"EGFR, e Lesões Displásticas do Colo do Útero".

Alice Manuela Santos Alves

EGFR,

HPV

L

D

C

Ú

Dissertação de Candidatura ao grau de

Mestre em Oncologia, submetida ao Instituto

de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da

Universidade do Porto.

Orientador

– Prof. Doutor Rui Manuel de

Medeiros Melo Silva

Categoria – Prof. Associado convidado

Afiliação

– Instituto de Ciências Biomédicas

Abel Salazar da Universidade do Porto.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos que directa ou indirectamente contribuíram para a realização deste trabalho, indispensável para o crescimento do meu conhecimento científico. Ao Prof. Doutor Rui Medeiros, meu orientador neste trabalho, pela oportunidade, orientação, conhecimentos transmitidos e disponibilidade demonstrada em todo o desenvolvimento desta tese.

Quero também agradecer ao Laboratório de Anatomia Patológica Dr.Albino Oliveira, e ao meu chefe, Dr. Albino Oliveira pela disponibilidade dos meios necessários no serviço para a realização deste trabalho. Quero agradecer também a oportunidadede frequentar este mestrado que contribuiu para o meu crescimento pessoal e curricular. Ao Dr. Horácio Scigliano, por toda a disponibilidade, ajuda, pelas indispensáveis sugestões que contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho de investigação.

A toda a comissão coordenadora do Curso de Mestrado em Oncologia, assim como a todos os docentes deste mestrado, pelo empenho demonstrado e excelente modo de transmissão dos conhecimentos científicos. Às minhas amigas e companheiras de laboratório, agradeço a ajuda, a força, a paciência, a simpatia, o respeito e o bom ambiente de trabalho. Em especial, à Sandra e à Joana pela disponibilidade e ajuda no laboratório de imunohistoquímica. E à Margarida pela falta de atenção que lhe “roubei”. À Estela, Paula, Ana, Sofia e Marta obrigada pelo incentivo, coragem, carinho e amizade que desde sempre demonstraram. Obrigada “meninas do LAO”!

À Jani Silva e à Joana Mendes obrigada pela atenção, tempo e valiosas observações neste estudo, à Judite pelo companheirismo, pelas ajudas espontâneas, pela presença e coragem que transmite. À Liliana, à Rita, à Estela Teixeira, à Cristina e à Elsa pelo companheirismo, pelo carinho e amizade que se reforçou nestes períodos. À Sara Ricardo, à Soledad Almeida ao Ricardo Correia, e ao Sr. Fernando pelo contributo indispensável de sugestões e material laboratorial.

Ao Joaquim pela incansável partilha e ajuda nesta tese, sem a tua disponibilidade teria sido muito mais difícil, um obrigada muito sincero e especial.

Finalmente, uma palavra aos meus pais, à minha irmã e ao João por se esforçarem inesgotavelmente para me proporcionar uma vida melhor…Obrigada pelo amor, valores, educação, apoio, coragem, paciência…enfim…Não posso deixar de referir o vosso exemplo, que mesmo nos piores dias, que tudo parece escuro, com uma força de vontade extraordinária e trabalho honesto, tudo se consegue… Não há dias maus, há dias menos bons!

RESUMO

O Cancro do Colo do Útero (CCU) é uma das neoplasias mais frequente a nível mundial. A presença da infecção pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV

)

Nesta patologia, o diagnóstico precoce das lesões pré-neoplásicas, é essencial para um melhor prognóstico. Neste sentido, as técnicas de imunohistoquímica são cada vez mais utilizadas como método auxiliar de diagnóstico no CCU. Ao disponibilizar marcadores biológicos de detecção, esta técnica contribui para o aumento da sensibilidade do rastreio cervico-vaginal, definindo critérios mais precisos que os actualmente utilizados.

Assim, sabendo que o HPV provoca alterações ao nível do ciclo celular por interacção com o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), pretende-se analisar a adequação da técnica de quantificação da expressão de EGFR em citologia como método de rastreio de lesões displásicas do colo do útero.

Com o intuito de melhorar a precisão do diagnóstico citológico diminuindo a subjectividade de interpretação por parte do profissional citopatologista, o principal objectivo deste estudo consistiu em determinar se o marcador EGFR poderia ser indicativo do tipo de lesão displásica diagnosticada pelo exame de Papanicolaou. Avaliou-se em que medida (i) o método por marcação com EGFR seria fiável para a identificação de células displásicas, (ii) a quantidade de células displásicas seria indicativa do tipo de lesão e/ou HPV e (iii) o método em estudo seria equiparável a outros métodos actualmente reconhecidos.

Os resultados obtidos sugerem que o marcador EGFR poderá ser um potencial classificador na identificação de células displásicas, apresentando uma sensibilidade de 78,5 % acompanhada de uma especificidade de 92,3%.

A quantificação da expressão do marcador EGFR apresentou-se estatisticamente homogénea quando comparada entre os diferentes diagnósticos citológicos para um nível de confiança de 95% ( (2) = 1,759, p = 0.415). O mesmo resultado foi obtido face ao tipo/risco de genótipo de HPV ( (3) = 3,963, p = 0.265) e ao diagnóstico histológico ( ) = 5,084, p = 0.079). No entanto, neste último caso, a quantificação da expressão do EGFR é sugestivamente maior nos casos de CINIII.

Em conclusão, o EGFR representa um classificador aceitável para a identificação de células displásicas e, após quantificação da expressão de EGFR, que este poderá ser um potencial método de screening para detecção de lesões de CIN III.

ABSTRACT

Cervical Cancer is one of the most common malignancies worldwide. The presence of high risk human papillomavirus infections is the main risk factor for its development.

Within this pathology, early diagnosis of precancerous lesions is essential for better prognosis. In this regard, immunohistochemical techniques are increasingly used as auxiliary diagnostic methods for the cervical cancer. By providing biomarkers detections, this technique contributes to an increase of the sensitivity of the cervix screening, defining a more precise criteria than those currently used.

Knowing that HPV changes the cell cycle by interacting with the epidermal growth factor receptor (EGFR), it is intended to assess the suitability of the technique to quantify the expression of EGFR in cytology as a method of screening for dysplastic lesions of the cervix.

In order to improve the accuracy of cytological diagnosis by reducing the subjectivity introduced by the interpretation of the cytopathologist professional, the main objective of this study was to determine whether the EGFR marker may be suggestive of the type of dysplastic lesions diagnosed by Pap smear. For this purpose it was evaluated the extent to which (i) the EGFR marking would be reliable for identifying dysplastic cells, (ii) the quantity of dysplastic cells would be suggestive of the type of lesion and / or HPV and (iii) the studied method would be comparable to other methods currently recognized.

The results revealed that the EGFR marker would be a potential classifier for dysplastic cells, showing a sensitivity of 78.5% alongside with a specificity of 92.3%.

In turn, the quantification of the expression of EGFR marker had a statistically homogeneous distribution, when compared between the different cytological diagnoses, for a confidence level of 95% ( (2) = 1,759, p = 0.415, N = 98). The same result was obtained regarding the type / risk HPV genotype ( (3) = 3,963, p = 0.265, N = 72) and the histological diagnosis ( ) = 5,084, p = 0.079, N = 98). In the last case however, the quantification of the EGFR expression is suggestively higher for CINIII.

