UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRÓ-REITORIA DE GRADUAÇÃO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ANÁLISE CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS CURSO DE FARMÁCIA
MARIA DAS GRAÇAS PEREIRA DE ARAÚJO
AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS IMUNOFENOTÍPICAS DA MICOSE FUNGÓIDE E SÍNDROME DE SÉZARY
NATAL, RN 2021
MARIA DAS GRAÇAS PEREIRA DE ARAÚJO
AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS IMUNOFENOTÍPICAS DA MICOSE FUNGÓIDE E SÍNDROME DE SÉZARY
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Farmácia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do Título de Farmacêutico.
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Junior
NATAL, RN 2021
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Elaborado por Adriana Alves da Silva Alves Dias - CRB-15/474 Araújo, Maria das Graças Pereira de.
Avaliação das características imunofenotípicas da micose fungóde e Síndrome de Sézary / Maria das Graças Pereira de Araújo. - 2021.
15f.: il.
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) -
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Departamento de Farmácia e Análises Clinicas. Natal, RN, 2021.
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior.
Coorientador: Prof. Dr. Gustavo Henrique de Medeiros Oliveira.
1. Síndrome de Sézary - TCC. 2. Micose fungóide - TCC. 3.
Imunofenotipagem - TCC. 4. Linfócitos T - TCC. 5. Citometria de fluxo - TCC. I. Cavalcanti Júnior, Geraldo Barroso. II. Oliveira, Gustavo Henrique de Medeiros. III. Título.
RN/UF/BSCCS CDU 615.011
MARIA DAS GRAÇAS PEREIRA DE ARAÚJO
AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS IMUNOFENOTÍPICAS DA MICOSE FUNGÓIDE E SÍNDROME DE SÉZARY
BANCADA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Junior Universidade federal do Rio Grande do Norte
Msc. Victor Lima Soares
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Msc. Rafael Duarte Lima
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
NATAL, RN 2021
Avaliação das características imunofenotípicas da Micose Fungóide e Síndrome de Sézary
Evaluation of the immunophenotypic characteristics of Mycosis Fungoid and Sézary Syndrome
Maria das Graças Pereira de Araújo 1, Rafael Duarte Lima 2, Maria Letícia de Lima Machado 3, Victor Lima Soares 4, Gustavo Henrique de Medeiros Oliveira 5, Geraldo Barroso Cavalcanti Junior 6
1 Bacharelanda do curso de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). Natal – RN. Bacharel em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). Natal – RN, Brasil
2 Mestrando do curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (PPGCF-UFRN). Natal – RN
3 Mestranda do curso de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da Mulher da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (PGCASM-UFRN/MEJC). Natal-RN, Brasil
4 Especialista em Hematologia e Mestrando do curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (PPGCF- UFRN) 5 Doutorado em Ciências da Saúde pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Natal-RN, Brasil
6 Doutorado em Biologia Celular e Molecular pela Fundação Oswaldo Cruz, Prof.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal-RN. Instituição: Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). Natal-RN, Brasil.
RESUMO
Os linfomas cutâneos de células T (LCCTs) constituiem um grupo de doenças lifoproliferativas extranodais, atualmente classificadas e subdivididas de acordo com o comportamento clínico segundo a OMS/EORTC . Dentre os LCCTs, os mais comuns são a micose fungóide ( MF ) de curso indolente e síndrome sézary ( SS ), esta corresponde à forma leucêmica da MF, geralmente associada a um curso agressivo. O presente estudo teve como objetivo demonstrar a importância da Imunofenotipagem por citometria de fluxo por meio da positividade e intensidade de expressões antigênicas na confirmação do diagnóstico da micose fungóide e síndome de Sézary. Foram analisadas amostras de Sangue periférico (SP) de 23 pacientes previantente diagnosticados com MF no intuito de investigar a SS. Os referidos pacientes foram encaminados ao Laboratório do Departamento de Hematologia do Hemocentro Dalton Barbosa Cunha (HEMONORTE), Natal, Brasil. Os pacientes foram analisados quanto aos aspectos clínicos, hematológicos e imunofenotípico, utilizando 4,0 mL de sangue periférico (SP). Na Imunofenotipagem por citometria de fluxo (CF) foram utilizados painéis específicos de AcMo conjugado diretamente a três diferentes fluorocromos: isotiocianato de fluoresceína (FITC) Phicoeritrina (PE), proteína clorofila piridina, (PerCP), que detectam fluorescência verde, laranja e vermelha, respectivamente, possibilitando a marcação de até três marcações por tubo, constituidos de antígenos pan-B, pan-T e antígenos não espeficados. Em nosso estudo a análise por CF possibilitou identificar o predomínio da população de células T maduras (CD3+/CD2+/CD5+, TCRAB+) com expansão das células CD4+ em 100% dos casos. Mediante a análise de células de Sézary (CS) foram identificados os pacientes de números 1 e 3 ( tabela 3 ) com
contagem absoluta de CS inferior a 1.000/mm³, no entanto, os demais pacientes apresentaram valores absolutos de CS > 1.000/mm³ de SP. Nos resultados obtidos, observamos que a imunofenotipagem por CF mostrou ser uma metodologia eficiente na detecção da células de CS, podendo ser empregada no diagnóstico precoce e monitoramento da MS/SS.
