UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
ISAIANE MEDEIROS
AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E POTENCIAL BIOATIVO DE
NANOPARTÍCULAS CONTENDO EXTRATO DE CAROTENOIDES ORIUNDO DE MELÃO CANTALOUPE (Cucumis melo L.) ADMINISTRADAS EM MODELO
EXPERIMENTAL DE INFLAMAÇÃO CRÔNICA
NATAL/RN 2020
ISAIANE MEDEIROS
AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E POTENCIAL BIOATIVO DE
NANOPARTÍCULAS CONTENDO EXTRATO DE CAROTENOIDES ORIUNDO DE MELÃO CANTALOUPE (Cucumis melo L.) ADMINISTRADAS EM MODELO
EXPERIMENTAL DE INFLAMAÇÃO CRÔNICA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção de título de Mestre em Nutrição.
Orientadora: Profª. Drª. Ana Heloneida de Araújo Morais
Coorientadora: Profª. Drª. Thais Souza Passos
NATAL/RN 2020
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Medeiros, Isaiane.
Avaliação da segurança e potencial bioativo de
nanopartículas de carotenoides oriundo de melão Cantaloupe (Cucumis melo L.) administradas em modelo experimental de inflamação crônica / Isaiane Medeiros. - 2020.
82f.: il.
Dissertação (Mestrado em Nutrição) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Nutrição. Natal, RN, 2020.
Orientadora: Ana Heloneida de Araújo Morais. Coorientadora: Thais Souza Passos.
1. Beta caroteno - Dissertação. 2. Curcubitaceae -
Dissertação. 3. Nanotecnologia - Dissertação. 4. Toxicidade - Dissertação. I. Morais, Ana Heloneida de Araújo. II. Passos, Thais Souza. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 547.979.48
ISAIANE MEDEIROS
AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E POTENCIAL BIOATIVO DE
NANOPARTÍCULAS CONTENDO EXTRATO DE CAROTENOIDES ORIUNDO DE MELÃO CANTALOUPE (Cucumis melo L.) ADMINISTRADAS EM MODELO
EXPERIMENTAL DE INFLAMAÇÃO CRÔNICA
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Nutrição da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Nutrição.
Aprovada em 02 de junho de 2020.
Profª. Drª. Karine Cavalcanti Maurício de Sena Evangelista Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Nutrição
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________ Profª. Drª. Ana Heloneida de Araújo Morais Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
Orientador
_________________________________________ Prof. Dr. Fernando Vagner Lobo Ladd
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN Membro Externo ao Programa
_________________________________________ Profª. Drª. Jailane de Souza Aquino
Universidade Federal da Paraíba – UFPB Membro Externo
Dedico essa dissertação especialmente aos meus pais, Elson e Eliete, a minha irmã, Isadora, e ao meu namorado, Everton, pelo apoio em toda essa trajetória e o incentivo no momento que mais precisei.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e por haver me conduzido em todos os passos, dando-me forças para seguir em frente em todos os objetivos de vida. Só Ele sabe todas as batalhas que enfrentei e venci nesses dois anos.
Aos meus pais, Eliete e Elson, por me conduzirem ao caminho da bondade e do amor, pelo apoio incondicional, por me aguardarem com paciência, compreenderem minha ausência durante vários momentos nessa longa jornada acadêmica e por serem exemplo de luta. E a minha irmã, Isadora, por estar comigo lado a lado dividindo minhas angústias, apoiar-me e partilhar todos os nossos aprendizados.
Ao meu namorado, Jose Everton, por acreditar e incentivar todas as minhas escolhas. Obrigada por toda a paciência, compreensão nas minhas ausências e estresses, amor, cuidado, cumplicidade, respeito e ensinamentos. Se não fosse você, os experimentos não teriam sido conduzidos com tantos aprendizados. Finais de semanas e feriados, dedicados a ir ao biotério me ajudar segurando os animais para eu realizar a gavagem, em dias que ninguém podia ir.
Às minhas orientadoras, Profas. Dras. Ana Heloneida Morais e Thaís Passos, por me acolherem no grupo de pesquisa NutriSBioativoS, confiança, paciência, cuidado, orientação, incentivo, ensinamentos e partilha de conhecimentos os quais me imergiram em uma temática completamente nova e desafiadora que é a nanotecnologia.
À Profª. Drª. Nély Holland, que foi minha maior incentivadora a seguir para a pós-graduação e acreditou no meu potencial. Obrigada pelo incentivo, apoio, carinho e orientações.
Às minhas amigas, em especial, Aline, Amanda, Laíse, Larissa, Letícia, Marcely, Maressa e Vanessa, pelas palavras de incentivo, apoio, conselhos, carinho e palavras de conforto.
À Lídia, Mayara e Luana, pela amizade, companheirismo, apoio, conversas e auxílios nos experimentos. Vocês foram fundamentais para tornar essa jornada mais leve.
Às amizades que fiz, Keith, Josiane, Ana Priscilla e Thais, pelo apoio, ensinamentos, ajuda, conversas e todos os momentos onde podemos estar juntas.
A todos NutriSBioativoS, em especial Amanda Fernandes, Anna Beatriz, Ana Júlia, Camila, Fabiana, Grazielle, Izael, Rafael e Sara que partilharam os experimentos, ensinamentos e aprendizados. E as alunas de iniciação científica: Ana Francisca, Carla, Gerciane, Hanna e Luiza, pela dedicação e contribuição.
À minha turma de Mestrado (Mestrandos PPGNUT – 2018), pela caminhada juntos para alcançar nossos objetivos. E a todos que fazem o PPGNUT pelo empenho e dedicação.
Aos laboratórios da Faculdade de Farmácia por onde passei, obrigada por todos os ensinamentos e aprendizados. Laboratório de Bromatologia, especialmente a Profª. Drª. Cristiane, técnicos Maciel e Tati, Wendell, Maciel, Larissa e Lívia. A todos que compõem o Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica (TECBIOFAR), em especial a Alaine, Karla e Emanuell. Aos membros do Laboratório de Farmacognosia, principalmente ao técnico Luiz, e do Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos, Prof. Dr. Cícero e técnica Daiane.
A todos os laboratórios por onde passei: Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL), em especial o Prof. Dr. Hugo e Rony, Laboratório de Análise de Alimentos, Laboratório de Tecnologia de Alimentos, Laboratório de Caracterização Estrutural de Materiais, Instituto de Química e Física, Central Analítica – Núcleo de Petróleo e Gás.
Ao Departamento de Morfologia (DMOR), especialmente ao Prof. Dr. Pedro e Profª. Drª. Christina, e as técnicas Helaine e Sara, pelo apoio, rapidez, ensinamentos e disponibilidade durante as análises.
À minha banca de qualificação, Prof. Dr. Francisco Canindé e Profª. Drª. Juliana Maia, e à banca de defesa, as Prof. Dr. Fernando Ladd e Profª. Drª. Jailane Aquino, pelas importantes contribuições.
À UFRN por incentivar e financiar a vivência de novos aprendizados na Universidade Federal do Rio Grande do Sul, no laboratório do Prof. Dr. Maurício, importante para o conhecimento de novas técnicas de análise em órgãos de animais.
À UnP, em especial Sr. Manoel, Maíra e os alunos de Medicina Veterinária e Nutrição pela colaboração e disponibilidade em ajudar.
À CAPES (Código de Financiamento 001) e CNPq (Projeto Universal nº 422405/2016-7) pelo apoio financeiro, essencial para a construção desse trabalho.
“Esperei firmemente no Senhor e Ele se inclinou para mim, atendendo a minha súplica. Tirou-me da fossa da morte, do barro do pântano, colocou meus pés sobre a rocha, deu segurança a meus passos. Fez-me cantar um canto novo, um louvor ao nosso Deus. Muitos vão ver e temer, e confiarão no Senhor. Feliz o homem que põe no Senhor sua esperança e não se volta para os soberbos, nem para os que seguem a mentira.” Salmo 40, 2-5.
