UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE - UFRN CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA - CCET
INSTITUTO DE QUÍMICA - IQ
LABORATÓRIO DE ELETROQUÍMICA E NANOPARTÍCULAS APLICADAS - LENA
Rayane Pereira de Lima
DISCRIMINAÇÃO DE RESPOSTAS METABÓLICAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBMETIDAS A NANOPARTÍCULAS DE PRATA
Natal, RN 2017
DISCRIMINAÇÃO DE RESPOSTAS METABÓLICAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBMETIDAS A NANOPARTÍCULAS DE PRATA
Rayane Pereira de Lima
Trabalho de conclusão de curso apresentado junto ao curso de Química Bacharelado da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito obrigatório à obtenção do título de Bacharel.
Orientador: Prof. Dr. Luiz H. S. Gasparotto Co-orientadora: MSc. Heloiza F. O. Silva .
Natal, RN 2017
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Lima, Rayane Pereira de.
Discriminação de respostas metabólicas de Staphylococcus aureus submetidas a nanopartículas de prata / Rayane Pereira de Lima. - 2017.
49f.: il.
Monografia (graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Curso de Química Bacharelado. Natal, RN, 2018.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Henrique da Silva Gasparotto. Coorientador: Prof.ª Ma. Heloiza Fernanda Oliveira Silva.
1. Resistência bacteriana - Monografia. 2. Nanopartícula de prata - Monografia. 3. Hiclato de doxiciclina - Monografia. 4. Análise de componentes principais - Monografia. I. Gasparotto, Luiz Henrique da Silva. II. Silva, Heloiza Fernanda Oliveira. III. Título.
Rayane Pereira de Lima
DISCRIMINAÇÃO DE RESPOSTAS METABÓLICAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBMETIDAS A NANOPARTÍCULAS DE PRATA
Trabalho de conclusão de curso apresentado junto ao curso de Química Bacharelado da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito obrigatório à obtenção do título de Bacharel.
Orientador: Prof. Dr. Luiz H. S. Gasparotto Coorientadora: MSc. Heloiza F. O. Silva
Aprovado em / /
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Luiz Henrique da Silva Gasparotto (Orientador) Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Prof. Dr.ª Sibele Berenice Castella Pergher (Membro) Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Dr. Eduardo Rigoti (Membro)
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
A Deus, que permitiu a realização desse sonho, me ajudando a trilhar todos os caminhos necessários para que eu chegasse até aqui.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, meu Aba, por inúmeras vezes ter sido meu lugar de descanso.
Aos meus pais, Adelson e Rozelene, que sempre investiram na minha educação e se esforçaram para compreender todas as minhas escolhas.
A minha irmã Agatha, que com toda sua alegria deixou essa caminhada mais leve, relembrando momentos da minha infância. E a minha irmã Ângela, por todas as boas risadas e incentivos. Aos meus familiares e amigos por entenderem as minhas ausências em alguns encontros. Ao professor Luiz Gasparotto, pela oportunidade concedida, por sua confiança e orientação. Ao professor Edgar, por todas as sugestões e conhecimentos compartilhados.
A professora Celeste, por me receber em seu laboratório.
A Heloiza Fernanda, pela co-orientação e amizade. Sou grata por tanta dedicação, paciência e incentivo. A sua disponibilidade e prazer em compartilhar o conhecimento tornou esse processo enriquecedor.
Ao Celso e Mateus pelas análises de MET, ao LAMMEN pelas análises de infravermelho, e a ECT pela água ultrapura fornecida.
A Fernanda, por todo apoio e ajuda na área de quimiometria.
A Eryka, por toda ajuda, discussões acadêmicas e momentos divertidos. Ao Anderson por toda disponibilidade a ajudar em minhas dúvidas. Ao CNPq pelo financiamento.
Aos demais colegas que conheci por intermédio do LENA (Jannyely, Isadora, Zózimo, Thiago, Leandro, Rubens, Janine, Alex), pelos dias de companhia no laboratório. Aprendi algo com cada um.
A minha amiga Karina, por esses dez anos de amizade e companheirismo; Com certeza sua companhia nessa trajetória me fez seguir em frente e me incentivou até aqui, porque desde o início você foi a responsável por enxergar a linha de chegada. E por diversas vezes me fez lembrar que eu poderia prosseguir e que tudo daria certo. Obrigada!
Aos meus primos, Eloam e Alan, responsáveis por todos os passeios e momentos de descontração. Esses momentos foram importantes.
A Ana Lúcia que tanto tem me ensinado com seus conhecimentos e experiência de vida. As minhas discípulas, Andreia e Marcilayne, que compreenderam as minhas ausências quando era necessário.
Porque Dele, e por Ele, e para Ele, são todas as coisas. Romanos 11:36a
RESUMO
A resistência bacteriana é uma das problemáticas enfrentadas pela indústria farmacêutica. Dados da literatura mostram resultados promissores na aplicação de nanopartículas de prata (NanoAg) para combater a resistência bacteriana, além da possibilidade de realizar sua combinação com fármacos. Nesse estudo, as NanoAg foram sintetizadas por meio de uma rota de baixo impacto ambiental. Essas nanopartículas e seu combinado com hiclato de doxiciclina (DO) foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e espectroscopia na região do ultravioleta e visível (UV-Vis). A espectroscopia na região do UV-Vis mostrou a formação de bandas características das NanoAg (401 nm), DO (273 nm e 346 nm). Após a adição de DO à solução de NanoAg, a banda de DO apresentou um deslocamento na segunda banda, agora sendo apresentada em 355 nm, remetendo à uma possível interação. As micrografias de MET mostraram que a forma das NanoAg foi conservada após a adição de DO, bem como que promoveu uma mudança no tamanho médio das partículas de 5,32 nm ± 1,02 nm para 4,32 nm ± 1,02 nm (p < 0,05). Posteriormente, as bactérias foram ativadas, semeadas, incubadas e expostas aos agentes antimicrobianos (NanoAg, DO, NanoAg + DO), seguido da aquisição de seus respectivos espectros de FTIR-ATR. A Análise de Componentes Principais (ACP) foi aplicada ao grupo de espectros mostrando um padrão de diferenciação entre as classes.
Palavras-chave: Resistência bacteriana. Nanopartícula de prata. Hiclato de doxiciclina. Análise de Componentes Principais.
ABSTRACT
Bacterial resistance is one of the problems faced by the pharmaceutical industry. Data from the literature show promising results in the application of silver nanoparticles (NanoAg) to combat the bacterial resistance, in addition to the possibility of combining them with drugs. In this study, the NanoAg were synthesized by a low environmental impact route. These nanoparticles and their combination with doxycycline hyclate (DO) were characterized with transmission electron microscopy (TEM) and UV-Vis spectroscopy (UV-Vis). Spectroscopy in the UV-vis region showed the formation of bands characteristic of NanoAg (401 nm), DO (273 nm and 346 nm). After the addition of DO to the NanoAg solution, the DO band shifted to 355nm due to interaction with NanoAg. TEM micrographs showed that the shape of the NanoAg was preserved after the addition of DO and promote a change in the mean particle size from 5.32 nm ± 1.02 nm to 4.32 nm ± 1.02 nm (p < 0, 05). Subsequently, the bacteria were activated, seeded, incubated and exposed to the antimicrobial agents (NanoAg, DO, NanoAg + DO), followed by the acquisition of their respective FTIR-ATR spectra. The Principal Component Analysis (PCA) applied to the group of spectra showed a pattern of differentiation between the classes.
Keywords: Bacterial resistance. Silver nanoparticle. Doxycycline hyclate. Principal Component Analysis.