ABSTRACT
Cutaneous T-cell lymphomas (LCCTs) constitute a group of extranodal lymphoproliferative diseases, currently classified and subdivided according to clinical behavior according to the WHO/EORTC. Among the CTCLs, the most common are mycosis fungoides (MF) with an indolent course and sezary syndrome (SS), which corresponds to the leukemic form of MF, generally associated with an aggressive course.
The present study aimed to demonstrate the importance of immunophenotyping by flow cytometry through the positivity and intensity of antigenic expressions in confirming the diagnosis of mycosis fungoides and Sézary syndrome. Peripheral blood (SP) samples from 23 patients previously diagnosed with MF were analyzed in order to investigate SS.
These patients were referred to the Laboratory of the Department of Hematology, Blood Center Dalton Barbosa Cunha (HEMONORTE), Natal, Brazil. Patients were analyzed for clinical, hematological and immunophenotypic aspects, using 4.0 mL of peripheral blood (SP). In immunophenotyping by flow cytometry (CF), specific panels of AcMo conjugated directly to three different fluorochromes were used: fluorescein isothiocyanate (FITC) Phicoerythrin (PE), chlorophyll pyridine protein, (PerCP), which detect green, orange and red fluorescence, respectively, allowing the labeling of up to three labels per tube, consisting of pan-B, pan-T and unspecified antigens. In our study, the CF analysis made it possible to identify the predominance of the population of mature T cells (CD3+/CD2+/CD5+, TCRAB+) with expansion of
CD4+ cells in 100% of cases. Through Sézary cell (CS) analysis, patients numbers 1 and 3 were identified ( table 3 ) with absolute CS counts of less than 1,000/mm³, however, the other patients had absolute CS values > 1,000/mm³ of SP. In the results obtained, we observed that CF immunophenotyping proved to be an efficient methodology in the detection of CS cells, which can be used in the early diagnosis and monitoring of MS/SS.
PALAVRAS-CHAVES: Síndrome de Sézary, micose fungóide, imunofenotipagem, Linfócitos T, citometria de fluxo
KEYWORD: Sézary syndrome, fungoid mycosis, immunophenotyping, T lymphocytes, flow cytometry
INTRODUÇÃO:
Os linfomas cutâneos de células T (LCCTs) são doenças raras, correspondendo cerca de 2% de todos os linfomas com incidência anual de 0,3 a 1 por 100.000 casos, acomete primariamente a pele, podendo envolver outros órgãos e tecidos, incluindo o sangue periférico (SP) (1,3,4,8)
Dentre os LCCTs, os mais comuns são a micose fungóide (MF), de curso indolente e a síndrome de Sézary (SS), esta corresponde a forma leucêmica da MF, geralmente associada a um curso agressivo (1,6,20,31).
A MF é um linfoma cutâneo primário de células T epidermotrópico caracterizado por infiltrados de linfócitos T de pequenos a médios tamanho com núcleos convoluto em forma de cérebro (células de Sezary). Em estágios iniciais a MF pode apresentar lesões de pele indistinguíveis de outras doenças dermatológicas devendo ser diferenciada da eritrodermia de origem inflamatória, como a psoríase e farmacodermias (2, 5, 12).
A SS se caracteriza pela presença células de SS no SP (5,8,12,15), sendo necessário, no entanto a presença de um ou mais dos seguintes critérios: uma contagem absoluta de células de Sezary >1000/µL, ou >20% na distensão sanguinea, uma população de células TCD4+ expandida resultando em uma elevada razão CD4/CD8 (>10: 1) e perda ou baixa intensidade de um ou mais antígenos de células T como o CD7 e o CD26 (5, 8, 22, 19).
A imunofenotipagem pode ser realizada atraves do estudo imunohistoquimico de lesões cutâneas nos casos da MF ou por citometria de fluxo (CF) em amostras de SP na SS, evidenciando a expansão das células TCD4+ clonais, perda ou baixa intensidade de antigenos linfocitários pan-T e diminuição de linfócitos B e células natural kille (NK) (8,13,19,22).
Celulas anômalas consiste em uma proliferação de linfócitos TCD4/ TCRAB+, CD45RO+, com raros casos com expressão de células TCD8+ (21,18). Outro achado importante é a perda parcial ou total de antígenos CD7 e CD26, normalmente expressas nos linfócitos TCD4 normais, podendo estar associado com a progressão da doença, assim com aumento da relação CD4/CD8 (4,5,10).
