Fabiana Medeiros Boldrinia*; Adriana Aparecida Bosso Tomala; Magda Elisa Turini Cunhaa
Resumo
Realizou-se estudo de um método de coacervação das proteínas do soro de leite utilizando polissacarídeo, comparando pH e concentração do mesmo para melhor extração, utilizou-se 0,1 0,2 0,3% de concentração e 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 para pH, após o estudo, incorporou-se este coacervado em formulação de emulsões cosmética nas concentrações de 2,5 5,0 7,5 e 10% avaliando sua estabilidade. Obteve-se maior eficiência no método de coacervação em pH 3,0 e concentração 0,3% do polissacarídeo. As emulsões cosméticas se mostraram estáveis não apresentando alto índice de variação para as análises físico-químicas. Não houve presença de microorganismos patogênicos e o maior número de microorganismos viáveis totais foi de 12 UFC/g sendo o máximo permitido 5x103 UFC/g.
Palavras-chave: Carboximetilcelulose. Emulsão cosmética. Proteínas. Soro de leite. Abstract
We conducted a study of coacervation method of whey proteins using polysaccharide, pH and concentration compared to the same maximum extraction, we used 0.1 0.2 0.3% concentration and 2.5, 3.0, 3.5, to pH 4.0 after the study, the result of the coacervation method was incorporated in the formulization of cosmetic emulsions at concentrations of 7.5 and 5.2 5.0 10% evaluating their stability. The coacervation method was more efficient at pH 3.0 and 0.3% polysaccharide concentration. The cosmetic emulsions were stable and did not present high rate of variation for the physical-chemistry. There were no pathogenic microorganisms and the highest number of total viable microorganisms was 12 CFU / g being the maximum allowed 5x103 CFU / g.
Key-words: Carboxymethylcellulose. Cosmetic emulsion. Protein. Whey. 1 Introdução
O soro de queijo, também conhecido como soro de leite, é o efluente residual da elaboração do queijo. Pode ter variação na composição do soro dependendo da qualidade do leite utilizado e também do tipo de queijo produzido. A forma que é realizada a coagulação do leite também interfere na sua composição, pois existem dois processos de coagulação, um pela adição de ácido e o outro pela adição de coalho que constitui de enzimas bovinas (MADRID; CENZANO; VICENTE, 1995).
O soro pode gerar um grave problema com relação ao seu descarte no meio ambiente, em função da grande carga orgânica que está dissolvida no mesmo. Normalmente este problema ocorre em pequenas queijarias que por sua vez acabam por descartar o soro nos cursos d’água ou na rede de coleta de esgoto municipal sem qualquer tratamento prévio (MADRID; CENZANO; VICENTE, 1995).
Além do alto poder de poluição do soro o seu descarte é na verdade um desperdício de proteínas e outros nutrientes, uma vez que no soro está presente cerca de 55% dos nutrientes do leite (SISO, 1996).
Segundo Haraguchi, Abreu e Paula (2006) os compostos bioativos do soro de leite promovem benefícios a saúde humana, entre eles o efeito antioxidante.
São constantes os esforços para se aproveitar os resíduos agroindustriais em todo mundo. Neste em particular, o soro de leite, por sua alta produção, suas propriedades nutricionais e elevada capacidade poluente (SILVA; GOMEZ, 2000).
No soro de leite estão presentes cerca de oito tipos de proteínas, no qual 70 a 80% são alfa-lactoalbumina e beta-lactoglobulina e uma pequena parte de soro lactoferrinas, imunoglobulinas e glicomacropeptídeos (SALINAS, 2002).
As proteínas do soro de queijo possuem um alto valor biológico devido à presença de aminoácidos essenciais comparado a outros tipos de proteínas (HÁ; ZEMEL, 2003).
Levando em conta o fator aminoacídico, as proteínas de soro apresentam quase todos os aminoácidos essenciais, exceto pelos aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina) que não aparecem em excesso. As proteínas do soro apresentam elevadas concentrações de aminoácidos como, por exemplo, o triptofano, cisteína, leucina, isoleucina e lisina (SGARBIERI, 2004)
No soro de leite se encontram as proteínas mais completas que se conhecem, as mais importantes são: alfa-lactoalbumina, beta-lactoglobulina e lactoferrina esta última por sua vez apresenta forte atividade antibacteriana no desenvolvimento de fórmulas infantis, cosméticos, terapêuticos e soluções bucais (LIRA et al., 2009) .