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 – Principais diferenças entre (A) eucariontes e (B) procariontes ... 16
Figura 2 – Micrografia da Staphylococcus aureus colorizada artificialmente ... 17
Figura 3 – Esquema demonstrativo do fenômeno RPS em nanopartículas esféricas. ... 18
Figura 4 – Solução coloidal de prata ... 20
Figura 5 – Fórmula estrutural do hiclato de doxiciclina ... 22
Figura 6– Esquema de obtenção das NanoAg e do combinado (NanoAg + DO). ... 25
Figura 7– Esquema de ativação, semeadura e análise do efeito antimicrobiano. ... 26
Figura 8 – Mecanismo do processo de redução dos íons prata pelo glicerol em básico. ... 29
Figura 9 - Estudo cinético da síntese de NanoAg, 1 mmol. L-1, por espectroscopia de UV-Vis: (A) PVP A (B) PVP B ... 31
Figura 10 - (A) Solução de NanoAg. (B) Espectro de UV-Vis das NanoAg ... 36
Figura 11 - Micrografia e gráfico da distribuição de tamanho das NanoAg ... 36
Figura 12 - (A) Solução do combinado de DO com NanoAg (B) Espectro de UV-Vis das NanoAg, DO e NanoAg + DO ... 37
Figura 13 - Micrografia e gráfico da distribuição de tamanho das NanoAg com adição de DO. ... 38
Figura 14 – Média dos espectros referente a cada classe: controle, DO, NanoAg + DO e NanoAg ... 40
Figura 15 – Escores de ACP dos espectros de FTIR-ATR das amostras das quatro classes. . 41
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACP - Análise por Componentes Principais. Do inglês, Principal Component
Analysis (PCA).
ATS - Ágar Triptona de Soja. Do inglês, Tryptic Soy Agar (TSA).
BHI - Caldo de infusão de cérebro e coração. Do inglês, Brain Heart Infusion (BHI). DO - Doxiciclina
E. coli - Escherichia coli
FTIR-ATR - Espectroscopia de infravermelho por reflectância atenuada total. Do inglês,
Fourier Transform Infrared Spectroscopy- Attenuated Total Reflectance.
MET - Microscopia Eletrônica de Transmissão NanoAg - Nanopartículas de prata
NanoAu - Nanopartículas de ouro
NIR - Espectroscopia no infravermelho próximo PVP - Polivinilpirrolidona
RPS - Ressonância de Plasmon de Superfície
S. aureus - Staphylococcus aureus
UV-Vis - Espectroscopia na Região do UV-Visível Van - Vancomicina
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 13 2 OBJETIVOS... 14 2.1 OBJETIVOS GERAIS ... 14 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 14 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 15 3.1 RESISTÊNCIA BACTERIANA ... 15
3.2 PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DAS BACTÉRIAS ... 16
3.2.1 Staphylococcus aureus... 17
3.3 NANOCIÊNCIA NO TRATAMENTO ANTIMICROBIANO ... 17
3.3.1 Nanopartículas metálicas ... 17
3.3.2 Métodos de obtenção de nanopartículas metálicas ... 18
3.3.3 Nanopartículas de prata e nanomedicina ... 19
3.4 COMBINAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA A FÁRMACOS ... 21
3.5 HICLATO DE DOXICICLINA ... 22 3.6 BIOESPECTROSCOPIA ... 22 3.6.1 Espectroscopia de Infravermelho ... 22 3.6.2 Análise multivariada... 23 4 METODOLOGIA EXPERIMENTAL ... 24 4.1 REAGENTES ... 24
4.2 SÍNTESE E COMBINAÇÃO DE NANOAg ... 24
4.2.1 Síntese de NanoAg via rota verde ... 24
4.2.2 Preparação do conjugado de nanopartículas de prata com hiclato de doxiciclina. ... 25
4.2.3 Preparação da amostra biológica ... 25
4.2.4 Tratamento quimiométrico ... 27
4.3 TÉCNICAS DE CARATERIZAÇÃO ... 27
4.3.1 Espectroscopia na Região do UV-Visível (UV-Vis)... 27
4.3.2 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ... 28 4.3.3 Espectroscopia de Infravermelho por Reflectância Total Atenuada (FTIR- ATR). 28
SUMÁRIO
5.1 SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE PRATA E DO
COMBINADO ... 29
5.1.1 Obtenção de nanopartículas de prata por uma rota ambientalmente correta. ... 29
5.2 COMBINAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA COM HICLATO DE DOXICILINA ... 36
5.3 DISCRIMINAÇÃO DE RESPOSTAS METABÓLICAS ... 38
5.3.1 Pré- tratamento ... 39
5.3.2 Análise de Componentes Principais – ACP ... 40
6 CONCLUSÃO ... 42
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1 INTRODUÇÃO
Uma das problemáticas que a área da saúde enfrenta é a resistência antibiótica adquirida pelas bactérias, o que tem requerido o advento de tratamento alternativos e eficazes com certa urgência (LIVERMORE, 2007; WRIGHT; SUTHERLAND, 2007). A prata tem sido utilizada para fins de controle e tratamento de infecções dada sua propriedade bactericida intrínseca, e algumas pesquisas mostram que nanopartículas de prata (NanoAg) são capazes de interagir com as células bacterianas (ABDI, 2013; KIM et al, 2007; ZHANG et al., 2008) de modo à suprimir sua proliferação ou causar morte. Dados da literatura mostram que a estratégia de associação de NanoAg a fármacos pode produzir um agente antimicrobiano mais potente (SUBBIAH et
al., 2010; ZAINAL et al., 2013, RANGHAR et al., 2014; SILVA et al., 2015), o que é bastante
interessante para a concepção de novos fármacos.
Em um trabalho anterior, nosso grupo mostrou que a simples adição de uma solução de doxiciclina (DO) às NanoAg provocou um efeito bacteriostático sinérgico contra Escherichia
coli (SILVA et al., 2015). Algumas pesquisas atribuem às NanoAg a capacidade causar
mudanças estruturais na membrana celular por meio da degradação de alguns de seus componentes químicos, o que facilitaria a penetração do fármaco no interior das bactérias (JUNG et al., 2008; MARAMBIO-JONES; HOEK, 2010).
Com base nestes conhecimentos, esta pesquisa foi desenvolvida com o intuito de compreender mais profundamente o efeito sinérgico existente entre o NanoAg e DO, além de obter o padrão de resposta metabólica da bactéria Staphylococcus aureus após ser tratada com NanoAg, DO e o combinado (NanoAg + DO). A técnica de FTIR-ATR é uma alternativa de baixo custo quando comparada a grande variedade de procedimentos, reagentes e técnicas que são empregadas para obter respostas metabólicas. Quando associada a métodos multivariados, como a Análise por Componentes Principais, FTIR-ATR pode auxiliar na investigação que o trabalho se propõe. Sendo assim, uma pesquisa relevante no estudo de alternativas de tratamento das doenças infecciosas promovida por bactérias, bem como promover conhecimento científico ao propor uma metodologia mais rápida comparada aos métodos usuais para observar o efeito de qualquer agente terapêutico e/ou tóxico quando em contato com as bactérias.
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2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
Combinar NanoAg ao hiclato de doxiciclina e avaliar, por meio da Análise por Componentes Principais (ACP), a resposta metabólica da bactéria Staphylococcus aureus após ser tratada com esse combinado.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
✓ Avaliar qual melhor lote de polivinilpirrolidona (PVP) a ser utilizado na síntese; ✓ Investigar o tempo de ajuste do pH;
✓ Sintetizar NanoAg por meio de uma rota verde; ✓ Combinar NanoAg ao hiclato de doxiciclina;
✓ Preparar amostra biológica e realizar o tratamento com NanoAg, DO e NanoAg + DO. ✓ Caracterizar as NanoAg e os combinados NanoAg-DO por meio das seguintes técnicas:
▪ Espectroscopia na região do UV-Visível; ▪ Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET).
✓ Obter espectros de Staphylococcus aureus tratada com NanoAg, DO e NanoAg + DO por FTIR-ATR.
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3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A seguir será apresentado algumas informações presentes na literatura que tem por finalidade fundamentar e promover conhecimento prévio acerca do estudo a ser realizado.
