que se baseia em um ataque concomitante da enzima e da água, onde essa substituição nucleofílica simples resulta em produtos com estequeometria oposta às dos reagentes. Na quitina e na quitosana, os grupos acetil remanescentes da GlcNAc desempenham o papel nucleofílico da reação. Por isso, pode-se inferir que várias HGs não-específicas tenham a capacidade de clivar as ligações glicosídicas da quitosana.

Figura 2.4. Mecanismos de (a) retenção e (b) inversão da hidrólise enzimática das ligações

glicosídicas

Fonte: Poshina et al., 2018.

Dentre as diversas enzimas não específicas com capacidade quitosanolítica, pode-se citar a α-amilase, a qual foi usada com sucesso em um sistema de produção contínua dos QOS (SANTOS-MORIANO; WOODLEY; PLOU, 2016). Nesse estudo os autores alcançaram uma produção alta de QOS com baixo grau de polimerização (dímeros, trímeros, tetrâmeros e pentâmeros) e pouco monômero, o que é interessante para aplicações farmacêuticas, visto que a glicosamina possui pouca bioatividade.

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Destaca-se que a celulase e a lisozima também foram utilizadas de forma efetiva para a hidrólise da quitosana (LIN; LIN; CHEN, 2009). No estudo realizado por Lin et al. (2009), foi observado que diferentes enzimas produzem diferentes perfis de QOS sob as mesmas condições de hidrólise. Eles também obtiveram diferentes atividades antibacterianas para as diferentes amostras, concluindo que as atividades bioativas dos QOS estão diretamente relacionadas à sua massa molecular. Outros estudos já mostraram o sucesso da celulase na produção de QOS com bioatividades importantes como estimulação da atividade fagocitósica (WU; WU; TSAI, 2015), melhora da resposta imunológica em pacientes em tratamento de quimioterapia – onde os pacientes tratados mantiveram os indíces imunológicos durante o tratamento, enquanto o grupo controle apresentou uma queda significativa – (MA; QIAN; ZHOU, 2015) e com ação antioxidante e anti-microbiana (LAOKULDILOK et al., 2017).

A produção de QOS também já foi realizada utilizando-se lipases comerciais, onde foi realizado um estudo do perfil de oligômeros formados a partir de diferentes amostras de quitosanas com diferentes graus de acetilação (LEE; XIA; ZHANG, 2008). Os grupos acetil influenciam no impedimento estérico da molécula, e isto pode ou não interferir na acoplação da quitosana nos sítios ativos da enzima (YALPANI; PANTALEONE, 1994). Portanto, esses autores concluíram que os diferentes graus de acetilação também interferem no desempenho de uma mesma enzima no perfil de QOS produzidos.

2.4 Imobilização de enzimas

O uso de enzimas como uma alternativa verde para a catálise de reações vem sendo amplamente estudado ao longo dos anos (DATTA; CHRISTENA; RAJARAM, 2013). No entanto, a produção e purificação desses biocatalzadores ainda são onerosas, o que faz necessária a implementação de técnicas que promovam o aumento de sua estabilidade e vida útil, como é o caso da imobilização (TERRASAN; DE MORAIS JUNIOR; CONTESINI, 2019). Essa técnica consiste na introdução ou na ligação de natureza química ou física da proteína de interesse com uma matriz, também chamada de suporte, ou entre as próprias proteínas (DWEVEDI, 2016). A imobilização permite o aumento da estabilidade e reusabilidade da enzima, a viabilidade de aumento de escala (scale-up) e a automação do processo, com diminuição dos custos de purificação dos produtos (SINHA et al., 2012).

