Determinação do Polimorfismo de Seis STRs do Cromossomo X humano na população do Estado Pernambuco, Brasil

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(1)P r o g r a m a d e P ó s- Gr a d u a çã o e m Ge n é t i ca U n i v e r si d a d e Fe d e r a l d e P e r n a m b u co Ce n t r o d e Ci ê n c i a s Depart am ent o de. Bi o l ó g i ca s Ge n é t i ca. D E T E R M I N A ÇÃ O D O P O L I M O R F I S M O D E S EI S S T R S D O CR O M O S S O M O X H U M A N O N A P O P U L A ÇÃ O D O E S T A D O D E P ER N A M B U CO , B R A S I L. Vanessa Cavalcante da Silva. Recife, PE Abril, 2007.

(2) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Vanessa Cavalcante da Silva. D E T E R M I N A ÇÃ O D O P O L I M O R F I S M O D E S EI S S T R S D O CR O M O S S O M O X H U M A N O N A P O P U L A ÇÃ O D O E S T A D O D E P ER N A M B U CO , B R A S I L Dissertação apresentada ao Programa de PósGr a duçã o e m Ge né t ica da Unive r sida de Fe de r a l de Pe r n a m bu co, como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau de Mestre em Genética. Orientador: Profa. Dra. Rosilda dos Santos Silva, Dpto. Genética, Centro de Ciências Biológicas, UFPE. Recife, PE Abril, 2007. 1.

(3) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Silva, Vanessa Cavalcante da. Determinação do Polimorfismo de Seis STRs do Cromossomo X humano na população do Estado de Pernambuco, Brasil / Vanessa Cavalcante da Silva. – Recife: O Autor, 2007. 74 folhas: il., fig., tab. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Programa de Pós-Graduação em Genética. 2007.. Inclui bibliografia e anexos. 1. Cromossomo X. 2. STRs. 3. Pernambuco – População. 4. Polimorfismo Genético. I. Título.. 576.316 576.5. CDU (2.ed.) CDD (22.ed.). UFPE CCB – 2008-187. 2.

(4) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. 3.

(5) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Dedicatória. A DEUS, O maior geneticista de todos os tempos.. 4.

(6) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Agradecimentos Aos meus pais Vicente Ferreira da Silva Filho e Veralúcia Cavalcanti Aliança, pelo amor, carinho, incentivo e dedicação. A minha orientadora Profa. Dra. Rosilda dos Santos Silva, pela orientação, confiança e dedicação. A Adri (Adriana Vieira), pela amizade, coleguismo e por estar pronta a ajudar e a ensinar sempre que “impossível”. A Glorinha (Maria da Glória Raposo), pelo apoio técnico-científico e principalmente por sua amizade e descontração que me fizeram sorrir mesmo quando essa não era a minha intenção. A Mima (Jemima Eline), pelo apoio fundamental dado no início do mestrado. A Paulinha (Paula Braga), minha escravinha e mão direita, pelo suporte dado a fase laboratorial. A Simone, pelas extrações de DNA. A Douglas, pelo suporte técnico. A Carlos e a Alexandre, pela ajuda na estatística. A Janaína e a Dona Luzinete, pela amizade. A Daniel Benevides, pelo amor, amizade e presença especial. A Profa. Elizabete Malaquias Freitas, pelas sugestões pertinentes e pelo carinho. A todos que constituem o Programa de Pós Graduação em Genética, pela colaboração direta e indireta na minha formação. A Lobo, secretário do mestrado em Genética, por sua atenção. Ao Prof. Dr. Luiz Maurício da Silva, chefe do Laboratório de Genética Molecular Humana, pela utilização da infra-estrutura e apoio financeiro. A todos vocês, meu sincero agradecimento! “Todas as coisas passam, mas o amor permanece para sempre”. I Cor. 13.13.. 5.

(7) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. SU M ÁRI O. LISTA DE FIGURAS. 7. LISTA DE TABELAS. 8. LISTA DE ABREVIAÇÕES. 10. RESUMO. 11. 1. INTRODUÇÃO. 12. 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 14. 2.1. Breve história da origem da população brasileira 2.2. Microssatélites: dinâmica evolutiva e aplicações 2.3. O cromossomo X humano e suas STRs. 14 17 21. 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 27. 4. MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO. 35. Polimorfismo das X- STRs DXS7132, DXS8377, DXS6789, DXS101, DXS10011 e ARA na população de Pernambuco, Brasil 36 5 . ABSTRACT. 50. 6 . INFORMAÇÕES COMPLEMENTARES. 51. 7 . ANEXO. 62. Instruções para autores: Journal of Forensic Science. 61. 6.

(8) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. LI S T A D E F I GU R A S R E V I S Ã O B I B L I O G R Á F I CA Figura 1 - Ideograma da localização de X- STRs. 24. usadas em práticas forenses.. M A N U S CR I T O Figura 1. Dendrograma construído de acordo com o método UPGMA usando a distancia genética obtida das freqüências DXS6789,. alélicas DXS101. observadas e. DXS8377. nos de. locos. DXS7132,. pernambucanos,. portugueses, espanhóis e afro-americanos.. 45. 7.

(9) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. L I S T A D E T A B EL A S R E V I S Ã O B I B L I O G R Á F I CA Tabela 1. Distribuição dos contingentes imigratórios por período de entrada no Brasil.. 15. Ta be la 2 . Freqüências alélicas do loco DXS8377 em oito populações.. 19. Ta be la 3 . Principais informações referentes as X-STRs mais utilizadas em estudos populacionais e análises forenses.. 22. Ta be la 4 . Principais informações referentes as DXS7132, DXS6789, DXS8377, DXS101, DXS10011 e ARA.. 25. M A N U S CR I T O Ta be la 1 . Freqüências alélicas e parâmetros forenses das DXS7132, DXS6789, DXS101, ARA, DXS10011 e DXS8377 em amostra feminina da população de Pernambuco.. 43. Ta be la 2 . Freqüências alélicas e parâmetros forenses das DXS7132, DXS6789, DXS101, ARA, DXS10011 e DXS8377 em amostra masculina da população de Pernambuco.. 44. 8.

(10) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. I N F O R M A ÇÕ E S CO M P L E M E N T A R E S Tabela 1. Seqüências dos pares de primers utilizados para amplificação por PCR dos locos de STR do cromossomo X.. 52. Ta be la 2 . Freqüências genotípicas observadas no loco DXS7132 em amostra de 300 indivíduos do sexo feminino do estado de Pernambuco.. 53. Ta be la 3 . Freqüências genotípicas observadas no loco DXS6789 em amostra de 300 indivíduos do sexo feminino do estado de Pernambuco.. 54. Ta be la 4 . Freqüências genotípicas observadas no loco DXS101 em amostra de 300 indivíduos do sexo feminino do estado de Pernambuco.. 55. Tabela 5. Freqüências genotípicas observadas no loco ARA em amostra de 300 indivíduos do sexo feminino do estado de Pernambuco.. 56. Ta be la 6 . Freqüências genotípicas observadas no loco DXS10011 em amostra de 300 indivíduos do sexo feminino do estado de Pernambuco.. 57. Ta be la 7 . Freqüências genotípicas observadas no loco DXS8377 em amostra de 300 indivíduos do sexo feminino do Estado de Pernambuco.. 60. 9.

(11) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. L I S T A D E A B R E V I A ÇÕ E S STRs - Short Tandem Repeats- Repetições Curtas em Tandem; PCR - Polymerase Chain Reaction- Reação em Cadeia da Polimerase; Pb - Pares de base; Y- STRs - Repetições Curtas em Tandem do Cromossomo Y; X- STRs - Repetições Curtas em Tandem do Cromossomo X;. 10.

