Síntese e caracterização de compostos de cobre, potencialmente modelos para o Sítio Ativo de Metaloenzimas

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA -UFSC.

CENTRO DE CIÊNCIAS FÍSICAS E MATEMÁTICAS CFM.

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA - QMC

RELATÓRIO DE ESTAGIO DE CONCLUSÃO DE CURSO

TÍTULO DO ESTÁGIO

SINTESE E CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS DE COBRE, POTENCIALMENTE MODELOS PARA 0 SÍTIO ATIVO DE METALOENZIMAS.

Aluno: Leonardo Jantsch Fiuza

Orientador: Prof. Dr. Augusto Suzin Ceccato

DEDICATÓRIA:

Dedico este trabalho aos meus pais Armando de Padua Fiuza

e

Célia Jantsch

Fiuza, meus irmãos Armando de Padua Fiuza Júnior, Thiago Matheus Jantsch

AGRADECIMENTOS:

Agradeço ao Prof Dr. Augusto Suzin Ceccato pela paciência, apoio, compreensão, orientação e confiança depositada em mim.

Agradeço ao Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina o apoio disponibilizado através de sua estrutura física e corpo docente.

Agradeço ao PADCT III pelo apoio financeiro.

Agradeço aos meus colegas de laboratório pelo apoio e o café.

Agradeço aos colegas do Centro Acadêmico Livre de Química e aos demais colegas de classe.

SumArio

I - INTRODUÇÃO 1

1.1 - 0 Cobre 1

1.2 - Galactose Oxidase 3

2- PARTE EXPERIMENTAL 5

2.1 - Materiais, métodos e instrumentação 5

2.2 - Síntese e Caracterização do Ligante 5

2.2.1 - Sintese do ligante H2Bhis 5

2.3 - Síntese dos Complexos 8

2.3.1 - Síntese e Caracterização do Complexo 1 8

2.3.2 - Síntese e Caracterização do Complexo `") 11

3 - DISCUSSÃO 15

4 - CONCLUSÃO 17

5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 18

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura I - Esferas de Coordenação e geometria dos Centros de Cobre, em metaloenzimas do tipo 1, tipo2 e tipo 3

Figura 2 - Desenho esquemático do sitio ativo da galactose oxidase caracterizado cristalograficamente

Figura 3 - Espectro infravermelho do 1-12Bhis, em pastilha de KBr

Figura 4 - Espectro infravermelho do Complexo 1, em pastilha de KBr 1) Figura 5 - Estrutura Proposta para o Complexo 1

Figura 6 - Espectro infravermelho do Complexo 2, em pastilha de KBr I 2

Figura 7 - Espectro eletrônico UVWis, em DMF

Figura 8 - Análise Termo Gravimétrica I .;

vi

RESUMO

Foram sintetizados o H2Bhis Rácido[(2-hidroxifenilmetil)-2-amino)-3-(1H-imidazol-4-11)propanóico] corno ligante e dois complexos de Cobre mononuclear utilizando-se este ligante, corn o objetivo de mimetizar o sitio ativo da Galactose Oxidase, onde o complexo (1) foi sintetizado corn um rendimento de 95%, e o complexo (2) com 40,23% de rendimento.

A síntese de compostos utilizaram a proporção 1 : 1 (Cu 2+/L) na presença de Et3N obteve-se urn composto octaddrico mononuclear corn o ligante tetradentado e corn duas águas de coordenação (complexo (1)). Sem a adição de Et3N obtivemos o composto octaédrico onde se encontra dois ligantes protonados (fenáis) coordenados ao metal (Cu 24.) e corno contra-ion dois percloratos e duas águas de cristalização (complexo (2)).

Estes compostos foram caracterizados por espectroscopias no infravermelho , na região o ultra violeta e do visível (UV\Vis), análise elementar Cl-IN e termo gravimetrica (TGA).

1-INTRODUÇÃO:

Este trabalho foi realizado na intenção de sintetizar e caracterizar os complexos de Cobre do tipo 2, que mimetizassem o sitio ativo da Galactose Oxidase.