Para o sucesso desse processo, dois fatores vão ser fundamentais: o tipo de matriz e o processo de imobilização realizado. O suporte ideal deve ser inerte, possuir ampla estabilidade nas condições operacionais, além de ser capaz de se ligar majoritariamente com a enzima de

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Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 27

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado interesse. É importante que essa ligação não ocorra de forma a comprometer os sítios ativos, visando à manutenção da atividade enzimática ou, até mesmo, a sua intensificação (DATTA; CHRISTENA; RAJARAM, 2013). Os materiais utilizados como suporte são os mais diversos, incluindo polímeros naturais como ágar (ICHIKAWA et al., 2002), celulose (SINGH; KAYASTHA, 2014), alginato (ABURTO et al., 2018) e a própria quitosana (BILAL et al., 2016), podendo também ser usadas combinações de mais de uma matriz (DOSADINA; SAVELYEVA; BELOV, 2018). Também são amplamente utilizados materiais amorfos como a sílica (SONG; ALNAEELI; PARK, 2014), polímeros sintéticos como poliacrilonitrila (SINHA et al., 2012) ou metais (PECHSRICHUANG et al., 2018).

Os processos de imobilização vão depender dos tipos de interações possíveis entre o suporte e a enzima. Os mais comuns são adsorção, ligações covalentes, afinidade, aprisionamento (entrapment) e ligações covalentes (cross-linking) (DATTA; CHRISTENA; RAJARAM, 2013). Os processos, ilustrados na Figura 2.5., podem ser divididos em métodos de imobilização física e química. Na encapsulação, por exemplo, a enzima é recoberta pela matriz utilizada, enquanto que no aprisionamento, a enzima é introduzida dentro da matriz, portanto em ambos os métodos é importante que a matriz seja permeável ao substrato e não há nenhuma interação química entre matriz e enzima. A adsorção, que por sua vez também é um método físico, consiste na interação física entre enzima e substrato onde a enzima ficará exposta ao meio externo, recobrindo o suporte. Os métodos químicos consistem na formação de ligações químicas entre enzima-suporte (ligações covalentes) ou entre enzimas (ligações covalentes) (MOHAMAD et al., 2015). É importante mencionar que, assim como demonstrado na Figura 2.5., mais de um método pode ser aplicado em um mesmo processo de imobilização, na busca de garantir ainda mais a estabilidade da enzima (ROMO-SÁNCHEZ et al., 2014).

Na literatura, há relatos de quitosanases que foram imobilizadas com sucesso por afinidade em uma matriz metálica (PECHSRICHUANG et al., 2018) e em sílica-gel (SEO et al., 2014); por aprisionamento em ágar (ICHIKAWA et al., 2002) e por adsorção em uma matriz de agarose (SANTOS-MORIANO; WOODLEY; PLOU, 2016). Na Figura 2.5. estão ilustrados os diferentes tipos de imobilização citados anteriormente.

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Figura 2.5. Ilustração de tipos de imobilização de enzimas, sendo (a) adsorção física, (b)

adsorção física de alta afinidade, (c) encapsulação, (d) aprisionamento (entrapment), (e) ligação covalente em um suporte insolúvel, (f) cross-linking, (g) nano-gel, (h) a combinação

de e e f, (i) uma combinação de d e f e (j) uma combinação de cross-linkings.

Fonte: Zhang et al., 2011.

2.4.1 Imobilização por adsorção

A adsorção é um fenômeno de superfície, no qual há transferência de uma molécula de um fluido para uma interface, em geral, para um sólido (DWEVEDI, 2016). Este processo é normalmente utilizado a fim de separar os solutos presentes em um meio complexo, haja vista que as interações podem ser favorecidas entre determinadas moléculas (SUBRAMANI; THINAKARAN, 2016). Portanto, essa técnica se faz muito presente na purificação de proteínas (DE SOUSA JUNIOR et al., 2015; PADILHA et al., 2017), onde irá promover um ambiente propício para que ocorram interações entre o suporte e a proteína de interesse, fazendo com que haja uma transferência de massa da fase líquida para a fase sólida. Em geral, alterando-se esse ambiente para que as ligações adsorvente-adsorbato sejam desfeitas, pode-se recuperar o soluto de interesse.