(12) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. R ES U M O As Seqüências Repetidas em Tandem (STRs) presentes nos cromossomos sexuais são ferramentas importantes na genética forense. As X-STRs são especialmente úteis em casos complexos de testes de paternidade e naqueles de identificação de sexo. Com o objetivo de caracterizar a população pernambucana quanto ao polimorfismo de seis X-STRs (DXS7132, DXS6789, DXS8377, DXS101, DXS10011 e ARA), foi analisado um total de 300 homens e 300 mulheres não aparentados. O teste para o desequilíbrio de ligação entre os locos na subamostra feminina não revelou evidência consistente de associação entre os marcadores (p>0,214) e a verificação da diversidade haplotípica, na subamostra masculina, revelou que todos os haplótipos foram únicos. A heterozigosidade variou de 0,743 (DXS7132) a 0,937 (DXS8377) e o poder de discriminação (PD) de 0,906 (DXS7132) a 0,993 (DXS10011). Com base no cálculo da distância genética a partir dos dados dos marcadores DXS7132, DXS8377, DXS6789 e DXS101, concluiu-se que a população. pernambucana. está. geneticamente. mais. próxima. da. portuguesa (0.022) e da espanhola (0.029) do que da afro-americana (0.036). O presente trabalho demonstra que estes marcadores genéticos são altamente discriminantes, e portanto, úteis em propósitos forenses e estudos populacionais. Palavras- chave: Cromossomo X; STRs; População de Pernambuco, Polimorfismo Genético.. 11.

(13) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. 1 . I N T R O D U ÇÃ O A síntese de DNA in vit ro foi realizada pela primeira vez por Arthur Kornberg e colaboradores em 1957. Entretanto, apenas em 1985 foi apresentada ao mundo científico a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase-PCR, que amplifica trechos pré-determinados do DNA. Com o advento desta tecnologia, os microssatélites ou STRs (Short Tandem tornaram-se. Repeats). os. mais. populares. marcadores. genéticos. estudados nos últimos anos. Os microssatélites são repetições de seqüências de DNA em tandem com unidades de repetição constituídas por dois a seis pares de nucleotídeos. São designados dinucleotídicos quando a unidade repetitiva tem apenas 2 pares de nucleotídeos, trinucleotídicos quando tem três pares e assim por diante. As STRs estão amplamente distribuídas em todo o genoma humano e são polimórficas em todas as populações estudadas. Estas características das STRs, aliadas ao fato de serem fragmentos de DNA de pequeno comprimento (<300pb) passíveis de amplificação mesmo quando. o. DNA. está. degradado. mendeliana tornaram-nas. e. marcadores. de. apresentarem. genéticos. muito. segregação úteis. em. diferentes áreas da biologia como: antropologia física, na elaboração de mapas gênicos, na análise da. estrutura genética de populações e em. genética forense (teste de paternidade, maternidade,. identificação de. indivíduos, etc.). A. grande. maioria. das. publicações. referentes. à. análise. do. polimorfismo de microssatélites envolve locos autossômicos. No entanto, em alguns casos em que é necessária a identificação do sexo ou em casos complexos de determinação de paternidade/maternidade, a análise de STRs de cromossomos sexuais (Y-STRs e X-STRs) é indispensável, principalmente pelo fato de serem transmitidos de pai para filhos e filhas. 12.

(14) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. como haplótipos, uma vez que nos homens quase não há recombinação meiótica entre estes cromossomos. Estas situações são relativamente comuns nas áreas de genética forense e antropologia física. De uma maneira geral, a literatura especializada tem relatado muito mais dados sobre o polimorfismo de Y-STRs do que de X-STRs. No entanto, nos últimos anos, as X-STRs têm sido estudadas e reconhecidas como ferramentas importantes em genética forense, especialmente em casos complexos de testes de paternidade onde a criança disputada é do sexo feminino. A utilização destes marcadores pode identificar se presumidas meias-irmãs têm o mesmo pai biológico ou confirmar a relação paterna avó-neta, sem que seja necessária a análise de seus pais pois, meias-irmãs partilham entre si e com suas avós paternas no mínimo um alelo em cada X-STR. O presente trabalho teve como objetivo geral analisar a estrutura genética da população do Estado de Pernambuco em relação ao polimorfismo de seis locos X-STRs e como objetivos específicos: a) Caracterizar a população do Estado de Pernambuco quanto ao grau. de. variabilidade. genética. das. X-STRs. DXS7132,. DXS6789,. DXS8377, DXS101, DXS10011 e ARA; b) Comparar a variabilidade dessas X-STRs encontrada em Pernambuco com a de outras populações, principalmente com a daquelas que contribuíram para a formação dessa população; c) Fornecer dados para validação dos testes de investigação de paternidade e identificação de indivíduos na população do Estado de Pernambuco.. 13.

(15) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. 2 . R E V I S Ã O B I B L I O G R Á F I CA 2.1. Breve história da origem da população brasileira Os primeiros povos a se propagarem pelo território, que mais tarde recebeu o nome de Brasil, foram os ameríndios (Couto, 1981). Os índios brasileiros pertencem aos grupos chamados paleoameríndios, que provavelmente descenderam de antigas raças da Ásia e da Oceania e teriam chegado às Américas pelo estreito de Behring ou pela navegação no Oceano Pacífico. A colonização do Brasil (processo de povoamento, exploração e dominação) realizada pelos portugueses se deu a partir do século XVI, após sua “descoberta” por Pedro Álvares Cabral. Até 1530, o movimento de portugueses para o Brasil foi relativamente pequeno, em torno de 25 mil, mas cresceu durante os cem anos seguintes devido, principalmente, ao rentável negócio do açúcar, atingindo número considerável no século XVIII (Silva, 2001). No Brasil, na Capitania de São Vicente, São Paulo, se comprova a existência de escravos negros oriundos do continente africano a partir de 1531.. Registros. históricos. estimam. que. no. país. haviam. aproximadamente 4 milhões de negros entre 1551 e 1850. Os negros africanos espalharam-se por todo o território brasileiro, em engenhos de açúcar, fazendas de criação, arraias de mineração, sítios extrativos, plantações de algodão, fazendas de café e áreas urbanas (Cavignac, 2003). Entre 1580 e 1640, durante a união de Portugal com a Espanha, a imigração caucasóide para o Brasil era limitada aos ibéricos. Porém, no final deste período, vieram os ingleses e os holandeses, dos quais um certo número se estabeleceu em terras brasileiras, após o término da invasão holandesa (Conceição, 1987). Do século XVI ao século XVIII, em aproximadamente 15 gerações, consolidou-se a estrutura genética da população brasileira, com o 14.

