Imidazolidinas esquistomicidas: avaliação ultraestrutural, atividade citotóxica e imunomoduladora

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS. JULIANA KELLE DE ANDRADE LEMOINE NEVES. IMIDAZOLÍDINAS ESQUISTOSSOMICIDAS: AVALIAÇÃO ULTRAESTRUTURAL, ATIVIDADE CITOTÓXICA E IMUNOMODULADORA. RECIFE – 2010.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS. IMIDAZOLÍDINAS ESQUISTOSSOMICIDAS: AVALIAÇÃO ULTRAESTRUTURAL, ATIVIDADE CITOTÓXICA E IMUNOMODULADORA. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Biológicas – Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Doutor em Ciências Biológicas. Orientadora: Dra. Suely Lins Galdino Co-orientadora: Dra. Mônica Camelo P.A. Albuquerque. RECIFE – 2010.

(3) Neves, Juliana Kelle de Andrade Lemoine Imidazolidinas esquistomicidas: avaliação ultraestrutural, atividade citotóxica e imunomoduladora/ Juliana Kelle de Andrade Lemoine Neves. – Recife: O Autor, 2010. 166 folhas : il., fig., tab. Orientadora: Suely Lins Galdino Co-orientadora: Mônica Camelo P.A. Albuquerque Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Ciências Biológicas, 2010. Inclui bibliografia e anexos. 1. Esquistossomose 2. Imidazolidinas 3. Citotoxicidade I. Título.. 616.963. CDD (22.ed.). UFPE/CCB-2010-102.

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(5) "Aquele que tentou e não conseguiu é superior àquele que nada tentou”. Arquimedes.

(6) Dedico a Meu esposo e filho André Lemoine e Ângelo Lemoine Minha mãe Maria José.

(7) AGRADECIMENTOS A Deus que me deu oportunidade de vida, pela força e coragem pela caminhada longa que foi e será; A Professora Dra. Suely Lins Galdino, do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos, do Departamento de Antibióticos da UFPE, pela orientação e credibilidade; A Professora Dra. Mônica Camelo Pessoa Azevedo de Albuquerque, do Departamento de Medicina Tropical da UFPE, pela orientação e credibilidade; Ao Professor Dr. Ivan da Rocha Pitta, do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos, do Departamento de Antibióticos da UFPE, pela cooperação para realização deste trabalho e credibilidade; A Professora Dra. Maria do Carmo Alves de Lima, do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos, do Departamento de Antibióticos da UFPE, pela orientação, incentivo, credibilidade e amizade e por todos momentos de alegria; A Professora Dra. Paloma Lys de Medeiros do Departamento de Histologia e Embriologia da UFPE, pela cooperação e disponibilidade prestada; A Professora Dra. Valéria Rêgo Alves Pereira do Departamento de Imunologia do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães pelos grandes incentivos, colaboração e pela atenção dispensadas no decorrer da reta final do trabalho e esclarecimentos prestados nos momentos de dúvidas; A Dra. Cristiane Moutinho Lagos de Melo do Departamento de Imunologia do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, pela grande amizade, colaboração, dedicação e disponibildade prestada; A Dra. Maira Galdino da Rocha Pitta do Departamento de Antibióticos pela colaboração para realização deste trabalho;.

(8) A Dra. Christina Alves Peixoto do Laboratório de Ultraestrutura do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (FIOCRUZ) e toda sua equipe pela colaboração na realização da microscopia eletrônica de varredura. A Sandra Botelho do Departamento de Antibióticos pela grande ajuda nas sínteses dos compostos; A todos do Laboratório de Imunologia do LIKA, pela colaboração e agradável convívio durante o período de experimentação; Aos colegas do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos (GPIT/UFPE); Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, pela oportunidade do Doutorado; A Adenilda Eugênia de Lima, secretária do Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, pela competência e grande convívio; E a minha família, por sempre acreditar em mim e superarem pacientemente os meus momentos de ausência..

(9) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. Cepa BH – Cepa oriunda de Belo Horizonte – MG DMSO – Dimetilsulfóxido ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ESQ – Esquistossomose FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz FUNASA – Fundação Nacional de Saúde GGVS – Gerência Geral de Vigilância à Saúde GPIT – Grupo de Pesquisa e Inovação Terapêutica IFN- Interferon gama IL – Interleucina LIKA – Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami LPSF – Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos MEC - Matriz Extracelular MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura NO – Óxido nítrico OMS – Organização Mundial de Saúde PECE – Programa Especial de Controle da Esquistossomose UFPE – Universidade Federal de Pernambuco WHO - World Health Organization.

(10) LISTA DE FIGURAS Figura 1:. Medicamentos desenvolvidos entre 1975 a 2004. Fonte: CHIRAC e 20 TORREELE, 2006.. Figura 2:. Theodor Bilharz . Fonte: www.yearofscience.org.. 21. Figura 3:. Vermes adultos de Schistosoma. (A) Macho e (B) Fêmea. Fonte: PICASA, 23 2009.. Figura 4:. Distribuição mundial da esquistossomose. Fonte: GRYSSELS et al, 2006.. 24. Figura 5:. Áreas endêmicas da esquistossomose mansônica no Brasil. Fonte: 25 AMARAL et al., 2006.. Figura 6:. Prevalência da esquistossomose dos municípios da Zona da Mata no. 27. estado de Pernambuco. Fonte: BARBOSA et al., 2006. Figura 7:. Caramujo do gênero Biomphalaria. Fonte: www.york.ac.uk, 2009.. 29. Figura 8:. Segmento anterior do corpo do macho (à esquerda) e da fêmea (à 31 direita), mostrando os principais órgãos: a-ventosa oral e boca, b-porção anterior do intestino, c-acetábulo ou ventosa ventral, d-vesícula seminal, e-canal deferente, f-testículos, g-porção média bifurcada do intestino, hceco, i-orifício genital feminino, j-útero contendo dois ovos, k-um ovo em processo de formação da casca no oótipo, l-oviduto, m- ovário, nviteloduto, o-glândulas vitelinas. Fonte: REY, 2001.. Figura 9:. Fígado sem alterações (A); hepatomegalia com o lóbulo esquerdo 33 aumentado (B), baço com conformações normais (C); esplenomegalia mostrando um crescimento do órgão ultrapassando o ultimo arco costal na altura do umbigo (D). Fonte: medlineplus, 2009.. Figura 10:. Composição celular e de componentes da matri extraceular em 34 granulomas esquistossómticos hepáticos. (Modificado a partir de CARVALHO, et al 2008).. Figura 11:. Tipos de moléculas de adesão, fatores de crescimento e seus receptores 34 em granulomas esquistossomóticos. (Modificado a partir de CARVALHO, et al 2008).. Figura 12:. Esquema da reação granulomatosa em fígado de camundongo. Fonte: 35 HITARA e FUKUMA, 2003..

(11) Figura 13:. Granuloma esquistossomótico. Fonte:38 PEARCE e MACDONALD, 2002.. 36. Figura 14:. Ciclo de vida do Schist45osoma mansoni. Fonte: GRYSSELS et al, 2006.. 38. Figura 15:. Desenvolvimento da resposta imune na infecção. Fonte: PEARCE e 43 MACDONALD, 2002.. Figura 16:. (I). 5,5-Difenil-imidazolidina-2,4-diona e. (II). 5-(p-clorofenil)-5-metil- 45. imidazolidina-2,4-diona. Figura 17:. (I). 5-Benzilideno-2-tioxo-imidazolidin-4-ona e (II) 2-amino-5- 46 benzilideno-imidazolidina-2,4-diona.

(12) LISTA DE TABELAS. Tabela 1:. Grandes editais temáticos na área de doenças negligenciadas.. 21. Tabela 2:. As principais espécies que infectam seres humanos, as regiões onde são 22 encontradas e seus hospedeiros intermediários.. Tabela 3:. Número de infecções das cidades da Zona da Mata do estado de 28 Pernambuco, em destaque as cidades com maior número de infecções.. Tabela 4:. .. Principais fármacos esquistossomicidas desenvolvidos no século. XX.. 50.

(13) SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS RESUMO ABSTRACT 1 INTRODUÇÃO. 15. 2 REVISÃO DA LITERATURA. 18. 2.1 Doenças negligenciadas. 19. 2.2 Esquistossomose. 21. 2.3 Distribuição geográfica e dados epidemiológicos. 23. 2.4 Hospedeiro Intermediário. 29. 2.5 Classificação e morfologia. 30. 2.6 Morbidade, fisiologia e imunopatologia. 32. 2.7 Ciclo biológico. 37. 2.8 Diagnóstico. 38. 2.9 Controle e prevenção quimioterapica. 39. 2.10 Resistência ao tratamento. 40. 2.11 Imunopatologia. 41.