Logo, a adsorção é uma técnica amplamente usada na purificação de enzimas, com diversos relatos na literatura (ARAÚJO et al., 2016b; PADILHA et al., 2017; CHIANG et al., 2003; SANTANA et al., 2015). No entanto, ao se optar por não realizar o processo de eluição das enzimas do suporte, a adsorção passa a ser um processo de imobilização caso o sítio ativo da enzima não tenha sido prejudicado (RODRIGUES et al., 2013). Todavia, o uso da adsorção permitiu imobilizar diferentes enzimas com sucesso tais como quitosanase (SINHA; CHAND; TRIPATHI, 2016a), celulase (AHMED; CHANG; TSAI, 2017), amilase (SINGH;

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Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica 29

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado KAYASTHA, 2014), β-glicosidase (YAN et al., 2010) e lipase (RIOS et al., 2018). No entanto, por ser uma técnica que tem como princípio básico as interações eletróstaticas entre as moléculas envolvidas, uma das desvantagens desse método é a dependência com pH do meio onde se encontra, sendo menos estável que métodos com ligações químicas, no geral (NISHA; KARTHICK; GOBI, 2012).

2.4.2 Imobilização por ligações covalentes

O processo de imobilização de moléculas por meio de reações covalentes se dá pela utilização de métodos ligantes específicos (HIRSH et al., 2010). Existem diversos reagentes ligantes – também chamados de espaçadores – que podem realizar este papel, como o glioxal, epóxido, vinil-sulfona e glutaraldeído, o mais utilizado na literatura (VAZQUEZ-ORTEGA et al., 2018). O glutaraldeído, por exemplo, irá atuar principalmente nos grupos aminos presentes nas enzimas, sobretudo dos aminoácidos residuais que podem ser encontrado nos sítios ativos (BARBOSA et al., 2012).

Como demonstrado na Figura 2.6., o reagente ligante atuará como mediador da ligação entre o suporte e a enzima (DATTA; CHRISTENA; RAJARAM, 2013), o que irá caracterizar o método de ligação covalente. Quando a ligação ocorre entre enzimas, caracterizando o método de ligações cruzadas (MOHAMAD et al., 2015). Essa diferenciação ocorrerá de acordo com a metodologia empregada no processo dos complexos imobilizados. No primeitro caso, o reagente ligante é adicionado apenas ao suporte, como na Figura 2.6. e na metodologia empregada por Yu et al. (2012). No segundo,o reagente ligante éadicionado no mesmo passo de introdução da enzima, como na metodologia utilizada por Shuddhodana, Gupta e Bisaria (2018). No entanto, em ambos os casos, devido à proximidade das enzimas, podem ocorrer outras ligações entre as enzimas depois do processo de imobilização (VAZQUEZ-ORTEGA et al., 2018).

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Figura 2.6. Processo de ativação de materiais inertes para a realização de ligações covalentes.

Fonte: Autora.

As ligações covalentes vêm sendo utilizadas para a imobilização de diversas enzimas como β-galactosidase para a produção de lactulose (DE ALBUQUERQUE et al., 2018), celulase em diferentes suportes (HOSSEINI et al., 2018; YU et al., 2012; YUAN et al., 2016), β-glicosidase em sílica (WEI et al., 2018), acrilamidase em esferas de quitosana (BEDADE; SUTAR; SINGHAL, 2019), quitosanases em quitina (EL-SAYED; OMAR; SHOUSHA, 2017) e lisozima em uma matriz aminada (LEVASHOV et al., 2019). Isto demonstra a verasatilidade da técnica e o seu potencial para ser utilizado neste trabalho.

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Capítulo 3

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3. Materiais e Métodos

Este capítulo apresenta os principais reagentes e todo o procedimento experimental utilizado para a realização deste estudo. Durante a descrição de metodologia e os resultados, os coquetéis de Celulase, β-Glicosidase e Quitosanase poderão ser denominados como amostras C, G e Q, respectivamente, afim de tornar a discussão mais objetiva.