3.1 RESISTÊNCIA BACTERIANA
O sistema de saúde tem enfrentado a problemática da resistência bacteriana e diversas áreas da ciência, entre elas a química e as ciências biológicas, têm buscado alternativas de tratamento que sejam eficientes (WRIGHT; SUTHERLAND, 2007). Diz-se que a bactéria é resistente quando níveis terapêuticos da droga perde eficácia no processo de morte ou controle do seu crescimento (TENOVER; MCGOWAN, 1996). A ocorrência desse fenômeno pode ser atribuída ao uso indiscriminado de antibióticos, que contribui para o aparecimento de cepas bacterianas resistentes e multirresistentes. Isso tem estimulado consideravelmente a busca por drogas eficazes que combatam as doenças infecciosas promovidas pelas bactérias (MOTA et
al., 2005).
A resistência antibiótica é um processo natural e algumas bactérias são naturalmente resistentes a determinados antibióticos. Outras se tornam resistentes devido a uma mutação genética ou adquirindo resistência de outra bactéria ao receber elementos genéticos móveis como transposons e plasmídeos (WRIGHT; SUTHERLAND, 2007; DAVIES, J.; DAVIES, D., 2010; LEWIS; SHAN, 2017). Se novos tratamentos não forem descobertos para enfrentar as infecções promovidas por esses patógenos, as atuais opções clínicas serão limitadas no combate desse problema.
Para combater essa resistência é necessário compreender o processo evolutivo desse fenômeno e como os fármacos e os novos químicos com propriedades antimicrobianas impedem o desenvolvimento das bactérias. Os principais mecanismos de resistência antibiótica existentes são: (I) diminuição da entrada do composto na célula por meio da redução da permeabilidade da membrana ; (II) modificação do alvo do antibiótico; (III) desenvolvimento de uma via bioquímica resistente, que pode ser promovida por transferência genética; (IV) inativação dos medicamentos via alteração da sua composição química por enzimas específicas; (V) o efluxo, que trata-se da retirada dos antibióticos de dentro da célula (MADIGAN et al., 2004; WRIGHT; SUTHERLAND, 2007). É notório, portanto, que este fenômeno é preocupante devido a sua rapidez e fácil adaptação, podendo progredir facilmente por diversas vias mecanísticas.
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A
B
3.2 PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DAS BACTÉRIAS
Bactérias são organismos unicelulares de estrutura relativamente simples, diferentemente das células animais e vegetais. São classificadas como procariontes porque não possuem um núcleo típico, já que não há membrana nuclear delimitando o material genético. Sua reprodução é assexuada e não possuem as organelas que estão presentes nos seres eucariontes (MURRAY et al., 2009). Pode-se observar detalhadamente essas diferenças na Figura 1.
Figura 1 – Principais diferenças entre (A) eucariontes e (B) procariontes.
Fonte: Murray (2009).
Esses microrganismos podem ser patogênicos ou não, e são classificados de acordo com sua forma, tamanho, configuração (cocos, bastonetes, curvos ou espirilados) e coloração de Gram. O teste da coloração de Gram consiste na aplicação de dois tipos de corantes nas bactérias, o cristal violeta e a safranina. Como as bactérias gram-positivas possuem uma espessa camada de peptidoglicano, o corante cristal violeta fica retido nessa camada, fornecendo coloração violeta ou púrpura aos microrganismos. Já as gram-negativas, como possuem uma fina camada de peptidoglicano envolvida por uma membrana externa, retém apenas a safranina e adquire coloração vermelha ou rosa (MURRAY et al., 2009; TORTORA et al., 2012). As gram-positivas são morfologicamente mais simples quando comparadas as gram-negativas, sendo a S. aureus uma representante bastante comum a esse grupo.
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3.2.1 Staphylococcus aureus
S. aureus são cocos gram-positivos, classificados como cocos por possuir formato
arredondado e gram-positivos por apresentar coloração violeta no teste de Gram (Figura 2), como foi citado na seção anterior. Caracterizados como patógenos virulentos são capazes de provocar desde pequenas infecções na pele até graves infecções que podem levar a óbito. A sua ação patogênica pode causar pneumonia, endocardite, osteomielite, septicemia e entre outros. Este tipo de bactéria pode ser pode também ser encontrados no organismo de pessoas saudáveis, no ar, água, poeira e alimentos. Podem ser transmitidas de uma pessoa para outra, também por meio de alimentos provocando intoxicação alimentar e do compartilhamento de objetos infectados pela bactéria.
Com o desenvolvimento dos antibióticos acreditava-se ter encontrado uma solução para as infecções. Entretanto, estudos mostram que o S. aureus possui resistência a diversos antimicrobianos, o que tem estimulado novas pesquisas afim de solucionar essa problemática (SANTOS et al., 2007; CHUA et al., 2013; PAPADOPOULOS et al., 2017).
Figura 2 – Micrografia da Staphylococcus aureus colorizada artificialmente.
Fonte: www.objetoseducacionais2.mec.gov.br
3.3 NANOCIÊNCIA NO TRATAMENTO ANTIMICROBIANO
3.3.1 Nanopartículas metálicas
Nanopartículas metálicas têm atraído a atenção de pesquisadores de diversas áreas da ciência por apresentarem propriedades diferentes daquelas encontradas no material bulk. O interesse por essas diferentes propriedades tem levado a aplicação da nanociência em várias
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áreas como na confecção de sensores, em dispositivos fotovoltaicos, trabalhos dentários, catálise, entre outros (MELO JR. et al., 2012; THANH et al., 2014).
Um dos primeiros usos das nanopartículas foram na composição de vitrais medievais. Alguns possuíam NanoAg para conferir coloração amarela a matriz vítrea, já que a prata apresentava coloração amarela na sua forma nanométrica, e coloração cinza para a bulk. Essa característica é atribuída a Ressonância de Plasmon de Superfície (RPS), que é o fenômeno da oscilação coletiva dos elétrons de condução devido a excitação óptica promovida pela interação da onda eletromagnética (luz) com a matéria (LU et al., 2009). Observe a Figura 3.
Figura 3 – Esquema demonstrativo do fenômeno RPS em nanopartículas esféricas.
Fonte: Zhang (2008). Adaptada.
A oscilação coletiva dos elétrons promove a separação de cargas elétricas na partícula, o que seria o plasmon. Porém, o sistema tende a retornar ao seu estado inicial, onde os elétrons se encontram distribuídos uniformemente na partícula, gerando uma oscilação eletrônica própria. Quando a frequência de oscilação eletrônica coincide com a frequência da onda eletromagnética, tem-se a ressonância plasmônica. Esse efeito permite que as partículas sejam analisadas de forma simples e rápida por espectroscopia de UV-Vis, gerando uma banda plasmônica como resposta. Os diferentes comprimentos de onda e quantidade de bandas obtidas variam em função do metal, tamanho da partícula, ligante e forma (EUSTIS; EL-SAYED, 2005).
3.3.2 Métodos de obtenção de nanopartículas metálicas
Os principais métodos de obtenção de nanopartículas estão divididos em duas classes:
Top down e Bottom up. Refere-se à classe Top down quando as partículas nanométricas são
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método físico. Já a classe Bottom up refere-se aos métodos químicos, baseando-se em um sistema formado por um agente redutor, responsável pela redução do metal precursor e por um agente estabilizante (JU-NAM; LEAD, 2008; CAO; WANG, 2011).
Uma das vantagens da síntese por via química é que o método não envolve o uso de equipamentos de custo elevado quando comparadas com os métodos físicos, sendo então os mais empregados (FILHO; SERRA, 2015; XIONG; LU, 2015). No método químico o mecanismo de formação das nanopartículas envolve três etapas: redução do metal, nucleação e crescimento (SOLTANI et al., 2012).