Thus, it was concluded that EGFR represents an acceptable classifier to identify dysplastic cells and after quantifying the expression of EGFR marker, this would be a potential screening method for detection of CIN III lesions.

i

ÍNDICE

1. Introdução ... 1

2. EnquadramentoTeórico ... 3

2.1. Cancro do Colo do Útero ... 3

2.2. Aspectos Epidemiológicos ... 3

2.3. Etiopatogenia ... 4

2.4. Histopatologia ... 6

2.4.1. Morfologia ... 7

2.5. Citopatologia ... 8

3. Papiloma Vírus Humano ...11

3.1. HPV - Definição ...11

3.2. A Organização Genómica do HPV ...12

3.3. Carcinogénese Induzida pela Infecção por HPV ...13

4. Biopatologia do Cancro ...16

4.1. O Ciclo Celular ...17

4.2. Inibidores das Cinases Dependentes das Ciclinas ...18

4.2.1. Proteína p16 no ciclo celular ...18

4.3. Proliferação celular ...19

4.3.1. EGFR no ciclo celular ...19

5. Objectivos ...21 6. Material e Métodos ...22 6.1. População em Estudo ...23 6.2. Procedimento Laboratorial ...24 6.2.1. Detecção e genotipagem do HPV ...24 6.2.2. Imunohistoquímica ...28

6.2.3. Avaliação dos imunomarcadores ...29

ii

7. Resultados ...33

7.1. Análise de Dados ...33

7.1.1. Descrição da base de dados ...33

7.1.2. Caracterização dos casos clínicos analisados ...34

7.1.3. Validação estatística dos objectivos do estudo ...37

8. Discussão de Resultados ...46

9. Conclusão e Perspectivas futuras ...49

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ASCUS – Células escamosas atípicas de significado indeterminado CCU – Cancro do Colo do Útero

CIN - Neoplasia Intraepitelial Cervical CCV – Citologia Cervico-vaginal

CDKs - Ciclina / cinases dependentes de ciclinas DNA –Ácido desoxirribonucleico

DST – Doença Sexualmente Transmissível DO - Densidade Óptica

E2F – Factor de Transcrição H0 – Hipótese nula

HE - Hematoxilina-Eosina

HIV –Vírus da Imunodeficiência Humana HPV – Papilomavírus Humano

HSV – Herpes vírus Simples

HSIL – Lesão pavimentosa intra-epitelial de alto Grau IARC – Internacional Agency for Research on Cancer MHC-I - Complexo de Histocompatibilidade I

LCR – Região Regulatória

LSIL – Lesão pavimentosa intra-epitelial de baixo grau OMS – Organização Mundial de Saúde

ORF – Regiões de leitura aberta PBS – Tampão fosfato

pb – Pares de base

PCR – Polymerase Chain Reaction p 16 – Proteína p16

pRB – Proteína do retinoblastoma p53 - Proteína supressora tumoral

RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism RNA - Ácido Ribonucleico

SIL - Lesão intra-epitelial escamosa

TGF-α - Factor de crescimento transformante alfa VEGF - Factor de crescimento vascular endotelial

1/53

1. I

NTRODUÇÃO

A elevada incidência do CCU, com mais de 530.000 novos casos em todo mundo, constitui um grave problema de Saúde Publica Mundial (International Agency for Research on Cancer 2008).

Apesar dos avanços científicos no diagnóstico e tratamento de várias neoplasias malignas, as doentes com CCU continuam a ocupar o segundo lugar das neoplasias mais frequente no sexo feminino em todo mundo (International Agency for Research on Cancer 2008).

Nesta patologia, o diagnóstico precoce das lesões pré-neoplásicas, é essencial para um melhor prognóstico e consequentemente útil para a diminuição da mortalidade por esta causa. Com a introdução de programas de rastreio pelo exame de Papanicolaou a incidência de CCU tem diminuído. No entanto, apesar do êxito destes programas, o screening ginecológico tem limitações significativas no que diz respeito à sensibilidade e especificidade de detecção das lesões pré-neoplásicas, em parte devido à subjectividade dos critérios morfológicos utilizados (Denton, Bergeron et al. 2010).

Com o avanço existente no estudo dos mecanismos de carcinogénese nomeadamente na regulação do ciclo celular, as técnicas de imunohistoquímica são cada vez mais utilizadas como método auxiliar de diagnóstico em patologias do colo do útero (Shen, Shui et al. 2008). Ao disponibilizar de marcadores biológicos de detecção, esta técnica contribui para o aumento da sensibilidade do rastreio cervico-vaginal, definindo critérios mais precisos que os actualmente utilizados para a identificação de lesões pré-neoplásicas e pré-neoplásicas do colo do útero. Assim, usando as metodologias indicadas, este estudo propôs-se investigar características morfológicas, moleculares e imunocitoquímicas das lesões displásicas do colo do útero com o objectivo de contribuir para novas estratégias de diagnóstico citológico.

Neste sentido, sabendo que o HPV provoca alteração ao nível do ciclo celular por interacção com o EGFR, pretende-se analisar a adequação da técnica de imunomarcação por EGFR em citologia como método de rastreio de lesões displásicas do colo do útero. Esta análise é realizada comparando a técnica de EGFR com as actuais metodologias utilizadas no rastreio cervico-vaginal, nomeadamente o screening pelo exame de Papanicolaou, associado ou não aos testes de detecção de HPV e com o recente teste de detecção da p16 para identificação de lesões de alto grau.

Assim, tem-se como principal objectivo deste estudo, determinar se o marcador EGFR pode ser indicativo do tipo de lesão displásica diagnosticada pelo exame de Papanicolaou.

2/53

Para tal, o documento apresentado foi estruturado da seguinte forma: a Introdução ao tema com uma breve apresentação do status of the art, seguindo do Enquadramento Teórico que faz uma abordagem geral dos aspectos teóricos necessários para a concretização dos objectivos de estudo. No capítulo dos Objectivos apresenta-se o objectivo geral e os objectivos específicos, a partir dos quais foram formuladas as hipóteses do estudo.

O capítulo do Material e Métodos apresenta todos os procedimentos metodológicos laboratoriais. Aqui é feita uma breve descrição da base de dados assim como, a caracterização dos casos clínicos analisados. A validação estatística dos objectivos do estudo foi apresentada sobre a forma de gráficos e tabelas de apoio no capítulo dos Resultados.

A Discussão dos Resultados foi feita segundo os resultados estatísticos apresentados. Por fim, o último capítulo é dedicado à Conclusão.

3/53

2. E

NQUADRAMENTO

T

EÓRICO

2.1.

C

C

Ú

O CCU continua a ser uma das principais causas de morte por cancro no sexo feminino, especialmente em países subdesenvolvidos (Policht and Song 2010).

Contrariamente a outros tipos de cancro, o CCU, é prevenível, já que se trata de uma patologia com um longo período de lesões precursoras que antecedem a neoplasia invasora (Bibbo and Wilbur 2008; Kumar, Abbas et al. 2010). Neste sentido, surgem os programas de rastreio para detecção das suas lesões precursoras, que actualmente se baseiam na avaliação subjectiva pelo exame de Papanicolaou associado ou não, aos testes de HPV (Salcedo M, Silveira et al. 2008).

Nenhuma outra neoplasia documenta melhor os notáveis efeitos da prevenção, do diagnóstico precoce e do tratamento curativo sobre a taxa de mortalidade do que o CCU e, daí, a importância na continuidade da investigação na área do diagnóstico precoce (Kumar, Abbas et al. 2010).

2.2.

A

E

O CCU é o segundo cancro mais frequente no sexo feminino e representa cerca de 13% de todos os cancros na mulher. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), em 2008, foram diagnosticados 530.000 novos casos, dos quais 85% foram diagnosticados em países subdesenvolvidos onde não se aplicam programas de rastreio, representando um grave problema de saúde pública mundial (International Agency for Research on Cancer 2008).

4/53

Figura 1-Taxa de incidência mundial do Cancro do Colo do Útero, por 100.000 habitantes, em 2008 (adaptado de International Agency for Research on Cancer 2008).

Esta neoplasia apresenta uma distribuição geográfica variável (Figura 1). Aproximadamente 88% das mortes ocorrem em países em vias de desenvolvimento (América Latina, África, China e Índia), onde a incidência da doença é maior, enquanto que em países desenvolvidos (Europa Ocidental e América do Norte), os programas de rastreio já permitem a sua detecção precoce e como tal a incidência da doença é menor (Clifford, Smith et al. 2003; International Agency for Research on Cancer 2008).

Em Portugal, em 2008, foram diagnosticados 949 novos casos e 346 mortes por esta doença, o que corresponde a uma taxa de incidência de 12,2/100.000 e a uma taxa de mortalidade de 3,6/100.000, representando o valor mais elevado da Europa Ocidental (Sociedade Portuguesa de Ginécologia 2008; International Agency for Research on Cancer 2008).