(14) 2.12 Imidazolidinas bioativas. 44. 2.13 Fármacos esquistossomicidas. 46. 3-OBJETIVOS. 53. 3.1 Geral. 54. 3.2 Específicos. 54. 4 CONCLUSÃO. 55. 5 PERSPECTIVAS. 57. 6 REFERÊNCIAS. 59. ANEXOS. 74. Biological and immunological activity of new Imidazolidines front of adult worms of Schistosoma mansoni Immunological studies and in vitro schistosomicide action of new imidazolidine derivatives Antischistosomal action of thioxo-imidazolidine compounds: an ultrastructural study Comissão de Ética de Experimentação Animal.

(15) RESUMO. A esquistossomose é uma doença debilitante e endêmica, distribuída em 74 países, causada por parasitas do gênero Schistosoma, onde existem cinco espécies de interesse médico, apenas o Schistosoma mansoni é endêmico no Brasil. Existem aproximadamente 207 milhões de pessoas infectadas pela esquistossomose no mundo, no Brasil estima-se sete milhões de portadores de esquistossomose mansônica e é considerada uma endemia em franca expansão atingindo aproximadamente 19 estados brasileiros. O praziquantel é o único fármaco para o tratamento de todas as esquistossomoses no mundo. O objetivo do nosso trabalho foi a busca de novos compostos biologicamente ativos para o combate da esquistossomose, através da síntese de derivados imidazolidínicos e avaliação da atividade esquistossomicida. Os derivados imidazolidínicos das séries 5-benzilideno-3-benzil-4tioxo-imidazolidin-2-ona e 5-arilazo-4-tioxo-imidazolidin-2-ona foram avaliados in vitro frente a vermes adultos de Schistosoma mansoni (Cepa BH). Todos derivados avaliados in vitro apresentaram atividade esquistossomicida, sendo que os compostos LPSF/PT05, PT10 e PT11 provocaram mortalidade de 100% em 24 horas nas concentrações de 320 e 200 M e o LPSF/PT09 mortalidade de 100% em 48 horas também na maior concentração 320 M. O LPSF/PT05 e LPSF/PT10 foram analisado em microscopia eletrônica de varredura. Os derivados também foram avaliados quanto a citotoxicidade e viabilidade celular, apresentando uma toxicidade inferior ao praziquantel e uma baixa mortalidade celular (apoptose e necrose) em relação ao padrão. Na dosagem de citocinas (IL-10 e IFN- ) nenhum dos compostos apresentou indução dessas proteínas, porém todos os compostos analisados apresentaram uma indução no óxido nítrico estatisticamente significativo.. Palavras-chave: Esquistossomose, imidazolidinadionas, Ensaios in vitro ..

(16) ABSTRACT. Schistosomiasis is a debilitating and endemic, distributed in 74 countries, caused by parasites of the genus Schistosoma, which has five species of medical interest, only the Schistosoma mansoni is endemic in Brazil. There are approximately 207 million people infected with schistosomiasis in the world, in Brazil an estimated seven million people with schistosomiasis and is considered an endemic disease on the rise amounting to about 19 states. The Praziquantel is the main drug for the treatment of schistosomiasis in all the world. The aim of our study was the search for new biologically active compounds for the fight against schistosomiasis, through the synthesis of imidazolidine. Derivatives imidazolidine series 5-benzylidene-3-benzyl-4-thioxo-imidazolidin-2-one and 5-arilazo-4thioxo-imidazolidin-2-one were evaluated in vitro against the adult worms of Schistosoma mansoni (strain BH). Derivatives evaluated in vitro all showed schistosomicidal activity and the LPSF/PT05, PT10 and PT11 had 100% mortality within 24 hours in higher concentrations 320 and 200 M and LPSF/PT09 100% mortality within 48 hours also the highest concentration 320 M. The LPSF/PT05 e LPSF/PT10 analyzed in scanning electron microscopy. Derivatives were also evaluated for cytotoxicity and cell viability, showing a lower toxicity to praziquantel and a low mortality in relation to the cellular standard. The measurement of cytokines (IL-10 e IFN- ) none of the compounds showed induction, but all the compounds showed an induction analyzes nitric oxide statistically significant.. Keywords: Schistosomiasis, imidazolidinedione, Assay in vitro..

(17) INTRODUÇÃO.

(18) 1. Introdução A Química Medicinal estuda as razões moleculares da ação dos fármacos de maneira a descrever a relação entre a estrutura química e a atividade farmacológica, hierarquizando as diferentes contribuições funcionais. No contexto inverso, inclui-se o planejamento e o desenho estrutural de novas substâncias que possuam propriedades farmacoterapêuticas úteis, capazes de representarem novas entidades químicas, candidatas a protótipos de novos fármacos de uso seguro. A química medicinal é uma disciplina híbrida que está no centro de um grande espaço inter e multidisciplinar constituído pela biofísica, biologia molecular, bioquímica, clínica médica, físico-química, fisiologia, patologia, química biológica, química inorgânica, química orgânica, entre outras. Tratando do planejamento racional das drogas, sua síntese, sua elucidação estrutural, o desenvolvimento de ensaios farmacológicos e estudos de relações estrutura-atividade farmacológica (WILLIAMS e LEMKE, 2002; IUPAC, 2010). As doenças infecciosas parasitárias continuam sendo um obstáculo ao desenvolvimento social e econômico dos países mais pobres, afetando as populações pobres e marginalizadas. As alternativas quimioterápicas para o tratamento da maioria das doenças parasitárias são extremamente limitadas. A esquistossomose, doença debilitante causada por parasitas do gênero Schistosoma constitui um dos maiores problemas mundiais enfrentados na saúde pública, visto que está distribuída em várias regiões geográficas. E mundialmente só perde para malária em número de pessoas infectadas (CARVALHO et al, 2008). O Schistosoma. é endêmico, afetando, aproximadamente, 76 países tropicais e. subtropicais, principalmente países da África, Ásia e América Latina, sendo que nas Américas, ocorre apenas a espécie S. mansoni. No Brasil, ocorre nas regiões Norte, Nordeste, e no Norte das regiões Sul e Sudeste (GREVELDING, 2004). Atualmente, estima-se no mundo 207 milhões de pessoas infectadas com as esquistossomoses, com um total de 650 milhões expostos ao risco de contrair a doença. Há aproximadamente seis a oito milhões de portadores de esquistossomose mansoni no Brasil. No mundo o S. mansoni infecta cerca de 70 milhões de indivíduos (CHITSULO et al., 2000; CIMERMAN, 2001; WHO, 2008)..

(19) O ciclo do Schistosoma é complexo, pois exige a presença de hospedeiro intermediário, representados por diferentes espécies de moluscos pertencentes ao gênero: Bullinus, Biomphalaria, Oncomelania e Neotricula (CARRERA, 1990; NEVES,2005), com as seguintes formas evolutivas do S. mansoni: verme adulto (macho e fêmea), ovo, miracídio, esporocisto, cercária e esquistossômulo. Na dependência de elevadas cargas parasitárias e, conseqüentemente, do número de ovos com formações granulomatosas, instala-se, progressivamente, o regime de hipertensão portal, com o conseqüente aparecimento de esplenomegalia de caráter congestivo e de circulação colateral, inclusive de varizes de esôfago. As fêmeas liberam centenas de ovos por dia, um número substancial ficam presos ao intestino e fígado, principalmente. Tem-se, assim, a forma hepatoesplênica com hipertensão portal da esquistossomose, definida como descompensada quando houver sangramento digestivo alto (GRYSCHEK, 2001; HELMY et al., 2009). Há relatos de resistência ao praziquantel em cepas de Schistosoma principalmente na África, aonde o fármaco vem sendo utilizado agressivamente por longos períodos. Com a possível resistência a este fármaco são utilizadas doses maiores para se obter um melhor resultado (LIANG, 2001; ISMAIL et al., 1996). Porém, faz-se necessário o desenvolvimento de vacinas e o planejamento e síntese de novos fármacos que constituem novas alternativas terapêuticas para a parasitose em questão. As imidazolidinas tiveram no passado um representante na clínica médica como um fármaco de ação comprovada frente a vermes adultos de S. mansoni, o niridazol (CATTO; TRACY; WEBSTER, 1984). A propriedade esquistossomicida in vitro frente a vermes adultos de S. mansoni dos derivados imidazolidínicos vem sendo relatada por Oliveira e colaboradores (2004) e Albuquerque e colaboradores (2006). Derivados imidazolidínicos sintetizados por nossa equipe no Laboratório de Síntese e Planejamento de Fármacos-LSPF, ressaltam a contribuição química do núcleo imidazolidínico. Os resultados já obtidos com derivados imidazolidinônicos-3,5dissubstituídos revelam que estas moléculas são portadores de significante atividade esquistossomicida (OLIVEIRA et. al., 2004; SOARES, 2004; ALBUQUERQUE et. al., 2005; PITTA, 2005)..