O agente estabilizante é utilizado para evitar a agregação das partículas em solução. Isso ocorre porque as partículas nanométricas possuem alta energia superficial e tendem a desestabilização. Em algumas sínteses, o mesmo reagente consegue reduzir e estabilizar a partícula, como é o caso da rota clássica que envolve o borohidreto de sódio, NaBH4, (MELO
JR. et al., 2012).
Em função do crescente número de aplicações, pesquisadores tem investido em novas rotas de síntese, principalmente as que atendem o padrão voltado para química verde. A literatura aborda o uso de glicerol, açúcares, extratos de plantas e flores como agentes redutores e estabilizantes na síntese de nanopartículas (SAHOO et al., 2009; ANAND et al., 2017). Gasparotto et al. (2012) mostraram uma rota verde para as sínteses de nanopartículas de ouro (NanoAu). No presente trabalho esta rota será empregada, onde a síntese ocorrerá a temperatura ambiente e em meio básico; terá o nitrato de prata como metal precursor, o polímero polivinilpirrolidona (PVP) como agente estabilizante e o glicerol como agente redutor. Sendo possível observar o excelente papel do glicerol na redução dos íons prata (Ag+), mostrando uma alternativa economicamente mais viável quando comparado a outros agentes redutores.
3.3.3 Nanopartículas de prata e nanomedicina
As NanoAg esféricas em sua forma coloidal apresentam coloração amarela, conforme a Figura 4, e possuem uma banda de plasmon de superfície na região de 380-420 nm. Porém, outras bandas podem aparecer em maiores comprimentos de onda no espectro eletrônico de absorção (KAPOOR et al., 1998).
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Figura 4 – Solução coloidal de prata
Fonte: Autoria própria (2017).
Relatos na literatura mostram que a prata já tem sido aplicada com o intuito de tratar e controlar algumas infecções, além de alguns estudos mostrarem a sua capacidade de interação com as células bacterianas (KIM et al., 2007; ZHANG et al., 2008; ABDI, 2013). As NanoAg apresentam dois papéis de destaque: (I) como agente bacteriano e (II) e carreador de fármaco para o sistema drug delivery. Quanto a sua ação bacteriana, as NanoAg são eficazes frente a fungos, vírus e bactérias gram negativas e gram positivas, e a literatura mostra poucos casos relacionados ao desenvolvimento de resistência bacteriana (DASTJERDI; MONTAZER, 2010; MARAMBIO-JONES; HOEK, 2010).
Um aspecto bastante importante é que o mecanismo de ação das NanoAg não foi totalmente esclarecido. Algumas pesquisas relatam que a morte celular promovida pelas NanoAg pode está diretamente relacionada a interação existente entre os íons prata e o grupo tiol presente na membrana celular e DNA da bactéria. Além de outras possibilidades de alvos, como o fósforo, por exemplo, o que pode levar a inativação da síntese proteica. Outras propostas mostram que as NanoAg possuem a capacidade de produzir Ag+ e gerar espécies reativas de oxigênio, as quais afetam a permeabilidade da membrana e o DNA, impedindo o processo de replicação (FENG et al., 2000; MARAMBIO-JONES; HOEK, 2010). A fim de observar esse efeito, Jung (2008) realizou uma comparação da estrutura da S. aureus antes e depois de ser submetida ao tratamento com NanoAg. E por meio de imagens de MET foi mostrado consideráveis alterações morfológicas na S. aureus quando tratada com os íons prata, o que possivelmente está relacionada a morte celular.
Outra abordagem promissora de tratamento antimicrobiano apontado na literatura é a associação de nanopartículas a antibióticos (RAI, 2012).
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3.4 COMBINAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA A FÁRMACOS
Sabendo da atividade antimicrobiana da prata (KIM et al., 2007; HAJIPOUR et al., 2012), estudos foram desenvolvidos para que a exploração dessa propriedade tornasse cada vez mais eficiente e viável economicamente. A partir de então pesquisas apontaram que partículas de prata em escala nanométrica apresentavam propriedades distintas do material bulk, e o seu pequeno tamanho favorece a interação com outras substâncias, o que implica em um melhor desempenho contra os microrganismos. Com base nisso, iniciou-se a associação de NanoAg a outros materiais (RATYAKSHI; CHAUHAN, 2009).
Na década de 1940 é comercializado o primeiro antibiótico natural, a penicilina, descoberto acidentalmente por Alexander Fleming. Após este advento novos fármacos foram desenvolvidos, alguns pertencente a classe das penicilinas e outros a novas classes encontradas (HUGO; RUSSELL´S, 2007). Este avanço na medicina promoveu uma diminuição do uso dos compostos de prata neste tipo de abordagem (RAI et al., 2009). Entretanto, com o decorrer do uso dos antibióticos notou-se o aparecimento de microrganismos cada vez mais resistentes, o que estimulou novos estudos envolvendo NanoAg objetivando encontrar a solução para este problema.
Com o intuito de propor antimicrobianos cada vez mais potentes, relatos na literatura propõem a associação de nanopartículas a antibióticos. Hwang et al. (2012) combinou NanoAg com ampicilina, cloranfenicol e kanamicina e observou a inibição da resistência antimicrobiana de várias bactérias patogênicas. Os métodos mais empregados são a utilização do antibiótico como agente redutor e/ou como estabilizante na síntese de partículas e a observação da atividade microbiana em discos que contém antibiótico impregnados com nanopartículas (KORA; RASTOGI, 2013; HARI et al., 2013). Uma nova metodologia abordada pelo nosso grupo de pesquisa foi verter a solução de NanoAg ao antibiótico, o qual apresentou um papel benéfico do agente estabilizante na aplicação (SILVA et al., 2015). Jamaran e Zarif (2016) avaliaram a atividade da neomicina e gentamicina pelo método de difusão em disco, tanto para o antibiótico sozinho quanto para o combinado, verificando a existência de efeito sinérgico antibacteriano contra a S. aureus. Já Hur e Park (2016) utilizaram a Vancomicina como agente redutor e estabilizante na síntese de Vancomicina-NanoAu (Van-NanoAu) e Vancomicina-NanoAg (Van-NanoAg). Com a funcionalização notou-se um aumento na atividade antibacteriana contra a S. aureus resistente à Vancomicina, sendo as Van-NanoAg com maior potencial de atividade antibacteriana.
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3.5 HICLATO DE DOXICICLINA
O hiclato de doxiciclina é um antibiótico pertencente a classe das tetraciclinas e apresenta fórmula estrutural conforme apresentado na Figura 5. Foi em 1945 que Benjamin Duggar descobriu o primeiro componente da classe das tetraciclinas, a partir de então, outras moléculas foram desenvolvidas, entre elas o DO (DUGGAR, 1948). Uma de suas características é seu amplo espectro de ação frente a diversos patógenos e sua ação preventiva. Nas bactérias, sua ação aplica-se tanto para as gram-positivas quanto para as gram-negativas. (GRIFFIN et al., 2010).
Figura 5 – Fórmula estrutural do hiclato de doxiciclina.
Fonte: Autoria própria (2017).
As tetraciclinas atuam nas bactérias ligando-se a porção 30S do ribossoma, impedindo a síntese proteica (GRIFFIN et al., 2010). Sendo o DO, um dos fármacos mais utilizados dessa classe, possuindo uma aplicação na área da saúde humana, mas também no uso veterinário. O uso elevado e indiscriminado contribui na disseminação da resistência microbiana, promovendo o desenvolvimento de diversos trabalhos (VALENTÍN et al., 2009; LOLLAI et al., 2016).