Os dados disponíveis apontam para que os dois grandes picos de incidência no nosso país ocorram em mulheres entre os 40-45 anos e entre os 55-65 anos (Ramada and Medeiros 2007).

2.3.

E

A patogénese do CCU tem sido delineada por uma série de factores epidemiológicos, clínico-patológicos, e estudos de genética molecular. Vários estudos têm demonstrado que o HPV é um factor etiológico necessário para o desenvolvimento desta neoplasia, embora não seja suficiente (Sociedade Portuguesa de Papillomavírus 2004; Ramada and Medeiros 2007).

5/53

Esta ligação (HPV e cancro) foi pela primeira vez demonstrada, no início dos anos 80, por Harald zur Hausen, um virologista alemão, cuja descoberta lhe valeu a atribuição do prémio Nobel da Medicina em 2008 (Zur Hausen 2002).

A maior parte das mulheres com CCU estão infectadas por estirpes de HPV de alto risco e a sua prevalência é distinta em diferentes populações. Segundo Medeiros et al, o HPV de alto risco com maior incidência em Portugal é o 16 (Medeiros et al 2005).

Estudos epidemiológicos têm demonstrado que o efeito carcinogénico do HPV de alto risco está relacionado com as oncoproteinas virais E6 e E7 que interagem, inactivam e degradam proteínas de genes oncosupressores celulares como a proteína supressora tumoral (p53) e a proteína do retinoblastoma (pRb) permitindo a proliferação celular descontrolada (Zur Hausen 2002; Longworth and Laimins 2004).

Em 1996, a OMS reconheceu o HPV como uma causa importante para o desenvolvimento de CCU o que teve implicações importantes, não só relativamente à etiologia da doença, mas, também, na implementação de testes de detecção e tipagem do HPV, como adjuvantes no rastreio deste tipo de cancro (Burd 2003).

Segundo a Sociedade Portuguesa de Papillomavírus, em 2004, a infecção por HPV, por si só, não leva ao desenvolvimento de cancro. No entanto, 99,7% das mulheres com CCU estão infectadas por estirpes de HPV de alto risco (Sociedade Portuguesa de Ginécologia 2007). E a infecção com múltiplos tipos de HPV tende a aumentar a gravidade da doença (Zur Hausen 2002).

A infecção por HPV é muito comum em mulheres jovens sexualmente activas, apresentando uma prevalência de 20-46% (Zur Hausen 2002). A transmissão sexual contribui para este facto, ocorrendo por contacto cutâneo, embora a transmissão não sexual via fómites também possa ocorrer (Burd 2003). Estão estabelecidos alguns factores de risco que favorecem esta infecção, nomeadamente factores relacionados com a actividade sexual, designadamente a idade precoce da primeira relação sexual. O risco de infecção é maior quando a mulher, ou o parceiro, tem ou teve, parceiros sexuais múltiplos. Além disso, o uso de hormonas esteróides e a paridade também influenciam o desenvolvimento deste tipo de neoplasia, bem como o consumo de tabaco, por diminuir a resposta imunitária e por apresentar actividade mutagénica (Kirwan and Herrington 2001; Burd 2003; Trottier and Franco 2006).

A imunossupressão está associada à persistência do ácido desoxirribonucleico (DNA) viral e à progressão das lesões. A maioria das infecções são subclínicas, podendo, inicialmente, resultar em lesões de baixo grau. Os mecanismos pelos quais o sistema imunitário elimina a infecção por HPV ainda não estão completamente esclarecidos. Sabe-se, no entanto, que há infecções que não são totalmente eliminadas pelo sistema

6/53

imunitário, podendo persistir por longos períodos e causar doença clínica (Longworth and Laimins 2004; Trottier and Franco 2006).

Para além das imunodeficiências, também a presença de outros agentes infecciosos responsáveis por doenças sexualmente transmissíveis (DST), como por exemplo o Herpesvirus Simples II (HSV-II), Chlamydia Trachomatis e o Citomegalovírus, podem actuar como co-factores no desenvolvimento de CCU. (Camara, Cruz et al.; Sociedade Portuguesa de Papillomavírus 2004; Sociedade Portuguesa de Ginécologia 2007).

Por fim, factores genéticos como haplótipos HLA (antigénios leucocitários humanos) específicos,polimorfismos em alguns genes envolvidos na regulação do ciclo celular e reparação do DNA têm sido também associados ao desenvolvimento desta neoplasia (Jee, Won et al. 2004). A Figura 2 representa o modelo etiológico da infecção por HPV e CCU, evidenciando o papel das infecções persistentes e dos co-factores na mediação da progressão das lesões.

Figura 2- Modelo etiológico da infecção por HPV e Cancro do Colo do Útero, ilustrando o papel das infecções persistentes e dos co-factores na mediação da progressão das lesões. (adaptado de

Franco et al. 2001).

2.4.

H

A classificação das lesões pré-neoplásicas do colo do útero tem evoluído ao longo do tempo e já foram classificadas de diversas formas. A classificação mais antiga consiste no sistema displasia/ carcinoma in situ, no qual a displasia leve está situada numa das extremidades e a displasia grave/ carcinoma in situ encontra-se na outra

7/53

extremidade. Este sistema de classificação foi seguido pelo sistema de classificação de neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) na qual a displasia leve foi denominada NIC de grau I, displasia moderada NIC de grau II e displasia grave denominado NIC de grau III (Stevens, Lowe et al. 2003; Coleman and Tsongalis 2009; Kumar, Abbas et al. 2010).

Actualmente o sistema de classificação deve ser expresso, preferencialmente, segundo a classificação de Richart, em 1968, para neoplasia intraepitelial. A maioria dos médicos estão familiarizados com este sistema classificativo, que parece traduzir melhor o comportamento biológico das lesões (Tabela 1) (Stevens, Lowe et al. 2003; Coleman and Tsongalis 2009; Kumar, Abbas et al. 2010).

Tabela 1 - Classificação de Richart

Neoplasia Intraepitelial Cervical

Classificação

CIN I Grau I

CIN II Grau II

CIN III / CIS Grau III

2.4.1. M

O diagnóstico de lesão intra-epitelial escamosa (SIL) é baseado na identificação de atipia nuclear caracterizada pelo aumento nuclear, hipercromasia, presença de grânulos de cromatina grosseira, e variação de tamanho e forma nuclear. As alterações nucleares podem ser acompanhadas por halos citoplasmáticos, indicando o rompimento do citoesqueleto antes da libertação do vírus no meio ambiente. Estas alterações nucleares e halos perinucleares são chamados de atipia coilocítica (Stevens, Lowe et al. 2003; Kumar, Abbas et al. 2010).

A alteração seguinte do espectro consiste no aparecimento de células atípicas nas camadas mais baixas do epitélio escamoso, porém acompanhado de uma diferenciação persistente em direcção às camadas de células escamosas. As células atípicas mostram alterações na relação núcleo/citoplasma, variações no tamanho do núcleo, perda de polaridade, aumento do número de figuras mitóticas e hipercromasia. Resumindo as células atípicas adquirem características de células malignas e expandem-se para os dois terços da espessura epitelial. Estas lesões situam-se dentro do intervalo de variação da CIN II e são classificadas citológicamente como lesão intraepitelial de alto grau (HSIL). As características descritas anteriormente foram associadas a populações de células aneuplóides e correlacionam-se fortemente com os tipos de HPV de alto risco (Bibbo and Wilbur 2008). Estas células provavelmente reflectem as alterações precoces que ocorrem na população celular em replicação (basais e parabasais) e que estão

8/53

associadas aos efeitos dos oncogenes E6/E7 sobre o ciclo celular. Tais alterações precoces englobam a desregulação do ciclo celular e o aumento do número de receptores da proteína p16 INK4. O aumento da expressão da p16 é provavelmente uma das respostas compensatória aos distúrbios celulares provocados pelos oncogenes virais. À medida que a lesão evolui, ocorre uma perda progressiva da diferenciação até que os tecidos sejam completamente substituídos por células atípicas imaturas, que não exibem diferenciação na superfície CIN III (Figura 3).