Extração de Proteínas do Soro de Leite por Coacervação com Polissacarídeo e Sua Utilização
em Formulação Cosmética
Extraction of Whey Proteins Coacervation with Polysaccharides and Their Use in Cosmetic
Formulation
aUniversidade Norte do Paraná, PR, Brasil *E-mail: fabianaboldrini@hotmail.com
Todas as proteínas presentes no soro apresentam funcionalidades particulares. Assim, por exemplo, a Beta-lactoglobulina possui excelentes propriedades gelatinizantes; a alfa-lactalbumina tem capacidade de formação de espuma; e a lactoferrina apresenta propriedades bacteriostáticas, há ainda as propriedades funcionais das proteínas do soro de leite que merecem ser destacadas como: solubilidade, ligação ou retenção de água e emulsificação (ANTUNES, 2003).
Diversas técnicas têm sido desenvolvidas visando à recuperação das proteínas do soro de leite, uma das alternativas para a recuperação das proteínas do soro, seria a interação das mesmas com hidrocolóides que pode ser considerada uma alternativa limpa, pois não ocasiona aumento de agente poluente no meio ambiente (CAPITANI et al., 2006).
O carboximetilcelulose (CMC) pode ser utilizado para a recuperação das proteínas do soro de leite sendo que o mesmo é derivado de celulose produzido, via reação de Williamson, pelo tratamento de celulose com ácido monocloroacético em presença de excesso de hidróxido de sódio (FUJIMOTO; REIS; PETRI, 2001).
A recuperação das proteínas com CMC se dá pelo método de coacervação, com a variação do pH do meio e a concentração de CMC é possível realizar a precipitação das proteínas do soro (CAPITANI et al., 2006).
Esta técnica ocorre pela interação eletrostática entre as proteínas do soro e o polissacarídeo (CMC) em uma faixa de pH acima do valor da constante de ionização do polissacarídeo e abaixo do ponto isoelétrico das proteínas (CAPITANI et al., 2006).
De acordo com Elias et al. (2006) complexos de proteínas com polissacarídeos podem melhorar as propriedades emulsificantes, pelo fato de contribuir no espessamento de camadas aquosas de emulsões.
Emulsões são sistemas dispersos contendo duas fases líquidas imiscíveis, normalmente se caracteriza por uma fase oleosa e outra fase aquosa onde uma das fases é totalmente dispersa como gotículas na outra fase (ANSEL; ALLEN; POPOVICH, 2007; GENNARO, 2004)
As proteínas de soro podem atuar como agentes surfactantes, podendo então diminuir a tensão interfacial na interface óleo/água e assim formar um filme coesivo muito delgado em torno das gotículas de óleo. Desta forma as proteínas atuam como estabilizante de emulsão evitando a floculação e a coalescência (ANTUNES, 2003).
As emulsões são as formas farmacêuticas mais utilizadas para fórmulas hidratantes, uma vez que conseguem ultrapassar as barreiras superficiais da epiderme, carregando os ativos que irão recompor as estruturas higroscópicas da pele e manter a sua hidratação (SAMPAIO, 1996).
A hidratação da pele corresponde à sua capacidade de reter a água pelo estrato córneo (camada mais superior da pele), estando em torno de 10 a 30% em pele normalmente
hidratada. Quando o grau de hidratação do estrato córneo reduz-se chegando a menos de 10%, podemos dizer que a pele está clinicamente desidratada. A diminuição do grau de hidratação da pele é o resultante da evaporação da água presente no estrato córneo para o meio ambiente, o que pode acarretar a diminuição da sua capacidade protetora (KEDE; SABATOVICK, 2003).
Nas proteínas do soro de leite em geral, em sua conformação nativa concentram grande quantidade de água e se as mesmas passarem por tratamento térmico, suas moléculas se desenovelam e aumenta a capacidade de retenção de água (ANTUNES, 2003).
A lactoglobulina e a lactoalbumina em baixas concentrações são consideradas hidratantes potentes devido às suas características polares, possuem capacidade de adsorção e liga-se com a água na superfície da pele. A lactoglobulina é capaz de prender grande quantidade de ácidos graxos que contribui para o reforço da barreira cutânea evitando o excesso de evaporação de água. As proteínas do soro de leite formam também um filme elástico responsável por efeito de suavização na superfície da pele o chamado efeito cinderela (KINSELLA, 1984).