(16) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. intercruzamento de africanos, portugueses e índios (Ribeiro, 1995). Ainda no período colonial, franceses, holandeses e ingleses tentaram se estabelecer em território brasileiro e deixaram alguma contribuição étnica, embora restrita. As nacionalidades que mais contribuíram para a composição das correntes imigratórias a partir de 1850 foram, além da portuguesa, em ordem decrescente, a italiana, a espanhola, a alemã e a japonesa (Tabela 1). A maioria dos europeus não-portugueses se estabeleceu nas regiões Sul e Sudeste do país (Pena, 2000). Ta be la 1 . Distribuição dos contingentes imigratórios por período de entrada no Brasil. Período. Portugueses. Italianos. Espanhóis. Japoneses. Alemães. Totais. 1851-1885. 237.000. 128.000. 17.000. -. 59.000. 441.000. 1886-1900. 278.000. 911.000. 187.000. -. 23.000. 1.398.000. 1901-1915. 462.000. 323.000. 258.000. 14.000. 39.000. 1.096.000. 1916-1930. 365.000. 128.000. 118.000. 85.000. 81.000. 777.000. 1931-1945. 105.000. 19.000. 10.000. 88.000. 25.000. 247.000. 1946-1960. 285.000. 110.000. 104.000. 42.000. 23.000. 564.000. Totais. 1.732.000. 1.619.000. 694.000. 229.000. 250.000. 4.523.000. Fonte: Ribeiro, 1995. Em 1534, o Brasil foi dividido em quinze capitanias hereditárias, das quais apenas duas prosperaram: Pernambuco, doada a Duarte Coelho Pereira, e São Vicente (São Paulo), doada a Martim Afonso de Souza (Siebert, 1998). A prosperidade de Pernambuco, que teve início em 1535 com o cultivo da cana-de-açúcar e do algodão, atraiu grande número de europeus para a região. Quatro anos mais tarde, em 1539, chegaram os primeiros escravos africanos para suprir as necessidades de mão-de-obra da crescente produção açucareira, até então exercida apenas pelos nativos (Patriota, 2000).. 15.

(17) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Em virtude das riquezas e da partilha da América entre Portugal e Espanha, o Brasil foi alvo de contrabandistas, ataques e invasões. Em Pernambuco, os franceses destruíram a Feitoria Régia, erguida por Cristóvão Jacques junto ao porto, e construíram uma fortificação na Ilha de Itamaracá. O assentamento francês permaneceu de 1561 até 1567 (Souza, 1998). Entre 1630 e 1654, a região foi ocupada também pelos holandeses, que fizeram de Recife a capital de seu domínio brasileiro, durante 24 anos. A forte resistência dos portugueses e brasileiros de origem lusitana, africana e indígena, acabou resultando na expulsão dos holandeses (Andrade, 1987). Segundo os historiadores, durante o tempo de permanência dos portugueses, espanhóis e franceses em terras pernambucanas, houve intercruzamento desses colonizadores europeus com indígenas nativos e também com os negros de origem africana trazidos para esse território. Pesquisas realizadas com o polimorfismo apresentado por Y-STRs e do DNA mitocondrial com a população atual brasileira de diversas regiões indicam que esse intercruzamento ocorreu, em maior proporção, entre homens europeus e mulheres indígenas e/ou mulheres negras africanas (Pena, 2000). 16.

(18) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. 2.2. Microssatélites: dinâmica evolutiva e aplicações Os microssatélites ou STRs (Short Tandem Repeat s) apresentam repetições em tandem de seqüências curtas de DNA com apenas dois a seis pares de nucleotídeos. Estas seqüências por serem inativas, no aspecto transcricional, foram consideradas, por muito tempo, não funcionais e tratadas como DNA lixo. Hoje, sabe-se de seu envolvimento em diversas funções incluindo regulação gênica (Garcia et al., 2001), sinais para recombinação (Hiroshi et al., 2000) e replicação de telômeros (Blackburn, 2005). As STRs são altamente polimórficas e oferecem um significante grau de. discriminação. entre. os. indivíduos.. Esse. polimorfismo. é. predominantemente devido a mudanças no número de cópias da repetição principal que se acumularam em sucessivas gerações ao longo do processo evolutivo, provavelmente devido a elevadas taxas de mutação durante a replicação (Eisen, 2000). A taxa de mutação dos microssatélites varia de 10-6a 10-2 por geração e esse valor é significativamente mais alto que a taxa de mutação pontual que é da ordem 10-9 a 10-10. O mecanismo proposto para esta maior variabilidade dos microssatélites foi o slippage de DNA (Kruglyak et al, 1998). Nessa proposta, assume-se, que durante a replicação ocorra um deslizamento a. molde.. Se. entre. a. fita. DNA. nascente. e. este pareamento errôneo não for corrigido, uma das. moléculas do DNA apresentará alterações no número de repetições do microssatélite. Experimentos in vit ro têm demonstrado que o slippage de DNA ocorre com uma freqüência de uma mutação a cada cem eventos de replicação (Streisinger e Owen, 1985; Schloterer et. al, 1998). A. diferença entre a elevada taxa de mutação esperada, com base em experimentos in vit ro, e a taxa de mutação de microssatélites de 10-6 a 10-2, observada in vivo, pode ser explicada pela existência de sistema de. 17.

(19) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. reparo. Estudos revelam que sistemas funcionais de reparo reduzem a taxa de mutação entre 100 e 1000 vezes (Strand et al, 1993). A estimativa precisa da taxa de mutação é um pré-requisito para a confiabilidade de teste de paternidade e identificação humana que utilizam marcadores moleculares genéticos. Diversos fatores potenciais podem contribuir para as diferenças observadas na dinâmica evolutiva dos microssatélites: número de. repetições. (Wierdl. et. al.,. 1997). seqüência repetida (Weber e Wong, 1993; Chakraborty et al., 1997), seqüência flanqueadora (Glenn et al., 1996) e taxa de recombinação (Begun e Aquadro, 1992). O alto nível de variabilidade e a ampla dispersão no genoma humano, fazem das STRs uma fonte profícua de marcadores genéticos para estudos evolutivos e antropológicos (Drmic et al., 1998; Mauricioda-Silva et al., 2000; Cainé et al., 2005; Rodrigues et al., 2007), bem como úteis para identificação de indivíduos em ciência forense, teste de paternidade, predição de parentesco evolutivo e grau de diversidade genética das diferentes populações do mundo (Frégeau et al., 1998;; Bydlowski et al., 2003; Pereira et al., 2007). Recentemente, as STRs têm sido aplicadas também no monitoramento de transplante de medula óssea (Santana et al, 2004). A eficácia das STRs na caracterização genética de diversas populações se dá pela variabilidade das freqüências alélicas e pela presença ou ausência de determinados alelos nas diferentes populações. Por exemplo, o alelo 8 do loco TPOX (autossômico) e os alelos 23 e 24 do loco DYS390 são freqüentes em populações da Europa, Ásia, África, Oceania e América (Huang et al., 1995; Budowle et al., 1997; Pu et al., 1999; Pablo. et al.,2004; Alves et al., 2005; Rosa. et al., 2006). Por. outro lado, o alelo 6 do loco TPOX, o 7 do CSF1PO, o 20 do DYS390 e os alelos 14 e 15 do DYS392 são encontrados em populações africanas e estão ausentes em populações européias, ameríndias e asiáticas ( Garofano et al., 1998; Lins et al.,1998; Pu et al., 1999; Pérez-Lezaun et al.,2000). Em relação as X-STRs, a distribuição das freqüências alélicas. 18.