Figura 3 - Representação da infecção pelo HPV e o espectro de lesões provocadas nos tecidos do colo do útero (adaptado de Woodman et al. 2007).

As alterações celulares que correspondem a esse espectro histológico e que são observadas nos esfregaços de Papanicolaou, serão mencionadas na secção seguinte.

2.5.

C

Actualmente e desde 1988 (ano da sua criação), o Sistema de Bethesda é a classificação mais utilizada para a avaliação da citologia cervico - vaginal (Bibbo and Wilbur 2008). Este Sistema de classificação impôs-se à já existente classificação de Papanicolaou, pelas suas vantagens; nomeadamente na clareza da terminologia utilizada, na uniformidade e razoável reprodutibilidade entre diferentes citotécnicos, patologistas e laboratórios; reflectindo também a compreensão mais actual da neoplasia cervical (Solomon and Nayar 2004). A sua última actualização aconteceu em 2001 e encontra-se esquematizada na secção Anexo I.

Os critérios adoptados para esta classificação segundo Bethesda 2001 foram (Solomon and Nayar 2004; Bibbo and Wilbur 2008):

9/53

 Células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US): Existência de núcleos com aproximadamente 1/2 a 3 vezes o tamanho da área do núcleo de uma célula pavimentosa normal intermediária. A relação núcleo-citoplasma (N/C) está ligeiramente aumentada; com hipercromasia nuclear mínima e irregularidade na distribuição da cromatina ou da forma nuclear. Pode ocorrer, ainda, anormalidade nuclear associada a citoplasma denso e orangófilo (paraqueratose atípica).

 Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau (LSIL): O aumento nuclear é, pelo

menos, 3 vezes a área do núcleo de uma célula intermediária normal, resultando em aumento da N/C com maturação bem definida do citoplasma. Os graus variáveis de hipercromasia nuclear são acompanhados por variações no tamanho nuclear, número e forma. A binucleação ou multinucleação estão geralmente presentes; a cromatina apresenta-se, em geral, uniformemente distribuída, mas grosseiramente granular; no entanto, pode apresentar-se baça ou degenerada. O contorno da membrana nuclear é normalmente ligeiramente irregular, mas pode ser liso. Frequentemente surgem coilócitos, células com cavidades perinucleares de contornos irregulares e atipia nuclear; no entanto, são importantes para a classificação como LSIL.

 Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau (HSIL): As células apresentam menos maturação que na LSIL. O tamanho da célula é variável, afectando principalmente células do tipo basal. A hipercromasia nuclear é acompanhada por variações no tamanho e forma nuclear; o grau de aumento nuclear é mais variável do que observado na LSIL. Algumas células com HSIL apresentam o mesmo grau de aumento nuclear como na LSIL, mas a área do citoplasma está diminuída, levando ao aumento mais acentuado da N/C. Outras células apresentam uma N/C muito elevada, mas o tamanho real dos núcleos pode ser consideravelmente menor do que na LSIL. A cromatina pode ser fina ou grosseiramente granular e com distribuição uniforme. O contorno da membrana nuclear é bastante irregular e frequentemente demonstra fendas proeminentes e estrias.

 Carcinoma epidermóide: as células apresentam-se maioritariamente isoladas, de marcada variação no tamanho e forma, com células caudadas e fusiformes, que frequentemente têm citoplasma denso e orangófilo. Também o núcleo tem variação marcada de tamanho, membrana irregular e opacidade nuclear. A

10/53

cromatina apresenta-se grosseiramente granular e irregularmente distribuída. Alterações queratóticas associadas podem estar presentes, mas não são suficientes para interpretação de carcinoma na ausência de anomalias nucleares. A diátese tumoral está muitas vezes presente.

11/53

3. P

APILOMA

V

ÍRUS

H

UMANO

3.1.

HPV

-

D

O vírus HPV é facilmente transmissível e a sua infecção pode ser totalmente silenciosa.

O HPV constitui um grupo heterogéneo. São pequenos vírus, de aproximadamente 55nm de diâmetro, cujo material genético é uma molécula de DNA circular de cadeia dupla. Apresentam replicação nuclear e são revestidos por uma cápside proteica, de simetria icosaédrica, sem invólucro lipídico (Figura 4) (Kirwan and Herrington 2001; Burd 2003; Longworth and Laimins 2004).

Figura 4-Imagem tridimensional do HPV (adaptado de http://www.prn.org /html/authorized/3dvirusmodels/hpvlow.php, Julho 2011).

Este vírus pertence à família dos Papillomaviridae e estão já identificados cerca de 140 genótipos de HPVs diferentes, dos quais cerca de 40 infectam preferencialmente os genitais: vulva, vagina, colo do útero, pénis e áreas perianais (Sociedade Portuguesa de Papillomavírus 2004; Doorbar 2006; Sociedade Portuguesa de Ginécologia 2007).

Apesar da elevada taxa de infecção, na maioria dos casos esta é transitória e auto-limitada, tendo resolução espontânea em 75 a 80% dos casos, ao fim de 1-2 anos (Sociedade Portuguesa de Ginécologia 2007).

A infecção torna-se persistente nos restantes 25%, condição predisponente a uma evolução desfavorável. Mas, mesmo assim, muitos destes casos não evoluem para neoplasia. Estima-se que apenas 10 a 11% dos casos de infecção evoluam para neoplasia intraepitelial, dos quais 10% para neoplasia intraepitelial cervical (CIN) II-III (verdadeira lesão pré-neoplásica) e 1% para cancro invasivo, com um tempo de progressão variável, em geral, à volta dos 15 anos (Figura 5) (F. and MD 2004).

12/53

Figura 5 - Representação esquemática do modelo de infecção com HPV de alto risco e número de anos que leva ao desenvolvimento do Cancro do Colo do Útero (Adaptado de mtm laboratories

2011).

3.2.

A

O

G

HPV

O vírus do HPV é um vírus de DNA circular de cadeia dupla, com cerca de 8.000 pares de bases (pb) e é constituído por 8 regiões de leitura aberta (open reading frame- ORF) que correspondem às sequências delimitadas entre um codão de “iniciação” e um codão “stop” (Figura 6) (Munger, Baldwin et al. 2004; Doorbar 2006).

A sua expressão está intimamente dependente do programa de diferenciação da célula hospedeira, de modo que, a nível funcional, o genoma divide-se numa região precoce e numa região tardia, de acordo com o momento em que os respectivos genes são transcritos, durante o ciclo viral (Fehrmann, Klumpp et al. 2003; Silva 2008).

Figura 6 - Representação esquemática do Genoma do HPV, com os genes precoces (E1, E2, E4, E5, E6 e E7), os genes tardios (L1 e L2) e a região reguladora (URR) (adaptado de Doorbar 2006).

Os genes precoces (E1, E2, E4, E5, E6 e E7) são expressos nas células das camadas inferiores do epitélio do colo do útero e codificam as proteínas necessárias para a replicação e transcrição do genoma viral. Os genes tardios (L1 e L2) codificam proteínas estruturais, com capacidade para se auto-agregarem, de modo a formar a

13/53

cápside do vírus, constituída maioritariamente pela proteína viral L1, que contribui com cerca de 80-90% do conteúdo proteico, e, em menor proporção, pela L2 (Fehrmann, Klumpp et al. 2003; Doorbar 2006; Silva 2008).

A montante das ORF, existe uma região reguladora (URR) não codificante (Figura 6), de aproximadamente 1.000 pb. Esta região contém as sequências que regulam a expressão dos genes virais, nomeadamente o promotor, contendo locais de ligação para as polimerases do DNA e do ácido ribonucleico (RNA), e outros factores que potenciam ou reprimem a expressão dos genes virais (Doorbar 2006; Silva 2008).

A sequência de aminoácidos da proteína L1 é altamente conservada entre todos os tipos de HPV. A cápside é constituída por 72 capsómeros, cada um composto por 5 subunidades da proteína L1. Supõe-se que a L2 tem a função de atrair o DNA viral para o interior da cápside (encapsulamento do genoma), durante a formação de novas partículas virais. As proteínas da cápside dão origem a determinantes antigénicos específicos para cada tipo de vírus, que dependem da conformação tridimensional das proteínas na cápside, e não apenas de cada uma das proteínas isoladamente (Kirwan and Herrington 2001; zur Hausen 2002; Burd 2003).