RESUMO
Os carotenoides exercem potente ação anti-inflamatória no organismo humano. Entretanto, são instáveis à presença de luz, ácidos, oxigênio e calor, o que pode levar a perda dos efeitos antioxidantes relacionados ao consumo dessas moléculas. A nanoencapsulação surge como estratégia para preservar ou potencializar a ação anti-inflamatória, além de aumentar a solubilidade e biodisponibilidade dos carotenoides. Portanto, é necessário avaliar a segurança das nanopartículas visando futuras aplicações clínicas. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi avaliar a segurança e bioatividade de nanopartículas à base de extrato bruto de melão
Cantaloupe rico em carotenoides e gelatina suína em
ratos Wistar. A encapsulação foi realizada por emulsificação óleo/água, seguida de liofilização, utilizando gelatina suína como agente encapsulante e Tween 20 como tensoativo. A nanoformulação (EGS) foi caracterizada por diferentes análises físicas e químicas, e avaliada quanto à eficiência de incorporação (EI). A toxicidade foi investigada por meio de sinais de toxicidade geral, peso corporal e consumo alimentar em ratos Wistar alimentados com dieta de alto índice glicêmico e alta carga glicêmica (HGLI), tratados com EGS administrada por gavagem (50 mg de EGS/kg, n = 5) e extrato bruto de carotenoide (EB) (12,5 mg/kg, n = 5) durante 10 dias, utilizando como controles um grupo sem tratamento (n = 5) e outro tratado com dieta padrão (n = 5). Foi avaliada a toxicidade sanguínea (hemograma, glicose, triglicerídeos, colesterol total, função hepática e renal), morfologia e histopatologia de fígado, intestino delgado, rins, estômago e baço. A caracterização de EGS apontou a presença de partículas esféricas com superfície lisa, diâmetro médio de 74 (12,7) nm, índice de polidispersão de 0,53 (0,12), e EI de 98% (1,78). Para os sinais de toxicidade geral, não houve diferença significativa (p > 0,05) entre o peso inicial e final dos ratos de cada grupo avaliado. Observou-se aumento significativo (p < 0,05) de 23 % no consumo alimentar somente do grupo sem tratamento. Por meio dos parâmetros bioquímicos analisados, constatou-se baixa toxicidade de EGS. Os resultados obtidos para as determinações do peso relativo dos fígados, intestino delgado, baço, rins e estômago mostraram que não houve diferença significativa (p > 0,05) entre os grupos estudados. As análises morfológicas e histopatológicas do fígado apontaram hepatite aguda nos animais de todos os grupos avaliados, sendo que os tratados com EB e EGS apresentaram melhores aspectos teciduais. Para intestino delgado, observou-se enterite crônica em todos os animais, com um melhor aspecto nas vilosidades e glândulas intestinais dos animais tratados com a EGS. O estômago, baço e os rins não apresentam alteração histopatológica. As correlações de Spearman (r) e valor de p dos parâmetros histopatológicos analisados semiquantitativamente corroboraram com os aspectos das lâminas histopatológicas. Os resultados sugerem a aplicação segura de EGS e um efeito bioativo, possivelmente, relacionado ao potencial anti-inflamatório, mostrando a segurança quanto à utilização em estudos clínicos futuros, visando investigar a eficácia no controle dos processos inflamatórios.
ABSTRACT
Carotenoids have powerful anti-inflammatory action on the human body. However, are unstable in the presence of light, acids, oxygen, and heat, which can lead to the loss of antioxidant effects related to the consumption of these molecules. Nanoencapsulation appears as a strategy to preserve or enhance the anti-inflammatory action, in addition to increasing the solubility and bioavailability of carotenoids. Therefore, it is necessary to evaluate the safety of nanoparticles for future clinical applications. Thus, the objective of this study was to evaluate the safety and bioactivity of nanoparticles based on crude Cantaloupe melon extract rich in carotenoids and porcine gelatin in Wistar rats. Encapsulation was performed by oil/water emulsification followed by freeze-drying, and porcine gelatin was used as an encapsulating agent, and Tween 20 as a surfactant. Nanoformulation (EPG) was characterized by different physical and chemical analyzes and evaluated for efficiency of incorporation (EI). Toxicity was investigated through signs of general toxicity, body weight and food consumption in male Wistar rats fed with a high glycemic index and glycemic load (HGLI) diet treated with EPG administered by gavage (50 mg/kg, n = 5), and crude extract rich in carotenoid (CE) (12.5 mg/kg, n = 5) for ten days, using as controls a group without treatment (n = 5) and another treated with a standard diet (n = 5). Blood toxicity (blood count, fasting blood glucose, triglycerides, total cholesterol, liver, and kidney function), morphology and histopathology of the liver, small intestine, kidneys, stomach, and spleen, were evaluated. The characterization of EPG pointed to the presence of spherical particles with a smooth surface, an average diameter of 74 (12.7) nm, a polydispersion index of 0.53 (0.12), and EI of 98% (1.78). For signs of general toxicity, there was no significant difference (p> 0.05) between the initial and final weight of the rats in each evaluated group. There was a significant increase (p <0.05) of 23% in food consumption only in the group without treatment. The biochemical parameters analyzed evidenced low toxicity of EPG. The results obtained for the determination of the relative weight of the livers, spleen, small intestine, kidneys, and stomach showed that there was no significant difference (p> 0.05) between the studied groups. The morphological and histopathological analyzes of the liver showed acute hepatitis in the animals of all the evaluated groups, and those treated with CE and EPG showed improved tissue aspects. For small intestine, chronic enteritis was observed in all animals, with an improvement in the aspect of the animals' villi and intestinal glands treated with EPG. The stomach, spleen, and kidneys do not present a histopathological alteration. Spearman (r) correlations and p-value of the histopathological parameters analyzed semiquantitatively corroborated with the aspects of the histopathological slides. The results suggest the safe application of EPG and a bioactive effect, possibly related to the anti-inflammatory potential, showing the safety regarding the use in future clinical studies, aiming to investigate the efficacy in the control of inflammatory processes.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Melão Cantaloupe (Cucumis melo L. cantalupensis)... 20 Figura 2. Estrutura química do β-caroteno ... 21
Figura 3. Fluxograma de obtenção do extrato bruto de carotenoides oriundos do
melão Cantaloupe. ... 32
Figura 4. Fluxograma do processo de encapsulação de extrato bruto de
carotenoides oriundos de Melão Cantaloupe por meio de emulsificação óleo/água. A. Fase oleosa. B. Fase aquosa 1. C. Fase aquosa 2. ... 34
Figura 5. Delineamento temporal e fluxograma do desenho experimental in vivo. A.