(20) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. do loco DXS8377, observada em oito populações diferentes (Tabela 2), mostra que doze alelos estão presentes nas oito populações (do alelo 43 ao 54), no entanto, o alelo 33 foi encontrado apenas na população da China e o alelo 59 só foi detectado na população da África (Toni et al., 2003; Chen et al., 2004; Tabbada et al., 2005; Poetch et al., 2005; Pereira et al., 2007; Gomes et al., 2007). Tabela 2. Freqüências alélicas do loco DXS8377 em oito populações Alelo. Alemã. Italiana. Espanhola. Portuguesa. Africana. 33. Japonesa. Filipina. 0.003. 37. 0.004. 38. 0.004. 39. Chinesa. 0.007. 40. 0.008. 0.012. 0.003. 0.002 0.003. 0.004. 0.003. 0.012. 0.017. 0.021. 0.012. 0.023. 0.009. 41. 0.016. 0.042. 0.017. 0.020. 0.008. 0.019. 42. 0.020. 0.071. 0.041. 0.040. 0.046. 0.031. 0.011. 43. 0.043. 0.071. 0.045. 0.029. 0.062. 0.082. 0.032. 0.029. 44. 0.075. 0.067. 0.055. 0.058. 0.069. 0.070. 0.032. 0.052. 45. 0.049. 0.088. 0.083. 0.043. 0.085. 0.135. 0.074. 0.064. 46. 0.089. 0.125. 0.107. 0.075. 0.085. 0.123. 0.137. 0.121. 47. 0.095. 0.133. 0.072. 0.098. 0.054. 0.126. 0.095. 0.104. 48. 0.098. 0.108. 0.086. 0.101. 0.085. 0.120. 0.116. 0.133. 49. 0.105. 0.096. 0.100. 0.124. 0.131. 0.089. 0.168. 0.104. 50. 0.108. 0.075. 0.121. 0.121. 0.046. 0.063. 0.126. 0.121. 51. 0.138. 0.046. 0.086. 0.115. 0.046. 0.065. 0.074. 0.064. 52. 0.062. 0.017. 0.045. 0.032. 0.054. 0.041. 0.042. 0.081. 53. 0.043. 0.017. 0.052. 0.052. 0.085. 0.012. 0.042. 0.041. 54. 0.016. 0.008. 0.031. 0.023. 0.039. 0.007. 0.021. 0.041. 55. 0.020. 0.004. 0.017. 0.014. 0.031. 0.021. 0.017. 56. 0.016. 0.004. 0.014. 0.017. 0.031. 0.003. 0.012. 0.008. 57 58 59. 0.006 0.011. 0.012. 0.008. Fonte: Poetch et al., 2005; Pereira et al., 2007; Gomes et al., 2007; Chen et al., 2004; Tabbada et al., 2005; Toni et al., 2003. 19.

(21) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Atualmente, as STRs autossômicas são os marcadores moleculares mais utilizados em identificação humana e teste de paternidade, devido ao seu alto poder de discriminação e fácil análise. Entretanto, em casos especiais, onde é necessária a identificação do sexo ou em casos complexos de investigação de paternidade/maternidade, a investigação de marcadores localizados nos cromossomos sexuais é indispensável (Quintana-Murci et al, 2001). As STRs do cromossomo X e Y são úteis porque são transmitidas de pai para filho (Y) ou para filha (X) como haplótipos. (conjunto. de. alelos. situados. no. mesmo. segmento. cromossômico que tendem a ser transmitidos em bloco na genealogia). A aplicação das Y-STRs e X-STRs como ferramentas é apropriada principalmente em genética forense porque todos os homens em uma linhagem parental compartilham o mesmo Y haplotípico e, por outro lado, os homens também transmitem o mesmo cromossomo X sem recombinação para todas as suas filhas. Desta forma, pode-se obter um maior poder de exclusão ou maior probabilidade de inclusão em casos de testes de paternidade por exemplo, pois dependendo do grau de polimorfismo dos. diferentes locos, os haplótipos têm freqüências tão. baixas que torna cada indivíduo quase único (Strachan e Read, 2002; Edelmann et al., 1999).. 20.

(22) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. 2.3. O cromossomo X humano e suas STRs As propriedades únicas do cromossomo X são conseqüências da evolução dos cromossomos sexuais nos mamíferos. Os cromossomos sexuais evoluíram de um par de autossomos nos últimos 300 milhões de anos (myr) (Ohno, 1967). Os elementos originais e funcionais foram conservados no cromossomo X, todavia, o cromossomo Y perdeu quase todos os traços do autossomo ancestral, incluindo os genes que foram outrora compartilhados com o cromossomo X. A hemizigosidade dos machos para quase todos os genes do cromossomo X expõe fenótipos recessivos, o que contribuiu para o conhecimento do grande número de doenças que têm sido associadas ao cromossomo X (OMIN). A conseqüência biológica da evolução dos cromossomos sexuais (nos seres humanos) é a principal razão do intenso interesse nos cromossomos X e Y humanos nas últimas décadas. O processo evolutivo dos. alossomos. resultou. em. modificações. da. estrutura. e. do. comportamento desses cromossomos que se refletem em diferenças de características como volume de repetições, taxa de mutação, quantidade de genes e estrutura haplotípica (Ross et al., 2005). O cromossomo X tem aproximadamente 155 Mb de comprimento e 56% de sua região eucromática é constituída por seqüências repetitivas, sendo este percentual maior do que a média do genoma que é de 45%. Até o momento, 153.146 SNPs (Single- nucleot ide polym orphism s) e 269 STRs foram descritas para o cromossomo X (Ross et al., 2005). Das 269 STRs para o cromossomo X apenas 26 X-STRs são utilizadas em estudos populacionais e análises forenses (Tabela 3). Os critérios. utilizados. para. a. seleção. das. 26. X-STRs. são:. a). alto. polimorfismo; b) alto poder de discriminação; c) apresentarem unidades de. repetição. aumentam. a. partir. de. três. nucleotídeos. (essas. características. as chances de sucesso na PCR) e d) a possibilidade de. constituírem sistemas de amplificação multiplex.. 21.

(23) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Tabela 3. Principais informações referentes as X-STRs mais utilizadas em estudos populacionais e análises forenses. Loco. N0. Tamanho. Unidade de. Localização. Alelo. (pb). Repetição. Citogenética. Referência. DXS 101. 17. 181-238. (CTT) n (ATT) n. Xq21. Szibor et al., 2003. DXS 981. 14. 209-238. (AGAT)n. Xq11.2 – 13.1. DXS 6789. 12. 154-198. (TATG)n (TATC)n. Xq22.3. DXS 6797. 8. 245-281. (ATCT) n. DXS 6800. 7. 194-218. (TAGA) n (GATA)n. DXS 6801. 8. 109-141. (ATCT) n. Xq21. DXS 6803. 7. 109-128. (TCTA) n. Xq12-Xq21.33. DXS 6804. 7. 173-201. DXS 6807. 8. 251-275. (GATA) n. Xpter-Xp22.2. DXS 6809. 12. 235-279. Xq21.33. DXS 6810. 7. 219-243. (CTAT) n (ATCT) n (TATC) n (CTGT) n (CTAT) n. DXS 7132. 9. 272-304. (TCTA) n. X Cenq11. Shin et al., 2005 Hering et al., 2001 Shin et al., 2005 Edelmann et al., 2002 Szibor et al., 2005 Son et al.,2002 Kang e Li, 2006 Poetsch et al., 2005 Szibor et al., 2005 Shin et al., 2005. DXS 7133. 8. 104-128. (ATAG) n. DXS 7423. 5. 181-197. (TCTA) n. Xq27-28. DXS 7424. 12. 147-180. (TAA) n. Xq21. DXS 8377. 25. 204-276. Xq28. DXS 8378. 7. 110-134. (AGA)x-(GGA-AGA)y(AGA)2-GGA-(AGA)6 (CTAT) n. DXS 9895. 19. 139-163. (AGAT) n. Xpter-Xp22.2. DXS 9898. 7. 188-215. DXS 9902. 7. 152-176. DXS 10011. 39. 131-287. Xq21.33. A: (GAAA)n GAAG GAAA (GGAA)4(AGAA)3 B: GAAA GA (GAAA)k GAGA GAAA)m GAAG GAAA (GGAA)4 (AGAA)3. Xq28. Szibor et al., 2003 Edelmann et al., 2002 Edelmann et al., 2002 Poetsch et al., 2005 Edelmann et al., 2002 Edelmann et al., 2002 Edelmann et al., 2002 Poetsch et al., 2005 Edelmann et al., 2001 Matsuki, 1999. 22.