(20) REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.

(21) 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Doenças negligenciadas Doenças negligenciadas são doenças que não só prevalecem em condições de pobreza, mas também contribuem para a manutenção do quadro de desigualdade, já que representam forte entrave ao desenvolvimento dos países. Como exemplos de doenças negligenciadas, podemos citar: dengue, doença de Chagas, esquistossomose, hanseníase, leishmaniose, malária, tuberculose, entre outras. Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), mais de um bilhão de pessoas estão infectadas com uma ou mais doenças negligenciadas, o que representa um sexto da população mundial (BRASIL, 2010). Essas doenças têm sido progressivamente marginalizadas por aqueles encarregados pelos programas de pesquisa tanto do setor público quanto do privado, essencialmente porque as pessoas que sofrem de doenças negligenciadas são pobres, e não oferecem um retorno lucrativo suficiente para que a indústria farmacêutica invista em pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos voltados para tais doenças. Fica claro, portanto, que a crise na falta de medicamentos para doenças negligenciadas não chegou às atuais proporções por falta de conhecimento científico, e nem somente pelo hiato entre a pesquisa básica e a pré-clínica. Esta crise é o resultado tanto das insuficientes políticas públicas voltadas para P&D de medicamentos de interesse nacional dos países em desenvolvimento, quanto da falha de mercado, provocada pelo baixo interesse econômico que esses pacientes representam para a indústria (CHIRAC e TORREELE, 2006; MJUR, 2007). Entre 1975 e 2004, apenas 21 medicamentos (figura 01) foram registrados para doenças tropicais e tuberculose, ainda que estas doenças constituam mais de 11% da carga global de doenças. Durante o mesmo período, 1.535 medicamentos foram registrados para outras doenças (CHIRAC e TORREELE, 2006)..

(22) .. Figura 1: Medicamentos desenvolvidos entre 1975 a 2004. Fonte: CHIRAC e TORREELE, 2006.. Um estudo sobre o financiamento mundial de inovação terapêutica para doenças negligenciadas revelou que menos de 5% deste financiamento foram investidos no grupo das doenças negligenciadas, ou seja, doença do sono, leishmaniose visceral, esquistossomose e doença de Chagas, ainda que mais de 500 milhões de pessoas sejam ameaçadas por estas quatro doenças parasitárias (MORAN, 2009). No intuito de agregar grupos de pesquisa e apoiar atividades de pesquisas científicas, tecnológicas e de inovação (tabela 1), em 2008, foram selecionados projetos para formação e consolidação de institutos nacionais de ciência e tecnologia (INCT), em uma iniciativa do MS, MCT, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Banco Nacional de Desenvolvimento Econômico e Social (BNDES) e das FAP do Amazonas, Minas Gerais, Pará, Rio de Janeiro, São Paulo e Santa Catarina. Entre os INCT que tiveram recursos do MS, existem alguns com grande potencial de contribuição para a temática de doenças negligenciadas e o combate às doenças: INCT em Tuberculose, INCT de Gestão da Inovação em Doenças Negligenciadas, INCT de Biotecnologia Estrutural e Química Medicinal em Doenças Infecciosas e INCT de Vacinas (BRASIL, 2010)..

(23) Tabela 1. Grandes editais temáticos na área de doenças negligenciadas. ANO 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009. EDITAL Rede Tuberculose Dengue Hanseníase Doenças negligenciadasa Doenças negligenciadas Rede Malária Rede Dengue. RECURSOS R$ 1,9 milhões R$ 945 mil R$ 2,5 milhões R$ 17 milhões R$ 22 milhões R$ 15,4 milhões R$ 22,7 milhões. a. Diferentemente do edital de 2008, o edital de doenças negligenciadas de 2006 não incluiu esquistossomose (BRASIL, 2010).. 2.2 Esquistossomose Foi Bilharz (figura 2), em 1852, quem descreveu um parasita intravascular durante uma necropsia em um rapaz, para qual deu o nome de Distomum haematobium e posteriormente em 1858 Weinland denominou o gênero deste helminto de Schistosoma. A doença é popularmente conhecida como “xistose”, “barriga-d’água” ou “mal-docaramujo” o qual foi trazida durante o tráfico de escravos e com os imigrantes orientais e asiáticos, entretanto, apenas o S. mansoni se fixou por encontrar bons hospedeiros intermediários e pelas condições ambientais semelhantes às da região de origem (figura 06) (REY, 2001; NEVES, 2005). De acordo com a Organização Mundial da Saúde existem cinco espécies de Schistosoma que representam risco a saúde publica devido a sua capacidade de infectar humanos (tabela 2).. Figura 2: Theodor Bilharz. Fonte: www.yearofscience.org.

(24) Tabela 2: Principais espécies que infectam seres humanos, as regiões onde são encontradas e seus hospedeiros intermediários. Espécies de Schistosoma. Regiões Endêmicas. Gêneros de caramujo. Esquistossomose intestinal. S. mansoni. África, Oriente Médio e América. Biomphalaria. do Sul S. intercalatum. África (raro, somente no oeste da. Bulinus. África) S. japonicum. Ásia (primeiramente encontrado no. Japão,. hoje. ocorre Oncomelania. principalmente na China). S. mekongi. Ásia (próximo ao rio Mekongi). Neotricula. África e Oriente Médio. Bulinus. Esquistossomose urinária. S.haematobium. Fonte: WHO, 2009 As espécies do gênero Schistosoma, que têm importância epidemiológica em medicina humana, são o S. haematobium, S. japonicum, S. mekongi, S. intercalantum e o S. mansoni. Os vermes adultos vivem no sistema porta migrando para as veias mesentéricas causando lesões em vários órgãos (MALTA, 1994; NEVES, 2005)..

(25) O Schistosoma é um trematódeo da família Schistosomatidae que compreende espécies completamente adaptadas ao parasitismo que se aloja nos vasos sanguíneos. Ao contrário de outros trematódeos, os causadores da esquistossomose não são hermafroditas, ou seja, possuem sexos separados, os machos são achatados e as fêmeas são finas e cilíndricas (figura 03). As espécies diferenciam por sua morfologia, forma de diagnóstico, gêneros do hospedeiro intermediário e localização do parasita no hospedeiro.. A B. Figura 3: Vermes adultos de Schistosoma. (A) Macho e (B) Fêmea. Fonte: PICASA, 2009.. 2.3 Distribuição geográfica e dados epidemiológicos Apesar do sucesso dos programas de controle, estima-se no mundo 207 milhões de pessoas infectadas (BLANCHARD, 2004) com 120 milhões sintomáticas e 20 milhões com a doença em estado agravado, sendo um total de 650 milhões expostos ao risco de contrair a doença de uma das esquistossomoses (CHITSULO et al., 2000; WHO, 2009) (figura 4). Entre 207 milhões de pessoas com a doença, 85 % vivem na África, onde a grande maioria das fatalidades ocorre devido ao S. haematobium, porém o S. mansoni causa 130.000 mortes por ano, pela hipertensão portal (WHO, 2007). No mundo, existem aproximadamente 70 milhões de infectados pelo S. mansoni (CHITSULO et al., 2004; CIMERMAN, 2001)..

(26) Figura 4: Distribuição Mundial da Esquistossomose. Fonte: GRYSSELS et al, 2006.. No Brasil, antes da implantação do Programa Especial de Controle da Esquistossomose (PECE), a esquistossomose atingia entre dez e doze milhões de pessoas, sendo considerada uma das mais importantes áreas de ocorrência da doença (BINA e PRATA, 2003). Há cerca de 7,01 milhões de portadores de esquistossomose mansoni (CHITSULO et al., 2004; CIMERMAN, 2001) (figura 5). No país, a área endêmica para esquistossomose abrange 19 estados com aproximadamente 26 milhões de habitantes expostos ao risco. Ocorre de forma endêmica e focal desde o estado do Maranhão até Minas Gerais (FUNASA, 2002)..