Delineamento temporal do experimento com ratos Wistar, adultos. B. Fluxograma do desenho experimental in vivo para avaliação da segurança e potencial bioativo de nanopartículas de carotenoides do melão Cantaloupe ... 37
Figura 6. Caracterização do EGS e agentes encapsulantes. A. Microscopia
Eletrônica de Varredura (MEV). B. Difração a laser. C. Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) ... 43
Figura 7. Toxicidade da dose bioativa do EGS (50 mg/kg de peso) sob parâmetros
hematológicos em ratos Wistar ... 47
Figura 8. Toxicidade da dose bioativa do EGS (50 mg/kg de peso) sob parâmetros
de glicose e perfil lipídico em ratos Wistar ... 48
Figura 9. Toxicidade da dose bioativa do EGS (50 mg/kg de peso) sob parâmetros
bioquímicos em ratos Wistar ... 50
Figura 10. Toxicidade da dose bioativa do EGS (50 mg/kg de peso) sob parâmetros
bioquímicos renais e proteicos em ratos Wistar ... 52
Figura 11. Peso relativo do fígado e cortes histológicos hepáticos corados com H&E
Figura 12. Peso relativo do intestino delgado e cortes histológicos intestinais
corados com H&E revelando enterite crônica em ratos Wistar ... 56
Figura 13. Escores de avaliação histológica semiquantitativa das secções intestinais
de quatro grupos de ratos Wistar submetidos a diferentes tratamentos durante 10 dias. ... 58
Figura 14. Peso relativo dos rins e cortes histológicos renais corados com H&E
revelando infiltrados inflamatórios em ratos Wistar ... 60
Figura 15. Escores de avaliação histológica semiquantitativa das secções renais de
quatro grupos de ratos Wistar submetidos a diferentes tratamentos durante 10 dias. ... 61
Figura 16. Peso relativo e cortes histopatológicos dos estômagos corados em H&E
revelando aspectos de normalidade em ratos Wistar ... 63
Figura 17. Peso relativo e cortes histopatológicos dos baços corados em H&E
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Distribuição de grupos e tratamentos de ratos Wistar, adultos, alimentados
com dieta HGLI por 17 semanas. ... 31
Tabela 2. Parâmetros sanguíneos de referência para ratos Wistar, adultos,
eutróficos aclimatados no biotério da Universidade Potiguar/Brasil, em janeiro de 2019. ... 39
Tabela 3. Escores de avaliação semiquantitativa de alteração percentual de intestino
delgado e rins de quatro grupos de ratos Wistar submetidos a diferentes tratamentos durante 10 dias. ... 41
Tabela 4. Peso corpóreo inicial e final dos quatro grupos de ratos Wistar submetidos
a diferentes tratamentos durante 10 dias de experimento. ... 45
Tabela 5. Correlações de Spearman entre os diferentes parâmetros morfológicos
detalhados para as avaliações de pontuação semiquantitativa dos quatro grupos de ratos Wistar avaliados. ... 59
Tabela 6. Correlações de Spearman entre os diferentes parâmetros morfológicos
detalhados para as avaliações de pontuação semiquantitativa dos quatro grupos de ratos Wistar avaliados. ... 62
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária DCNT Doenças crônicas não-transmissíveis DNA Ácido desoxirribonucleico
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais CHT Cilindros hialinos tubulares
DEB Dilatação de espaço de Bowman EB Extrato bruto de carotenoides EFSA European Food Safety Authority
EGS Nanopartículas de carotenoides e gelatina suína
EI Eficiência de Incorporação
FII Focos de infiltrados inflamatórios
FTIR Espectrometria no Infravermelho por Transformada de Fourier GGT Gama glutamiltransferase
HG Hialinização glomerular
HGLI Dieta experimental de alto índice glicêmico e alta carga glicêmica IC50 Concentração de carotenoide capaz de reduzir a atividade em 50%
ILs Interleucinas
MAPK Proteína quinase ativada por mitogênio MEV Microscopia Eletrônica de Varredura NaCl Cloreto de sódio
NF-κB Fator nuclear kappa B
Nrf2 Fator nuclear derivado de eritroide tipo 2
OECD Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico PAV Percentual de ausência de vilosidades
PCR Proteína C-reativa
PIGI Percentual de integridade das glândulas intestinais PIV Percentual de integridade de vilosidades
PNV Percentual de necrose das vilosidades PTH Presença de túbulos hipertróficos PVU Percentual de vilosidades ulceradas
SISGEN Sistema Nacional de Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado
TGI Trato gastrointestinal
TGO Transaminase glutâmico-oxalacética TGP Transaminase glutâmico-pirúvica TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 15 2 OBJETIVOS ... 18 2.1OBJETIVOGERAL ... 18 2.2OBJETIVOSESPECÍFICOS ... 18 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 19
3.1ALIMENTOSDEALTOÍNDICEGLICÊMICO VERSUS INFLAMAÇÃO ... 19
3.2MELÃOCANTALOUPE(CUCUMIS MELO L. VAR CANTALUPENSIS) ... 20
3.3CAROTENOIDES ... 21 3.4ENCAPSULAÇÃO ... 23 3.5TOXICIDADE ... 26 4 METODOLOGIA ... 30 4.1MATERIAIS ... 30 4.1.1 Dietas e animais ... 30 4.2MÉTODOS ... 31
4.2.1 Processamento da polpa de melão (Cucumis melo L. var cantalupensis) e obtenção do extrato contendo carotenoides ... 31
4.2.2 Caracterização do extrato de melão Cantaloupe ... 32
4.2.2.1 Espectrofotometria de absorção no UV-vis ... 32
4.2.2.2 Cromatografia Líquida de UltraEficiência (UPLC) ... 33
4.2.3 Encapsulação de carotenoides ... 33
4.2.4 Caracterização das nanopartículas ... 35
4.2.4.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 35
4.2.4.2 Difração a laser ... 35
4.2.4.3 Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) ... 36
4.2.4.4 Determinação da eficiência de incorporação de carotenoides (EI) ... 36
4.2.5 Avaliação da segurança da dose bioativa de carotenoides nanoencapsulados in vivo ... 36
4.2.5.1 Avaliação de consumo alimentar, peso e sinais gerais de toxicidade ... 38
4.2.5.2 Análises hematológicas e bioquímicas ... 38
4.2.5.3 Determinação do peso relativo de fígado, intestino delgado, rins, estômago e baço ... 39 4.2.5.4 Análise histopatológica do fígado, intestino delgado, rins, estômago e baço 40
4.4ANÁLISEESTATÍSTICA ... 41
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 42
5.1 CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO BRUTO DE CAROTENOIDES DO MELÃO
CANTALOUPE ... 42
5.2CARACTERIZAÇÃODASNANOPARTÍCULASDECAROTENOIDESDOMELÃO
CANTALOUPE ... 42 5.3AVALIAÇÃODASEGURANÇAEMMODELOANIMAL ... 44
5.2.1 Avaliação do peso corporal, consumo alimentar e sinais gerais de toxicidade... 44 5.2.2 Avaliação da segurança da dose bioativa de carotenoides nanoencapsulados ... 46 5.2.3 Avaliação de peso relativo, macroscopia e histopatologia dos órgãos .... 53 6 CONCLUSÃO ... 66 7 TRAJETÓRIA ACADÊMICA ... 67 REFERÊNCIAS ... 69
1 INTRODUÇÃO
Atualmente, o padrão alimentar de consumo global é predominantemente representado por uma dieta rica em açúcares, gorduras e sódio, proveniente de alimentos ultraprocessados1. No entanto, sabe-se que as escolhas alimentares são fundamentais para o controle glicêmico e consideradas uma ferramenta valiosa na prevenção primária e secundária de doenças graves como obesidade, diabetes mellitus tipo 2, hipertensão arterial sistêmica, dislipidemia, síndrome metabólica, doenças cardiovasculares e doenças inflamatórias2,3. Assim, considerando a inflamação aguda ou crônica como causa ou efeito desse comportamento alimentar contemporâneo, tem-se constatado o interesse crescente por parte de pesquisadores por novas moléculas ou compostos, capazes de proteger e regenerar o organismo humano.
Entre esses, os carotenoides são compostos lipofílicos e, devido às características naturais, possuem diversas propriedades funcionais. Esses fitoquímicos exercem atividade antioxidante; por isso, são capazes de transformar e/ou diminuir a ação de oxidação dos radicais livres, agindo na prevenção de doenças cardiovasculares, câncer, diabetes, disfunções imunes, mutação no DNA e degeneração macular2. Apresentam, também, potente ação anti-inflamatória e, em alguns casos, como provitamina A4–6.
Ademais, os carotenoides são responsáveis pelas colorações laranja, vermelha e amarela encontradas em diversas algas, microrganismos e plantas2. Entre as diferentes fontes vegetais de carotenoides, sobressaem os melões de polpa salmão, como o tipo comercial Cantaloupe, produzido na região Nordeste do Brasil, em especial, no estado do Rio Grande do Norte. O melão Cantaloupe (Cucumis
melo L. var cantalupensis) apresenta, principalmente, carotenoides do tipo
β-caroteno, além de luteína, responsáveis pela coloração alaranjada de sua polpa7. Estudos destacam a potente ação anti-inflamatória dos carotenoides administrados a curto e médio prazo em indivíduos ou animais saudáveis e com sobrepeso6,8–10, mas, de maneira interessante, indivíduos com inflamação crônica apresentaram melhores resultados. De acordo com a literatura, muitos desses achados podem ser atribuídos aos efeitos antioxidantes benéficos à saúde, além de
outros mecanismos como a alteração das cascatas de sinalização intracelular e/ou a expressão gênica, reduzindo formação de citocinas inflamatórias11.