(24) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Tabela 3. (continuação) Loco. N0. Tamanho. Unidade de. Localização. Alelo. (pb). Repetição. Citogenética. GATA172D05. 7. 108-132. (AGAT) n. GATA165B12. 6. 117-141. (AGAT) n. GATA31E08. 9. 240-260. ARA. 22. 260-366. (CAG) n. X Cenq13. HPRTB. 10. 279-307. (AGAT) n. Xq26. Referência Edelmann et al., 2002 Asamura et al., 2006 Shin et al., 2005 Edwards et al., 1992 Poetsch et al., 2005. A análise simultânea de STRs localizadas no mesmo cromossomo requer o conhecimento dos locos ligados e a ocorrência de desequilíbrio de ligação entre os mesmos. Alelos de locos ligados formam haplótipos que recombinam durante a meiose a uma freqüência correspondente a distância entre eles (distância genética), e o desequilíbrio de ligação refere-se a combinação não aleatória dos alelos de locos diferentes no cromossomo. No cromossomo X, em decorrência da recombinação ocorrer quase que exclusivamente na linhagem germinativa feminina, o desequilíbrio. de. ligação. entre. os. marcadores. diminui. mais. vagarosamente ao longo das gerações se comparado aos autossomos (Pereira et al, 2007). Foram descritos grupos de ligação para 17 locos de X-STRs utilizados. em. prática. forenses. (Figura1).. A. ordem. e. a. posição. aproximada das X-STRs no ideograma foram baseadas em informações do mapa do NCBI e suas distâncias em centi-Morgam (cM) foram calculadas dois a dois (pair-wise). Considerando os locos de STRs presentes. no. ideograma. apenas. os. locos. DXS101. e. DXS7424. apresentaram desequilíbrio de ligação (p<0.001). As seis STRs do cromossomo X, analisadas no presente trabalho, estão localizadas em dois grupos de ligação: grupo 2- DXS7132, ARA, DXS6789 e DXS101 e grupo 4- DXS8377 e DXS10011, ambos no braço longo do cromossomo X. As DXS7132 e ARA situam-se na região Peri-centromérica, as. 23.

(25) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. DXS8377 e DXS10011 na Xq28 e as DXS6789 e DXS101na região Xq21 (Szibor, et al., 2003).. Figur a 1 -. DXS6807 DXS9895 DXS8378 DXS9902. 5.9 cM 6.7 cM 10.0 cM 10.0 cM. DXS7132 ARA DXS6800 DXS9898 DXS6789 DXS101 DXS7424 DXS7133 GATA172D05. 4.5 cM 4.5 cM 10.9 cM 3.6cM 9.3 cM 6.7 cM 4.8 cM 3.9 cM 11.4 cM. HPRTB. 14.0 cM. DXS7423 DXS8377 DXS10011. 8.2 cM 8.2 cM. Grupo de ligação 1. Grupo de ligação 2. Grupo de ligação 3 Grupo de ligação 4. Ideograma da localização de X- STRs usadas em práticas forenses. (Szibor, et al., 2003). As principais informações relativas as seis X-STRs selecionadas para caracterizar a população de Pernambuco são descritas a seguir. As DXS8377, DXS101 e ARA apresentam a unidade de repetição trinucleotídica, entretanto, a composição do trinucletídeo varia na DXS8377 e DXS101 (unidade de repetição complexa). Das X-STRs com repetição tetranucleotídica apenas a DXS7132 não apresenta variação ao longo. das. unidades. de. repetição.. As. X-STRs. selecionadas. para. caracterizar a população pernambucana estão entre as 15 mais polimórficas utilizadas em estudos populacionais, sendo a DXS10011 a mais polimórfica com 39 alelos descritos e a DXS7132 a menos polimórfica com 9 alelos descritos (Tabela 4) (Edelmann et al., 2002; Poetsch et al., 2005; Hering et al., 2001; Allen e Belmont, 1993; Szibor et al., 2003; Edwards et al., 1992; Tilley et al., 1989; Hering et al., 2004; Matsuki, 1999). 24.

(26) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Tabela 4. Principais informações referentes as DXS7132, DXS6789, DXS8377, DXS101, DXS10011 e ARA. Loco DXS7132 DXS8377 DXS6789 DXS101 ARA DXS1001. Localização X Cenq11 Xq28 Xq21 Xq21 X Cenq13 Xq28. Unidade repetitiva (TCTA) n (AGA)x-(GGA-AGA)y-(AGA)2-GGA-(AGA)6 (TATC) (TATG)n (TATC)n (CTT) n (ATT) n (CAG) n A: (GAAA)n GAAG GAAA (GGAA)4(AGAA)3 B: GAAA GA (GAAA)k GAGA (GAAA)m GAAG GAAA (GGAA)4 (AGAA)3. N-o de alelos 9 25 12 15 22 39. pb 272-304 204-276 154-198 181-232 260-326 131-287. x,y,m e n correspondem ao número de vezes em que as estruturas entre parênteses se repetem.. Fonte: Edelmann et al., 2002; Poetsch et al., 2005; Hering et al., 2001; Allen e Belmont, 1993; Szibor et al., 2003; Edwards et al., 1992; Tilley et al., 1989; Hering et al., 2004; Matsuki, 1999.. Embora as freqüências alélicas das seis X-STRs variem de população para população, os alelos 13 e 14 do loco DXS7132, por exemplo, são os mais freqüentes em populações etnicamente tão diferentes quanto a tailandesa, coreana, africana, portuguesa e hispânica (Chen e Pu, 2004; Shin et al., 2005; Pereira et al, 2007). Esta variação também leva a discrepâncias entre as freqüências de um mesmo alelo em diferentes populações, como pode ser observado para o alelo 20 do loco DXS6789, cuja freqüência é de 0.0379 na população da China e 0.4352 na de Portugal. Um outro exemplo é dado pelo loco DXS101: os alelos. 14-18. encontrados. nas. populações. germânica,. italiana. e. portuguesa (Toni et al., 2003; Pereira et al., 2007) estão ausentes em populações asiática (Tabbada et al., 2004) . Em geral as STRs encontram-se dispersas por todo o genoma e se localizam fora dos genes expressos (Strachan e Read, 2002). No entanto, a X-STR ARA localiza-se no exon 1 do gene para o receptor de androgênio humano, X cenq13 e consiste em repetições do trinucleotídeo CAG (Edwards et al., 1992; Tilley et al., 1989). A redução das repetições CAG tem sido associada ao aumento do risco de câncer de próstata e de tumores dependentes de androgênio (Chamberlain et al., 1994; Choong 25.

(27) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. et al., 1996). Os androgênios são os principais hormônios sexuais masculinos,. responsáveis. pela. diferenciação. sexual. secundária,. espermatogênese, crescimento dos órgãos sexuais acessórios, incluindo a proliferação e diferenciação de células prostáticas. Os efeitos dos androgênios são mediados através da proteína receptora de androgênio, uma ligante ativadora do fator de transcrição nuclear. Baseados nestes fatos, Coetzee e Ross (1994) supõem que a variação na atividade transcricional do ARA, relacionada a repetições polimórficas CAG, influencie a carcinogênese prostática. Um estudo realizado por Mishra et al (2005) encontrou que indivíduos com repetições = 22 tem 2.9 vezes mais chance de desenvolver o câncer de próstata que indivíduos com repetições CAG maior que 22. Um risco 3.7 vezes maior foi descrito quando se compararam repetições CAG = 17 com repetições > 17. Esta associação é biologicamente plausível porque as repetições curtas impõem uma alta atividade de trans ativação no receptor e aumenta a afinidade de ligação a androgênios. Dezenove alelos foram descritos na população italiana para a XSTR ARA e estudos realizados nesta e em outras populações européias mostram que alelo o 21 é o mais freqüente (Pelotti et al., 2001).. 26.