A compreensão da maneira que atuam as metaloenzimas tem sido facilitada pela Química Bioinorgánica. A síntese e caracterização de modelos e análogos sintéticos que mimetizam a estrutura do sitio ativo de enzimas tem fornecido relevantes informações para o trabalho na área biológica, contribuindo para o desenvolvimento de metodologias de análise quantitativa e para o melhor entendimento da enzimologia.

0 processo de mimetização de enzimas se desenvolve em etapas , para um ajuste das propriedades fisico- químicas dos modelos ou análogos sintéticos com as respectivas propriedades das enzimas de interesse, o que requer tempo e aprendizagem para obtenção , através de sínteses elaboradas e análises sofisticadas, dos novos ligantes e, posteriormente, dos respectivos complexos.

1.1-O Cobre:

Cobre é um elemento de minero atômico 29, que ocorre nos estados de oxidação +1, +2 e +3 em seus compostos. Os estados de oxidação mais importantes em biomoléculas são o +1 e o +2. 1

No estado +I, apresenta configuração eletrônica [Ar) kV ° , tendo os orbitais e s e t2g completos. Portanto, a grande maioria dos complexos de cobre (I) é diamagnética e a ausência de transições d-d implica em compostos incolores.'

No estado +2, o estado de oxidação mais estável e importante do metal, a configuração eletrônica é [Ar] 3d9, apresentando os orbitais t2g completos, enquanto que

os orbitais eg estão semipreenchidos, sendo que seus compostos são coloridos e paramagnéticos. E de se esperar que os complexos de Cu (II) apresentem uma pronunciada distorção Jahn-Teller.'

O cobre é essencial à vida e uma pessoa adulta tern no organismo cerca de 100 mg de Cu. É a terceira maior quantidade de um metal de transição, inferior ao Ferro (4g) e ao Zinco (2g).

Embora pequenas quantidades de Cu sejam essenciais, quantidades maiores são toxicas. As necessidades diárias na alimentação são da ordem de 4 a 5 mg de Cu, e em animais a deficiência desse metal resulta na incapacidade de aproveitar o ferro armazenado no fígado. Dessa forma, o animal passa a sofrer de anemia. 0 cobre liga-se a proteínas do organismo, como metaloproteinas, ou como enzimas.

Dependendo da esfera de coordenação e da geometria dos centros de cobre, essas enzimas podem ser classificadas em tipo 1, o cobre "azul", tipo 2, o -não-azul", e tipo 3, não detectável por RPE e, o cobre presente na hemocianina, de acordo com o esquema abaixo.(Figura 1)23

As metaloenzimas de Cobre do tipo 1 possuem a função de transportar elétrons e são conhecidas como as proteínas azuis do cobre. As metaloproteinas de cobre do tipo 2 possuem a função de ativar o oxigênio em conjunto com outras enzimas orgânicas. As metaloproteinas de um cobre do tipo 3 são dimeras, possuindo um ligante em ponte entre os dois átomos de cobre e atuam como transportadoras de oxigênio.

:VS

.... '

C „

C

His

TIPO 1 TIPO 2 TIPO 3

Onde: R 4 Met (Azurina, Plastocianina, Lactase) L 4 Ligantes contendo 0 ou N.

Figura 1: Esferas de Coordenação e geometria dos Centros de Cobre, em metaloenzimas do tipo 1, tipo 2 e tipo 3,2.3

I.

1 i

■

, . , , , 1 • .., - L

V

'.--

",,t ••'

3

1) Amino Oxidase (responsáveis pela oxidação de minas) - tipo 2 2) Ascorbato Oxidase (Oxidação do Ácido Ascorbico) - tipo 1.

3) Galactose Oxidase (Oxidação do grupo RR'-CHOH ao grupo RR'-CHO no mono ssacarideo galactose) - tipo 2.

As biomoléculas de cobre são responsáveis, principalmente, pelo transporte de oxigênio e de elétrons. Existe um grande interesse dos químicos em estudar modelos para reproduzir em laboratório compostos similares com o objetivo de elucidar o mecanismo de atuação dessas moléculas.

Abordaremos aqui a galactose oxidase que é uma enzima, em que o cobre é

responsável pelo transporte de elétrons em sistemas biológicos.