Tendo em vista esses fatores o trabalho possui o objetivo de extrair as proteínas do soro de leite pelo método de coacervação com CMC, fazer um estudo da concentração de CMC e pH ideal para se extrair maior quantidade de proteínas e incorporar esse complexo proteína/CMC em uma emulsão cosmética para pele, estudando sua estabilidade e analisando os parâmetros físico-químicos e microbiológicos desta emulsão.
2 Material e Métodos
2.1 Caracterização do soro de leite
O soro de leite foi fornecido pela fazenda experimental da Unopar de Tamarana - PR. O método de obtenção do mesmo foi pela produção do queijo minas frescal, sendo que soro estava in natura.
As análises realizadas no soro foram.
• Teor de proteínas utilizando o método de Kjeldahl; • PH utilizando-se pHmetro digital da marca Tecnolon
segundo INSTITUTO ADOLF LUTZ, 2005; e
• Teor de lactose utilizou-se o método de glicídios redutores em lactose segundo Instituto Adolf Lutz (2005).
2.2 Estudo da extração das proteínas
Foram realizados testes para definir a melhor concentração do polissacarídeo e melhor pH do meio, de modo a obter maior precipitação das proteínas segundo metodologia descrita em Capitani et al. ( 2004).
Quadro 1: Codificação das amostras
Códigos Concentração de CMC Variação do pH
P1.A 0,1% 2,5 P1.B 0,1% 3,0 P1.C 0,1% 3,5 P1.D 0,1% 4,0 P2.A 0,2% 2,5 P2.B 0,2% 3,0 P2.C 0,2% 3,5 P2.D 0,2% 4,0 P3.A 0,3% 2,5 P3.B 0,3% 3,0 P3.C 0,3% 3,5 P3.D 0,3% 4,0
Desenvolvimento das emulsões: Desenvolveu-se 4 emulsões com diferentes concentrações de proteínas. A emulsão utilizada foi O/A, que é a dispersão da fase oleosa com fase aquosa, utilizou-se cera alto emulsionante do tipo não-iônica, a preparação das emulsões se deu com o aquecimento das fases a 75 °C e a versão da fase aquosa na fase oleosa agitando manualmente para a incorporação da emulsão.
O complexo CMC/proteínas extraído pelo método de coacervação foi incorporado nas emulsões em concentrações de 2,5%, 5,0%, 7,5%, e 10%.
As emulsões foram codificadas da seguinte forma: E1= emulsão com 2,5% de CMC/proteínas. E2= emulsão com 5,0% de CMC/proteínas. E3= emulsão com 7,5% de CMC/proteínas. E4= emulsão com 10% de CMC/proteínas. 2.3 Estudo de estabilidade preliminar
O estudo de estabilidade preliminar consiste na realização do teste na fase inicial do desenvolvimento do produto e com duração reduzida. Emprega-se condições extremas de temperatura com o objetivo de acelerar possíveis reações, esse teste não tem como objetivo determinar a vida útil do produto (BRASIL, 2004).
Os parâmetros físico-químicos controlados foram análise macroscópica, teste de centrífuga, pH, condutividade elétrica e viscosidade (BRASIL, 2004).
Na parte microbiológica analisou-se a presença de microorganismos patogênicos como: Staphylococcus aureus, Salmonella SP, Escherichia coli, Pseudômonas aeruginosa e contagem de microorganismos viáveis totais (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988).
Todos os testes foram realizados 24 h após a preparação das emulsões, e após o término do ciclo gela-degela. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
3 Resultados e Discussão
A caracterização do soro foi realizada com o intuito de possuir um parâmetro de quantidade de proteínas inicial sendo que na tabela 1 pode-se verificar que o teor de proteínas, pH e a lactose no soro de leite foi alto se comparado com de Teixeira e Fonseca (2008) que foi de 0.8% para proteínas, 6,3 para o pH e 4,12 para lactose. Um dos fatores que pode justificar esta diferença seria o método de fabricação do queijo, pois dependendo do processo utilizado pode ocorrer alteração nos valores avaliados.
Tabela 1: Caracterização do soro de leite com relação ao teor de
proteínas total, lactose e pH
Componentes Média Resultados
Lactose % 4.62
Proteínas % 1.56
pH 6.84
O estudo da extração de proteínas total pelo método de coacervação com polissacarídeo CMC mostrou-se uma técnica eficiente de extração de proteínas total do soro de leite.
Segundo a análise estatística podemos observar na tabela 2 que as amostras com menor teor de proteínas no líquido residual foram: P1. A, P1. B, P1. C, P3. B e P3. C, não havendo diferença significativa entre as mesmas. Porém, percebeu-se a otimização do processo ao analisar a amostra P3. B (pH 3,0 e concentração 0,3%), constatando-se a alta compactação das proteínas, que facilitou a técnica utilizada. Capitani et al. (2004) obtiveram resultados próximos ao encontrado neste trabalho.