(27) Figura 5: Áreas endêmicas da esquistossomose mansônica no Brasil. Fonte: AMARAL et al., 2006.. A esquistossomose é primariamente uma endemia rural e periurbana que, em algumas cidades como Belo Horizonte, Salvador e Recife estão tornando-se urbana, devido à migração descontrolada e à falta de saneamento básico. No Nordeste vem sendo registrado na Região Metropolitana do Recife, imposta por uma mudança na indústria agroaçucareira que vem promovendo o deslocamento de trabalhadores para a periferia das grandes cidades, onde não há condições básicas de saneamento e moradia, favorecendo o surgimento de novos focos urbanos da doença como os registrados em São Lourenço da Mata e na Ilha de Itamaracá (IGLÉSIAS, 1997; BARBOSA et al. 2000; XIMENES et al., 2000; BERGQUIST, 2002)..

(28) A esquistossomose é endêmica em 90 dos 185 municípios do Estado de Pernambuco. Com uma área total de 98.933 Km², o Estado possui 19.425 Km² de área esquistossomótica, sendo 16.693 Km² de área endêmica e área focal de 2.732 Km², os quais correspondem a um percentual de 19,63 % da superfície pernambucana. A prevalência média foi de 8,7 % e a média anual de internações, de 1999 a 2003, foi de 377, taxa de 5,12/10 mil internações. O número médio de óbitos, de 1998 a 2002, foi de 139,2 com taxa de mortalidade de 1,76/100 mil habitantes (GGVS/LABEND/ESQ, 2001; BRASIL, 2005). A figura 6 mostra a prevalência da esquistossomose nos municípios da Zona da Mata do estado de Pernambuco, na parte mais clara com prevalência moderada de 10 a 50% e na parte mais escura com prevalência baixa, menor que 10% (BARBOSA et al., 2006), na tabela 3 mostra o número de infecções das cidades da Zona da Mata, destacando-se os municípios de Aliança, Condado, Escada, Itambé, Itaquitinga, Jaqueira, Rio Fomoso e Tracunháem com prevalência alta de número de pessoas infectadas com Schistosoma mansoni..

(29) 10%-50% (prevalência moderada) < 10% (baixa prevalência). Figura 6: Prevalência da esquistossomose dos municípios da Zona da Mata no estado de Pernambuco (BARBOSA et al., 2006)..

(30) Tabela 3: Número de infecções das cidades da Zona da Mata do estado de Pernambuco, em destaque as cidades com maior número de infecções.. Município epg. Escolas. Examinados. %SM. GM. (BARBOSA et al., 2006).

(31) 2.4 Hospedeiro intermediário Em 1913, foi descrito o hospedeiro intermediário da doença: moluscos do gênero Biomphalaria (figura 7) com concha espiral plana, que podem medir de 10 a 40 mm. Miyaki e Suzuki, autores do feito inédito, demonstraram também que a cercária (larva do Schistosoma) transmite a doença ao homem quando penetra em sua pele.. Figura 7: Caramujo do gênero Biomphalaria. Fonte: www.york.ac.uk, 2009. Os caramujos transmissores da esquistossomose mansoni no Brasil pertencem ao: Filo Mollusca Classe Gastropoda Subclasse Pulmonata Ordem Basommatophora Família Planorbidae Gênero Biomphalaria Já foram identificadas dez espécies pertencentes ao gênero Biomphalaria no Brasil. São elas: B. glabrata, B. tenagophila, B. straminea, B. amazonica, B. peregrina, B. occidentalis, B. intermedia, B. schrammi, B. oligoza e B. kuhniana. Destas, apenas as três primeiras foram encontradas eliminando cercárias na natureza, sendo, portanto, transmissoras da esquistossomose mansoni nas Américas (BARNES, 1996). São moluscos de água doce, conhecidos como planorbídeos e, popularmente, como caramujos, têm a concha em espiral, com as voltas ou giros no mesmo plano e, por isso, recebem a denominação de planorbídeo. Os caramujos planorbídeos criam-se e vivem na água doce de corrégos, riachos, valas, alagados, brejos, açudes, represas ou outros locais onde haja pouca correnteza, quando jovens alimentam-se de vegetais em decomposição e de folhas verdes e põem ovos, dos quais, depois de alguns dias, nascem novos caramujos.

(32) que crescem e tornam-se adultos. O hábitat de preferência do Biomphalaria para colonização é de microflora rica, bastante matéria orgânica, boa insolação, temperatura média da água entre 20°C e 26°C, pH neutro tendendo a alcalino, salinidade abaixo de 3 por 1.000, pouca turbidez e velocidade da água inferior a 30cm/s, com leito raso, lodoso ou rochoso e vegetação enraizada mais próxima das margens (NEVES, 2005). O B. glabrata é o mais importante transmissor de S. mansoni na região neotropical, não só pelo alto grau de suscetibilidade de suas populações ao parasito como pela extensão de sua distribuição geográfica (CARVALHO, 2008). 2.5 Classificação e morfologia Os parasitas transmissores da esquistossomose pertencem. Reino Animalia Sub-reino Metazoa Filo Platyhelmintes Classe Trematoda Subclasse Digenea Superfamília Schistosomatoidea Família Schistosomatidae Subfamília Schistosomatinae Gênero Schistosoma (BARNES, 1996). O S. mansoni macho mede entre 0,6 a 1,4 cm de comprimento por 0,11 cm de largura e sua cor é branca. É largo na posição mediana e afilado nas extremidades do corpo. Na extremidade anterior traz uma ventosa oral afunilada e logo após uma segunda ventosa, a ventral, pedunculada, também denominada de acetábulo e ainda um canal ginecóforo, onde fica alojada a fêmea. O aparelho genital masculino compreende de seis a oito massas testiculares pequenas, situadas dorso ventralmente, no início do segmento posterior. A fêmea tem o corpo cilíndrico comprido e fino medindo cerca de 1,2 a 1,6 cm de comprimento por 0,016 cm de largura, sua cor é acinzentada devido ao tubo digestivo.

(33) conter um pigmento derivado da digestão sanguínea, hemozoína. Em sua região anterior, existem estruturas especializadas na fixação do verme ao hospedeiro, as ventosas, estando a ventosa acetabular e pedunculada muito perto da oral. O ovário é oblongo e lobado, ficando na metade anterior do corpo. Nos dois sexos, o tubo digestivo se inicia na extremidade anterior, no fundo da ventosa oral, compreendendo um esôfago sem espessamento muscular, o sistema excretor, tem início nos solenócitos, convergindo para dois canais longitudinais que desembocam em uma pequena vesícula excretora (BARNES et al., 1996; REY, 2001) (figura 8).. Figura 8: Segmento anterior do corpo do macho (à esquerda) e da fêmea (à direita), mostrando os principais órgãos: a-ventosa oral e boca, b-porção anterior do intestino, cacetábulo ou ventosa ventral, d-vesícula seminal, e-canal deferente, f-testículos, g-porção média bifurcada do intestino, h-ceco, i-orifício genital feminino, j-útero contendo dois ovos, k-um ovo em processo de formação da casca no oótipo, l-oviduto, m-ovário, nviteloduto, o-glândulas vitelinas (REY, 2001). Após alguns dias de infecção no hospedeiro definitivo, os esquistossômulos chegam ao fígado e alimentam-se de sangue, na terceira semana começa a atração dos sexos por.

(34) quimiotaxia, iniciando o acasalamento e completam seu desenvolvimento na quarta semana e migram para as vênulas, mesentério e plexo hemorroidário. A nutrição deles é feita através da ingestão de sangue venoso (REY, 2002; NEVES, 2005). 2.6 Morbidade, fisiopatologia e imunopatologia Embora a parasitose possa resultar em morte, a sua natureza crônica reduz a capacidade das pessoas infectadas para o trabalho. Em crianças, pode causar anemia, nanismo e de uma reduzida capacidade de aprender (WHO, 2009). A principal causa de mortalidade e morbidade na esquistossomose humana são as fibroses hepáticas, que envolve o espaço portal, devido a isso a resposta granulomatosa e a fibrose hepática vêm sendo intensamente estudadas na patogênese da resposta imune celular do S. mansoni. O granuloma tem um papel hepatoprotetor por sequestrar as toxinas secretadas pelos ovos (PHILLIPS e COLLEY, 1978). A doença é causada principalmente pela deposição dos ovos dos vermes adultos nos vasos sanguíneos que rodeiam a bexiga ou intestinos. O sinal clássico da esquistossomose urinária é hematúria (sangue na urina). Fibrose ureteral e hidronefrose são achados comuns em casos avançados, e o câncer na bexiga também é uma possível complicação em estágio final. Na esquistossomose intestinal um quadro clínico de dor abdominal, diarréia, sangue nas fezes e fígado aumentado é comum em casos avançados e freqüentemente associada à ascite e outros sinais de aumento da pressão portal. Nesses casos, pode haver também esplenomegalia (LOPES et al., 2008; WHO, 2008). Diante diso, a formação de granuloma associada a fibrose poderá conduzir a hipertensão portal, uma das maiores causas de mortalidade e morbidade da esquistossomose (LOPES et al., 2008). As agressões que ocorrem no organismo parasitado pelo S. mansoni são decorrentes das lesões diretas do parasito e da resposta do hospedeiro a tais lesões (PRATA, 1996). A maioria das pessoas infectadas permanece assintomáticas. A sintomatologia clínica corresponde ao estágio de desenvolvimento do parasito no hospedeiro, podendo ser dividida em:.