3.6 BIOESPECTROSCOPIA
3.6.1 Espectroscopia de Infravermelho
Na literatura são abordados diversos trabalhos utilizando técnicas espectroscópicas na análise de amostras biológicas, a este campo da ciência denominamos bioespectroscopia. Blout
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e Mellors (1949), e Woernley (1952) foram os primeiros a utilizar espectroscopia na área biológica. Seus trabalhos destinavam-se a busca de indicadores de doenças (carcinoma de bexiga, carcinoma mamário humano, fibroadenoma mamário humano) por meio de espectros de infravermelho de tecidos, além de esfregaços de sangue leucêmico. Atualmente nosso grupo de pesquisa tem desenvolvidos alguns trabalhos abordando essa área. Santos et al. (2017) utilizou técnicas espectroscópicas, entre elas o FTIR-ATR, em estudos no campo da virologia. Outro trabalho realizado por Morais et al. (2017) mostrou um método alternativo de classificar os fungos de C. gattii e C. neoformans utilizando a espectroscopia FTIR-ATR aliada a aplicação de diferentes tipos de algoritmos. Marques (2015) foi a primeira a utilizar espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) junto a técnicas quimiométricas para classificar a bactéria P.
aeruginosa como espécies multiressistentes e sensíveis a todas as classes de agentes
antibacterianos testados.
3.6.2 Análise multivariada
A ciência moderna trabalha com dados que envolvem inúmeros fatores. No tratamento desses tipos de dados utilizam-se os conhecimentos da quimiometria, que trata-se da “ciência de relacionar as medidas de um sistema ou processo químico com o estado do sistema via aplicação de métodos matemáticos ou estatísticos” (IUPAC, 2016).
A análise multivariada é um campo da quimiometria que auxilia na análise de informações obtidas a partir dos resultados experimentais que envolvem muitas variáveis (NETO; MOITA, 1997). Como citado no tópico anterior, uma das aplicações frequentes é aliar dados de técnicas espectroscópicas à análise multivariada.
A classificação multivariada pode ser supervisionada e não supervisionada. Neste estudo será aplicado o método de classificação não supervisionado, onde o algoritmo possibilita a detecção de um padrão associado a uma classe baseado exclusivamente em um padrão de treinamento, assim agrupando com base na similaridade com esses dados de treinamento. Umas das técnicas mais conhecidas é Análise por Componentes Principais (ACP), do inglês, Principal
Component Analysis (PCA). Essa técnica permite a redução do número de dados
24
4 METODOLOGIA EXPERIMENTAL
Nesta seção será apresentada o procedimento experimental aplicado na realização deste trabalho.
4.1 REAGENTES
Os reagentes utilizados foram de grau analítico. Nitrato de prata (AgNO3),
polivinilpirrolidona (PVP; peso molecular = 10.000), glicerol, hidróxido de sódio (NaOH) e hiclato de doxicilina (≥ 98%) foram obtidos da Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA). Ácido clorídrico (HCl) da VETEC (Rio de Janeiro, BR). Caldo de infusão de cérebro e coração (Brain Heart Infusion Broth, HiMedia®, Mumbai, Índia). Ágar Triptona de Soja (Tryptic Soy Agar,
Kasvi, Itália). A cepa padrão de Staphylococcus aureus ATCC® 25923™ (Fundação Osvaldo
Cruz – RJ) foi cultivada em laboratório.
4.2 SÍNTESE E COMBINAÇÃO DE NANOAg
4.2.1 Síntese de NanoAg via rota verde
A vidraria passou por um processo de limpeza prévia, utilizando a solução KMnO4 +
NaOH e H2SO4 + H2O2, de acordo como descrito por Silva et al. Posteriormente, foram
preparadas as soluções estoques de AgNO3 10,0 mmol. L-1, PVP 100 g.L-1 e glicerol em
hidróxido de sódio, ambos na concentração de 1,0 mol. L-1. Na preparação de todas as soluções foi utilizada água ultrapura como solvente.
As NanoAg foram sintetizadas segundo a metodologia descrita por Gasparotto et al. (2012). Em um béquer denominado redutor foi adicionado uma solução de glicerol em hidróxido de sódio; em outro béquer, chamado reator, foi adicionado a solução de AgNO3 e
PVP, respectivamente. Logo em seguida, verte-se de uma só vez e rapidamente o redutor no reator. Após a mistura, a solução resultante adquire uma coloração amarela, o que indica a formação das nanopartículas de prata. Aguardam-se aproximadamente 25 minutos e ajusta-se o pH da solução para 7,0 com a adição de HCl. A solução de NanoAg obtida foi analisada por espectroscopia na região do UV-Visível (UV-Vis) após o ajuste do pH. O volume final da solução coloidal foi ajustado para 10mL, resultando em uma solução de concentração final 1 mmol. L1, contendo 10 g.L-1 do agente estabilizante.
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Para o ajuste de pH das sínteses foi utilizado o pHmetro KASVI (Curitiba, BR). Os espectros de absorção foram obtidos por meio do espectrofotômetro Ocean Optics RED TIDE USB-650 (Winter Park, USA), conectado ao computador para a gravação dos espectros. E um microscópio FEI Tecnai G2 Spirit BioTWIN operando em 120kV permitiu a aquisição das micrografias das partículas. O FTIR em modo ATR foi realizado com um espectrofotômetro Bruker Vertex 70.
4.2.2 Preparação do conjugado de nanopartículas de prata com hiclato de doxiciclina
Para etapa de conjugação é preparada uma solução estoque de DO, na concentração de 10 mmol. L-1, a qual será vertida à solução NanoAg, seguindo o método relatado por Silva et
al. (2015) como demonstrado na Figura 6. O volume de DO adicionado varia em função da
técnica de caracterização aplicada, para que contenha as concentrações desejadas de DO. Para a caracterização foram utilizadas todas as técnicas citadas na seção 4.2.1.
Figura 6– Esquema de obtenção das NanoAg e do combinado (NanoAg + DO).
Fonte: Autoria própria (2017). 4.2.3 Preparação da amostra biológica
No preparo da amostra biológica foi utilizada a cepa padrão de S. aureus ATCC® 25923™. A ativação das bactérias foi realizada transferindo 100 μL da amostra padrão em aproximadamente 5 mL de caldo de infusão de cérebro e coração, do inglês Brain Heart Infusion (BHI) por 24 h a 37 ºC, na estufa. Em seguida, as bactérias ativadas foram semeadas. O processo
26
consiste em inserir o swab na suspensão preparada e passá-lo de forma leve e rápida com movimentos horizontais da direita para a esquerda em outra placa de Petri contendo meio TSA, de modo a garantir uma semeadura uniforme. Sendo posteriormente incubadas por um período de 12 h a 37 ºC. Após, com uma alça bacteriológica retirou-se massa de colônias da superfície da placa e homogeneizou-se em solução salina estéril a 0,9 %. A quantidade retirada foi apenas o necessário para que a turbidez dessa solução apresentasse o mesmo padrão de turvação da solução padrão de MaCFarland a 0,5, resultando em aproximadamente 1x108 UFC.mL-1. Esse procedimento é baseado na percepção visual, que compara o padrão de turbidez entre a amostra e a solução padrão com o auxílio de um cartão com linhas horizontais.
Para a análise da resposta metabólica foi adicionado a placa Petri, com auxílio de uma micropipeta, as soluções de NanoAg (0,20 mmol.L-1), DO (200 g/mL) e NanoAg + DO (0,10
mmol.L-1 + 100 g/mL), de modo que superfície contendo colônias fosse recoberta. As placas
foram colocadas na estufa por 12 h a 37 ºC. Decorrido o tempo de incubação, foram retirados espectros de FTIR-ATR da massa de bactéria tratada e não tratada, conforme a Figura 7.
Figura 7– Esquema de ativação, semeadura e análise do efeito antimicrobiano.