1.2- Galactose Oxidase (GOase):

A galactose oxidase (GOase) é uma enzima extracelular secretada pelos fungos

Dactyllium dendroides, Polyporus circinatus e Polyporus dendroids.4 Atua promovendo

a oxidação estereoespecifica de um grande número de álcoois primários transformando-os em seus correspondentes aldeídos com a redução acoplada do oxigênio molecular a peróxido de hidrogenio. 2'5

RR' CHOH + RR'CHO + H202

A proteína é monomérica e possui um peso molecular de 68 kDa, com cerca de 639 aminoácidos sendo que seu sitio ativo apresenta apenas um centro de cobre não-azul, essencial para catalisar a transferência de dois elétrons na reação de oxidação. 2

Recentemente Ito et alii6a determinaram a estrutura da galactose oxidase via

difratometria de raios-X com uma resolução de 1,7 A (Figura 2) Esta enzima consiste de três domínios apresentando predominantemente estrutura 13 e somente uma única a hélice. 0 ion cúprico encontra-se na superfície acessível por solventes do segundo

His 495 Tyr495 N NN c I N N H 1-1 2 0 Cys 228 1-lis 661 4

como piramidal quadrada. 0 ion de cobre (II) está coordenado a quatro resíduos de aminoácidos da cadeia protéica e a um anion acetato exógeno. 0 quadrado quase perfeito é formado por um átomo de oxigênio do resíduo tirosinato, dois nitrogênios histidinicos e um átomo de oxigênio do anion acetato ou de uma molécula de água em pH 7. Um oxigênio de outro resíduo tirosinato ocupa a posição apical da pirâmide.

Figura 2: Desenho esquemático do sitio ativo da galactose oxidase caracterizado cristalograficamente.6.7

0 CH,-CH—C - I \ OH NH OH 0 1. Met:gill:OH 2. NaBH4 5

2- PARTE EXPERIMENTAL:

2.1- Materiais, métodos e instrumentação.

Todos os reagentes e solventes utilizados nas sínteses foram adquiridos de fontes comerciais e foram utilizados sem prévia purificação.

Para medidas de ponto de fusão foi utilizado o aparelho MQAPF-301, da Micro-Química, os espectros infravermelhos na região de 4.000 à 400 cni l foram realizados em pastilha de 1(13r, em espectrofotômetros Perkin Elmer modelo FT 16PC, as análises de Cl-IN foram realizadas em um equipamento Perkin Elmer 2400, os espectros eletrônicos UV/Vis foram realizados em espectrofotômetros Perkin Elmer modelo lambda 19 e as análises de TGA foram realizadas em um equipamento Shimadzu modelo TGA-50.

2.2- Síntese e Caracterização do Ligante.

2.2.1- Síntese do ligante H2Bhis: [(dcido [(2-hidrox ifenilmetil)-2-am i no]-3 -(1H-imidazol-441)propanôico]

H2BHis

O H2Bhis foi sintetizado a partir da aminação redutiva entre a histidina e o aldeido salicílico, conforme a seguinte rota sintética:

A uma suspensão de histidina (15,5g; 0,1 mol) em 250 mL de metanol, sob agitação magnética, foram adicionados 4,2g (0,1 mol) de Li0H.H20, permanecendo partes insolúveis.

6

Ern seguida foram adicionados

12,0 mL (-0,11mol)

de

aldeido salicilico

à esta

solução,

a qual apresentou uma

coloração

amarelada.

A

solução

foi mantida à

45 °C

por

15

minutos

restando,

ainda,

partes insaaveis.

Em seguida

esta solução foi

resfriada à temperatura

ambiente, e

durante

45

minutos foi adicionado

o Boroidreto

de

Sódio (4,0g; —0,1 lmol), ocorrendo liberação

de

gás e

um

enfraquecimento

gradual da

coloração,

até a

solução tomar-se praticamente

incolor.

Endo,

a solução foi

concentrada

à secura, restando um

sólido

branco

e

um

óleo

amarelo.