(35) a)Dermatite Cercariana, fase de penetração das cercárias através da pele. Varia desde assintomática até uma dermatite urticariforme, com erupção papular, eritema, edema e prurido, podendo durar até cinco dias após a infecção; b)Esquistossomose Aguda caracteriza-se após 3-7 semanas de exposição com febre, anorexia, dor abdominal e cefaléia. Com menor freqüência, o paciente pode apresentar diarréia, náuseas, vômitos, tosse seca. Também conhecida como febre de KATAYAMA (DOHERTY et al., 1996), a esquistossomose aguda é comum em áreas de alta taxa de transmissão, que são mediados por formação de imunocomplexos e na maioria do casos com a deposição de ovos nos tecidos do hospedeiro. Sintomas respiratórios também foram descritos, (70% dos casos) do que em pacientes infectados por S. haematobium (BETHLEM et al., 1997; COOKE et al., 1999). As manifestação inflamatória deve-se ao processo migratório do parasita, que passa pelos pulmões (pequena circulação), antes de atingir o sistema hepático (SCHWARTZ et al., 2000; SALANTRINI et al., 2002; ROSS et al., 2002). c)Esquistossomose Crônica, fase que se inicia a partir dos seis meses após a infecção, podendo durar vários anos. Podendo surgir os sinais de progressão da doença em diversos órgãos, atingindo graus extremos de severidade como hipertensão pulmonar e portal, ascite, ruptura de varizes do esôfago (figura 10) (REESE et al., 1989; REY, 2002; GRYSSELS et al, 2006).. Figura 9 - Fígado sem alterações (A); hepatomegalia com o lóbulo esquerdo aumentado (B), baço com conformações normais (C); esplenomegalia mostrando um crescimento do órgão ultrapassando o ultimo arco costal na altura do umbigo (D). Fonte:medlineplus, 2009..

(36) A esquistossomose humana e experimental é uma doença sistêmica podendo comprometer vários órgãos, como fígado, baço, intestino e outros. Porém, a maioria dos estudos se concentra nas alterações hepáticas e intestinais. Três alterações patológicas merecem mais destaque: presença de granulomas, fibrose de Symmer e alterações vasculares, como hipertensão portal, varizes esofágicas (ANDRADE, 2004). Os granulomas provocados por ovos de Schistosoma mansoni expressam durante o seu desenvolvimento (maturação e involução) vários componentes de matriz extracelular (MEC) (figura 11) e várias moléculas de adesão (CAMs) (figura 12), os quais são especialmente distribuídos em seu interior e sofrem variações (modulações) temporais, em suas expressões. TIPOS DE CÉLULA Monócitos/Macrófagos Células epitelióides Eosinófilos Neutrófilos Mastócitos Linfócitos (T, B, K) Fibroblastos Miofibroblastos COMPONENTES DA MATRIZ EXTRACELULAR Colágenos Fibronectina Fibras elásticas Figura 10: Composição celular e de componentes da matri extraceular em Laminina granulomas esquistossómticos hepáticos (Modificado a partir de CARVALHO, et al 2008). MOLÉCULAS DE ADESÃO Integrinas Selectinas Imunoglobulinas Caderina Octudinas Conexinas. FATORES DE CRESCIMENTO Fator estimulador de colônias (CSF) Entropoetina Leptina Fator transformador de crescimento beta (TGF- ) Interferon gama (IFN- ). Figura 11: Tipos de moléculas de adesão, fatores de crescimento e seus receptores em granulomas esquistossomóticos (Modificado a partir de CARVALHO, et al 2008)..

(37) Com a maturação dos ovos, os neutrófilos começam a infiltra-se em torno deles com aproximadamente oito dias de implantação dos ovos. Com o surgimento de uma extensa necrose aparecem células como macrófagos, linfócitos, fibroblastos e eosinófilos entorno da lesão (10 dias). O aumento da reação do tecido chega ao máximo em duas semanas, com necrose dos hepatócitos, rodeados de componentes da matriz extracelular. Em quatro semanas a reposta Th1 diminui e a Th2 aumenta juntamente com as IL-4, IL-5, e IL-13 e com seis semanas a fibrose hepática (HIRATA e FUKUMA, 2003) (figura 13).. 0 dia. 8 dias. 2 semanas. 10 dias. 4 semanas. 6 semanas. Figura 12: Esquema da reação granulomatosa em fígado de camundongo. Fonte: HITARA e FUKUMA, 2003.. O granuloma é um nódulo de tecido inflamatório composto de agregado de macrófagos ativados e de linfócitos T, muitas vezes com associação de necrose e fibrose.

(38) (figura 14). A inflamação granulomatosa é uma forma de reação de hipersensibilidade tardia (TH), frequentemente em resposta aos microrganismos persistentes. Ele é encontrado num grupo relativamente pequeno de doenças infecciosas e autoimunes, sendo definido como uma área focal de inflamação granulomatosa (WYNN e CHEEVER, 1995).. Hepatócitos. Ovo. Colágeno Eosinófilo Macrófago. CD4+ T Outras Cél. Figura 13: Granuloma esquistossomótico. Fonte: PEARCE e MACDONALD, 2002.. O granuloma atinge o seu maior tamanho durante a fase aguda da infecção, diminuindo na fase crônica. Nesse processo são envolvidos vários mecanismos, incluindo alterações nos padrões de citocinas produzidas por células Th1 e Th2 (MONTESANO et al., 1997). Consiste de um agregado microscópico de células epitelióides rodeadas por um colar de linfócitos e eventualmente alguns plasmócitos. Sua gênese está fortemente relacionada a processos imunes e suas células apresentam, nas preparações de rotina, um.

(39) citoplasma rosa-pálido, com grânulos, que aparenta se fundir com o citoplasma das células vizinhas. O núcleo é oval ou alongado, menos denso que o de um linfócito e pode apresentar dobras na membrana nuclear. Granulomas de idade ”avançada” desenvolvem uma cápsula formada por fibroblastos e tecido conectivo (NEVES, 2005). O elemento anatopatológico básico do processo esquistossomótico crônico e sua lesão típica é o granuloma que se forma do ovo do parasita. Os antígenos secretados no interior do ovo maduro atravessam os tecidos e se disseminam nas circunvizinhanças destes, que são chamados de antígenos solúveis do ovo (SEA) que são fundamentais para a formação da reação granulomatosa, ou seja da doença (REY, 2001; NEVES, 2005).. 2.7 Ciclo Biológico O ciclo evolutivo do S. mansoni é do tipo heteroxênico com dois hospedeiros, um intermediário (molusco) e um definitivo (vertebrado). Os ovos do S. mansoni são eliminados pelas fezes do hospedeiro definitivo (figura 9), homem. Na água, estes eclodem, liberando larvas microscópicas, ciliadas, chamadas de miracídio, que completam o seu ciclo vital em apenas 48 horas. Se não encontram um hospedeiro intermediário, essas larvas, ficam incapazes de infestar o homem e morrem. Mas se encontram os hospedeiros apropriados, nele penetram e aí continuam o seu ciclo evolutivo formando esporocistos dando origem a novas larvas que retornam ao meio líquido. Após 4-6 semanas os caramujos começam a liberar as cercarias, elas nadam através de movimentos vibratórios e circulares até encontrar um hospedeiro vertebrado, e penetrar ativamente por sua pele, onde perdem a cauda e transformam-se em esquistossômulos (BLANCHARD, 2004). Aqueles que não são destruídos pelo sistema imunológico do hospedeiro, seguem através da corrente sanguínea, passando pelo coração, pulmões e fígado. Nos vasos do sistema porta-hepático, eles alcançam a fase adulta, acasalam-se e migram para as vênulas da parede intestinal, onde o ciclo começa novamente (ROSS et al, 2002). Um verme adulto vive, em média, 3-5 anos, mas pode alcançar 30 anos. O potencial teórico de reprodução de um par de vermes é aproximadamente de 600 bilhões de esquistossomos (GRYSSELS et al, 2006)..