27
O equipamento utilizado para a aquisição dos espectros de FTIR-ATR foi o Bruker VERTEX 70 FTIR spectrometer (Bruker Optics Ltd., Coventry, UK) contendo um elemento reflexivo interno de cristal de diamante a um ângulo de incidência de 45º do feixe de IR. Configurou-se o instrumento para realizar 16 scans com resolução espectral de 4 cm-1 para a referência e para a amostra. Em uma temperatura de 21 ºC foram coletados os espectros, em um total de 480, com 5 réplicas para cada uma das 96 amostras [(Controle (n=24), DO (n=24), NanoAg + DO (n=24) e NanoAg (n=24)]. O espectro de referência foi o ar e então, com uma alça metálica, a massa de bactéria foi removida e colocada no suporte do equipamento. Um pedaço de folha de alumínio foi colocado sobre a amostra para a retirada do espectro, conforme descrito por Cui et al. (2016). Cada medida foi intercalada com a limpeza do cristal com álcool (70% v / v) e toalhas de papel. Além da coleta de espectros para garantir que o cristal estivesse realmente limpo antes de prosseguir a análise.
4.2.4 Tratamento quimiométrico
As NanoAg, DO e NanoAg + DO foram aplicados em S. aureus e os espectros brutos de infravermelho das bactérias, antes e após contato com NanoAg, foram adquiridos, pré- processados e o modelo de classificação quimiométrica ACP foi obtido no software MATLAB R2014a (MathWorks, EUA). Os espectros brutos foram pré-processados selecionando a faixa de 1800 - 900 cm-1 (468 números de onda com resolução espectral de 4 cm-1) e centrados na
média. O modelo não supervisioado, ACP, foi construído com 96 amostras, sendo 24 amostras de cada classe: controle, DO, NanoAg + DO, NanoAg, usando 4 PCs, o que explicou 97,6% da variância total.
4.3 TÉCNICAS DE CARATERIZAÇÃO
A seguir se descreve as técnicas de caracterização que normalmente se emprega para analisar as NanoAg, o combinado e a amostra biológica em estudo.
4.3.1 Espectroscopia na Região do UV-Visível (UV-Vis)
A técnica de espectroscopia de UV-Vis consiste na absorção de radiação eletromagnética pelo material, na região de 190-800nm. Quando o material absorve a radiação, o mesmo passa para um estado eletrônico excitado, assim emitindo uma resposta dependente
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da concentração, do coeficiente de absorção molar da espécie absorvente e do caminho óptico. Essa resposta trata-se da quantidade de luz absorvida pela amostra, em função da luz transmitida (PAVIA, 2016). Esta técnica foi utilizada porque o sistema em estudo (NanoAg e combinado) absorve luz na região de UV-Vis em decorrência do fenômeno RPS.
4.3.2 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
A Microscopia Eletrônica de Transmissão tem como fundamento a passagem de um feixe de elétrons através da amostra, resultando no espalhamento de vários sinais. Como resposta, é gerada uma imagem denominada micrografia. A imagem contém regiões claras e escuras, formadas por elétrons pouco desviados e elétrons refratados, respectivamente (MANNHEIMER et al., 2002). É esta técnica que viabiliza a comprovação do formato das partículas e sua distribuição de tamanho.
4.3.3 Espectroscopia de Infravermelho por Reflectância Total Atenuada (FTIR-ATR)
Os espectrômetros de infravermelho são utilizados para análises de amostras sólidas, líquidas e gasosas, e tem como resposta a quantidade de luz refletida ou transmitida. Algumas amostras precisam ser previamente preparadas e dispersadas sobre uma matriz, sendo o brometo de potássio (KBr) a matriz mais empregada nessa técnica.
O modo em reflectância total atenuada (ATR) consiste no uso de um cristal com índice de refração maior do que o da amostra e baixa absorção no infravermelho (MCDONALD, 1986;
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5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
A seguir será apresentado os resultados da pesquisa realizada, bem como suas respectivas discussões, de modo a extrair as informações de interesse.
5.1 SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE PRATA E DO COMBINADO.
5.1.1 Obtenção de nanopartículas de prata por uma rota ambientalmente correta.
A síntese foi realizada baseada no método proposto por Gasparotto et al. (2012). Como citado anteriormente, o autor sintetizou NanoAu, utilizando íons ouro (Au3+) como metal precursor, glicerol em meio básico como redutor e o PVP como estabilizante. Para este estudo foram sintetizadas NanoAg, tendo os íons prata como precursor. A reação ocorreu em temperatura ambiente e em meio básico. A condição básica do meio reacional favoreceu a desprotonação do glicerol, gerando sua base conjugada, um alcóxido. Segundo o que é reportado no trabalho referenciado, a espécie gerada é a responsável pelo processo de redução do metal, como demonstrado no mecanismo descritivo da Figura 8.
Figura 8 – Sugestão de mecanismo generalístico do processo de redução dos íons prata pelo glicerol em básico.
Fonte: Autoria própria (2017).
O glicerol foi escolhido a fim de propor um processo “verde”, por tratar-se do uso de uma matéria-prima renovável. Uma de suas vias de obtenção é como subproduto do biodiesel, o qual tem sido produzido em larga escala, o que implica em um aumento exponencial de glicerol, podendo futuramente se tornar um excedente (QUISPE et al., 2013).
Alguns resultados do nosso grupo mostraram que o glicerol atuava apenas na redução, então foi-se necessário buscar um agente estabilizante. A técnica de estabilização é necessária
30
para fornecer proteção as partículas, de modo a evitar sua agregação e precipitação. O reagente escolhido foi o polímero PVP, devido a sua não toxicidade e propriedades estabilizantes (NAIR, 1998; GASPAROTTO et al., 2012). A estabilização das partículas pode acontecer de modo eletroestérico ou eletrostático. O agente estabilizante utilizado promove a estabilização por seu efeito eletroestérico. O polímero se encontra adsorvido na superfície da partícula, e sua parte liofílica interage com o solvente, o que conduz a um aumento da energia livre do sistema e forma uma barreira energética, a qual é responsável pela repulsão gerada entre as cadeias poliméricas e consequentemente entre as nanopartículas, assim evitando o crescimento descontrolado e agregação (COUTO, 2006; OLIVEIRA, M., 2005). Temos, portanto, que o PVP é o responsável por bloquear o processo conhecido como Amadurecimento de Ostwald, impedindo que as partículas unam-se umas às outras, aumentando seu tamanho e extrapolando o padrão nanométrico.
De modo geral, quando os primeiros átomos de prata são reduzidos inicia-se o processo de nucleação e crescimento das partículas; quanto maior a disponibilidade de Ag+, mais rápido
ocorre a nucleação e menor é tamanho final dessas partículas. Isto também está associado a capacidade de autocatálise das reações de redução apresentadas pelo metal precursor. Sendo portanto, uma característica intrínseca as condições de síntese (SHENASHEN et al., 2014). Baseado nisto, Silva et al. (2015) investigaram a influência nos parâmetros Ag+ e PVP no tamanho das nanopartículas de prata por meio de um planejamento experimental, mostrando que a variação dos parâmetros da síntese provocaria diferentes tamanhos de partículas.
Para a síntese deste trabalho foi necessário ajustar alguns parâmetros. Primeiramente foram feitos testes com PVPs provenientes de dois lotes distintos (PVP A – lote SLBF5858V; PVP B – lote SLBF9793V), com intuito de se investigar se haveria alguma diferença nos resultados, observando se ambos os reagentes possuíam a mesma resposta ou não, já que por tratar-se de um polímero, os mesmos podem não apresentar exatamente a mesma quantidade de moléculas constituintes. Para essa investigação foi realizado estudo cinético de ambos ensaios (Figura 9), o que permitiu analisar qual seria o melhor PVP a ser utilizado e o tempo ideal para ajuste do pH.
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Figura 9 - Estudo cinético da síntese de NanoAg, 1 mmol. L-1, por espectroscopia de UV-Vis: (A) PVP A;
(B) PVP B.
A
0,8 0,7 0,6 380 400 420Comprimento de onda / nm
1,0 5 min. 10 min. 15 min. 0,8 0,6 0,4 0,2 20 min. 25 min. 30 min. 35 min. 40 min. 45 min. 50 min. 55 min. 60 min. 300 350 400 450 500Comprimento de onda / nm
Fonte: Autoria própria (2017).