3.1 Reagentes

Para garantir que o tipo de quitosana não influenciasse o perfil dos QOS produzidos, foi utilizada a quitosana de baixa massa molecular (entre 50 e 190 kDa e grau de desacetilação 75-85%) da Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA). As enzimas comerciais utilizadas foram coquetel de celulase de Trichoderma reseei (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) e coquetel de β-glicosidase NS22118 (Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca). A resina que foi utilizada nos ensaios de imobilização foi a Streamline® SP (diâmetro 100-300 µm, GE Healthcare, Uppsala, Suécia) e a sílica-gel (diâmetro 0,063-0,200 nm) foi da Merck (Darmstadt, Alemanha). Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico. As amostras com coquetel de celulase serão identificadas como C, as com β-glicosidase como G e as amostras com o caldo de fermentação contendo quitosanases (produzidas no Laboratório de Engenharia Bioquímica (LEB) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)) serão representadas com Q.

3.2 Produção das quitosanases

A cepa de Bacillus toyonensis utilizada foi isolada anteriormente por Araújo et al. (2016a), porém previamente identificada como B. cereus, e foi cultivada para produção de quitosanases de acordo com metodologia descrita por Araújo et al. (2016a). A cepa isolada foi preservada em solução de glicerol a -20 oC em microtubos. Após a ativação da cepa, para a produção do inóculo, uma colônia isolada foi retirada da placa e adicionada a Erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL do meio líquido composto por peptona (6,0 g.L−1), sulfato de magnésio heptahidratado (0,5 g.L−1), fosfato dibásico de potássio (1,0 g.L−1) e quitosana (2,0 g.L−1). Os frascos foram incubados a 30 °C e 120 rpm por 24 h. Na etapa de produção da enzima, o inóculo (10% v/v) foi transferido para Erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL do meio citado anteriormente sob agitação (120 rpm) por 72 h a 30 oC.

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Capítulo 3 – Materiais e métodos 33

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado

3.3 Precipitação das quitosanases

O caldo bruto foi submetido a uma etapa para se avaliar qual a melhor proporção e o melhor agente precipitador que favoreceria o fator de purificação (FP). Baseado em trabalhos de precipitação de quitosanases (CHEN; XIA; YU, 2005; DOAN et al., 2018; FARINAS et al., 2011; LIANG et al., 2014; NGUYEN et al., 2014), decidiu-se utilizar etanol absoluto, acetona e solução saturada sulfato de amônio nas concentrações de 30, 50 e 70% (v/v) de agente precipitante em relação ao volume total do sistema.

Assim, o volume desejado de agente precipitante foi gotejado lentamente no caldo enzimático em constante agitação. Depois, as amostras foram deixadas overnight a 4 oC para

que ocorresse a precipitação. Finalmente, elas foram centrifugadas (4000 rpm por 15 min a 4

oC) e ressuspendidas em água deionizada. É importante ressaltar que essa técnica também

possibilita a concentração das proteínas, o que foi realizado, considerando que a amostra foi ressuspendida em um volume menor que o inicial nos ensaios de imobilização, a fim de padronizar a carga enzimática utilizada.

3.4 Atividade enzimática

A atividade enzimática foi analisada através do método colorimétrico de quantificação de açúcares redutores utilizando o ácido 3,5-Dinitrosalicílico (DNS), usando D-glicosamina como padrão (MILLER, 1959). Neste método, 250 μL de amostra foram incubadas com 250 μL da solução de quitosana a 1% (pH 6,0) em tubo de ensaio por 0 e 30 minutos a 55 oC, em

triplicata (ARAÚJO et al., 2013). Em seguida, adicionaram-se 1,3 mL da solução de DNS incubando-se em água em ebulição por 10 minutos. Por fim, foram acrescentados 1,2 mL de água destilada. A absorbância das amostras foi registrada a 590 nm usando-se um espectrofotômetro (Thermo Spectronic). Uma unidade de atividade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima necessária para formar 1,0 μmol de GlcN por minuto nas condições definidas no ensaio. A curva de concentração foi construída através de concentrações conhecidas do padrão analítico D-glicosamina (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, EUA).