(40) Figura 14: Ciclo de vida do Schistosoma mansoni. Fonte: GRYSSELS et al, 2006.. 2.8 Diagnóstico No diagnóstico clínico, deve-se levar em conta a fase da doença e o histórico do paciente tais como origem, hábitos, contato com água, entre outros. Algumas formas de diagnósticos podem ser aplicadas: exame parasitológico das fezes, biópsia ou raspagem da mucosa retal, testes sorológicos, ultra-sonografia, palpação do fígado e baço. A esquistossomose pode ser confundida com diversas doenças, em função das diferentes manifestações que ocorrem durante sua evolução: Dermatite cercariana – seu quadro clínico pode ser confundido com manifestações exantemáticas como sarampo, rubéola, escarlatina e dermatites causadas por outros tipos de cercárias de aves aquáticas..

(41) Esquistossomose aguda ou toxêmica – o diagnóstico diferencial deve ser feito com outras doenças infecciosas agudas, tais como febre tifóide, malária, hepatite viral anictérica, estrongiloidíase, amebíase, mononucleose, tuberculose miliar e ancilostomose aguda. Esquistossomose crônica – nessa fase, a doença pode ser confundida com amebíase, estrongiloidíase, giardiase e demais parasitoses, além de outras afecções que cursam com hepatoesplenomegalia, tais como calazar, leucemia, linfoma, salmonelose prolongada, esplenomegalia tropical e cirroses. Para se chegar ao diagnóstico da esquistossomose é muito importante não apenas os resultados laboratoriais mas também os dados epidemiológicos, como história de banhos em águas com caramujos e procedência do doente. A esquistossomose aguda, por exemplo, é mais freqüente em pessoas que não vivem em áreas endêmicas (BRASIL, 2005). No diagnóstico parasitológico ou exame de fezes pode ser feito utilizando o método de Hoffman, que é uma técnica qualitativa de sedimentação espontânea, e pelo o método de Kato-Katz que é uma técnica quantitativa que determina o número de ovos por grama de fezes indicando a carga parasitária (KATZ et al., 1972). A biópsia ou raspagem da mucosa retal, apesar de não fazer parte dos exames de rotina, é recomendável em casos suspeitos com parasitológico negativo, além de permitir uma verificação mais rápida do efeito da quimioterapia, entretanto o resultado não significa necessariamente a cura, pois as fêmeas podem não terem sido mortas, mas somente cessado temporariamente a postura de ovos (NEVES, 2005). Os testes sorológicos não possuem sensibilidade/especificidade suficiente para sua aplicação. A ultra-sonografia é um dos diagnósticos mais importantes, principalmente na fase crônica da doença onde são observadas as alterações hepáticas e determinado com precisão o grau de fibrose (REY, 2001; FUNASA, 2003).. 2.9 Controle e prevenção quimioterápica O controle da esquistossomose é um desafio para muitos países endêmicos. Apesar dos esforços para controlar a doença ela continua sendo uma das infecções parasitárias mais prevalentes do mundo e um problema de saúde pública mundial, perdendo apenas para a malária nos países tropicais e subtropicais (SAVIOLI et al., 1997)..

(42) A nova estratégia coordenada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) sobre uso de drogas antihelmintica tornará possível o controle da esquistossomose em comunidades pobres e marginalizados, por conta do baixo custo e segurança dos medicamentos que agora estão amplamente disponíveis (WHO, 2008). No combate à esquistossomose várias medidas devem ser adotadas como, eliminação sistemática dos hospedeiros intermediários no seu habitat natural, drenagem de lagos e córregos ou pelo combate biológico empregando peixes, a tilápia, que se alimenta desse molusco. No entanto não é uma medida correta vista o desequilíbrio ecológico. Outra medida seria identificar as áreas contaminadas e submetê-las a processos de saneamento. Evitando que os excrementos de pessoas portadoras da doença possam ser carregados pela água das chuvas. As medidas de profilaxia consistem basicamente em medidas preventivas, de fundamental educação sanitária das populações sobre o modo de transmissão da doença. Assim como o tratamento da população infectada (OLIVEIRA, 1997; REY, 2002). A estratégia para o controle da esquistossomose tem como objetivo reduzir a mortalidade através do tratamento com praziquantel, que é a única droga disponível. Praziquantel tem sido utilizado com sucesso nos últimos 20 anos para a esquistossomose no Brasil, Camboja, China, Egito, Marrocos e Arábia Saudita. Tratamento pelo menos três vezes durante a infância para a prevenção da doença na idade adulta. O recente foco e consenso sobre doenças tropicais negligenciadas, sublinharam que algumas destas doenças podem ser tratadas em larga escala com medicamentos seguros e eficazes, e em intervalos regulares. Tal tratamento é feito individualmente, sem diagnóstico, assim que defini a área hiperendêmica. O Praziquantel é o fármaco utilizado para o tratamento de todas as esquistossomoses, no entanto está havendo falhas em estudos nos laboratórios e no campo (CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2004; RENGANATHAN e CIOLI, 1998).. 2.10 Resistência ao Tratamento A evolução da resistência dos helmintos é decorrente da inexistência de métodos para detectar o seu desenvolvimento. Então, muitos casos não são detectados em estágios iniciais, reduzindo ou mesmo anulando, a possibilidade do processo ser revertido. Para diminuir os níveis de resistência, recomenda-se prosseguir a terapia com cautela ou retirar.

(43) totalmente o medicamento. Para os portadores da esquistossomose torna-se impossível, pois o Praziquantel representa o único medicamento capaz de combater a doença (BENNETT et al., 1997; CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2004). Resistência a um determinado fármaco, significa que houve uma redução na sensibilidade após ter sido tratada por ele. Tolerância é uma insensibilidade ao fármaco inata, onde a população não tinha tido contato prévio com o mesmo (DOENHOFF et al., 2002). O uso de quimioterápicos no controle de doenças infecciosas ao longo do tempo pode ser apontado como fator principal no desenvolvimento de resistências. O uso extensivo e doses exageradas de anti-helmínticos poderá resultar na resistência, afetado o controle das parasitoses. A resistência aos fármacos tem ocorrido em conseqüência do uso abusivo (COLES, 1999; SANGSTER e GILL, 1999). Os primeiros relatos da resistência ao praziquantel registrados na literatura vieram de um foco no Norte do Senegal na África, onde o fármaco não teria sido eficaz em torno de 18-39 % dos casos (GRYSEELS et al., 1994; STELMA et al., 1995), o qual poderia ter sido devido a sua epidemiologia, ou seja, de acordo com a imunologia do paciente, a carga parasitária, o número de vermes imaturos e a reinfecção (CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2003). A diminuição da susceptibilidade dos esquistossômulos com a administração do Praziquantel foi repentina e a monitoração desse fenômeno deve ser ativa assim como o desenvolvimento de novos fármacos esquistossomicida, visto que ao longo do tempo as conseqüências podem se agravar (DOENHOFF et al., 2002). 2.11 Imunopatologia A esquistossomose mansônica é basicamente uma doença que decorre da resposta inflamatória granulomatosa que ocorre em torno dos ovos vivos do parasito. Os antígenos são secretados pela membrana interna da casca do ovo maduro, chamada envelope de Von Lichtenberg, que apresenta toda maquinaria de síntese protéica, núcleo próprio, inúmeras mitocôndrias e uma extensa rede de retículo endoplasmático rugoso indicando alto nível de síntese protéica (NEVES, 2005). Os antígenos induzem. a uma resposta imunológica. humoral e celular que são elementos fundamentais na formação da reação granulomatosa e, portanto da doença..