Tabela 2: Análise do teor de proteínas total no líquido residual
após a extração das proteínas. Aplicação da análise de Variância (ANOVA) e teste de Tukey ao nível de confiança de 95%
Tratamentos Média dos resultados
P1.A 0,014 e P1.B 0,017 e P1.C 0,016 e P1.D 0,089 c P2.A 0,12 b P2.B 0,16 a P2.C 0,089 c P2.D 0,095 c P3.A 0,028 d P3.B 0,009 e P3.C 0,015 e P3.D 0,039 d
Após a escolha da melhor amostra de extração das proteínas desenvolveram-se 4 emulsões em proporções citadas anteriormente.
Na análise de centrífuga, as 4 amostras de emulsões com diferentes concentrações de CMC/Proteínas mostraram-se estáveis não havendo indícios de floculação e coalescência, e macroscopicamente as emulsões mantiveram-se no seu estado normal do início ao fim do ciclo gela-degela, não havendo alterações físicas visíveis nas emulsões.
Tabela 3: Resultados da análise macroscópica e de centrifugação
nas emulsões antes e após o ciclo gela-degela
Amostras E1 E2 E3 E4 Macroscopia E1 E2 E3 E4 Centrifugação Antes N N N N N N N N Após N N N N N N N N
N= normal LN= levemente normal M= modificada
Segundo a análise estatística não houve diferença significativa entre as amostras das emulsões E1, E2, E3, E4, ficando dentro do parâmetro estipulado, que foi de 5% de variação, pois segundo Brasil (2008) a determinação de variação máxima para análises físico-químicas devem ser definidas pelo formulador.
Com relação aos valores de coeficiente de variação obtidos, podemos dizer que são muito baixos, contudo os valores de pH, mantiveram-se dentro da faixa ácida a neutra, o que é desejável em caso de formulações de produtos cosméticos. Tais variações de pH não contribuem para instabilidade das formulações, uma vez que evidências de instabilidade não foram detectadas através do aspecto macroscópico nem do teste de centrífuga.
Tabela 4: Valores de pH das emulsões na fase inicial e final do
ciclo gela degela. Aplicação da análise do teste de Tukey ao nível de confiança de 95%
Parâmetro Avaliado E1 E2 E3 E4
pH incial 6,45 b 6.45 b 6.46 b 6.46 b
pH final 6.50 a 6.52 a 6.50 a 6.51 a
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si
Sabe-se que a alteração na condutividade elétrica de sistemas dispersos pode ser indicativa de instabilidade. O aumento da condutividade pode estar relacionado com a coalescência; enquanto a diminuição, com a agregação (BRASIL, 2004).
Na tabela 5 a condutividade elétrica das emulsões E1, E2, E3 e E4, diferem estatisticamente entre si e também no início e final do ciclo gela-degela. Todas apresentaram pequeno aumento sendo que o maior coeficiente de variação foi de 0,75% na amostra E2, ficando abaixo do limite estipulado de
5% segundo ANVISA (BRASIL, 2008), porém as emulsões mostraram-se estáveis ao final das análises, não apresentando possíveis sinais de coalescência.
Tabela 5: Valores de condutividade elétrica das emulsões na fase
inicial e final do ciclo gela-degela. Aplicação da análise do teste de Tukey ao nível de confiança de 95%
Parâmetro Avaliado E1 E2 E3 E4
Cond. Inicial 0,078 h 0,104 f 0,125 d 0.144 c
Cond. Final 0,084 g 0,111e 0,162 b 0.176 a
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Na tabela 6 com relação à viscosidade as formulações de emulsões E1, E2, E3 e E4 não diferem estatisticamente entre si, tanto no início quanto no final do ciclo gela-degela para todas as rotações analisadas, porém das 4 rotações a de 6 rpm foi a que teve melhor valor deviscosidade.
Embora a determinação da viscosidade seja critério adequado na avaliação da estabilidade das emulsões, seu uso em estudos de estabilidade não está relacionado a valores absolutos de viscosidade, mas a alterações na viscosidade durante o ciclo gela-degela (SOUZA, 2007).