3.5 Quantificação de proteínas totais

A quantificação de proteínas totais foi realizada pelo metódo proposto por Lowry et al. (1951). O método consiste em adicionar 100 μL da amostra em um tubo contendo 1,0 mL do catalisador cobre (II), agitando-se por 30 s e incubando-se por 20 min no escuro. Na sequência, adiciona-se o reagente Folin-Ciocalteau, seguido de nova agitação e incubação por

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30 min no escuro. Após esse tempo, faz-se a leitura da absorbância a 660 nm no espectrofotômetro (Thermo Spectronic). O padrão para quantificação utilizado foi albumina de soro bovino (BSA), da Sigma-Aldrich (Saint-Louis, EUA). Todas as amostras foram analizadas em triplicata.

Os resultados de atividade enzimática e concentração de proteína foram então aplicados nas Equações 3.1, 3.2 e 3.3 para se estimar a atividade específica, o fator de purificação (FP) e a recuperação, respectivamente:

𝑨𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒔𝒑𝒆𝒄í𝒇𝒊𝒄𝒂 (𝑈 𝑚𝑔) = 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 (𝑈/𝑚𝐿) 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑖𝑠 (𝑚𝑔/𝑚𝐿) (3.1) 𝑭𝑷 = 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑜 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑜 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑏𝑟𝑢𝑡𝑜 (3.2) 𝑹𝒆𝒄𝒖𝒑𝒆𝒓𝒂çã𝒐 (%) = 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑝𝑖𝑡𝑎𝑑𝑜 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑜 𝑐𝑎𝑙𝑑𝑜 𝑏𝑟𝑢𝑡𝑜× 100 (3.3)

3.6 Eletroforese em gel de Poliacrilamida com Dodecilsulfato de sódio

(SDS-PAGE)

As amostras da precipitação com melhor fator de purificação foram escolhidas para serem submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) a 12% na presença de dodecilsulfato de sódio (SDS) para estimar qualitativamente a pureza das proteínas. Também foram realizadas análises dos coquetéis comerciais para a visualização do perfil de massa molecular das proteínas presentes neles.

Primeiro, as amostras foram submetidas a uma dessalinização ao ficarem submersas em água destilada, enquanto envoltas em uma membrana de diálise, por 24 h, a fim de retirar os sais e evitar interferência desses durante a realização do ensaio. Em seguida, as amostras foram liofilizadas no liofilizador modelo L101 (Liobras, Brasil), e depois re-solubilizadas em tampão de amostra (Tris-HCl 0,0625 M, SDS 2%, glicerol 10% v/v, 0,01% de azul de bromofenol) de forma a estarem todas com a mesma concentração (LAEMMLI, 1970). Então, elas foram aquecidas a 100 °C por 5 minutos e 20 µL de cada amostra e do padrão de proteínas foram aplicados no gel. Depois de realizar a eletroforese, o gel foi corado por nitrato de prata, para a visualização das bandas de proteínas. O marcador de massa molecular utilizado foi proveniente da GE Healthcare (Suécia), e continha as seguintes proteínas: α-lactalbumina (14,4

(37)

Capítulo 3 – Materiais e métodos 35

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa), anidrase carbônica (30,0 kDa), ovoalbumina (45,0 kDa), albumina (66,0 kDa) e fosforilase b (97,0 kDa).

3.7 Padronização da atividade quitosanolítica das enzimas não específicas

As enzimas não-específicas, coquetéis de celulase e β-glicosidase, foram utilizadas para a hidrólise da quitosana na sua forma livre. Portanto, ensaios foram realizados a fim de padronizar a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1,0 mL da quitosana (U). Ambos os coquetéis foram testados em condições variadas de pH e temperatura descritas na Tabela 3.1. para avaliar as condições ideais de hidrólise de cada uma delas. Destacando-se que esses valores foram determinados com base na literatura (FARINAS et al., 2011; LIN; LIN; CHEN, 2009; MA; QIAN; ZHOU, 2015).