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(36) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. 4. Manuscrito de Artigo Científico. 35.

(37) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. P o l i m o r f i sm o d a s X - S T R s D X S7 1 3 2 , D X S8 3 7 7 , D X S6 7 8 9 , D X S1 0 1 , D X S1 0 0 1 1 e A R A n a p o p u l a çã o d e P e r n a m b u co , B r a si l. Manuscrito a ser encaminhado à revista Journal of Forensic Science ISSN 0022-1198 PA, U.S.A. 36.

(38) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Polimorfismo das X- STRs DXS7132, DXS8377, DXS6789, DXS101, DXS10011 e ARA na população de Pernambuco, Brasil Vanessa Cavalcante da Silva, Adriana Vieira Gomes, Maria da Gloria Raposo, Paula Braga Ferreira, Luiz Maurício-da-Silva, Rosilda dos Santos Silva.. Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco. Endereço: Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Genética. Avenida Professor Morais Rego, s/n, Laboratório de Genética Molecular Humana, Cidade Universitária 50670-420-Recife, PE-Brasil. Telefone: (81) 21268512 Fax: (81) 21268512. 37.

(39) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Resumo. As Seqüências Repetidas em Tandem (STRs) presentes nos cromossomos sexuais são ferramentas importantes na genética forense. As X-STRs são especialmente úteis em casos complexos de testes de paternidade e naqueles de identificação de sexo. Com o objetivo de caracterizar a população pernambucana quanto ao polimorfismo. de. seis. X-STRs. (DXS7132,. DXS6789,. DXS8377,. DXS101, DXS10011 e ARA), foi analisado um total de 300 homens e 300 mulheres não aparentados. O teste para o desequilíbrio de ligação entre os locos na subamostra feminina não revelou evidência consistente de associação entre os marcadores (p>0,214) e a verificação da diversidade haplotípica, na subamostra masculina, revelou que todos os haplótipos foram únicos. A heterozigosidade variou de 0,743 (DXS7132) a 0,937 (DXS8377) e o poder de discriminação (PD) de 0,906 (DXS7132) a 0,993 (DXS10011). Com base no cálculo da distância genética a partir dos dados dos marcadores DXS7132, DXS8377, DXS6789 e DXS101, concluiu-se que a população pernambucana está geneticamente mais próxima da portuguesa (0.022) e da espanhola (0.029) do que da afro-americana (0.036). O presente trabalho demonstra que estes marcadores genéticos. são. altamente. discriminantes. e,. portanto,. úteis. em. propósitos forenses e estudos populacionais. Palavras- chave: Cromossomo X; STRs; População de Pernambuco, Polimorfismo Genético.. 38.

(40) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Introdução As STRs (Short tandem repeats) ou microssatélites contêm unidades de repetição que variam de 2-6 pb de comprimento, estão amplamente. distribuídos. no. genoma. humano,. apresentam. segregação mendeliana e geralmente mostram um alto grau de polimorfismo (grande número de alelos por loco, a maioria deles com freqüências inferiores a 1%) [1,2]. A grande maioria das publicações referentes à análise do polimorfismo de microssatélites envolve locos autossômicos, e estes são amplamente aplicados em análises de manchas presentes em cena de crimes, identificação molecular post m ort em e teste de paternidade [3,4]. Entretanto, em alguns casos especiais, por exemplo, onde o pai alegado não pode ser tipado, mas seus parentes podem ser investigados, ou quando se quer identificar se presumidas meias-irmãs têm o mesmo pai biológico, mas os pais não podem ser testados, a investigação de marcadores alossômicos pode ser mais informativa que a investigação de polimorfismos autossômicos [5, 6, 7] pois as fêmeas de uma mesma linhagem paterna compartilham o mesmo X. De uma maneira geral, a literatura especializada tem relatado muito mais dados sobre o polimorfismo de STRs do cromossomo Y do que do X. Dados de genética de populações para STRs do cromossomo X (X-STRs) são disponíveis em poucos grupos étnicos, embora o polimorfismo de muitos locos tenha sido publicado [7, 8]. Considerando o potencial das X-STRs em casos específicos de testes de paternidade e de análises forenses, e também o fato de que a distribuição alélica dos marcadores de DNA frequentemente diferem em populações separadas geograficamente, o objetivo do presente trabalho é criar um banco de dados referente às freqüências alélicas dos. locos. de. STRs. DXS7132,. DXS8377,. DXS6789,. DXS101,. DXS10011 e ARA, na população de Pernambuco, para validação dos. 39.

(41) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. testes de paternidade e propiciar estudos antropológicos uma vez que estamos analisando uma população miscigenada.. Materiais e métodos. Amostras e extração do DNA Amostras. sangüíneas. para. o. estudo. populacional. foram. coletadas de 300 homens e 300 mulheres não aparentados da população do Estado de Pernambuco. A extração de DNA das amostras de sangue total foi realizada pelo método m ini salt ing out com posterior digestão por proteinase K [9].. Amplificação por PCR e genotipagem A PCR foi realizada em 25µ L de reação contendo 30ng de DNA genômico, 1x PCR buffer, 1.5 mM de MgCl2, 200µ M de cada dNTP, 1U t aq polym erase (Invitrogen Life Techologies, Carlsbad, CA,USA) e 10 pmoles de cada primer para as DXS7132, DXS8377, DXS101, DXS10011, ARA e 6 pmoles para a DXS6789. A seqüência dos primers utilizados foram publicadas em estudos anteriores [10, 11, 12, 13, 14]. Das seis X-STRs investigadas, três (DXS7132, DXS8377, DXS6789) foram analisadas em sistema multiplex e as demais em sistemas monoplex. Foi usado o seguinte protocolo de PCR: uma desnaturação inicial de 12 min a 95 oC seguida por 30 ciclos de 1 min a 95 oC, 1 min a 62 oC para os sistemas monoplex e 62.5 oC para o triplex, 3 min a 72 oC, e uma extensão final de 30 min a 72 oC no termociclador MJ Research. Os produtos da PCR foram separados por eletroforese, em gel de poliacrilamida 5% desnaturante contendo uréia 7M e tampão TBE 1x, após serem submetidos a uma voltagem constante de 2000 V no seqüenciador manual Hoefer SQ3 Sequencer (Hoefer Pharmacia Biotech, São Francisco, CA). A revelação foi feita pelo método de impregnação com nitrato de prata [15] e a tipagem alélica foi baseada na comparação dos alelos com o controle K562. 40.

(42) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. (Promega, USA) como recomendado por Szibor et al [16], aliado ao uso de marcadores de tamanho de fragmento.. Análise estatística As freqüências alélicas, o PIC (Índice de informação do polimorfismo), a H. obs. (heterozigosidade observada), o PE (poder de. exclusão), e o PD (poder de discriminação) foram calculados pelo programa PowerStats V12 (http://www.promega.com/geneticidtools). O teste Markov para verificação do equilíbrio de Hardy-Weinberg (dados femininos), as freqüências haplotípicas e o desequilíbrio de ligação entre os locos estudados foram calculados usando o programa ARLEQUIN ver 3.1 [17], considerando significativo o valor de p menor que 0,05. A distância genética entre diferentes populações foi examinada usando o programa Dispan [18].. Resultados e discussão. As freqüências alélicas e parâmetros forenses calculados para as. seis. X-STRs. analisadas. na. amostra. feminina. e. masculina. encontram-se nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. O teste do quiquadrado mostrou que não houve diferença significante entre as freqüências alélicas de machos e fêmeas (p>0.9 em todos os locos) e a verificação do equilíbrio de Hardy-Weinberg realizado na amostra feminina indicou que a distribuição genotípica não desviou do equilíbrio em nenhum dos locos. Para cada loco, foram encontrados de nove a trinta e oito alelos, totalizando 114 alelos reunindo os seis marcadores estudados. Os locos DXS10011, DXS8377, DXS101 e ARA foram os mais polimórficos, apresentando 38, 20, 19 e 17 alelos, respectivamente.. 41.