3.3.

C

I

I

HPV

A forte associação entre a infecção precoce por HPV e o desenvolvimento de lesões pré-neoplásicas ou carcinoma é evidente e amplamente aceite (Bollmann, Mehes et al. 2003; Bibbo and Wilbur 2008; Singh, Mehrotra et al. 2008).

Um dos principais eventos da carcinogénese induzida pelo HPV é a integração do genoma do HPV no cromossoma do hospedeiro (Bibbo and Wilbur 2008). A carcinogénese deste tipo de tumor desenvolve-se com a integração do DNA do HPV no genoma do hospedeiro, envolvendo a linearização do genoma do vírus entre os genes E1 e L1, e a inactivação do gene E2 por corte ou delecção aquando da sua integração (Silva 2008). A perda da expressão do receptor transcripcional da proteína E2 é importante pois pode resultar numa expressão descontrolada das proteínas E6 e E7 produzindo alterações fenotípicas na célula hospedeira (Munger, Baldwin et al. 2004; Sociedade Portuguesa de Papillomavírus 2004).

Os genes virais E6 e E7 dos HPVs de alto risco codificam proteínas responsáveis pelo potencial oncogénico do vírus, pela sua capacidade de induzir a transformação maligna das células infectadas. Os genes E6 e E7 codificam oncoproteínas que têm como alvo a pRb e a p53 respectivamente, que são proteínas codificadas por genes supressores tumorais (Melsheimer, Vinokurova et al. 2004; Kumar, Abbas et al. 2010).

A proteína E6 dos HPVs de alto risco liga-se à p53, e leva à sua rápida degradação pela via ubiquitina proteossoma (Kumar, Abbas et al. 2010).

14/53

Como resultado desta degradação, as actividades normais da p53 como a indução de paragem do ciclo celular em G1, apoptose e reparação do DNA, não são realizadas. Deste modo, e uma vez que a p53 regula os chekpoints G1/S e G2/M do ciclo celular, a sua rápida degradação resulta na perda destes pontos de controlo, podendo levar à ocorrência de duplicações cromossómicas e anomalias centroméricas (DeFilippis, Goodwin et al. 2003; Bibbo and Wilbur 2008).

A proteína E7 forma um complexo com a forma hipofosforilada (activa) da pRb, que leva à proteólise da pRb pelo proteossoma, e como a pRb hipofosforilada normalmente inibe a entrada na fase S ligando-se ao factor de transcrição E2F, os dois oncogenes do vírus operam conjuntamente para promover a síntese de DNA quando bloqueia a paragem do crescimento mediada pela p53 e a apoptose das células geneticamente alteradas (Figura 7) (DeFilippis, Goodwin et al. 2003; Doorbar 2006; Bibbo and Wilbur 2008; Kumar, Abbas et al. 2010; Laurson, Khan et al. 2010).

Figura 7 - Representação esquemática da acção das oncoproteínas E6 e E7 e a sua relação com o ciclo celular. As E6 e E7 ligam-se às proteínas celulares p53 e pRb respectivamente, alterando as

suas funções e vias de regulação do ciclo celular (adaptado de Burd 2003).

Além dos oncogenes virais referidos anteriormente, uma outra proteína viral, a E5, parece ter influência no ciclo de vida viral. A função desta proteína não está ainda bem caracterizada, e existem controvérsias sobre o seu real papel no ciclo viral.

Segundo Camara et al. a proteína E5, por meio de um sinal da via de transdução dos receptores de factor de crescimento, parece actuar, sinergicamente, com o EGFR (Camara, Cruz et al.2003).

A proteína E5 do HPV tipo 16 activa o EGFR através da ligação a uma subunidade da ATPase levando a uma reduzida degradação dos receptores de EGF, a um aumento

15/53

da reciclagem do EGFR, e consequentemente resultando numa expressão acentuada do mesmo (Soonthornthum, Arias-Pulido et al. 2011). Como consequência, este aumento de EGFR promove a inibição da expressão do complexo de histocompatibilidade (MHC-I) e MHCII na membrana plasmática (Gao and Zheng 2010).

A E5 parece ser importante na fase inicial da infecção, estimulando a proliferação celular, resultando na entrada e progressão do ciclo celular através da regulação da p27 (Kip 1), afectando várias vias celulares envolvidas na adesão, motilidade celular e sinalização mitogénica. Estas alterações podem levar à inibição da apoptose e facilitar a persistência da infecção no epitélio uterino (Kivi, Greco et al. 2008; JM, Kim et al. 2010; Muto, Stellacci et al. 2011).

Assim, a proteína E5 parece ter fracas propriedades oncogénicas que ocorrem por inibição da apoptose após lesão do DNA. No entanto, à medida que as lesões associadas a infecção por HPV progridem até cancro, o DNA viral integra-se no DNA da célula hospedeira, e uma parte substancial do genoma viral sofre delecção, incluindo a sequência codificadora da E5. Logo, a E5 não será necessária para os eventos tardios da carcinogénese mediada por HPV (Hausen 2002; Gao and Zheng 2010).

No conjunto, os oncogenes virais E5, E6 e E7 desempenham assim um papel fundamental na transformação celular por diversos mecanismos que afectam o normal funcionamento celular (M and F 2005; Vermeulen, Jordanova et al. 2007; Kumar, Abbas et al. 2010; Pedroza-Saavedra, Lam et al. 2010).

16/53

4.

B

IOPATOLOGIA DO

C

ANCRO

A carcinogénese baseia-se na acumulação de alterações genéticas sucessivas ao longo do tempo que acabam por transformar uma célula normal numa célula maligna. Determinados grupos de genes são particularmente afectados, resultando na aquisição de novas capacidades que são importantes para a progressão tumoral neste processo de “multistep” até ao desenvolvimento de neoplasia, Essas novas características são seguidamente listadas e representadas na Figura 8 (Kumar, Abbas et al. 2010):

 Crescimento e proliferação celular autónoma – capacidade de proliferação independente dos estímulos mitogénicos;

 Insensibilidade aos factores inibidores de crescimento – as células tumorais poderão não responder aos factores inibitórios extra e intra-celulares, continuando assim a sua proliferação;

 Fuga à apoptose- resistência à morte celular geneticamente programada por alteração de genes que controlam a apoptose, permitindo a sobrevivência das células com erros graves no DNA;

 Imortalidade celular- manutenção da actividade dos telómeros essencialmente por reactivação da telomerase;

 Angiogénese- as células tumorais adquirem capacidade de produzir factores de crescimento que estimulam a formação de novos vasos que nutrem o tumor permitindo a sua progressão;

 Capacidade de invasão tecidular e metastização - aquisição de capacidades de mobilização, penetração e migração das células tumorais.

Figura 8 - Alterações necessárias adquiridas pelas células malignas (adaptado de Hanahan e Weinberg 2000).

17/53

Esta acumulação sucessiva de alterações genéticas, citogenéticas e epigenéticas, está paralela e fenotipicamente relacionada com várias alterações histológicas e citologicas detectáveis, como hiperplasias e displasias culminando com a evolução para carcinomas in situ e invasores.

O ciclo celular é o ponto-chave para a compreensão da biopatologia do cancro. Muitos dos erros moleculares que causam o comportamento anormal das células neoplásicas assentam em alterações do ciclo celular (Massague 2004).

4.1.

O

C

C

A maioria das nossas células é substituída nos tecidos através de um processo que envolve a replicação de DNA e a divisão do núcleo e citoplasma originando duas células- filhas. Esta rotina sequencial, designada por ciclo celular, é constituída por duas partes básicas: a mitose, onde ocorre a divisão celular com divisão nuclear e citocinese e a interfase, período entre as mitoses onde há síntese e replicação de DNA (Cooper 2001).