Sabe-se que os carotenoides apresentam instabilidade em presença de fatores envolvidos no processamento e armazenamento de alimentos, tais como presença de luz, ácidos, oxigênio, calor e reações indesejáveis com outros compostos alimentares. Técnicas que preservem as propriedades benéficas são fundamentais. Com isso, surgem métodos, capazes de minimizar as perdas das funções antioxidantes desses carotenoides; um deles é o encapsulamento12.
A encapsulação é uma técnica que tem como objetivo reter compostos bioativos e fitoquímicos com auxílio de um material de parede, atuando como barreira contra as condições de processamento como calor, oxigênio, luz, enzimas, pH, entre outros13. Devem ser levadas em consideração as alterações de tamanho das partículas, solubilidade do composto e cristalinidade durante a incorporação da substância ativa no material de parede para facilitar a biodisponibilidade desses compostos bioativos12.
Estudos envolvendo a encapsulação de carotenoides, oriundos de melão do tipo Cantaloupe, são escassos na literatura, principalmente, demonstrando os benefícios em face da estabilidade dos compostos bioativos, manutenção das funções bioativas e segurança alimentar.
Medeiros et al.14 produziram e caracterizaram carotenoides extraídos da polpa de melão Cantaloupe com base na nanoencapsulação com gelatina suína, proteína concentrada e isolada do soro do leite, além de avaliar a estabilidade da cor em matriz alimentícia (iogurte), visando à substituição dos corantes sintéticos, utilizados pela indústria de laticínios. Os autores constataram que a encapsulação ocorreu em escala nanométrica (< 100 nm), principalmente utilizando a gelatina (59 nm), além de possuir maior eficiência de incorporação e solubilidade em água, comparado aos demais agentes encapsulantes avaliados. O estudo de estabilidade em iogurte demonstrou que o nanoencapsulado em gelatina permaneceu estável durante todo o período de vida útil (60 dias) do produto, quando comparado ao extrato bruto de carotenoides, o qual perdeu a coloração amarela-alaranjada característica a partir do 15º dia de armazenamento.
Contudo, considerando as propriedades funcionais e prováveis aplicações bioativas e biotecnológicas desses carotenoides nanoencapsulados em gelatina
suína, tem-se a necessidade de investigar o potencial tóxico, visto que os carotenoides, em altas doses, apresentam riscos à saúde humana como efeitos em diversos órgãos (fígado, estômago, intestino, entre outros)15, sendo necessários testes iniciais in vitro e in vivo.
Embora os estudos in vitro possam fornecer informações sobre os aspectos coloidais, físico-químicos e princípios estruturais que regem a biodisponibilidade de nutrientes, na maioria dos casos (devido à complexidade do sistema digestivo humano), estudos in vivo com animais ou humanos são necessários para obter uma percepção confiável dos processos de digestão e absorção.
Com isso, estudos, para avaliar a segurança de nanopartículas, são fundamentais para definir os potenciais riscos de utilização e, auxiliar na composição de ações preventivas, proporcionando segurança, limitando a indicação de uso. Isso impede possíveis riscos de interação com organismos e indica o destino do material após manipulação, fazendo-se necessário tomar medidas cautelosas de regulação desde o planejamento até o consumo16.
Entre as avaliações de segurança, destaca-se a toxicidade subaguda que analisa e caracteriza todos os efeitos provocados por uma determinada substância, quando administrada, diariamente, a animais experimentais, em doses previamente estabelecidas e por curto período17. Apesar desses estudos, ainda permanece como desafio a aplicação clínica de nanopartículas.
Cabe ressaltar que a Nanotecnologia pode desempenhar um papel importante na preservação ou potencialização das funcionalidades dos compostos bioativos. Ademais aumenta a biodisponibilidade, solubilidade, bioacessibilidade no intestino e, promove uma liberação controlada12. Com isso, sabendo que a ação anti-inflamatória dos carotenoides já é bem documentada, avaliar a segurança das nanopartículas, contendo carotenoides, em modelo experimental inflamado, torna-se interessante para uma futura aplicação clínica. Sendo, portanto, um modelo in vivo inovador para avaliação da toxicidade em animais tratados com carotenoides nanoencapsulados.
Em face do exposto, o presente estudo visa avaliar a segurança e o potencial bioativo, em ratos Wistar, de nanopartículas à base de extrato bruto de carotenoides oriundos de melão Cantaloupe e gelatina suína.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a segurança e o potencial bioativo de nanopartículas à base de extrato de melão Cantaloupe rico em carotenoides e gelatina suína em modelo experimental de inflamação crônica.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter extrato rico em carotenoides a partir de melão Cantaloupe.
Produzir nanopartículas à base de extrato de carotenoides e gelatina suína.
Caracterizar as nanopartículas obtidas por métodos físicos e químicos e, determinar a eficiência de incorporação do extrato de carotenoides.
Investigar o efeito das nanopartículas no consumo alimentar, peso, alterações de comportamento, apatia, má condição de pelagem em ratos Wistar alimentados com dieta HGLI.
Avaliar a segurança da dose bioativa de carotenoides nanoencapsulados in vivo por meio da determinação de parâmetros sanguíneos, glicose, perfil lipídico, função hepática e renal em ratos Wistar alimentados com dieta HGLI.
Analisar a morfologia histológica do fígado, intestino delgado, rins, estômago e baço e avaliar os pesos relativos dos mesmos órgãos de ratos Wistar alimentados com dieta HGLI.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 ALIMENTOS DE ALTO ÍNDICE GLICÊMICO versus INFLAMAÇÃO
O índice glicêmico representa uma resposta da glicose sanguínea após a ingestão de uma porção de alimento ou refeição, contendo 50 gramas de carboidratos, disponíveis em relação a 50 gramas de um alimento referência (pão branco ou solução de glicose). E a carga glicêmica é o produto do índice glicêmico e o total de carboidratos presente em uma determinada quantidade de alimento18.
Os alimentos de alto índice glicêmico e alta carga glicêmica são predominantemente ricos em açúcar livre e comumente reconhecidos como alimentos ultraprocessados1, tais como os biscoitos recheados, sorvetes, molhos, bolos, refrigerantes, leite condensado, entre outros. Ressalta-se que os alimentos ultraprocessados são formulações industriais prontas para consumo que são elaboradas total ou predominantemente com base em substâncias extraídas de alimentos, constituintes de alimentos ou ingredientes sintetizados em laboratório com base em materiais orgânicos19.
Ademais, esses alimentos trazem uma composição nutricional desbalanceada e, majoritariamente, carecem de micronutrientes e fitoquímicos. Além de conter baixos teores de fibra e proteína, ainda apresentam-se ricos em gorduras totais, gorduras saturadas e trans e sódio, e um alto teor de açúcar livre1. Devido a esse desequilíbrio, estudos têm demonstrado associação entre a maior concentração plasmática de marcadores inflamatórios e o alto consumo de alimentos ultraprocessados presentes em dietas de alto índice glicêmico e alta carga glicêmica (dieta HGLI), sendo, portanto, atribuído a esses alimentos, também, a alteração da resposta inflamatória do organismo20,21.
A inflamação depende de vários mediadores que transmitem sinais na corrente sanguínea ou em outros fluidos. Esses mediadores incluem uma variedade de citocinas (interleucina - ILs, interferons, quimiocinas), óxido nítrico, moléculas de adesão intercelular ou outras moléculas mensageiras, como prostaglandinas. Muitos mediadores são regulados por fatores de transcrição, entre os envolvidos na inflamação estão fator nuclear kappa B (NF-κB), que está relacionado à liberação de várias citocinas (IL-6, IL-8, TNF-α, IL-1β) e proteína quinase ativada por mitogênio (MAPKs). Além disso, devido às interações entre estresse oxidativo e inflamação, o
fator nuclear (derivado do eritroide 2) tipo 2 (Nrf2) parece desempenhar um papel fundamental no fortalecimento de enzimas antioxidantes (superóxido dismutase, glutationa peroxidase, catalase e heme oxigenase 1)22.
Quando o processo inflamatório não é controlado, adequadamente, pode evoluir para uma condição de inflamação crônica de baixo grau, envolvendo efeitos deletérios como lesão tecidual, ocorrência e progressão das doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) como a obesidade, doenças cardiovasculares e câncer20.