(43) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Observamos que os alelos 18 (DXS10011), 58 (DXS8377), 10 (DXS7132) e 31 (DXS101) foram encontrados apenas na subamostra feminina. Embora o número de machos e fêmeas analisados tenha sido o mesmo, devemos considerar que, além do fato dos citados alelos serem raros (freqüências de 0,007, 0,002, 0,002 e 0,003, respectivamente, inferiores a 1%), a amostra feminina tem o dobro do número de alelos quando comparada a masculina que é hemizigota com relação ao cromossomo X, o que pode explicar o achado. O teste para o desequilíbrio de ligação entre os locos na subamostra feminina não revelou evidência consistente de associação entre os marcadores (p>0,214) e entre os 300 homens tipados, todos os haplótipos foram únicos (não compartilhados). Com base nos dados da subamostra feminina, a heterozigosidade observada nos locos (Hobs) variou de 0,743 (DXS7132) a 0,937 (DXS8377), o índice de informação do polimorfismo (PIC) de 0,73 (DXS7132) a 0,95 (DXS10011) e o poder de discriminação (PD) de 0,906 (DXS7132) a 0,993 (DXS10011). Esses dados atestam que os seis marcadores (PD conjunto= 0,999) são muito úteis na resolução de casos complexos de testes de paternidade. A partir dos dados disponíveis para os marcadores DXS7132, DXS8377, DXS6789 e DXS101 foi calculada a distância genética de Ney comparando pernambucanos, portugueses, espanhóis e afroamericanos [19, 20]. Analisando o dendrograma gerado com. base. nas freqüências alélicas desses quatro locos (Figura 1) concluímos que a população pernambucana está geneticamente mais próxima da portuguesa (0.022) e da espanhola (0.029) do que da afro-americana (0.036). Esses resultados corroboram outros estudos realizados na mesma. população. confirmam. a. com. marcadores. contribuição. genética. autossômicos da. população. [21,. 22]. européia. e na. miscigenada população pernambucana que apresenta, com base em inferências históricas, contribuições européia, africana e indígena.. 42.

(44) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Tabela 1. Freqüências alélicas e parâmetros forenses das DXS7132, DXS6789, DXS101, ARA, DXS10011 e DXS8377 em amostra feminina da população de Pernambuco. ALELOS DXS7132 DXS8377 DXS6789 DXS101 DXSARA ALELOS DXS10011 (n=600) (n=600) (n=600) (n=600) (n=600) (n=600) 10 0,002 17 0,002 11 0,012 18 0,007 12 0,117 22 0,003 13 0,275 0,007 23 0,007 14 0,319 0,003 0,008 0,015 24 0,005 15 0,198 0,102 0,018 0,012 25 0,012 16 0,055 0,062 0,007 0,028 26 0,010 17 0,015 0,007 0,008 0,052 27 0,020 18 0,007 0,005 0,048 0,087 28 0,022 19 0,065 0,048 0,108 29 0,028 20 0,322 0,047 0,110 29.2 0,022 21 0,258 0,062 0,152 30 0,007 22 0,128 0,045 0,100 30.2 0,010 23 0,043 0,053 0,090 31 0,017 24 0,005 0,174 0,100 31.2 0,023 25 0,138 0,067 32 0,030 26 0,132 0,035 32.2 0,028 27 0,122 0,017 33 0,042 28 0,050 0,012 33.2 0,030 29 0,025 0,008 34 0,015 30 0,012 34.2 0,022 31 0,003 35 0,028 37 0,008 35.2 0,018 40 0,015 36 0,070 41 0,028 37 0,065 42 0,033 38 0,073 43 0,060 39 0,063 44 0,055 40 0,060 45 0,062 41 0,077 46 0,095 42 0,062 47 0,110 43 0,040 48 0,122 44 0,032 49 0,100 45 0,017 50 0,117 46 0,013 51 0,070 47 0,012 52 0,040 48 0,002 53 0,023 49 0,003 54 0,023 50 0,003 55 0,022 56 0,008 57 0,007 58 0,002 P 0,053 0,952 0,240 0,727 0,520 0,050 H obs 0,743 0,937 0,770 0,857 0,897 0,850 PIC 0,73 0,91 0,77 0,89 0,90 0,95 PE 0,498 0,871 0,545 0,708 0,789 0,695 PD 0,906 0,986 0,929 0,980 0,981 0,993 p: Equilíbrio de Hardy-Weinberg para os dados femininos.. 43.

(45) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Tabela 2. Freqüências alélicas e parâmetros forenses das DXS7132, DXS6789, DXS101, ARA, DXS10011 e DXS8377 em amostra masculina da população de Pernambuco ALELOS 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 37 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 PIC PD. DXS7132 DXS8377 DXS6789 DXS101 DXSARA ALELOS DXS10011 (n=300) (n=300) (n=300) (n=300) (n=300) (n=300) 0,010 17 0,003 0,083 22 0,007 0,273 0,003 0,010 23 0,010 0,384 0,003 0,007 0,023 24 0,007 0,183 0,070 0,010 0,003 25 0,013 0,050 0,057 0,010 0,017 26 0,017 0,010 0,003 0,007 0,037 27 0,017 0,007 0,017 0,023 0,090 28 0,013 0,030 0,040 0,123 29 0,040 0,357 0,053 0,110 29.2 0,013 0,273 0,067 0,144 30 0,013 0,123 0,030 0,107 30.2 0,017 0,060 0,073 0,077 31 0,023 0,007 0,178 0,120 31.2 0,027 0,163 0,083 32 0,033 0,173 0,033 32.2 0,027 0,093 0,013 33 0,027 0,030 0,007 33.2 0,043 0,037 0,003 34 0,020 0,003 34.2 0,020 0,003 35 0,023 0,003 35.2 0,020 0,020 36 0,080 0,047 37 0,057 0,043 38 0,033 0,060 39 0,084 0,083 40 0,088 0,100 41 0,053 0,119 42 0,067 0,116 43 0,033 0,087 44 0,013 0,070 45 0,023 0,067 46 0,010 0,067 47 0,013 0,057 48 0,003 0,027 49 0,003 0,017 50 0,007 0,007 0,007 0,69 0,92 0,74 0,87 0,89 0,95 0,735 0,921 0,770 0,885 0,902 0,955. 44.

(46) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Figura 1 . Dendrograma construído de acordo com o método UPGMA usando a distância genética obtida a partir das freqüências alélicas observadas nos locos DXS7132, DXS6789, DXS101 e DXS8377 em pernambucanos, portugueses, espanhóis e em afro-americanos.. 45.