Pode dividir-se o ciclo celular em quatro fases: fase de pré-sintese (fase G1) onde ocorre a produção de RNA e proteínas necessárias para a etapa seguinte fase de síntese de DNA (fase S), onde existe replicação gradual do DNA nuclear a fase pós-síntese (fase G2) com produção de proteínas necessárias para a fase seguinte, e a fase de mitose (fase M). Na fase de mitose ocorre separação dos cromátideos duplicados e tem lugar tanto a divisão nuclear (mitose) como a divisão do citoplasma (citocinese). Corresponde à fase mais curta do ciclo. É de referir que a maior parte das células não se encontram em fase activa de produção de DNA ou de mitose, podendo estar em fase de repouso G0 ou de pré-síntese (G1), a fase mais longa do ciclo celular (Cooper 2001).

A progressão do ciclo celular é altamente regulada por um conjunto de sinais e mecanismos extra-celulares e intracelulares que coordenam os vários processos que ocorrem durante as fases do ciclo, resultando na sua activação ou inibição. Esta rede complexa mas coordenada de proteínas actuam maioritariamente em determinados pontos-chave do ciclo denominados de pontos de controlo. Um dos mais importantes ocorre na passagem da fase G1 para a fase S denominado por ponto de restrição ou ponto de controloG1/S, dependente da acção dos factores de crescimento para a passagem para a fase S. O ponto de controlo G1 permite a detecção de erros no DNA antes da sua replicação. Quando é detectado um erro no DNA o ciclo celular é interrompido permitindo a reparação dos genes afectados. O ponto de controlo de G2 previne a iniciação da mitose sem a completa replicação do DNA, embora também permita a detecção dos erros de DNA. Outro ponto de controlo ocorre na mitose onde um conjunto de proteínas, (ex. Bub e Mad), controlam o alinhamento dos cromossomas

18/53

assegurando a correcta distribuição dos cromátideos para as células-filhas (Cooper 2001; Pinto, Soares et al. 2007).

4.2.

I

C

D

C

O controlo do ciclo celular é não só regulado pelos complexos ciclina / cinases dependentes de ciclinas (CDKs) mas também pelos inibidores das CDK (CDKIs). Estas proteínas intervêm a vários níveis do ciclo celular inibindo a sua progressão. Pertencem as duas classes distintas: a família Cip/Kip das quais fazem parte a p21 WAF1, p27 Kip1 e p57 kip2com domínios amino-terminal homólogos que contêm regiões de ligação às CDK e ciclinas e a família INK4/ARF das quais fazem parte as P16INK4B, p15INK4C e p19INK4D com repetições tandem de sequência tipo anquirina (Sherr and Roberts 1995).

Os membros da família Cip/Kip regulam várias fases do ciclo celular nomeadamente G1 e S inibindo os complexos das CDK 2, 4 e 6 com as ciclinas A, E e D. Por sua vez, os membros da família INK4, como a p16INK4A, apenas actuam no ponto de restrição do ciclo celular, no final da fase G1, inibindo o complexo das CDK4/6 - ciclina D (Cooper 2001).

4.2.1. P

16

A proteína p16 funciona como um regulador negativo da proliferação celular que inibe especificamente os complexos CDK4/6-ciclina D evitando a fosforilação da pRb (Serrano, Hannon et al. 1993).

O aumento da P16 na presença da pRb normal mostrou levar à restrição do ciclo celular (Serrano, Lee et al. 1996). A sua expressão pode ser encontrada em células epiteliais, fibroblastos, células musculares lisas e melanócitos mas de uma forma muito baixa durante quase todo o ciclo celular aumentando ligeiramente na fase G1 (Tam et al, 1994). Valores de expressão muito elevados ou completamente ausentes poderão corresponder a alterações na dinâmica desta proteína.

Valores elevados de expressão proteica da p16 foram detectados em lesões pré-neoplásicas e pré-neoplásicas cervicais associadas à infecção por HPV (Galgano, Castle et al. 2010). Estudos no âmbito das lesões displásicas do colo do útero e expressão de marcadores tumorais, têm revelado que a expressão da p16 é marcadamente influenciada pelo status de expressão da pRb. Segundo a literatura a sobreexpressão da p16 em células cervicais pode ser interpretada como um dos indicadores da integração do genótipo do HPV de alto risco na célula hospedeira, devido à inactivação funcional da pRb pela proteína E7 (Sano, Oyama et al. 1998).

Têm sido publicados diversos estudos em que se tem observado uma sobreexpressão imunohistoquimica da proteína p16 num elevado número de casos de

19/53

displasia de alto grau (80-100% de lesões de CINII e praticamente todas as lesões de CINIII) e carcinoma invasor (Missaoui, Hmissa et al. 2010). Estudos mostram uma tendência linear da expressão da p16 com o aumento da gravidade da lesão (Salcedo Mde, Silveira et al. 2008). Para além disso, a imunocitoquímica com marcação por p16, tem o potencial para fornecer uma elevada sensibilidade na presença de lesões de alto grau, com uma especificidade significativamente mais elevada que o teste de HPV (Denton, Bergeron et al. 2010).

4.3.

P

A proliferação celular pode ser definida como aumento do número de células resultante da conclusão do ciclo celular. Depende da proporção de células que proliferam (fracção proliferativa), da duração do ciclo celular e da fracção de células que se vão perdendo por morte ou diferenciação celular.

A hiperproliferação celular é um indicador de uma desordem no crescimento celular que muito frequentemente resulta em cancro. Por outro lado, quanto maior for a fracção de proliferação maior será o crescimento do tumor.

Estes factos suscitaram o interesse do estudo da proliferação em Oncologia, desenvolvendo-se várias metodologias para tal. Estes métodos incluem a determinação do índice de figuras mitóticas, índice marcado por timidina tritiada, demonstração por métodos argênticos de regiões organizadoras nucleares (AgNORs), proliferação por citometria de fluxo e avaliação da proliferação através da avaliação de proteínas relacionadas com o ciclo celular por imunohistoquímica. Esta última corresponde a um dos métodos mais utilizados actualmente e baseia - se na detecção de determinadas proteínas que são expressas durante as distintas fases do ciclo celular (Hall and Woods 1990).

4.3.1. EGFR

O EGFR é uma glicoproteína transmembranar com 170 kDa constituída por um domínio extracelular transmembranar para o ligando, por uma região transmembranar hidrofóbica e por um domínio interno com actividade tirosina cinase intrínseca. Este receptor é codificado pelo protooncogene C-erb B localizado no cromossoma 7 (7p12) e faz parte da família ErbB de receptores tirosina cinase do tipo I, constituída por quatro receptores homólogos: ErbB1 (EGFR/HER-1) ErbB2 (HER-2) ErbB3 (HER-3) e ErbB4 (HER-4) (Venook 2005).

O EFGR é um receptor expresso em várias células normais não hematopoiéticas tais como células epiteliais, células do tecido conjuntivo, células da glia, células musculares e células das glândulas salivares. É um importante receptor mediador de

20/53

acções como crescimento, desenvolvimento, diferenciação e sobrevivência celular (Venook 2005).

Este receptor pode ser activado por vários ligandos como o factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento transformante alfa (TGF-α), entre outros (Charoenrat, Rhys-Evans et al. 2002).

A ligação do factor de crescimento (por exemplo o EGF) estimula a formação de um complexo dimérico com dois membros da família ErbB promovendo a autofosforilação dos resíduos de tirosina específios da região citoplasmática. Poderão formar-se diferentes formas de complexos homo e heterodiméricos. O receptor de tirosina autofosforilado fica desta forma activo e recruta proteínas adaptadoras e efectoras com a subsequente activação das vias sinalização intracelular. Outros segundos mensageiros podem ser mobilizados e activam consequentemente factores transcricionais nucleares determinando respostas celulares como por exemplo a proliferação celular, inibição da apoptose, estimulação da invasão e disseminação.

A expressão ou sobrexpressão do EGFR tem sido descrita em vários tipos de neoplasias, nomeadamente em carcinomas da cabeça e pescoço (80-100%), cancro do pulmão (40-93%), cancro da mama (14-91%) e na neoplasia cervical a expressão do EGFR varia entre 70-90% dependendo da metodologia utilizada (Khalil, Grandis et al. 2003; Soonthornthum, Arias-Pulido et al. 2011).