Portanto, o consumo de alimentos anti-inflamatórios, proveniente, sobretudo, de frutas, legumes e verduras, é fundamental para a redução da incidência de doenças causadas pela cascata de citocinas inflamatórias. Para isso, surge o melão Cantaloupe, considerado excelente fonte de micronutrientes e compostos bioativos.
3.2 MELÃO CANTALOUPE (Cucumis melo L. var cantalupensis)
O melão teve origem na região Oeste da África e Ásia Central, pertence à família das Cucurbitaceae; é classificado em sete grupos (cantalupensis, reticulatus, inodorus, makuwa, flexuosus, dudaim e conomon)23–25. O tamanho e a forma do fruto são variáveis, assim como a cor da casca (branca, verde e amarela), textura (lisa, rendilhada, rugosa, escriturada e gomada) e cor da polpa (laranja, verde, rosa e branca)26.
O tipo comercial Cantaloupe (Figura 1) é bastante consumido, internacionalmente, devido aos micronutrientes e ao sabor adocicado27. A qualidade do fruto é determinada pela combinação dos seus compostos, tais como: os açúcares, ácidos orgânicos, compostos aromáticos voláteis e pigmentos naturais28.
O consumo dessa fruta está associado a efeitos benéficos, atuando como anticancerígeno, antidiabético, antiviral, anti-inflamatório, hepatoprotetor, hipolipidêmico e hipocolesterolêmico, além de propriedades calmantes, refrescantes, estimulantes, alcalinizantes, mineralizantes, antioxidante, diuréticas e laxativas29–31.
As variedades de melão são ricas fontes de vitaminas, minerais, flavonoides, fenólicos, saponinas, peptídeos e compostos alcaloides, além de excelentes fontes de carotenoides e tocoferois32.
3.3 CAROTENOIDES
Os carotenoides são pigmentos isoprenoides sintetizados por organismos fotossintéticos (incluindo plantas), algumas bactérias e fungos não fotossintéticos. Existem mais de 600 carotenoides conhecidos que podem ser classificados em dois grupos: as xantofilas (originalmente conhecida como filoxantinas) em que há a presença de oxigênio nas formas de grupos hidroxilas, carbonilas ou combinação de ambos (astaxantina, luteína e zeaxantina) e os carotenos que contêm, apenas, cadeias de hidrocarbonetos (β-caroteno, α-caroteno e licopeno)33 (Figura 2).
Figura 2. Estrutura química do β-caroteno. Fonte: RAO & RAO2
Além desses dois grupos, os apocarotenoides e carotenoides C50 são outras categorias identificadas. Os apocarotenoides são os produtos da clivagem oxidativa dos carotenoides, catalisados por uma família de dioxigenases (CCDs). Exemplos de apocarotenoides são: a bixina, pigmento de urucum; compostos aromáticos voláteis β-ionona e α-ionona; hormônio ácido abscísico da planta e estrigolactona; e vitamina A34.
Os carotenoides podem, também, ser classificados como pró-vitamina A, como α- caroteno, β-caroteno e β-criptoxantina, e os que não podem ser convertidos em retinal, como luteína e licopeno34.
Visto que o organismo humano não consegue sintetizar esses fitoquímicos, estudos epidemiológicos demonstraram que o consumo de dietas ricas em carotenoides traz diversos benefícios, como proteção contra câncer de pulmão, cabeça, pescoço e próstata, provavelmente, devido às propriedades antioxidantes potentes, mediadas pela oxidação e sequestro de radicais livres. Além de atuar na modulação do sistema imunológico, fatores de crescimento e vias de sinalização intracelular atuam, também, na regulação da diferenciação celular, ciclo celular e apoptose, fotoproteção contra radiação UV sendo precursores do pigmento retinol visual (vitamina A)35.
Estudos de intervenção de curto e médio prazo com alimentos à base de carotenoides como produtos de tomate ricos em licopeno, sugeriram benefícios para a saúde de pessoas geralmente saudáveis e com sobrepeso, conforme medido por mudanças favoráveis nos marcadores de inflamação (IL-6, IL-8, TNF-α, IL-1β, PCR, NF-κB) e estresse oxidativo (superóxido dismutase, glutationa peroxidase, catalase, heme oxigenase1, Nrf2)9. Vários estudos destacaram diferenças interindividuais bastante altas em relação à absorção, degradação, metabolismo e excreção de carotenoides, em parte devido a diferenças genéticas em vários polimorfismos de nucleotídeo único na luteína, licopeno e absorção de β-caroteno; isso pode explicar, parcialmente, as respostas variáveis à intervenção36–38.
Altas doses de carotenoides apresentam risco à saúde humana. Em um estudo realizado envolvendo crianças, sendo submetidas a transplante de células-tronco hematopoiética que apresentam hipervitaminose A, foram observados aumento do baço e fígado, concentrações séricas elevadas de fosfatase alcalina, TGO, TGP, GGT, infiltrados linfocitários, esteatose e alterações na pele15.
Em um outro estudo efetivado com suplementação de vitamina A em alta dose em mulheres com obesidade e sem obesidade, verificou-se que há um aumento na glicemia de jejum e triglicerídeos, não ocorrendo diferença para colesterol total, além de aumento na TGO39.
Apesar dos diversos benefícios relacionados ao consumo de carotenoides, a biodisponibilidade e bioatividade desses fitoquímicos são limitadas pela baixa estabilidade contra a degradação oxidativa durante o armazenamento e a acessibilidade biológica da matriz alimentar durante a digestão gastrointestinal40.
A cadeia de polienos é responsável pela baixa estabilidade dos carotenoides e limita o uso desses pigmentos naturais pela indústria alimentícia devido à oxidação relacionada a ações químicas, físicas e ambientais (presença de luz, oxigênio, calor, metais e enzimas). Os carotenoides são relativamente estáveis, em ambiente natural, mas são facilmente decompostos após a trituração do vegetal e extração com solventes41.
Para minimizar as perdas dos efeitos bioativos dos carotenoides, têm-se desenvolvido e melhorado os métodos de extração dessas substâncias, visando à diminuição da oxidação quando em contato com calor, luz, ácidos por longos tempos de extração. Além disso, matrizes alimentares complexas, barreiras físicas e químicas, carotenoides com polaridade variada retardam a extração dos pigmentos34.
Ademais, outro problema relacionado à utilização desses compostos é a baixa solubilidade em água. Atualmente, estudos estão sendo desenvolvidos visando proteger esses pigmentos frente aos fatores citados anteriormente, e promover o aumento da solubilidade em água, facilitando, assim, a utilização em produtos alimentícios14,42.
Devido à maior exigência em relação à qualidade dos alimentos, preservação de compostos sensíveis e aplicação, surgem técnicas importantes43, como a encapsulação de carotenoides, visando garantir a liberação controlada, reduzir as perdas das propriedades funcionais, aumentar a estabilidade e solubilidade desses compostos lipofílicos, além de aumentar o potencial de utilização pela indústria alimentícia para diversos fins.
3.4 ENCAPSULAÇÃO
Nos últimos anos, novas tecnologias surgiram com a intenção de manter os pigmentos naturais, presentes em alimentos, inalterados durante o seu processamento e armazenamento evitando, assim, a oxidação. Entre as tecnologias existentes, destaca-se a encapsulação44.
O encapsulamento é um processo em que os compostos bioativos são revestidos por um agente encapsulante para formar partículas ou cápsulas em escala micrométrica (0,2 – 5000 μm) ou nanométrica (1 a 100 nm)45
. Essa tecnologia é amplamente utilizada em alimentos e fármacos para encapsular polifenois,
micronutrientes, enzimas e antioxidantes, formando barreiras de proteção contra a luz, oxigênio, pH, umidade, calor, cisalhamento ou outras condições extremas46.
Várias são as técnicas de encapsulação, mas, para compostos lipofílicos, sobressaem: a) emulsão convencional (ativo lipofílico, agente encapsulante e tensoativo); b) nanoemulsão (igual à primeira emulsão, mas com diâmetro na faixa de 1 – 100 nm); c) lipossomas (bicamada lipídica encapsulando uma solução aquosa); d) partículas de hidrogel (rede de biopolímeros hidrofílicos aprisionando moléculas de solvente); e) partículas sólido-lipídeo (partícula sólida dispersa em óleo)47. As nanoemulsões têm sido descritas como promissoras para promover a encapsulação de compostos bioativos lipofílicos com propriedades aprimoradas em comparação às emulsões convencionais48.