Ambos

foram dissolvidos em

aproximadamente 300

mt., de

Agua, onde o

pH foi

acertado ern

tomo

de

7 (122 mL

de

HC1 1M). ocorrendo a precipitação

de um

sólido

branco.

Este

sólido

foi

filtrado

à

vácuo, lavado

com

água

quente

(80

°C)

e

lavado com

éter. Então

foi seco a

vácuo,

apresentando

ponto de

fusão

entre

249-250 °C. Rendimento

81% (21,14g),

baseado na

histidina.

• Análise Elementar:

CHIN do

H2Bhis: C13H15N303 -

PM

= 261,3 g/mol

Nitrogênio

Carbono

Hidrogênio Enxofre

Experimental 59,30 5,41 15,70 0

291-415 A. SP

it

23_ 1 "" C.0 7 z 1 0400 3 3500 . a.00 2000 2000.3 I 500 1 6CG 1 403 203 t3C0 517 doo o CV-1

Figura 3: Espectro infravermelho do I -12Bhis, em pastilha de KBr. Atribuições: —> v(NH): 3114 cm-1

qcoo-,

ass.): 1602 cm -1

qcoo-,

sim.): 1406 cm -I —> 40H): 1380 cm -1 aromático): 3014 cm-I alifatico): 2900 - 2970 cm'

2.3- Síntese

dos Complexos

2.3.1- Síntese e

_{caracterização do}

_{Complexo 1.}

Cu(C104)2.6H20 /Me0H H2Bhis agitação Solução

Verde

Et3N agitação Acetonitrila

Filtrado

lavado 2 x 3 mL isopropanol [Cu(Bhis)(H20)2]

H 2 l3his + Cu(C104)2.61-1)0 +

Et:A

\k`)" [Cu(Bhis)(1-120)2] ( 1)

A uma solução de

20 mL

de

Me0H

contendo

0,74g (2 mmol)

de

Cu(C104)2.6H20

foi adicionado

0,522g (2 mmol)

do

ligante sólido,

alterando a

coloração

da

solução

de

que

no principio era

azul

clara para verde.

Adicionou-se a esta solução verde

_{6 mmol}

_de

_Et3N

_para

_{deprotonar e}

_dissolver

o ligante.

Utilizou-se

aproximadamente

80,0 mL

de

Acetonitrila,

para precipitar

o

produto,

gerando um precipitado fino que foi filtrado

_{e lavado}

_{duas vezes com}

_{3 mL}

_de

1

1 t?;D:1 lliD7.■ 1 aZi7i 2C-r,1

:".

9

isopropanol. obtendo-se 0,68g de _{produto com um rendimento de 95%, em relação ao}

ligante.

Verificou-se que o complexo não é solúvel nos solventes disponíveis no laboratório: H20, Me0H, Et0H, DMF, Clorofórmio, Diclorometano, Acetona, Acetonitrila, Éter etílico. etc.

• _{Análise elementar: CNN: do complexo 1: C13H17N305Cu - PM = 358,54 g/mol}

Nitrogênio Carbono Hidrogênio Enxofre

Experimental 11.934 43.947 4.445 0

Teórico 11.71 43.51 477 0

Atribuições: —> t(NH): 3114

cm'

aromático): 3012

cm-1

alifático): 2900 - 2970

cm'

—> q011,

11

20): 3382

cm-1

—> qC=N): 1592

cm'

10

11 2.3.2- Síntese e _{caracterização do Complexo 2.}

Cu(C104)2.61120 /Me0H H2Bhis agitação Solução Verde

agitação c/ leve aquecimento. Solução Azul

Filtrado em papel

lavado 2 . 3 mL isopropanol lavado 2 „ 3 mL éter

[Cu(H2Bhis)2].(C104)2.21 -120

H2Bhis + Cu(C104)2.6H20 _{[Cu(H2Bhis)2].(C104)2.2H20 (2)}

A uma _solução de 20 mL de _{Me0H com 0,74g (2 mmol) de Cu(C104)2.6H20 foi} adicionado _{0,522g (2 mrnol) do ligante, alterando a cor inicial da}

solução de azul para verde.

Deixada sob agitação com leve aquecimento por aproximadamente cinco minutos, passando a _solução a adquirir uma coloração azul intenso. Após dez minutos retirada a agitação e filtrada em papel filtro.