Analisando estatisticamente os valores de viscosidade em todas as rotações no início e no final do ciclo gela-degela observamos a diminuição nos valores de viscosidade para todas as formulações. O que já era esperado, uma vez que segundo Souza (2007), quase todas as emulsões apresentam alterações na viscosidade com o passar do tempo. Mas em nenhum dos casos foi detectado qualquer indício que pudesse caracterizar instabilidade nas formulações, mesmo porque o maior valor do coeficiente de variação entre o início e o final do ciclo gela-degelo foi de 0,96%, valor significativamente baixo.
Tabela 6: Valores de viscosidade em das emulsões na fase inicial
e final do ciclo gela-degela. Aplicação da análise do teste de Tukey ao nível de confiança de 95%
Rotações E1 E2 E3 E4 6 rpm inicial 945 a 945 a 944 a 945 a 6 rpm final 919 b 920 b 920 b 920 b 12 rpm inicial 472 c 472 c 472 c 472 c 12 rpm final 421 d 421 d 420 d 420 d 30 rpm inicial 182 e 182 e 182 e 182 e 30 rpm final 162 f 163 f 162 f 162 f 60 rpm inicial 92 g 92 g 92 g 92 g 60 rpm final 83 h 83 h 83 h 84 h
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Na tabela 7 podemos verificar que todas as formulações de emulsões estiveram ausentes de microorganismos patogênicos tanto no início quanto no final do ciclo gela-degela, o que é
essencial para produtos cosméticos, pois os mesmos entram diretamente em contato com a pele.
Sabe-se também que microorganismos patogênicos como Staphylococcus aureus podem causar eritemas, descamações na pele ficando esta mais suscetível a outros invasores, sendo que os outros patogênicos analisados podem causar doenças gastrintestinais, pulmonares e outras. Por esses motivos não se deve entrar em contato diretamente com a pele humana. Tabela 7: Resultados da análise microbiológica de
microorganismos patogênicos em 5g de amostra das emulsões antes e após o ciclo gela-degela
Amostras Pseudômonas aeruginosa Staphylococcus aureus Salmonella sp Escherichia coli Inic. Fin. Inic. Fin. Inic. Fin. Inic. Fin. E1 A A A A A A A A E2 A A A A A A A A E3 A A A A A A A A E4 A A A A A A A A A = AUSENTE P = PRESENTE, segundo Farmacopéia Brasileira (1988), não podem haver presença dos microorganismo patogênicos em 5g de amostra em emulsões cosméticas.
Os resultados obtidos para microorganismos viáveis total ficaram dentro dos parâmetros estipulados pela Farmacopéia Brasileira (1988), que é de no máximo 5x103 UFC/g para emulsões cosméticas. Na tabela 8 pode-se observar que o maior número de microorganismos contados foi de 12 UFC/g para a amostra E3, isso no final do ciclo gela-degela. Verificou-se também que não houve aumento significativo de bactérias e fungos nas emulsões, podendo-se afirmar que o sistema de conservantes das emulsões se mostrou eficiente, pois não houve maior crescimento de microorganismo durante o tempo de análise.
Tabela 8: Resultados da contagem de microorganismos viáveis
totais em 1g de amostra das emulsões
Amostras Quant. inicial Quant. final Farmacopéia Brasileira (1988)Limites máx. permitidos pela E1 3 UFC/g 4 UFC/g 5 x 103 UFC/g E2 3 UFC/g 3 UFC/g 5 x 103 UFC/g E3 6 UFC/g 12 UFC/g 5 x 103 UFC/g E4 3 UFC/g 5 UFC/g 5 x 103 UFC/g
4 Conclusão
O estudo concluiu que o método de extração de proteínas do soro de leite por processo de coacervação com polissacarídeo CMC é eficiente, pois remove uma quantidade significativamente alta de proteínas do soro. Verificou-se que a variação de pH e a concentração de CMC é fator importante neste método de extração, pois o mesmo
influenciou na quantidade de proteínas precipitadas e também na compactação das mesmas, por este motivo otimizou-se o processo pela amostra P3.B.
Com relação à estabilidade das emulsões cosméticas hidratantes contendo o coacervado proteína/CMC obteve-se resultados satisfatórios tanto nos parâmetros físico-químicos quanto no microbiológico, pois para ambos as emulsões cosméticas mantiveram-se com estabilidade preliminar dentro dos parâmetros estipulados, sendo que todas as concentrações utilizadas podem ser aplicadas nas emulsões, não havendo instabilidades nas mesmas.
Desta forma, pode-se afirmar que a utilização do coacervado de proteínas/CMC para fins cosméticos é uma alternativa viável para o reaproveitamento de efluentes das indústrias de laticínios.
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