Na neoplasia cervical a expressão do EFGR está relacionada com infecção pelo HPV, e sabe-se que a desregulação do EGFR causa oncogenicidade, mas os mecanismos biológicos que promovem o crescimento das células não estão completamente esclarecidos (Soonthornthum, Arias-Pulido et al. 2011).

O EGFR está envolvido na proliferação e crescimento celular de células tumorais assim como no aumento da sua vida celular por resistência à apoptose (Venook 2005). Pode ter efeitos em importantes fases da invasão e disseminação tumoral, nomeadamente por promoção da motilidade celular, alteração e redução de moléculas de adesão e pela estimulação de enzimas proteolíticas de degradação da matriz extracelular (Ch'ng, Low et al. 2008).

A participação do EGFR na angiogénse, provavelmente pela regulação do factor de crescimento vascular endotelial (VEGF), parece ser igualmente relevante (Charoenrat, Rhys-Evans et al. 2002).

A determinação da expressão do EGFR pode ser de igual forma útil na planificação do tratamento com radioterapia ou quimioterapia, uma vez que tumores com aumento deste receptor foram associados a maior radiorresistência (Milas, Fan et al. 2004).

A expressão aumentada do EGFR nestas neoplasias faz desta molécula um alvo atractivo para utilização terapêutica de agentes inibidores deste receptor.

21/53

5.

O

BJECTIVOS

Com a finalidade de melhorar a precisão do diagnóstico citológico pela diminuição da subjectividade de interpretação por parte do profissional citopatologista, o principal objectivo deste estudo consiste em determinar se o marcador EGFR poderá ser indicativo do tipo de lesão displásica diagnosticada pelo exame de Papanicolaou.

Para tal pretende-se avaliar em que medida o método por marcação com EGFR é fiável para a identificação de células displásicas:

I. Sensibilidade e especificidade do marcador EGFR para detecção de células displásicas;

Seguidamente, pretende-se averiguar em que medida a quantidade de células displásicas será indicativo do tipo de lesão e/ou HPV:

II. Relação entre a expressão do marcador EGFR e o diagnóstico citológico; III. Relação entre a expressão do marcador EGFR e o tipo/risco de HPV; IV. Relação entre a expressão do marcador EGFR e o diagnóstico histológico;

Por fim, pretende-se também comparar o método em estudo com outros métodos actualmente reconhecidos:

22/53

6. M

ATERIAL E

M

ÉTODOS

Depois de ter sido efectuada uma análise dos registos clínicos foi realizada uma triagem dos casos, sendo rejeitados os casos em que não foram detectadas quaisquer lesões displásicas. Os casos com displasia foram sujeitos a uma análise citológica, histológica e molecular.

Na análise citológica, após revisão dos resultados previamente obtidos pelo exame de Papanicolaou, procedeu-se à análise imunocitoquímica, recorrendo aos marcadores EGFR e p16.

A análise histológica consistiu na revisão dos casos arquivados e reclassificação dos mesmos, se aplicável.

Do ponto vista da análise molecular foram efectuadas metodologias de detecção de HPV e subsequente genotipagem.

A figura seguinte representa o delineamento geral da pesquisa que permitiu a orientação do estudo.

23/53

6.1.

P

E

Este estudo, do tipo retrospectivo, realizou-se com amostras residuais obtidas a partir de citologias armazenadas em meio líquido PreservCyt (Cytyc Corporation, Boxborough, MA, USA), provenientes do programa de rastreio do colo do útero, de um Laboratório de Anatomia Patológica da zona Norte, e a partir de tecidos fixados em formol tamponado a 10%, incluídos em parafina e diagnosticados e arquivados no mesmo laboratório. Através do estudo com técnicas convencionais de hematoxilina-eosina (HE), em lâminas arquivadas, realizou-se a reclassificação histológica dos casos e apenas uma amostra foi reclassificada de CIN II para CIN I.

Os critérios de inclusão foram os seguidamente listados:

 Sabendo que a expressão do EGFR está alterada em células displásicas e partindo do pressuposto teórico de que os casos saudáveis não apresentam displasia, o estudo centrou-se exclusivamente na utilização de amostras de ASC-US, LSIL e HSIL. Segundo o sistema de Bethesda (Bibbo and Wilbur 2008) representam: células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US), lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau (LSIL), lesões intraepiteliais escamosas de alto grau (HSIL);

 Amostras com confirmação histológica, correspondentes aos casos de citologia meio líquido, classificadas em CIN I- displasia leve; CIN II- displasia moderada; CIN III- displasia grave/carcinoma in situ. As amostras histológicas compreendem biópsias cervicais e conizações.

Para os critérios de inclusão previamente listados, foram identificados as seguintes limitações com possibilidade de condicionar a qualidade dos casos estudados e consequentemente a qualidade dos dados estatisticamente analisados:

 A consecutiva reutilização da amostra em estudo perde representatividade celular à medida que novas lâminas são laboratorialmente processadas a partir mesma amostra; assim, a contagem de células nos resultados obtidos de lâmina para lâmina apresentam uma ordem de grandeza distinta e imprevisível, impossibilitando uma correspondência directa entre os valores capturados entre amostras;

 O facto de serem considerados casos histológicos até 6 meses depois da colheita de citologia meio líquido, podem prejudicar a qualidade da relação entre diagnóstico citológico e diagnóstico histológico. Esta relação pode ser prejudicada, uma vez que neste intervalo temporal a patologia pode evoluir,

24/53

ignorando possíveis melhorias (por intervenção terapêutica ou regressão espontânea) ou agravamentos (por evolução natural da patologia, sem qualquer tratamento).

Foram excluídos exames cujos resultados apresentam lesões displásicas de (i) ASC-H, não se pode excluir lesão de alto grau, (ii) anomalia das células glandulares e (iii) „Outras‟ neoplasias.

O conjunto de dados final resultou em 49 casos respeitando os critérios anteriormente descritos.

6.2.

P

L

6.2.1. D

HPV

Processamento das amostras

Das citologias de colo uterino, previamente colhidas e armazenadas em meio líquido PreservCyt, foram centrifugadas cerca de 2ml de cada amostra a 4500 rpm durante 15 minutos.De seguida rejeitou-se o sobrenadante e suspendeu-se em 2mL de tampão fosfato (PBS). Uma alíquota de 1ml foi concentrada em 200μL de PBS para posterior extracção de ácidos nucleícos.

Isolamento de ácidos nucleicos

Procedeu-se à extracção de DNA das amostras de citologia de colo uterino com o kit comercial QiAamp DNA Blood mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) e de acordo com as normas do fabricante (QIAGEN, 2010).

Quantificação de DNA

A presença de DNA, após a extracção, foi avaliada através da quantificação da Densidade Óptica (DO) utilizando um espectofotómetro UV/visível, Nanodrop (ND-1000, Nanodrop Technologies), a partir de 2μL de amostra. A avaliação da quantidade e da qualidade deve ser executada a vários comprimentos de onda: 260nm (para avaliar especificamente para ácidos nucleicos) e 280nm (para avaliar presença de proteínas). A sua pureza foi avaliada através do rácio dos valores de absorvância a 260/280nm. Uma razão maior que 1,8 é geralmente considerada um indicador de qualidade aceitável do DNA, sendo-o também aplicado neste trabalho experimental.

25/53

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Nas reacções de PCR foram incluídos controlos negativos e positivos: para o controlo negativo, substitui-se o DNA da amostra por água bidestilada estéril (ddH2O); o controlo positivo para o HPV consistiu numa amostra de citologia do colo do útero com HPV de alto risco detectado por diagnóstico com o kit hc2 High-Risk HPV DNA test (Qiagen, Hilden, Alemanha).

As reacções de amplificação foram efectuadas no termociclador programável BioRad MyCyclerTM (Bio-Rad, Hercules, Canadá) num volume total de 50μL.