Separado precipitado _{microcristalino de cor roxa, lavado com isopropanol}

e com éter etílico. Produzindo 0,33g com um rendimento de _{40,23%, com relação ao perclorato} de cobre hexaidratado.

• Análise elementar: CHN: do complexo _{2: C26H34N6016CuC1 2 - PM = 821,04 g/mol}

Nitrogênio Carbono _{Hidrogênio Enxofre} Experimental _{10,235 38,097 4. I 76}

0

ti

I

12

r•CCO::

Figura

6:

espectro infravermelho do Complexo

2,

em pastilha de

KBr.

Atribuições: —>

(NH):

3154 cni 1 —> 8(OH): 1394

cm-1

aromático): 768 - 3012

cm-1

—> p(CH, alifático): 2900 - 2970

cm-1

—> v(C=N): 1610

cm-1

—> v(C104): 1114

cm-I

• Espectroscopia Eletrônica:

0

espectro

eletrônico

do Complexo

(2)

em

DMF (Figura 7),

apresenta duas

transições

em

648,00

rim

(s = 137,4 M-lcm-1 )

e

427,20 nm

(e

= 343,7 M-l cm-1 ),

correspondentes as

transições dz2 dx2-y2

e

dxy 4 dx2-y2 respectivamente.

L. 0.00 200.00 400 00 TempfC) -0 JO 010 -0 20 600.00 800.00 OrTGA mgimln lc. TOA 313 88.39C 8toort 101 .48C 184.02 0 En8 330.00C 1'2 I r1.4c... 228.480 148.240 Enciset 290.240

VVeslaht L.a. -0.103,10 VValaht Loma -0.817m0

-4.052 14 -32.00694 SO 100 00 tatart Mnel -2, ns.rt Endoebt

Figura 7: espectro eletrônico UV/Vis do complexo 2, em DMF

• Análise Termo Gravimétrica:

Como objetivo de determinar se as Aguas presentes no complexo (2) era de cristalização ou de coordenação, foi realizada a análise do mesmo, indicando que se trata de Aguas de cristalização.

Figura 8: Análise Termo Gravimétrica do complexo (2) [Cu(H2abis)21.(C104)2.2H20

14 O NH _{OFT \ OH} HO Nki OHM u—NH . (C104)2 . 21420

15

3- DISCUSSÃO:

O ligante H2Bhis, a análise de RMN 1 H não foi feita devido A sua baixa solubilidade, desde D20 até CDC1 3. Mas mesmo assim, foi possível a sua caracterização com base no seu espectro infravermelho e em sua análise elementar.

As demais análises que deveriam ser realizadas com os complexos (eletroquimica, espectro eletrônico UV/VIS) não foram realizadas, também pelo fato de não serem solúveis, só o complexo 2 era solúvel em DMF, mas quando diluído alterava sua coloração de roxo para verde, podendo haver uma alteração em sua estrutura, pois de acordo com o CHN, os dois complexos são diferentes, e o complexo 1 apresenta urna coloração verde idêntica A coloração da solução do complexo 2 em DMF.

A partir das excelentes análises elementares e do infra vermelho, propomos urna estrutura para o complexo 1 (Figura 5), cuja esfera de coordenação contém 1 Nitrogênio imidazólico, 1 Nitrogênio alifático, um oxigênio fenólico e dois oxigênios de água. com geometria octaddrica, ficando muito próxima da esfera de coordenação proposta por Ito et

alii para a Galactose Oxidase.

0 complexo 2 (Figura 9) apresenta 2 Nitrogênios imidazólicos, 2 Nitrogênios alifAticos, dois oxigênios fenálicos, com dois contraions perclorato e duas Aguas de cristalização, gerando uma estrutura octaddrica, também próxima da esfera de coordenação proposta por Ito et alii, faltando somente a água de coordenação.

0 espectro eletrônico feito a partir do complexo 2 em DMF (Figura 7), apresentou duas transições, uma em 648 nm com um s igual a 137.4 M' cm e outra em 427,7 nrn com um s igual a 343,7 M -l cm-1 , indicando que se trata de transições do tipo d-d do Cu 2+ .