Abs
Ab
32
Fonte: Autoria própria (2017).
Para o observar a cinética da reação foi utilizada a técnica de UV-Vis, relacionando a intensidade das bandas com a concentração de partículas presentes no meio reacional. As sínteses foram acompanhadas por uma hora. O PVP A apresentou uma maior absorbância antes do primeiro decréscimo da banda, aos 25 minutos; e o PVP B aos 5 minutos. O aumento da absorbância aponta para a formação de nanopartículas, já diminuição da banda indica sua desestabilização, voltando para a forma inicial de Ag+. Como o PVP A apresentou uma
B
0,68 0,64 0,60 380 400 Comprimento de onda / nm 420 1,0 0,8 0,6 0,4 5 min. 10 min. 15 min. 20 min. 25 min. 30 min. 45 min. 50 min. 55 min. 60 min. 0,2 300 350 400 450 500Comprimento de onda / nm
A
b
s
Abs33
desestabilização mais tardia foi preferível utiliza-lo na síntese, assim fornecendo um maior intervalo de tempo para o ajuste de pH.
Após a escolha do PVP, determinou-se o tempo de ajuste do pH observando qual banda possuía maior absorbância antes do primeiro decréscimo. Portanto, notou-se que aos 30 minutos ocorria o primeiro decréscimo da banda; então procurou-se iniciar o processo de adição de ácido 25 minutos após a síntese, pois nesse intervalo de tempo garantia-se a presença de um maior número de partículas no meio.
Algo curioso, é que observando a parte maximizada da Figura 9A e B, percebe-se que a absorbância diminui, porém, volta a aumentar. Isto sugere que o PVP disponível no meio interage na formação das primeiras partículas, porém não consegue estabilizar todas, assim algumas voltam para a forma de Ag+, no entanto o glicerol e hidróxido que estão no meio reacional estimulam novamente a redução da prata, que por sua vez conseguem ser estabilizadas pelo PVP, assim resultando em um aumento da absorbância. Esse processo ocorre diversas vezes e aponta para uma ação gradual do PVP.
Outro fato importante, é o deslocamento da banda durante o processo de formação. A Figura 9A apresenta um afastamento para um maior comprimento de onda para os primeiros 15 minutos de reação, o que poderia implicar em tamanhos maiores de nanopartículas. Posteriormente, a banda é deslocada para um menor comprimento de onda, apontando para formação de partículas menores. Isso pode ser explicado pelo mecanismo de formação conhecido como envelhecimento digestivo que consiste no processo inverso do envelhecimento de Ostwald. De acordo com esta teoria, as partículas menores crescem às custas das maiores, pois ocorre uma redispersão das partículas maiores no meio, as quais irão interagir com o estabilizante e por sua vez, tem o crescimento de partículas menores (THANH et al., 2014).
Para uma melhor compreensão deste caso foi realizado o cálculo da largura à meia altura da banda (LMAB), conforme apresentado na Tabela 1. Por meio deste cálculo é possível observar e comparar o grau de dispersão do tamanho das nanopartículas (CHOWDHURY et al, 2016).
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Tabela 1 – Relação dos valores de LMAB para o PVP A.
Tempo (minutos) LMAB (nm)
5 84,82 10 84,83 15 81,52 20 74,11 25 69,68 30 72,28 35 72,18 40 71,94 45 71,36 50 70,93 55 77,49 60 70,56
Fonte: Autoria própria (2017).
Nos 15 primeiros minutos, onde a banda aparece mais deslocada para direita, apresenta maiores valores de LMAB, apontando para uma maior dispersão de tamanho. Após esse tempo, nota-se que com o deslocamento da banda para a esquerda acontece também a diminuição dos valores de LMAB, indicando uma menor dispersão de tamanho, ou seja, uma maior uniformidade.
Com os parâmetros determinados, realizou-se a síntese para o presente estudo; o primeiro indício da reação é a mudança de coloração, saindo da cor incolor do AgNO3 para a
formação de uma solução coloidal de coloração amarela (Figura 10A), como já esperado. Posteriormente, foi obtido o espectro de UV-Vis da solução, no qual é possível observar apenas uma banda intensa na região de 401 nm, conforme a Figura 10B. Esses resultados corroboram com o já descrito na literatura para NanoAg esféricas (SOLOMON et al., 2007).
35
Figura 10 - (A) Solução de NanoAg. (B) Espectro de UV-Vis das NanoAg.
Fonte: Autoria própria (2017).
As NanoAg apresentam diferentes colorações que variam de acordo com o tamanho da partícula. Para esta síntese (NanoAg 1 mmol.L-1) foi obtida uma coloração amarelo intenso como pode ser observado na Figura 10A, diferindo da forma bulk da prata que é cinza. Essas diferentes cores estão relacionadas com a concentração de átomos na superfície e pode ser explicado pelo efeito plasmon ressonante. Na Figura 10B, nota-se o aparecimento de uma banda na região do UV-Vis referente a oscilação coletiva dos elétrons de condução provocada pela excitação óptica após a interação da solução com a luz. A permanência da banda com decorrer do tempo revela que a concentração de 10 g.L-1 do PVP conseguiu estabilizar a partícula.
As nanopartículas podem apresentar diversificados formatos, como de esferas, cubos, tubos, prismas, octaedros e outros (ATTIA et al., 2015). E a partir do espectro pode-se inferir que as partículas são esféricas, pois apresenta uma única banda com máxima absorbância em uma região muito próxima a 400 nm, de acordo com o já descrito na literatura (WONGRAVEE
et al., 2013). E as demais formas de nanopartículas metálicas mostram um espectro mais
complexo, com o aparecimento de outras bandas.
Outra técnica utilizada para análise das NanoAg foi a MET. Seus resultados nos fornecem micrografias, as quais permitiram a observação da forma da partícula, do tamanho e o modo como estão distribuídas. Os resultados seguem na Figura 11.
1,0 Após ajuste de pH
B
A
0,8 0,6 0,4 0,2 300 350 400 450 500 Comprimento de onda / nm Abs36
Figura 11 - Micrografia e gráfico da distribuição de tamanho das NanoAg.
Fonte: Autoria própria (2017).
Com base na micrografia pode-se confirmar a hipótese citada anteriormente, comprovando a sua forma esférica. No histograma é possível observar a distribuição de tamanho para estas condições de síntese, apresentando um tamanho médio de 5,32 nm ± 1,02 nm.
5.2 COMBINAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA COM HICLATO DE DOXICILINA
Nesta etapa foi realizada a combinação das NanoAg, previamente sintetizadas, com DO, apenas vertendo uma solução na outra (Figura 12A) e em seguida obteve-se os espectros de UV-Vis da solução (Figura 12B).
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Figura 12 - (A) Solução do combinado de DO com NanoAg (B) Espectro de UV-Vis das NanoAg, DO e NanoAg
+ DO.
Fonte: Autoria própria (2017).
Para esta análise foi realizada uma comparação dos espectros de UV-Vis das soluções de NanoAg, DO e NanoAg + DO. Como já informado, as NanoAg apresentaram uma banda plasmônica em 401 nm e quando investigado para a DO houve a ocorrência de duas bandas de absorção notórias em 273 nm e 346 nm, absorção característica das tetraciclinas (CARLOTTI, 2012). Quando ambas soluções foram misturadas notou-se uma combinação das bandas, entretanto houve um deslocamento na segunda banda de DO (346 nm), a qual após a combinação apresentou-se em 355 nm. Esse deslocamento para região do vermelho deve-se ao efeito batocrômico, que trata-se do deslocamento de bandas de absorção para um maior comprimento de onda devido a efeitos de substituição ou do solvente. O espectro do fármaco apresenta pico de absorção correspondente principalmente a transição π → π * (SILVERSTEIN; WEBSTER, 1997; ABDULGHANI et al., 2013). O deslocamento ocorrido possivelmente está relacionado ao grupo carboxamida, apontando para a existência de uma possível interação entre o PVP e o DO por esse grupo, como foi inferido Silva et al. por meio da técnica de FTIR-ATR.