O encapsulamento de um componente lipofílico pode ser realizado por uma série de razões visando: melhorar sua facilidade de manuseio e utilização; facilitar a incorporação em matriz alimentícia; aumentar a biodisponibilidade do bioativo; controlar a taxa de liberação ou localização alvo da ação; ou protegê-lo da degradação química. Esses componentes lipofílicos são, geralmente, misturados à fase oleosa antes da formação da emulsão, de modo que eles ficam presos dentro da gotícula formada. A localização física desses componentes dentro das nanoemulsões depende de suas propriedades moleculares e físico-químicas, como a hidrofobicidade, a atividade de superfície, o coeficiente de partição óleo-água, a solubilidade e o ponto de fusão48.
As nanopartículas têm muitas vantagens potenciais sobre as micropartículas, devido ao tamanho menor, tais como: a capacidade de aumentar a dispersão em água, a biodisponibilidade dos componentes bioativos, baixa dispersão de luz, além da alta estabilidade49,50.
Devido ao tamanho, as nanopartículas têm uma grande área de superfície de contato e podem, portanto, interagir, fortemente, com componentes biológicos no trato gastrointestinal com uma maior taxa de digestão em comparação aos demais tamanhos, uma vez que têm mais sítios de ligação disponíveis para as enzimas digestivas, como a lipase51. Além disso, o tamanho pode favorecer a rápida transferência de bioativos hidrofóbicos52.
Para obter nanopartículas, é importante a seleção de agentes encapsulantes e a técnica a ser aplicada45. Além disso, o tensoativo deve ser adequado, não-tóxico, biodegradável e excelente estabilizador da emulsão53.
Os agentes encapsulantes devem ser bons emulsificantes, possuir baixa viscosidade em alta concentração, boa dissolução e características de formação de sistema, capaz de preservar compostos bioativos em diferentes condições de processamento e armazenamento, sem tendência para causar ou favorecer a interação destes com produtos químicos. Além de promover resistência às condições ácidas e enzimáticas do estômago, deve provocar aderência e maior tempo de resistência de compostos bioativos nos locais-alvo do trato gastrointestinal (TGI)54–57.
Do ponto de vista da saúde e segurança, os agentes encapsulantes devem ser aprovados como materiais “geralmente conhecidos como seguros” (GRAS) para aplicação em alimentos e, biodegradáveis58. São exemplos de agentes encapsulantes, tipicamente utilizados, as proteínas (gelatina, proteínas do soro, caseinato de sódio, proteína de soja), poliois (sorbitol, manitol), açúcares amorfos (sacarose, lactose, trealose) e materiais poliméricos não cristalinos (amido, maltodextrinas e polissacarídeos)12.
A utilização de elementos ativos na superfície do encapsulado, como a gelatina, demonstra aumentar a estabilidade do armazenamento de carotenoides em até 5 vezes59–61. Em estudo realizado por Medeiros et al.14, um dos estudos desenvolvidos pelo grupo de pesquisa Nutrição e substâncias Bioativas para Saúde (NutriSBioativoS), constatou-se que a estabilidade de extrato rico em carotenoides nanoencapsulado em gelatina suína adicionado a iogurte, e armazenado em condições adequadas (sob refrigeração) por 60 dias, foi maior quando comparado ao extrato bruto.
As propriedades superficiais das nanopartículas lipídicas também têm um impacto importante sobre a funcionalidade e destino biológico. Assim, investigar essas propriedades é essencial para avaliar a função de nanopartículas. As superfícies de nanopartículas consistem, tipicamente, de uma mistura de moléculas ativas com diferentes propriedades estruturais, características elétricas, reatividade química e interações físicas48,62.
Pode haver grandes diferenças na carga elétrica de uma nanopartícula dependendo da natureza das moléculas presentes em sua superfície e das condições ambientais (principalmente pH e força iônica)63. As propriedades elétricas das nanopartículas influenciam na estabilidade física, bem como na capacidade das interpartículas de interagir em diferentes locais dentro do trato gastrointestinal64. As nanopartículas lipídicas, geralmente, têm superfícies relativamente hidrofílicas devido à presença de moléculas emulsificantes adsorvidas, mas também podem ter fragmentos não-polares que lhes dão uma hidrofobicidade superficial apreciável65.
Muitos compostos bioativos sofrem transformações químicas ou enzimáticas durante sua passagem pelo TGI, o que pode alterar sua biodisponibilidade e bioatividade. Essas transformações podem ser de uma forma ativa para uma inativa, ou vice-versa. Os isômeros trans em alimentos podem sofrer isomerização para cis, favorecendo a absorção com maior eficiência66,67. Por outro lado, certos tipos de componentes alimentares, sob oxidação ou outras reações de degradação, reduzem sua atividade biológica, por exemplo, carotenoides, ácidos graxos ω-3 e curcumina. Nesses casos, é possível adicionar antioxidantes naturais ou sintéticos para inibir sua degradação68. Portanto, esforços podem ser feitos na elaboração de alimentos que possam favorecer ou se opor às conversões químicas ou enzimáticas de compostos bioativos no TGI52.
Portanto, o nanoencapsulamento de carotenoides pode aumentar a biodisponibilidade melhorando a estabilidade contra isomerização e degradação, proporcionando maior solubilidade e maior bioacessibilidade no intestino e, liberação controlada no local alvo12. Apesar do potencial que essa tecnologia tem demonstrado, os aspectos legais relacionados à manipulação e ao consumo de materiais de dimensões nanométricas aplicados em alimentos são de extrema importância. Entretanto, as informações disponíveis sobre os riscos associados a produtos em escala nanométrica são limitadas69. No entanto, esses aspectos legais são importantes e influenciarão, diretamente, no uso, consequentemente, na decisão sobre o consumo desses produtos.
3.5 TOXICIDADE
A toxicidade é a capacidade que têm determinadas substâncias de causar danos aos seres vivos, e sua avaliação abrange ensaios com matérias-primas, formulações e produtos em que são aplicados testes in vitro e in vivo. Os ensaios in
vitro, como a citotoxicidade, são relevantes, portanto sensíveis, reprodutíveis, fáceis
de gerenciar e envolver menor custo, além de reduzir o número de ensaios in vivo, e, também, os danos causados aos modelos experimentais70.
Segundo a Anvisa71, os estudos toxicológicos devem ocorrer de acordo com diretrizes publicadas em referências internacionais existentes, como as da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OECD), que possui protocolos adequados para a maioria dos desfechos. A adaptação ou elaboração de protocolos, em função de circunstâncias de exposição ou tipos específicos de toxicidade (aguda, subaguda, subcrônica e crônica), devem ser devidamente justificadas.
A toxicidade aguda caracteriza-se pela produção de efeitos adversos, decorrentes de uma única dose ou múltiplas exposições a uma substância administrada em animais por um período de 24 horas72. A toxicidade subaguda provoca efeitos nocivos devido à exposição repetida em um período limitado de tempo, em média de 28 dias, embora estudos demonstrem resultados com 14 dias73 ou menos74. A toxicidade subcrônica apresenta efeitos tóxicos cumulativos nos tecidos e sistemas metabólicos por exposição repetida no período entre 1 e 3 meses, associada a inflamações na mucosa do estômago17. E a toxicidade crônica é aquela que resulta da exposição prolongada, maior que 3 meses, a doses graduadas de uma determinada substância em vários grupos de animais, sendo relacionada a efeitos neurotóxicos e carcinogênicos75.
A abordagem para identificação de perigos e avaliação de risco de novos produtos químicos tem sido amplamente dependente de experimentos in vivo caros e demorados. Esses experimentos, que incluem a dose repetida de 28 dias amplamente utilizada ou os de 90 dias, o estudo de carcinogenicidade de dois anos, o estudo de toxicidade reprodutiva de gerações e a toxicidade subaguda podem exigir centenas de animais e alto custo para um único composto experimental76, quando não se almeja, apenas, testar a sua dose bioativa.