Comparando os espectros de infravermelho do ligante com os dos complexos, notamos que ha presença do ligante confirmando no primeiro caso que este se encontra deprotonado devido a ausência de perclorato, e no segundo caso continua protonado.

No espectro de infravermelho do complexo

1

(fig. 4) verificamos a presença das bandas características do ligante livre, com algumas intensidades diferentes , e a banda de 1380 cm-1 , correspondente a deformação angular fora do plano do OH do fenol. desapareceu, indicando que houve a deprotonação do -OH do fenol.

16

0 espectro de infravermelho do complexo 2 (Figura 6),

é

semelhante ao do ligante livre exceto pela presença da banda do perclorato centrada em torno de 1100,0 cm -I .

A análise de TGA para

o

complexo 2 (Figura 8) indicou uma perda de massa de 4,052% em 121,84 °C, onde este valor ficou muito próximo da estrutura proposta (Figura 9) neste trabalho, que indica 4,38% de massa de Agua.

17

4- CONCLUSÃO:

1) Estas estruturas propostas para mimetização da Galactose Oxidase podem ser utilizadas no futuro para o estudo da reatividade, através da oxidação de álcoois a aldeídos na presença e ausência destes compostos. (Ação Catalítica).

2) No complexo 1 podemos confirmar que o fenol está coordenado deprotonado devido a ausência do estiramento (5(OH) - 1380 cm*

3) No complexo 2 podemos identificar a banda levemente deslocada em relação ao ligante livre ((5 (OH) - 1380 cm -1 ), indicando que o fenol continua protonado mas coordenado 8(OH) - 1394 cm -1 , e a presença da banda em 1114 cm -1 , correspondente ao contra ion perclorato.

4) Pela análise de TGA do complexo 2, onde a perda de massa ocorreu em uma única etapa, a uma temperatura relativamente baixa (121,84 °C) sugerindo tratar-se de águas de cristalização.

18

5- REFERÊNCIAS

BIBLIOGRAFIA:

1- JAMESON, R.. F., Coordination chemistry of copper with regard to biological systems. IN:H. Sigel(Ed.) Metal ions in biological systems, 12 : 1-30, Dekker. NewYork. (1981).

2- KAIM, Wolfgang and SCHWEDERSKI, B., Bioinorganic chemistry : inorganic elements in thechemistry of life. New York, Wiley, (1994).

3- COWAN, J. A., Inorganic Biochemistry: An Introduction; VCH Publisishers, Inc.: New York, 1993.

4- LATOUR, Jean-Marc, Les sites actifs binucleaires des proteines à cuivre : stimulants d'une nouvelle chimie de coordenatio du cuivre. Bull. Soc. Chim. De France, 3 : 508- 523, (1988).

5- MÉNAGE, Stéphane, GELLON, Giséle, PIERRE, Jean[louis, ZURITA, Dacil ande SAINT-AMAN, Eric, A class of ligands designed as model for apogalactose oxidase. Bull. Soc. Chim. Fr., 134: 785-791, (1997).

6- ITO, Nobutoshi, PHILLIP, Simon E.V.,YADAV, Kapil D. S. and KNOWLES, Peter F., Crystal structure of a free radical enzyme, galactose oxidase. J. Moi. Biol., 238 : 794-814, (1994).

7- ITO, Nobutoshi, PHILLIP, Simon E.V., STEVENS, Conrad. OGEL, Zumrut B., McPHERSON, Michael J., KEEN, Jeffery N., YADAV, Simon E. V. and KNOWLES. Peter F., Three dimensional structure of galactose oxidase: na enzymes with a built-in secondary cofactor. Faraday Discuss., 93 : 75 (1992).

8- CASELLA, L., GULLOTTI, M., PINTAR, A., MESSORI, L., ROCKENBAUER, A., and GYOR, M., Iron (HI) Tyrosinate Models. Synthesis and Spectroscopic and Stereochemical Studies of Iro (III) Complexes of N-Salicylidene-L-amino Acids,Inorg. Chem.26 : 1031 - 1038, (1987).