(47) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. Referências bibliográficas 1. kinjhodzic R, Kubat M, Skavic J. Bosnian population data for the 15 STR loci in the Power Plex 16 Kit. Int J Legal Med 2004; 118: 119121.. 2. Vaselinovic I, Kubat M, Furac I, Skavic J, Martinovic KI, Tasic M. Allele frequencies. of the. 15 AmpflSTR. Identifiler loci. in. the. population of Vojvodina Province, Serbia and Montenegro. Int J Legal Med 2004; 118:184-186.. 3. Deng Y,. Zhua B, Yu X, Lia Y, Fang J,. polymorphisms ethnic. of 15 STR. loci. of. Xion X et al. Genetic. Chinese Dongxiang and Salar. minority living in Qinghai Province of China. Legal Medicine. 2007; 9:38 -42.. 4.. Pereira. RW,. Monteiroa. EHG,. Hirschfel. GCR,. Wang. AY,. Grattapagliaa D. Haplotype diversity of 17 Y-chromosome STRs in Brazilians. Forensic Science International 2006; article in press.. 5. Huang D, Yang Q, Yu C, Yang R. Development tetrameric microsatellite for forensic. of. the. X-linked. markers HumDXS6803 and HumDXS9895. purpose. Forensic Sci Int 2003; 133:246-249.. 6. Tabbada KA, De Ungria MCA, Faustino LP, Athanasiadou D, Stradmann- Bellinghausen B, Schneider PM. Development of a pentaplex X-chromosomal short tandem repeat typing system and population genetic studies. Forensic Sci Int 2005; 154 (2-3):173-180. 46.

(48) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. 7. Shin SH, Yu JS, Park SW, Min GS, Chung KW. Genetic analysis of 18 X- linked short tandem repeat markers in Korean population. Forensic Sci Int 2005; 147 : 35-41.. 8. Poetsch M, Petersmann H, Repenning A, Lignitz E. Development of two systems with frequencies. in. X-chromosomal. STR. loci and their allele. a northeast German population. Forensic Science. International. Forensic Sci Int 155 (1):71-76.. 9. Miller SA, Dykes DD, Olesky HF. A simple salting-out procedure for extract. DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988;. 16: 1255.. 10. Edelmann J, Szibor R. DXS101: a highly polymorphic X-linked STR. Int J Legal Med 2001; 114: 301–304.. 11. Desmarais D, Zhong Y, Chakraborty R, Perreault C, Busque L. Development of a highly polymorphic marker for identity testing purposes at the human androgen. receptor gene (HUMARA). J. Forensic Sci 1998; 43: 1046–1049.. 12. Hering S, Brundirs N, Kuhlisch E, Edelmann J, Plate I, Benecke M et al. DXS10011:studies on structure, allele distribution in three populations and genetic linkage to further q-telomeric chromosome X markers, Int J Legal Med 2004; 118: 313–319.. 13. Edelmann J, Deichsel D, Hering S, Plate I, Szibor R. Sequence variation and DXS9895,. allele. nomenclature. DXS8378,. DXS7132,. for. the. X-linked. DXS6800,. STRs. DXS7133, 47.

(49) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. GATA172D05,DXS7423 andDXS8377. Forensic Sci Int 2002; 129: 99–103.. 14. Hering S, Kuhlisch E and Szibor R. Development of the Xlinked tetrameric microsatellite marker HumDXS6789 for forensic purposes. Forensic Sci Int 2001; 119: 42– 46.. 15. Bassam BJ, Caetano-Anolles G, Gresshoff PM. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem 1991; 196: 80-83.. 16. Szibor R, Edelmann J, Hering S, Plate I, Wittig H, Roewer L et al. Cell line DNA typing in forensic genetics–the necessity of reliable standards. Forensic Sci Int 2003; 138: 37–43.. 17. Excoffier, Laval LG, and Schneider S. Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online 2005; 1: 47-50.. 18. Ota T. DISPAN: Computer program for Genetic Distance and Phylogenetic. Analisis.. Institute. of. Molecular. and. Evolutionary. Genetics, Pennsylvania State University 1993.. 19. Gomes I, Prins M, Pereira R, Meyers C, Mikulasovich R, Amorim A et al. Genetic analysis of three US population groups using na Xchromosomal STR decaplex. Int J Legal Med. DOI 10.1007/s00414006-0146-2.. 48.

(50) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. 20. Pereira R, Amorim A, Gusmão L. Genetic diversity of 10 X chromosome STRs in northern Portugal, Int. J. Legal Med. DOI 10.1007/s00414-006-0144-4. 21. Nigam P, Dellalibera E, Maurício-da-Silva L, Donadi EA, Silva RS. Polymorphism of HLA class I genes in the Brazilian population from the Northeast State or Pernambuco corrobotates anthropological evidence of its origin. Tissue Antigens 2004; 64:204-209.. 22. Dellalibera E, Havro MLB, Souza M, Kajihara K, Mauricio-da-Silva L, Silva RS. Genetic analysis of 13 STR loci in the population from the State of Pernambuco, northeast Brazil. Forensic Sci Int 2004; 146:57-59.. 49.

(51) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. 5 . A B S T R A CT. The short tandem repeats (STRs) in sex chromosomes are important tools in forensic genetics. The STRs on the X chromosome (X-STRs) are particularly useful in complex cases of paternity tests and in those involving sex identification. The present study set out to genetically characterize. X-STRs. (DXS7132,. DXS6789,. DXS8377,. DXS101,. DXS10011 and ARA) in a population of 600 unrelated people in Pernambuco. Half this population was male and half female. The test for the linkage disequilibrium between the loci in the female subsample showed no consistent evidence of association between the markers (p> 0.214), while that for haplotypical diversity in the male subsample. showed. that. all. haplotypes. were. unique.. The. heterozygosity ranged from 0.743 (DXS7132) to 0.937 (DXS8377) and the power of discrimination (DP) from 0.906 (DXS7132) to 0.993 (DXS10011). Based on the calculation of the genetic distance of markers. DXS7132,. DXS8377,. DXS6789. and. DXS101,. it. was. concluded that the population of Pernambuco is genetically closer to the Portuguese (0.022) and Spanish (0.029) populations than to those of Afro-Americans (0.036). This study demonstrates that these genetic markers are highly discriminating and therefore useful for forensic. purposes. and. population. studies.. Keywords: X chromosome; STRs; Pernambuco population, Genetic Polymorphism.. 50.

(52) Silva, V.C.. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. 6 . Informações Complementares. 51.

(53) Silva, V.C.. Ta be la. Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil. 1.. Seqüências. dos. pares. de. primers. utilizados. para. amplificação por PCR dos locos de STR do cromossomo X. Loco de STR. DXS101 DXS10011 DXS8377 DXS6789. Seqüência dos Primers. Referência. Primer 1:5´-ACTCTAAATCAgTCCAAATATCT. Edelmann. Primer2: 5´- AAATCACTCCATggCACATgTAT. Szibor, 2001. Primer 1: 5´-CTgAgATTgCACCATTgCAC. Hering. Primer 2: 5´-TgggAgAACCgTTTgAAgTT. 2004. Primer 1: 5´- CACTTCATggCTTACCACAg. Edelmann et al.,. Primer 2: 5´-gACCTTTggAAAgCTAgTgT. 2002. Primer1: 5´-gTTggTACTTAATAAACCCTCTTT. Hering. Primer 2: 5´-AgAAgTTATTTgATgTCCTATTgT. 2001. et. e. al.,. et. al.,. Primer.2:5´-AATCAgTgCTTTCTgTACTATTCC. GDB. Primer 1: 5´-TCCAgAATCTgTTCCAgAgCgTgC. Desmarais. et. Primer 2: 5´-gCTgTgAAggTTgCTgTTCCTCAT. al., 1998. Primer 1: 5´- AgCCCATTTTCATAATAAATCC DXS7132. ARA. 52.