As micrografias de MET também foram obtidas para o combinado, como mostra a Figura 13. 1,2 355 nm
A
1,0 DO NanoAg NanoAg + DOB
346 nm 0,8 0,6 0,4 0,2 250 300 350 400 450 500 Comprimento de onda/ nm Abs38
Figura 13 - Micrografia e gráfico da distribuição de tamanho das NanoAg com adição de DO.
Fonte: Autoria própria (2017).
Com os resultados, é possível observar a permanência da forma esférica das nanopartículas e a mudança de seus tamanhos médios antes e após a adição de DO, onde antes da adição o tamanho médio era 5,32 nm ±1,02 nm e após tornou-se 4,32 nm ±1,02 nm. É possível afirmar em um nível de confiança de 95% que as médias são estatisticamente diferentes, entretanto visualmente não foi observado nenhuma alteração na solução coloidal, o que indica que a combinação com DO não provocou uma grande desestabilização, sendo o PVP responsável por essa resistência. Pode-se notar também que a adição de DO foi o fator que contribuiu para diminuição desse valor médio. E é importante destacar que a análise foi realizada após 30 dias da associação, assim apontando para um sistema mais estável que o proposto por Silva et al. (2015) que utilizaram 5,0 g L-1 como nível máximo da concentração de PVP.
5.3 DISCRIMINAÇÃO DE RESPOSTAS METABÓLICAS
A discriminação metabólica refere-se a diferenciação química dos metabólitos expressos por um organismo sob determinadas condições e tempo específico. O termo metabólitos remete-se a diversas moléculas pequenas constituintes de um organismo, tecido ou célula (ULRICH-MERZENICH et al., 2007).
39
Este estudo visa analisar a resposta metabólica da S. aureus após o tratamento com os NanoAg, DO e NanoAg + DO. Para realização deste processo houve um preparo prévio das amostras biológicas, onde a S. aureus foi ativada, semeada, incubada e os antimicrobianos foram aplicados. As massas de bactérias não tratadas (controle) e tratadas foram submetidas a análise espectroscópica para aquisição de espectros e no dataset gerado foi aplicado o ACP. O uso do FTIR-ATR associado a ferramenta quimiométrica é uma proposta inédita na inferência de respostas metabólicas frente a ação de agentes antibióticos, com destaque para NanoAg conjugado a antibióticos (HWANG et al., 2012; KORA; RASTOGI, 2013; WAN et al., 2016; DENG et al., 2016).
O interesse por este tema surgiu devido a uma pesquisa realizada em nosso grupo, onde o combinado (NanoAg + DO) provocou uma maior inibição no crescimento bacteriano da E.
coli quando comparado a aplicação de DO pura (SILVA et al., 2015). Com isso, surgiu o
interesse de se mostrar com auxílio da quimiometria a existência desse efeito sinérgico promovido pelo combinado.
Para uma primeira abordagem optou-se por trabalhar com um tipo de bactéria que apresentasse uma estrutura morfológica mais simples que a E. coli. Portanto, era preferível escolher alguma bactéria pertencente a classe das gram-positivas, sendo a S. aureus a escolhida. Para a aquisição dos espectros procurou-se construir um sistema que fosse o mais próximo da “idealidade” o tanto quanto possível. E para isso, a massa bactérias a serem analisadas foram retiradas diretamente da placa de petri, onde tinham sido cultivadas em meio ágar nutritivo. Foi preferível este tipo de metodologia em relação a análise de amostras aquosas a fim de se evitar a contribuição da banda referente a água, o que implicaria em um decaimento da intensidade das bandas de interesse referente a região de fingerprint (BAKER et al., 2014; DU et al., 2004). Obtido os espectros, foi aplicado um modelo de análise não supervisionada, o ACP, a fim de obter o padrão de resposta metabólica.
5.3.1 Pré- tratamento
Com auxílio do equipamento de FTIR-ATR foram coletados os espectros da massa de bactéria em um total de 96 amostras [(Controle (n=24), DO (n=24), NanoAg + DO (n=24) e NanoAg (n=24)], sendo cada um dos espectros o resultado da média de cinco análises. O conjunto de espectros obtidos foram cortados na região de interesse (900-1800 cm-1), denominada região de “bio-fingerprint”. Por meio do software MATLAB construiu-se um único gráfico com todos os espectros das amostras citadas acima (Figura 14).
40
Figura 14 – Média dos espectros referente a cada classe: controle, DO, NanoAg + DO e NanoAg.
Fonte: Autoria própria (2017).
Observando a Figura 14, é notória a semelhança entre os espectros, dificultando uma distinção visual entre as classes. Como apenas a abordagem qualitativa não é suficiente para detectar a região discriminante, então foi necessário o uso de ferramenta quimiométrica, ACP. Para aplicação dessa ferramenta, o conjunto de espectros recebeu um único pré- tratamento, onde os dados foram escalonados pelo método centrado na média, o qual atribui diferentes níveis de importância para cada variável. Esse método calcula o centroide da matriz de dados subtraindo cada elemento de cada coluna pela média, de acordo com a equação abaixo:
Xij = Xij- Xmj
Lê-se: o valor centrado na média para a variável j na amostra i é igual a diferença entre o valor da variável j na amostra i e a média dos valores das amostras na coluna j (BERG et al., 2006;
GEMPERLINE, 2006).
5.3.2 Análise de Componentes Principais – ACP
O gráfico de ACP irá mostrar a relação existente entre as variáveis, podendo distingui- las a partir da similaridade ou não similaridade entre elas; observando que aquelas com características semelhantes se agrupam.
Para aplicação do ACP é necessário realizar a técnica de normalização citada anteriormente, a fim de evitar amostras atípicas, denominados outliers. Por meio do gráfico da
41
Figura 15 é possível observar uma tendência na separação das classes estudadas. Os 4PCs explicaram 97,6% do total de variância dos dados.
Figura 15 – Escores de ACP dos espectros de FTIR-ATR das amostras das quatro classes.
Fonte: Autoria própria (2017).
O conjunto de espectros referentes bactérias tratadas com NanoAg + DO foi a classe que apresentou uma melhor separação ao longo da componente principal, sugerindo que o combinado promove um efeito sinérgico e não um simples somatório dos efeitos individuais de NanoAg e DO, assim comprovando que a conjugação das NanoAg à DO potencializa o seu efeito antimicrobiano, como previsto na literatura (OWENS, 2013; MORONES-RAMIREZ, 2013).
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6 CONCLUSÃO
Neste trabalho foi apresentada uma metodologia de combinação de NanoAg com DO para aplicação em ensaios biológicos. O PVP A – lote SLBF5858V foi o selecionado para síntese e o pH ajustado após 25minutos. As análises de MET e de UV-Vis evidenciaram que o esse sistema (NanoAg + DO), usando uma concentração de PVP duas vezes maior do que o reportado por Silva et al., foi mais estável. Esse processo de combinação promoveu uma alteração significativa no tamanho médio das partículas (p < 0,05), porém visualmente não foi observado nenhuma alteração no aspecto da solução coloidal, indicando que o PVP resistiu bem a adição do fármaco.
O passo seguinte visou entender mais profundamente o efeito sinérgico do combinado por meio da utilização da técnica (FTIR-ATR) aliada a ferramenta estatística de ACP, que mostrou-se eficiente na diferenciação das respostas metabólicas da bactéria S.aureus submetida aos três tipos de tratamento (DO, NanoAg e NanoAg + DO).
Sabendo dos efeitos promovidos pelos agentes antimicrobianos aplicados, futuros estudos podem propor rotas metabólicas de ação das NanoAg e do combinado, uma vez que esses mecanismos de ação ainda não foram totalmente esclarecidos.
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