Tabela 3.1. Parâmetros para análise da capacidade de hidrólisar a quitosana das amostras C e

G. pH Temperatura (oC) 4 45 5 55 6 65 Fonte: Autora.

O teste foi realizado seguindo o mesmo protocolo de quantificação de açúcares redutores para a amostra Q, onde foram preparadas soluções com a mesma concentração de enzimas em cada um dos três pHs avaliados, depois 0,25 mL da respectiva solução da enzima foi incubada com 0,25 mL de solução de quitosana (1% m/v) por 30 minutos em cada temperatura especificada, como esclarecido no item 3.4.

3.8 Determinação do Ponto isoelétrico das amostras C, G e Q

A determinação do ponto isoelétrico (pI) das enzimas é de fundamental importância para processos de imobilização que envolvam ligação eletrostáticas entre suporte e substrato (NGUYEN; KIM, 2017). Na determinação do pI, as três amostras – C, Q, e G – foram submetidas a medição do potencial Zeta (ZETAPLUS, Brookhaven Instruments Corporation) e de atividade enzimática do precipitado em diferentes pHs, indo do 4,0 ao 7,0. Para isso, foram formuladas soluções tampão com diferenças de 0,2 dentro do intervalo mencionado anteriormente, onde cada uma das amostras foi incubada e o potencial zeta registrado. Outro

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grupo de amostras (250 μL) foi centrifugado após a incubação, teve o sobrenadante descartado sendo o precipitado ressuspendido em água (250 μL) com a sua atividade enzimática analisada segundo o item 3.4.

3.9 Imobilização das enzimas

3.9.1 Imobilização por adsorção

O estudo de imobilização por adsorção foi realizado para cada amostra variando dois fatores fundamentais para o sucesso do mecanismo: o pH e a razão enzimas/suporte (U/gsuporte),

segundo a Tabela 3.2. A resina Streamline SP (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) foi utilizada como suporte para esses estudos.

Tabela 3.2. Níveis de variação de parâmetros para a imobilização por adsorção de Q, C e G.

pH Enzima/Suporte

(U/gsuporte)

5 25

6 50

Fonte: Autora.

O pH foi escolhido pois este influencia diretamente nas interações entre a enzima e o suporte. Seus níveis foram definidos de acordo com valores baseados na literatura (SANTOS-MORIANO; WOODLEY; PLOU, 2016; SINHA; CHAND; TRIPATHI, 2016b). A razão Enzima/Suporte foi escolhida a fim de encontrar o valor mínimo de enzima necessário para que se pudesse alcançar a capacidade de adsorção do suporte.

Assim, 0,1 g de resina foi previamente pesada em cada microtubo (em duplicata) e equilibrada com 0,5 mL de tampão citrato de sódio (50 mM) no respectivo pH. Depois, 1,0 mL da solução enzimática, na sua respectiva concentração, foi adicionado ao sistema, o qual foi homogeneizado por 10 s e incubado por 30 min a 4 oC. Após a incubação, o sobrenadante foi removido e teve a sua atividade enzimática analisada, enquanto a resina foi lavada com 3 mL do mesmo tampão analisando-se, em seguida, a atividade enzimática. A quantidade de enzima adsorvida foi estimada por balanço de massa. Para verificar a adsorção das enzimas na matriz, foi realizada a quantificação enzimática do caldo antes da adsorção e do tampão de lavagem depois da adsorção. Assim, caso a atividade enzimática presente no caldo seja mínima ou nula, poderá se afimar que ocorreu efetivamente a adsorção das enzimas no suporte.

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Capítulo 3 – Materiais e métodos 37

Julia Maria de Medeiros Dantas Dissertação de Mestrado

3.9.2 Imobilização por ligações covalentes

Assim como a imobilização por adsorção, o estudo da imobilização por ligações covalentes foi realizado variando-se dois fatores de fundamental importância para o sucesso do processo: a concentração de glutaraldeído utilizado na ativação da sílica e a razão enzima/suporte. Os valores dos níveis estão dispostos na Tabela 3.3.