(44) O organismo apresenta múltiplas camadas de defesa, pelas quais o organismo se defende contra a invasão de patógenos. As mesmas podem ser classificadas em: barreiras físicas – que compreendem a pele, a autolimpeza e a microbiota normal do indivíduo; imunidade inata e imunidade adaptativa. A pele é a primeira defesa do corpo humano contra a infecção armando uma barreira resistente e impenetrável de epitélio protegido por camadas de células queratinizadas (PARHAM, 2001). Quando a barreira física é rompida e os patógenos penetram nos tecidos moles do corpo, entra em ação a imunidade inata, que utiliza mecanismos de reconhecimento molecular geral para detectar a presença de microrganismos e não leva à imunidade prolongada contra aquele patógeno em particular. A resposta imune adaptativa, em contraste, focaliza especificamente o invasor em questão gerando memória imunológica para o mesmo, através da seleção clonal de células imunes para esse patógeno. As células responsáveis por ambas as respostas imunes, inata e adaptativa, são principalmente os leucócitos e as células teciduais relacionadas a eles (BENJAMINE et al., 2002; PARHAM, 2001). A infecção parasitária pode ser particularizada pela alta resistência dos parasitos às defesas imunes e pela cronicidade de sua ação. Os parasitos são capazes de sobreviver e de replicar-se nos seus hospedeiros, porque são bem adaptados para resistirem às defesas imunes. Resistem à fagocitose, multiplicam-se no interior de macrófagos e, em alguns casos, resistem a lise mediada pelo complemento. Os helmintos, de uma maneira geral, sobrevivem nos tecidos extracelulares e, com freqüência, sua eliminação é dependente de tipos especiais de resposta de anticorpo (ABBAS et al. 2003). Na infecção pelo S. mansoni tem-se uma resposta Th1 e Th2, o que chamamos de uma dicotomia da resposta imune, antes da oviposição ocorre a resposta Th1 e depois da oviposição ocorre a resposta Th2 (GRYZCH et al., 1991; WYNN et al., 1993; KUBY, 2002; PEARCE e MACDONALD, 2002) (figura 15). E é na resposta Th2 que se tem uma reação granulomatosa de agregados de leucócitos, linfócitos, eosinófilos e macrófagos (PEARCE e MACDONALD, 2002; STADECKER et al., 2004)..

(45) Após infecção. cercária. Aguda. esquistosômulo. vermes adultos. Crônica. ovos. Figura 15: Desenvolvimento da resposta imune na infecção pelo Schistosoma Fonte: PEARCE e MACDONALD, 2002.. A resposta Th1 é definida pela produção de interferon gama (INF-γ) e está associada com a imunidade mediada por células, incluindo reações de hipersensibilidade tardia, recrutamento e ativação de macrófagos inflamatórios e leucócitos e respostas citotóxicas que levam a proteção contra microrganismos celulares. Os linfócitos Th1 respondem otimamente aos antígenos apresentados pelas células B, utilizando como coestimulante o CD80 e produzem ainda IL-2, linfotoxinas e fator de necrose tumoral, não possuindo receptores para a IL-1 e TNF-β (CHTANOVA e MACKAY, 2001). A resposta Th2 é caracterizada pela produção de IL-4 e IL-5 e está associada com a imunidade humoral, incluindo a ativação de eosinófilos e mastócitos levando a proteção contra microrganismos extracelulares. Os linfócitos Th2 respondem otimamente aos antígenos. apresentados. pelos. macrófagos. e. células. dendríticas. mielóides,. são. especificamente ativados por sinais gerados pelo CD86 e mediante o estímulo do antígeno ou na presença de IL-1, citocina fundamental em seu processo de ativação, produzem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 (YANG et al., 2005). O subtipo Th3 foi identificado posteriormente por produzir elevados níveis do fator de crescimento transformante. (TGF-. , além de IL-4 e IL-10 em quantidades variáveis. As células Th3 apresentam um fenótipo imunossupressor de tolerância oral e autoimunidade em modelos experimentais (SING et.

(46) al., 1999). Além das células T CD4+, que deram origem ao paradigma Th1/Th2, outros tipos celulares como linfócitos T CD8+, células dendríticas, macrófagos e células NK também produzem citocinas de ambos os tipos, ou seja, tipos 1 e 2 (KIM et al., 2002). Isso levou a divisão do estudo das respostas imunológicas em resposta do tipo Th1 ou Th2 intrinsecamente relacionadas aos tipos de citocinas produzidas pelas diferentes populações celulares (KOURILSKY e TRUFFA-BACHI, 2001). As interleucinas 5 e 10 desempenham papéis importantes na infecção, quando estão ausentes durante a infecção aguda a IL-5 impede a eosinofilia, mas não tem nenhum efeito sobre o tamanho e a fibrose do granuloma (SHER, 1990). Sugerindo que a IL-5 desempenha um papel secundário na patogênese. Contudo, a IL-10 parece desempenhar um papel na regulação do tamanho do granuloma (FLORES-VILLANUEVA et al., 1996). Este fato levanta indícios de que a IL-10 diminui a quantidade das populações de células Th1 inflamatórias, ou torna-as anérgicas, levando a um desenvolvimento de uma resposta Th2 estável (FLORES-VILLANUEVA et al., 1996; REISER e STADECKER 1996). As células como os macrófagos possuem funções na imunidade inata e como células efetoras atuam na imunidade adquirida. Os macrófagos que são ativados na resposta Th1 secretam mediadores inflamatórios, como o óxido nítrico (NO) (JORENS et al., 1995; MACMICKING et al., 1997). Na infecção pelo S. mansoni, a ativação dos macrófagos pelo IFN- e por outros cofatores induz à produção de NO pela reação enzimática. O NO torna-se uma molécula efetora, causando a morte do verme (JAMES, 1995). O maior aumento na produção de NO é na oviposição dos vermes adultos, no entanto, com o início de resposta Th2 por parte do hospedeiro, a produção de NO diminui, uma vez que a resposta Th1 foi inibida (BRUNET et al., 1999). Estudos em camundongos infectados deficientes em IL-4 demonstraram, através de uma polarização da resposta Th1, com alta produção de IFN- e NO após a oviposição, que a citocina IL-4 tem grande importância no controle do NO e na produção do granuloma, fazendo assim com que a sobrevida do camundongo aumente (PATTON et al., 2002). 2.12 Imidazolidinas Bioativas.

(47) As imidazolidinas ou hidantoínas e seus derivados são uma classe de substâncias que despertam grande interesse por apresentarem importantes atividades farmacológicas, tais como anticonvulsivante, antiarrítmico e no tratamento de complicações diabéticas crônicas. Esses compostos também promovem agregação de plaquetas e inibição da aldose redutase. As imidazolidinas possuem um grupo metilênico muito reativo no carbono-5, o que permite a síntese de inúmeros derivados a partir da condensação com aldeídos aromáticos (ROSSI, 2000). Luttermoser e Bond (1954) a partir de modificações estrutural no anel imidazolidínico, observaram que a 5,5-difenil-imidazolidina-2,4-diona e a 5-(p-clorofenil)5-metil-imidazolidina-2,4-diona obtidas (figura 12) apresentavam atividade frente a vermes adultos em S. mansoni de ratos infectados. O. H. O. H. N N. N O. H3C. N. H. H. I. II. O. Figura 16: (I) 5,5-Difenil-imidazolidina-2,4-diona e (II) 5-(p-clorofenil)-5-metilimidazolidina-2,4-diona. A imidazolidina-2,4-diona foi descoberta em 1861 por Bayer durante um trabalho com ácido úrico. Em 1875 Bayer sintetizou a imidazolidina-2,4-diona pela primeira vez através do aquecimento do bromo-acetiluréia com amônia alcoólica, mais tarde Harries e Weiss em 1900 obtiveram a imidazolidina-2,4-diona a partir do éter etílico de glicina e cianato de potássio em presença do ácido clorídrico (ELDERFIELD et al., 1957; FINKBEINER, 1965). Em 1899, Ruhemann e Cunnington obtiveram derivados do 5–benzilideno imidazolídínicos pelo aquecimento do fenil proprionato de etila com uréia em solução alcoólica na presença de etóxido de sódio, onde substituiu a uréia pela tioúreia e guanidina, obtendo. o. 5–benzilideno-2-tioxo-imidazolidin-2-ona. imidazolidin-4-ona (figura 13) (JOHNSON et al., 1915).. e. o. 2-amino-5-benzilideno-.

(48) O. H. O. H N. N CH. N. S. CH. N. H. H. I. II. NH. Figura 17: (I) 5-Benzilideno-2-tioxo-imidazolidin-4-ona e (II) 2-amino-5-benzilidenoimidazolidina-2,4-diona. Derivados imidazolidínicos sintetizados por nossa equipe no Laboratório de Síntese e Planejamento de Fármacos ressaltam a contribuição química do núcleo imidazolidínico. Os resultados já obtidos com derivados imidazolidinônicos-3,5-dissubstituídos revelam que essas moléculas são portadores de significante atividade esquistossomicida (OLIVEIRA et. al., 2004; SOARES, 2004; ALBUQUERQUE et. al., 2005; PITTA, 2005). Alguns desses derivados já se encontram patenteados pelo INPI sob o numero de depósito 000362/03, em 02/10/2003, e vários em fase de desenvolvimento (PITTA et. al, 2003). Atualmente observa-se o aparecimento rápido de cepas resistentes aos fármacos disponíveis Praziquantel e Oxamniquine, sendo este último não mais incluso dentre os medicamentos essenciais (WHO, 2003), porém ainda utilizado na clínica médica em Pernambuco. Os resultados obtidos em nosso Laboratório de Planejamento e Síntese como os derivados imidazolidínicos frente aos vermes adultos de Schistosoma mansoni (OLIVEIRA et al., 2004; ALBUQUERQUE et al.,2005), nos impulsionou ao planejamento e a síntese de novos derivados 3-benzil-5-benzilideno-4-tioxo-imidazolidin-2-onas e a avaliação da atividade esquistossomicida in vitro e in vivo na busca de novos agentes esquistosomicidas.. 2.13 Fármacos esquistossomicidas Vários fármacos foram desenvolvidos para o combate do Schistosoma, desde do começo do século XX, estas apresentaram graves efeitos colaterais que tornaram a sua utilização terapêutica proibida..