Diretrizes para estudos in vivo, normalmente, exigem testes em doses máximas toleradas, em que a saturação dos processos metabólicos pode levar a respostas tóxicas com pouca ou nenhuma relevância para as exposições ambientais em humanos77. Entretanto, a partir do momento em que se tem uma dose bioativa estabelecida, baseada na quantidade de bioativo que evita ou inibe a oxidação em
50% (IC50), reduz-se o número de animais e priorizam-se protocolos de diminuição da dor e o estresse dos animais, atendendo, assim, ao princípio dos 3R’s. Esse princípio rege os estudos experimentais e faz-se pensar, primeiramente, na substituição de estudos in vivo por in vitro ou in silico, em seguida na redução do número de animais, e por fim no refinamento de protocolos experimentais que visem minimizar a dor ou estresse causados aos animais16,78.
Sinais de toxicidade sistêmica são definidos com base na redução da massa corporal dos animais experimentais79,80, além da redução nos consumos de água e ração, alterações de comportamento, apatia e má condição da pelagem, como a presença de pelos arrepiados. Outros sinais de toxicidade podem ser manifestados pela alteração da massa relativa dos órgãos, alterações hematológicas e bioquímicas81.
A aplicabilidade da nanotecnologia em diversas áreas requer uma investigação mais aprofundada, visto que as nanoformulações podem alterar o ambiente biológico, apresentar maior acessibilidade em barreiras fisiológicas, além de possuírem propriedades físico-químicas mais complexas, tornando-as mais desafiadoras que os produtos convencionais82.
A metodologia de testes in vivo baseia-se em promover a exposição de modelos experimentais às nanopartículas e avaliar parâmetros (bioquímicos, morfológicos e histológicos) para obter características de toxicidade. Com base nesses estudos, é possível caracterizar os parâmetros que irão compor a regulação, analisando os efeitos maléficos ainda desconhecidos. Uma classificação completa significa resultados seguros e com ampla utilidade81.
As nanopartículas apresentam características, capazes de afetar a toxicidade dos materiais, como por exemplo, a grande área superficial específica ou os diferentes comportamentos toxicocinéticos (mudanças significativas na absorção, distribuição e/ou metabolismo). Além disso, a morfologia, alterações na hidrofobicidade ou hidrofilicidade, estabilidade, reatividade aumentada, liberação direcionada ou controlada pela nanopartícula, maior biodisponibilidade e exposição interna comparada ao material de origem, interações com biomoléculas, bioacumulação afetarão, provavelmente, a toxicidade de uma nanopartícula16.
A nanotecnologia pode resultar em potencial dano à saúde humana, devido ao seu tamanho, sendo as nanopartículas capazes de atravessar barreiras
imunológicas da pele, pulmões e trato gastrointestinal, podendo evoluir para problemas sistêmicos decorrentes da translocação dessas partículas para a corrente sanguínea e, consequentemente, para órgãos, sistema linfático, tecidos e células. A observação da resposta biológica a nanopartículas fornece ferramentas bioquímicas, necessárias para conhecer e evitar exposição a substâncias tóxicas16.
Com relação aos carotenoides, poucos estudos de toxicidade foram realizados, utilizando formas encapsuladas, em contraste com estudos com matrizes de alimentos vegetais processados de frutas e vegetais. Para esse tipo de estudo, os modelos animais preconizados pelas diretrizes de testes toxicológicos são os roedores como ratos Wistar saudáveis81. No entanto, levar em consideração a utilização de animais com alterações induzidas por dietas que apresentam alto índice glicêmico e alta carga glicêmica, tal como a dieta HGLI, parece ser uma opção interessante.
A dieta HGLI, especificamente, é rica em alimento ultraprocessado83 e configura uma opção frequente no comportamento alimentar, estando bastante presente na população1. Além disso, essas dietas ricas em alimentos ultraprocessados, desencadeadoras de doenças, como obesidade, diabetes, doenças cardiovasculares, hipertensão, entre outras, as quais produzem metabólitos tóxicos e diversas alterações no organismo, entre elas a inflamação21, constituem objeto de estudo na atualidade.
Luz et al.83 observaram que a dieta HGLI apresenta uma alta carga inflamatória e, sabendo-se que carotenoides tem ação anti-inflamatória11, é interessante investigar a segurança e o potencial bioativo em modelo experimental de animais alimentados com dieta HGLI e nanopartículas de carotenoides, assegurando, assim, o uso das nanopartículas em estudos futuros com aplicação clínica com perspectiva anti-inflamatória.
Para tanto, se faz necessário avaliar os principais sinais de toxicidade como alteração no consumo alimentar, peso, pelagem, massa relativa dos órgãos, parâmetros sanguíneos hematológicos e bioquímicos, morfologia e histopatologia que auxiliam na visualização dos danos macroscópicos e celulares causados pelas moléculas ingeridas76,79,80.
4 METODOLOGIA
4.1 MATERIAIS
Os melões do tipo comercial Cantaloupe (cadastrado no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) sob o número A5A85DF) foram adquiridos no comércio da cidade de Natal/RN em estágio ótimo de maturação. Os materiais usados para encapsulação foram a gelatina suína (Tipo A) e surfactante Tween 20 obtidos da Sigma-Aldrich e, o óleo de soja da marca Lizza® adquirido no comércio local. O padrão de β-caroteno da Sigma® foi utilizado para caracterização do extrato de melão Cantaloupe.
4.1.1 Dietas e animais
As dietas utilizadas foram a ração Labina®, produzida pela Purina® do Brasil, adquirida, comercialmente, e dieta com alto índice glicêmico e alta carga glicêmica (HGLI) composta por ração padrão para roedores, leite condensado e açúcar cristal e foi produzida pelo grupo de pesquisa NutriSBioativoS de acordo com Carvalho et al.84 no Laboratório de Tecnologia de Alimentos do Departamento de Nutrição da UFRN.
Ratos Wistar adultos com inflamação crônica induzida pela dieta HGLI, de acordo com Luz et al.83, foram obtidos do Biotério da Universidade Potiguar (UnP). Os animais com inflamação crônica previamente induzida por dieta HGLI foram distribuídos, aleatoriamente, marcados para permitir a identificação, alocados em gaiolas individuais, mantidos em condições padrões laboratoriais de aclimatação de temperatura (22 + 3ºC), umidade (50 a 55%), luminosidade (12h de luz / 12h de escuro), água e alimentação ad libitum. O experimento de avaliação da segurança da dose bioativa de carotenoides nanoencapsulados ocorreu por dez dias, tendo no décimo primeiro dia ocorrido a coleta dos tecidos e materiais necessários para avaliação. Os experimentos ocorreram em concordância com o Guide for the Care
and Use of Laboratory Animals85 e aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA-UnP), protocolo 019/2017. Os grupos de animais avaliados foram descritos na Tabela 1.
Tabela 1. Distribuição de grupos e tratamentos de ratos Wistar com inflamação
crônica previamente induzida por dieta HGLI por 10 dias.
Grupos Tratamentos
Grupo 1 Ratos alimentados com dieta HGLI sem tratamento e administração de água por gavagem
Grupo 2 Ratos alimentados com dieta HGLI e tratados com dieta padrão e administração de água por gavagem
Grupo 3
Ratos alimentados com dieta HGLI e tratados com 12,5 mg extrato bruto de carotenoide (EB) / kg de peso do animal,
administração suspensa em água por gavagem
Grupo 4
Ratos alimentados com dieta HGLI e tratados com 50 mg de extrato bruto de carotenoides nanoencapsulado (EGS) / kg de
peso do animal, administração diluída em água por gavagem.
HGLI: dieta com alto índice glicêmico e alta carga glicêmica. EB: extrato bruto de carotenoides do melão Cantaloupe (Cucumis melo L.). EGS: nanopartículas de carotenoides do melão Cantaloupe nanoencapsulado em gelatina suína.