Controlo do método de extracção de DNA

Para testar a eficácia do método de extracção de DNA, foi pesquisada a presença do gene de referência, beta globina, pela técnica da PCR, de modo a obter um fragmento de 175 pb, com os primers PCO3 e BGII (Tabela 2). A reacção de amplificação continha 10 ng de DNA, 1U Taq DNA Polimerase (MBI Fermentas, #EP0402) e o respectivo tampão de reacção 1X, 4 mM de MgCl2 (MBI Fermentas), 0.2 mM de dinucleosídeos trifosfatados (dNTPs) (MBI Fermentas, #R0192) e 0.3 μM de cada primer. As condições de amplificação encontram-se descritas na Tabela 3.

Detecção de DNA do HPV

A presença de DNA viral foi avaliada com recurso à técnica da PCR, utilizando os primers GP5+/6+ e os primers degenerados MY09/11 (Tabela 2), que amplificam uma região relativamente estável do gene L1 do HPV com 150 e 450 pb, respectivamente.

A reacção com os primers MY09/11 continha 10 ng de DNA, 1U Taq DNA Polimerase (MBI Fermentas, #EP0402) e o respectivo tampão de reacção 1X, 4 mM de MgCl2 (MBI Fermentas), 0.2 mM de dNTPs (MBI Fermentas, #R0192) e 0.4 μM de cada primer. As condições de amplificação encontram-se descritas na Tabela 3.

A reacção com os primers GP5+/6+ (Tabela 2) continha 10 ng de DNA, 1U Taq DNA Polimerase (MBI Fermentas, #EP0402) e o respectivo tampão de reacção 1X, 3 mM de MgCl2 (MBI Fermentas), 0.2 mM de dNTPs (MBI Fermentas, #R0192) e 0.4 μM de cada primer. As condições de amplificação encontram-se descritas na Tabela 3.

26/53

Tabela 2- Sequência dos primers utilizados

(A =Adenina, T= Timina, G= Guanina e C= Citosina. Os primers MY09/11 são degenerados e usam nucleótidos modificados, em que M=A ou C, R=A ou G, W=A ou T e Y=C ou T).

Sequência dos Primers

Beta globina PCO3 5´-ACA CAA CTG TGT TCA TAG C-3´

BGII 5´-GTC TCC TTA AAC CTG TCT TG-3´

HPV MY 09 _{5´-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3´} MY11 5´-GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG-3´

GP5+ _{5´-TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC-3´}

GP6+ 5´-GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C-´

Tabela 3- Condições de amplificação de DNA.

Primers Condições de amplificação

Beta-globina PCO3/BGII Pré-desnaturação: 3min-95ºC

35 ciclos: 1min-94ºC, 1min-55ºC e 1min-72ºC Extensão final: 10min-72ºC

HPV MY09/11 Pré-desnaturação: 3min-95ºC

40 ciclos: 45s-94ºC, 45s-55ºC e 1min-72ºC Extensão final: 5min-72ºC

GP5+/6+ Pré-desnaturação: 4min-95ºC

40 ciclos: 30s-94ºC, 1min-44ºC e 1.30min-72ºC Extensão final: 10min-72ºC

Electroforese em gel de agarose dos fragmentos amplificados

De modo a verificar a amplificação dos fragmentos de DNA, 15 μl dos produtos obtidos na PCR foram analisados por electroforese em géis de agarose a 1,5% (p/v), corados com brometo de etídeo. Em seguida os géis foram visualizados, utilizando um transiluminador (Quantity one, Bio-Rad) de luz UV e com o suporte do programa informático.

27/53

A figura 10 mostra a banda característica da amplificação do gene L1 do HPV com peso molecular 450 pb.

Figura 10 – Representação do gel de agarose identificativo da presença de HPV.

Genotipagem do HPV por RFLP

As amostras positivas por PCR com os primers MY09/11 foram genotipadas pelo método Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), conforme o descrito por Nobre et al. (2008). Este método permite a diferenciação dos vários genótipos do HPV, pela análise de clivagem do DNA.

Os genótipos do HPV foram divididos em quatro grupos baseados na sua actividade oncogénica (Munoz, Castellsague et al. 2006; Nobre, de Almeida et al. 2008):

HPV de alto risco 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59; HPV de provável alto risco 26, 53, 66, 68, 73 e 82;

HPV de baixo risco 6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 70, 72, 81 e 89; HPV de risco indeterminado 30, 32, 34 e 64, 62, 67, 69, 71, 74, 83, 84, 85,

86, 87, 90, 91, 97, 102 e 106.

Cerca de 5 μL dos produtos de PCR foram submetidos a digestão em quatro reacções independentes, num volume total de 20 μL, que continha, 2μL de 10X de tampão de cada enzima e 10U das seguintes enzimas de restrição: PstI (New England BioLabs, R0140S), HaeIII (MBI Fermentas, #ER0151), DdeI (New England BioLabs, R0175L) e RsaI (New England BioLabs, R0167S). As digestões ocorreram durante 1hora a 37ºC.

Electroforese em gel de agarose dos fragmentos obtidos por RFLP

Os fragmentos obtidos por RFLP foram analisados por electroforese em géis de agarose a 3% (p/v), corados com brometo de etídeo e visualizados sob luz UV. A identificação dos tipos de HPV foi realizada seguindo o algoritmo proposto por Nobre et al. (2008) e foi representada na Figura 11.

28/53

Figura 11 – Representação de um gel de agarose exemplificativo da digestão por RFLP. Fragmentos obtidos pelas enzimas PstI, HaeIII,DdeI e RsaI. As referências M1 e M2 representam os

marcadores de peso molecular de 25 e 100 pb respectivamentes.

6.2.2. I

Para as técnicas de imunohistoquímica utilizou-se o sistema manual de detecção. O material residual presente nas amostras de citologia em meio líquido foi processado pelo Thinprep® T2000 (Hologic), colocou-se em solução fixadora (álcool a 95% durante 30 minutos) e foi posteriormente hidratado.

As amostras foram seguidamente submetidas a distintos processos de recuperação antigénica de acordo com o anticorpo primário utilizado, como indicado na Tabela 4.

Depois de colocar as lâminas nos receptores especiais do sistema de imunomarcação manual, a técnica de imunocitoquímica foi realizada de acordo com os seguintes passos:

 Bloqueio da peroxidase endógena, com o reagente indicado nos respectivos Kit´s de detecção, durante 5 (+ -) minutos;

 Incubação com o anticorpo primário (Tabela 4) durante 30 minutos;

 Lavagem com tampão e incubação com solução de DAB para visualização da imunomarcação;

 Contraste com hematoxilina de Gill III (leica microsystem) durante 2 minutos, diferenciação em água corrente, desidratação e montagem.

Foram incluídos controlos negativos e positivos para assegurar a especificidade da imunomarcação.

29/53

Tabela 4- Painel de anticorpos utilizados (ERS: Epitope Retrieval Solution, MW: microondas)

Anticorpo Clone Diluição Pré-tratamento Casa comerical

Anti-EGFR EGFR pharmDx IHC kit

Code K1492 2-18C9 Pré-diluido 2 minutos em proteinase K DacoCytomation Glostrup, Denmark Anti-P16 CINtec ® Cytology kit,

REF 9521 E6H4 Pré-diluido 10 minutos em ERS-MW (5`+ 5`) MTM, Heidelberg, Germany

6.2.3. A

A quantificação da expressão da imunomarcação foi realizada por 2 observadores independentes, dois citotécnicos (1 e 2) que avaliaram a expressão dos marcadores citológicos. Nesta análise utilizou-se o microscópio óptico DM1000 Leica (Leica Microsystems).

EFRG em Citologia

Na análise citológica a quantificação da expressão imunocitoquimica do marcador EGFR foi efectuada em 2 pontos” hot” seleccionados aleatoriamente com a objectiva de 4X. No campo seleccionado e devidamente marcado, efectuou-se a contagem das células displásias marcadas; displásicas não marcadas; não displásicas marcadas e não displásicas não marcadas, numa ampliação de 40 X.

A contagem de células foi realizada segundo os seguintes critérios: citoplasma marcado e/ou membrana citoplasmática a partir de 50%. Em casos de agrupamentos celulares só foram consideradas células com limites celulares bem definidos, inequivocamente marcadas. A Figura 12 mostra a presença/ ausência de marcação citoplasmática para os diferentes tipos de lesão.