Dessa forma, antes de iniciar o processo de imobilização, a sílica teve que ser ativada. A metodologia aplicada foi de acordo com o trabalho de Song, Alnaeeli e Park (2014). Nesse caso, ela foi seca (105 oC, 24 h) previamente a fim de eliminar qualquer umidade externa e

depois foi silanizada com uma solução de 0,5 M de (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) (Sigma-Aldrich, EUA) por 12 h a 25 oC. A silanização é necessária para diminuir a interação

dos grupos aminas da proteína com o suporte, promovendo uma melhor atuação dos agentes ligantes, como o glutaraldeído (AISSAOUI et al., 2014). Em seguida, a sílica foi lavada com água destilada e seca novamente. Na sequência, o material foi colocado em contato com o tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0) contendo glutaraldeído nas concentrações 0,5 e 1,0 M, em temperatura ambiente por 2 h. Finalmente, o material foi lavado extensivamente com água destilada, seco e guardado em um dessecador para uso futuro. O mesmo procedimento para verificação da efetividade da imobilização realizado no item 3.9.1. foi aplicado para as amostras imobilizadas em sílica.

Tabela 3.3. Níveis de variação de parâmetros para a imobilização por ligações covalentes de

C, G, e Q. Glutaraldeído (M) Enzima/Suporte (U/gsuporte) 0,5 M 25 1,0 M 50 Fonte: Autora

Para a realização dos ensaios, 0,1 g da silica ativada foi pesada em microtubos de 1,5 mL e equilibrada com 0,5 mL de tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0). Em seguida, adicionou-se, 1,0 mL da solução enzimática na respectiva concentração (pH 7,0), incubando-se por 24 h, a 4 oC, sendo homogeineizada ocasionalmente. Na sequência, assim como realizado para o processo de adsorção, o sobrenadante foi coletado e a silica foi lavada com 3 mL de

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tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0), para que ambos pudessem ter as suas atividades enzimáticas analisadas. Os ensaios foram realizados em duplicata.

3.10 Parâmetros de avaliação da imobilização

Para avaliar o desempenho da imobilização, foram avaliados dois fatores: o rendimento da imobilização e a atividade recuperada. O rendimento da imobilização (Yi) foi calculado a partir da atividade enzimática pré-imobilização (ao)e a atividade enzimática final

do sobrenadante pós-imobilização e do branco (af), conforme Equação 3.4 (RIOS et al., 2018).

𝑌𝑖 (%) = 𝑎𝑜−𝑎𝑓

𝑎𝑜 × 100 (3.4)

A atividade recuperada (ar) é definida como a relação entre a atividade enzimática

teórica (at) e a atividade da enzima imobilizada (ad). Este parâmetro vai expressar se a enzima

foi imobilizada de modo a não obstruir os seus sítios ativos. A at é calculada a partir da diferença

entre a atividade inicial (ao) e final (af) do sobrenadante, pois esta seria a atividade máxima

alcançada pelos catalisadores imobilizados, como demonstra a Equação 3.5. A atividade recuperada, estimada conforme Equação 3.6, é um indicativo da viabilidade do método de imobilização (DE OLIVEIRA et al., 2018).

𝑎𝑡= 𝑎0− 𝑎𝑓 (3.5)

𝑎𝑟 =𝑎𝑑

𝑎𝑡× 100 (3.6)

3.11 Estudo de estabilidade térmica

O teste de estabilidade térmica analisa a perda de atividade enzimática ao longo do tempo enquanto as enzimas estam submetidas a uma temperatura desnaturante. Ele é essencial para avaliar o quão benéfico o processo de imobilização é para cada enzima.

Assim, as enzimas livres e imobilizadas – na melhor condição de cada estratégia para cada enzima – foram incubadas em um banho termostático (Tecnal, Brasil) a 70 oC. As amostras foram retiradas nos tempos 0, 1, 5, 10, 20, 30 e 60 min e depois tiveram as suas atividades enzimáticas quantificadas como descrito no item 3.11. Os testes foram realizados em triplicata e seus resultados foram descritos em porcentagem em relação à atividade apresentada no tempo zero.

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