(49) A história da quimioterapia esquistossomicida representou sempre um desafio no encontro de um tratamento eficaz e seguro desde o começo do século XX. Foram utilizados vários fármacos para o tratamento da esquistossomose, tais como: Tártaro emético, Niridazol, Lucantone, Hicantone, entre outros (COLES, 2002). Foram usados na quimioterapia esquistossomicida há aproximadamente 50 anos, mas hoje obsoleto por boas razões. O tártaro emético (tabela 4) foi descoberto acidentalmente em 1918 por Christopherson, observando uma tribo Berbere que estavam sendo tratados com a droga para leishmaniose. Ele percebeu uma interrupção no parasita S. hematobium. A droga foi injetada por via intravenosa e com doses crescentes. As maiores preocupações foram os efeitos colaterais como, diarréias, cólicas, vômitos, rachaduras na pele e até mesmo problema cardiovasculares; sendo mais freqüentes com o uso da terapia e por ser uma droga de uso prolongado. Muitos médicos preferiram dar o antimônio somente aos pacientes hospitalizados. O tártaro emético é eficaz contra as três espécies de Schistosoma o S. haematobium, S. japonicum e S. mansoni com menor índice de eficácia para o S. japonicum (CIOLI et al., 1995). A emetina (tabela 4) foi usada a partir de 1920 para o tratamento das infecções do S. japonicum e seu uso mais tarde foi estendido para o S. mansoni. Seu efeito era satisfatório, no entanto as doses eram próximas do limite da toxicidade (CIOLI et al., 1995). Logo após introduziu a 2,3 dehidroemetina (tabela 4), que tem as mesmas atividades da emetina, mas com metade da toxicidade e com efeitos colaterais modestos sendo necessário o acompanhamento dos pacientes. Mas a droga ainda é usada para o tratamento da amebíase (CIOLI et al., 1995). O niridazol (tabela 4) é um derivado do nitrotiazol que foi introduzido em 1964 por Ciba-Geigy com o nome de Ambilhar . A droga recebeu atenção considerável, por ser uma das alternativas adiantadas dos antimoniais e por ter vantagens na administração oral (CIOLI et al., 1995). O composto não é muito eficaz e apresenta diversos inconvenientes sérios, tais como varias doses orais e ocorrência de efeitos colaterais como mutagenicidade, carcinogenicidade, embriotoxicidade, imunossupressão (FONTANILLES, 1969). A experiência clínica diz que o niridazol é mais eficaz em crianças do que em adultos (CIOLI et al., 1995)..

(50) O metrifonato (tabela 4) é um composto organofosforado, 2,2,2-tricloro-1hidroxietil dimetil fosfanato, que foi introduzido em 1955 com os nomes de DipterexO ou Dylox3 (LORENZ et al., 1955). Em 1962, um médico belga, Jaques Cerf observou a possibilidade de atividade anticolinesterásica em helmintos e mais tarde observou eficácia para o S. haematobium, no entanto comprovou que ele não tinha atividade frente ao S. mansoni. Hoje, ele não é mais usado contra esse parasita (CIOLI et al., 1995). O nitrofurano, em 1960, foi relatado alguma atividade para as infecções do S. japonicum em animais e humanos. O furapromidium, derivado do nitrofurano foi usado largamente na China, no entanto verificou-se alta toxicidade o que conduziu o abandono dos nitrofuranos (tabela 4) (CIOLI et al., 1995). Robinson e colaboradores em 1970, demonstraram atividade esquistossomicida em trans-5-amino-3-[2-(5-nitro-2- furil)-vinil]1,2,4-oxadiazole, molécula análogas ao niridazol. Observou-se que a toxicidade aguda era baixa, porém mostrou mutações cancerígenas e a substância foi descontinuada para o tratamento das esquistossomíases humana (CIOLI et al., 1995). Em 1938, descobriu-se um composto ativo chamado de Miracil, outros três compostos desta série foram sintetizados e testados o Miracil B, C e D. O Miracil D estava pronto para ser experimentado clinicamente, logo seus estudos foram interrompidos devido a segunda guerra mundial. Em 1945, foi introduzido na parte clínica com o nome de lucantona (tabela 4) ou 1-[2-(dietilamino)etilamino]-4-metil-9H-tioxant-9-one, onde foi eficaz frente ao S. mansoni e S. haematobium quando administrados oralmente. Devido aos seus efeitos colaterais como problemas no sistema cardiovascular, sistema nervoso central e gastrointestinais, não é mais utilizada (CIOLI et al., 1995). O hicantona (tabela 4) é análogo do lucantona. O hicantona é ativa frente ao S. mansoni e S. haematobium, porém com baixa atividade nos vermes adultos fêmeas e nas formas imaturas, nos experimentos in vitro (CIOLI et al., 1995). A atividade anti-helmíntica do amoscanato (tabela 4) ou 4-isotiocianato-4'nitrodifenilamino foi relatado, em 1976, por Striebel. O fármaco é uma substância cristalina amarela, insolúvel em água e na maioria dos solventes orgânicos (STRIEBEL, 1976). Uma característica atrativa do amoscanato é por sua larga atividade para as doenças como esquistossomíase, filariose e até nematódeos gastrointestinais. Nos experimentos o.

(51) amoscanato mostrou-se eficaz a todas as principais espécies de Schistosoma. Com apenas uma dose oral, os ratos infectados foram curados, a toxicidade era baixa (CIOLI et al., 1995). No entanto ele não consta na lista modelo de medicamentos essenciais da World Health Organization (WHO, 2003). O oltipraz (tabela 4) é um derivado do ditiol-tiona, sintetizado em 1976 na indústria Rhone-Poulenc, na França (BARREAU et al., 1977). É um pó vermelho fino, insolúvel na água e solúvel em lipídeos. É ativo frente ao S. mansoni, S. haematobium e S. intercalatum e inativo ao S. japonicum. Os efeitos tóxicos em longo prazo não foram relatados. Os principais efeitos colaterais são náuseas, vômitos, dores abdominais, sonolência (CIOLI et al., 1995). A tubericidina (tabela 4) ou 7-deazoadenosina é um análogo da purina que pode ser incorporado em ácidos nucléicos do Schistosoma. Seu uso como esquistossomicida foi em 1971, sendo eficaz na cura de ratos infectados com as principais espécies de Schistosoma, nãosendo relatado nenhuma toxicidade aparente (JAFFE et al., 1971; CIOLI et al., 1995). A atividade antiparasitária da ciclosporina A (tabela 4) foi descoberta, em 1981, por Bueding e colaboradores ao tentar suprimir a formação de granuloma de ratos infectados por S. mansoni. Observaram que ratos tratados tiveram uma redução drástica no número dos vermes e que esta redução era mais pronunciadas ao tratar de infecções imaturas e os mais afetados eram os machos. A ciclosporina A além de atividade contra o Schistosoma tem atividade frente ao plasmódio, leishmania, cestodos, filaria entre outros (CIOLI et al., 1995). A oxamniquine (tabela 4) e o praziquantel (tabela 4), ambas são administradas por via oral em dose única, que são relativamente bem toleradas, com baixa toxicidade, e apresentam bons percentuais de cura, em torno de 80 % para adultos e de 70 % para crianças abaixo de 15 anos (KATZ, 2004). Estudos realizados em camundongos infectados experimentalmente por S. mansoni e tratados com o oxamniquine mostraram que os vermes machos são mais susceptíveis, o fármaco produz edema e necrose do tegumento, com posterior aparecimento de lesão em bolhas. O praziquantel, em estudos in vitro, provoca contrações tônicos-clônicas no parasito, com posterior parada na postura de ovos. O praziquantel é ativo contra todas as.