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Processamento da polpa de melão (Cucumis melo L. var cantalupensis) e obtenção do extrato contendo carotenoides
O processamento da polpa e a obtenção do extrato contendo carotenoides seguiu de acordo com Medeiros et al.14. Os melões foram submetidos à lavagem em água corrente, para a remoção de sujidades. As cascas e sementes foram removidas, e a polpa separada e cortada em pedaços de, aproximadamente, 2 cm de espessura, para ser desidratada em estufa ventilada (Tecnal, Piracicaba, Brasil) a 55°C por 24 horas. Ao final desse processo, o material foi triturado em liquidificador industrial.
Para a obtenção dos extratos, o material desidratado e moído foi colocado em frascos de vidro junto ao etanol 95% (1:4 p/v) e submetido à maceração. Os frascos foram protegidos da luz, e o solvente trocado em dias alternados, por meio de filtração com bomba a vácuo, até exaustão.
O extrato etanólico obtido foi submetido à partição com solvente hexano (1:1 v/v) e solução de NaCl a 10% (1:10 v/v) até a fase hexânica apresentar-se incolor, sugerindo a saturação na transferência de pigmentos da fase polar para
apolar. O solvente foi eliminado em evaporador rotatório (Buchi – R-215, BÜCHI Labbortechnik AG, Surat, Índia) sob baixa pressão à temperatura de 28°C e, posteriormente, liofilizado (Figura 3).
Figura 3. Fluxograma de obtenção do extrato bruto de carotenoides oriundos do melão Cantaloupe.
Todas as etapas que envolveram o processamento da polpa de melão Cantaloupe foram realizadas no Laboratório de Tecnologia de Alimentos e Laboratório de Técnica Dietética do Departamento de Nutrição da UFRN. E as etapas envolvidas na obtenção do extrato contendo os carotenoides do melão Cantaloupe foram realizadas no Laboratório de Análise de Alimentos do Departamento de Nutrição da UFRN e no Laboratório de Farmacognosia do Departamento de Farmácia da UFRN.
4.2.2 Caracterização do extrato de melão Cantaloupe 4.2.2.1 Espectrofotometria de absorção no UV-vis
A determinação do teor de carotenoides totais do extrato bruto de melão Cantaloupe foi realizada com base em Biehler et al.86 no comprimento de onda de máxima absorção obtido por meio da espectrofotometria de varredura, por meio da seguinte equação: C (mol/L) = (A450 x FD) / 2592.
Em que:
FD = fator de diluição ajustado para as determinações de absorbâncias do extrato seco solubilizado em hexano.
2592 = coeficiente de absortividade molar do β-caroteno (ε).
O resultado foi expresso em micrograma de carotenoides/g de polpa de melão in natura (μg/g).
4.2.2.2 Cromatografia Líquida de UltraEficiência (UPLC)
A análise foi realizada em cromatógrafo líquido de ultra eficiência (Shimadzu, Quioto, Japão) acoplado a detector do tipo diode array detector (SPD-M20A), para identificação e quantificação de β-caroteno a 450 nm, de acordo com Rodriguez-Amaya87 com modificações propostas por Medeiros et al.14.
O equipamento possui bomba analítica binária (LC-20A3 XR), injetor automático (SIl-20AD XR), desgaseificador (DGU-20A3), forno de coluna (CTO-20AC), com um sistema controlado pelo software LC Solution®. A coluna utilizada foi do tipo XR-ODS, Shim-Pak®, C18, 30 x 20 mm; 2,2 μm. Antes da injeção, o extrato foi solubilizado em acetato de etila na concentração de 0,4 mg/mL e 5 μL foram injetados.
A fase móvel foi constituída pelos solventes acetonitrila e água (900:99 v/v - fase A) e acetato de etila (fase B), utilizando um gradiente de eluição na seguinte proporção: 0 min, 100% A, 0% B; 5 min, 75% A, 25% de B; 10 min, 30% A, 70% de B; 13 min, 0% A, 100% B; 14 min, 100% A, 0% B; 20 min, 100% A, 0% B. O fluxo utilizado na coluna foi de 0,5 mL/min. Uma curva de calibração para o padrão de β-caroteno (Sigma Aldrich) (450 nm) foi construída, previamente, utilizando concentrações de 0,005 a 0,2 mg/mL.
4.2.3 Encapsulação de carotenoides
Parte do extrato bruto (EB) permaneceu em frasco de vidro revestido com papel alumínio sob condições de congelamento a -20°C, enquanto a outra parte foi utilizada para produção de carotenoides nanoencapsulados em gelatina suína (EGS).
O EGS foi produzido pela técnica de emulsificação O/A com posterior dispersão de fase aquosa contendo tensoativo (Tween 20) e gelatina suína na emulsão obtida, seguido de secagem por liofilização para obtenção do material em pó de acordo com Medeiros et al.14.
Duas fases aquosas foram formuladas: a primeira (FA1) com 90 mL contendo 1,5% de Tween 20 (p/v) solubilizado em água destilada; a segunda (FA2) com 100 mL contendo 4% da gelatina suína (p/v) e 1,5% de Tween 20 (p/v) solubilizados em água destilada. A fase oleosa (10 mL) continha 0,5% de extrato de carotenoide (p/v) solubilizado em óleo de soja.
Para promover a solubilização do extrato rico em carotenoides em óleo de soja, foi utilizada agitação magnética por 30 min à temperatura ambiente, sendo a mesma técnica utilizada para solubilização de FA1. Para FA2, a solubilização ocorreu a 40ºC durante uma hora sob agitação magnética.
Para promover a formação da emulsão (Figura 4), a fase aquosa 1 foi homogeneizada com a fase oleosa sob ação do ultradispersor (17.000 rpm/10 min) (Ultra-Turrax, IKA®T18 basic, Gaungzhou, China). Em seguida, a FA2 foi dispersa e homogeneizada a emulsão obtida, utilizando as mesmas condições, anteriormente, citadas. Ao final do processo, a emulsão final foi seca por liofilização (LioTop L101, Vitória, Brasil) a – 57ºC e pressão de 43 µHg. Posteriormente, triturou-se o extrato liofilizado em liquidificador.
Figura 4. Fluxograma do processo de encapsulação de extrato bruto de carotenoides oriundos de
Melão Cantaloupe por meio de emulsificação óleo/água. A. Fase oleosa. B. Fase aquosa 1. C. Fase aquosa 2.
O processo de encapsulação aconteceu no Laboratório de Tecnologia de Alimentos do Departamento de Nutrição da UFRN e a liofilização no Laboratório de Farmacognosia do Departamento de Farmácia da UFRN.
4.2.4 Caracterização das nanopartículas
A Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ocorreu no Laboratório de Caracterização Estrutural de Materiais do Departamento de Engenharia de Materiais da UFRN; a Difração a laser foi realizada no Laboratório do Núcleo de Pesquisa em Petróleo e Gás – NUPEG do Departamento de Engenharia Química da UFRN; a Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier foi realizada na Central Analítica no Instituto de Química da UFRN.
4.2.4.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As nanopartículas foram suspensas em acetona e gotejadas sobre um suporte (stub) contendo placa de silício fixada com fita de carbono e, analisadas em várias ampliações usando um alto vácuo, tensão de 2-3 kV, sem metalização, com microscópio do tipo SEM-FEG ZEISS (AURIGA®, Oberkochen, Alemanha)14.
4.2.4.2 Difração a laser
A metodologia foi padronizada segundo Medeiros et al.14 com modificações. Para a determinação dos diâmetros médios e índice de polidispersão da nanoformulação obtida (EGS), foram utilizados 10 mg de EGS, dispersos em 4 mL de acetona sob agitação magnética a temperatura ambiente (28° C) por 2 min. Posteriormente, foram adicionados 2 mL de formaldeído PA (v/v) e agitando-se por 30 min. Após esse período, filtrou-se com auxílio do papel de filtro; as partículas retidas foram coletadas para a análise de difração a laser. O material foi disperso, novamente, em 6 mL de água destilada.
Em seguida, a dispersão foi disposta em cubeta de vidro e lidas a 10 corridas/min para mensuração de diâmetro médio e índice de polidispersão no NanoBrookZetaPlusZeta Potencial Analyzer (Brookhaven Instruments, Nova Iorque, EUA), software BrookhavenInstruments – ZetaPALSParticleSizing Software. O experimento foi realizado em triplicata.