MATERIAL E MÉTODOS Pacientes:
Amostras de Sangue periférico (SP) de 23 pacientes previantente diagnosticados com MF no intuito de investigar SS, foram encaminados ao Laboratório no Departamento de Hematologia do Hemocentro Dalton Barbosa Cunha (HEMONORTE), Natal, Brasil.
O diagnóstico de SS foi inicialmente baseado na apresentação clínica, hemograma incluindo a citomorfologia de esfregaços de SP corados com corantes hematologicos (may Grunwald- Ginsa- MGG) e imunofenotipagem por citometria de fluxo com um painel de de anticorpos monoclonais (AcMo) especifico para doença linfoproliferativas crônica. As características demográficas e clínicas desses pacientes.
Exames Hematológicos:
Investigação hematológica foi realizada com 4.0 ML de SP coletado em tubos K3EDTA da labor import. A contagem de leucócitos, dosagem de hemoglobina e contagem de plaquetas foram avaliadas no analisador hematológico (Cell-Dyn 3.000, Unipath Corp., Mountain View, CA). Análises citomorfológicas foram realizados em esfregaços corados com MGG em um microscópio óptico em lentes de aumento de 20, 40 e 100x (Microscópio Zeiss, Gütting, Alemanha) e o resultado pontuado em porcentagem e alterações citomorfológicas também foram registrados
Imunofenotipagem por citometria de fluxo:
Todas as amostras de SP foram submetidas a CF usando um painel específico de AcMo conjugado diretamente a três diferentes fluorocromos: isotiocianato de fluoresceína (FITC) Phicoeritrina (PE), proteína clorofila piridina, (PerCP), que detectam fluorescência verde, laranja e vermelha, respectivamente, possibilitando a marcação de até três marcações direta por tubo, constituido de antígenos pan-B: CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, sIgM, sIgD, sIgG, CD79b, CD79a, CD25, CD27, CD21,
FMC7, cadeia leves das imunoglobulinas (kappa e lambda); Antigenos pan-T: CD1, CD2, CD3,CD4,CD5, CD7, CD8, CD28, TCRA/B, TCR G/D; células NK CD56, CD57 e antígenos não espeficados: CD38 , TdT (Desoxinucleotidil Transferase Terminal), CD45, , CD16-56, CD103, CD25, CD11c, CD123 e CD45RO e CD45RA.
Para a marcação dos Ags de superfície, 50 microlitros (μL) das amostras de SP previamente homogeneizadas foram incubados com 5 μL de cada AcMo à temperatura ambiente por 30 minutos ao abrigo da luz. A suspensão foi homogeneizada e 3 mililitros (mL) de solução de lise (FacsLysing, Becton Dickinson, San Jose CA, EUA) previamente diluída a 10% em água destilada foram adicionados e posteriormente incubados por 15 minutos no escuro em temperatura ambiente. Em seguida, a suspensão foi centrifugada por 5 minutos a 1500 RPM, o sobrenadante descartado. O sedimento foi ressuspenso em 3 mL de PBS, centrifugado a 1500 RPM por 5 minutos e o sobrenadante descartado, sendo a última etapa realizada mais 1 vez. Ao final dessa etapa o pellet foi ressuspenso em 200μL de solução de formaldeído a 1% diluído em solução tamponada com fosfato (PBS, Ph 7.2) e armazenado sob refrigeração até a análise. Em todos os casos, um controle de autofluorescência não específico com um conjugado IgG marcado com fluorocromo (Gamma 1FICT / gama 2PE / gama 3PerCP - Becton Dickinson, San Jose CA, EUA) foi usado.
Realizou-se também a marcação de Ags intracitoplasmáticos e nucleares por se tratarem de antígenos cujos epítopos estão localizados no citoplasma. Foi necessária a prévia permeabilização celular possibilitando assim o direcionamento e reatividade do MoAb para o antígeno TdT. Para este procedimento foi utilizado o protocolo de permeabilização da membrana citoplasmática da célula utilizando solução de lise (solução de lise Becton Dickinson's FACS, San José CA, EUA) (Krivit, Good, 1957;
Lange, 2000). Aproximadamente 50μl de amostra de SP por tubo foi incubado por 10 minutos à temperatura ambiente com solução de lise (Facs-Lysing, Becton Dickinson, San Jose CA, EUA) previamente diluída a 10% em água destilada, seguida por centrifugação a 1500 RPM por 5 minutos, descartando o sobrenadante e homogeneizando o sedimento. Após a homogeneização, 5 μl do mAb foram adicionados, seguidos de incubação por 30 minutos à temperatura ambiente e protegidos da luz. O sedimento foi homogeneizado em 3 mL de solução de PBS seguido por centrifugação a 1500 RPM por 5 minutos. Após descartar o sobrenadante, o sedimento foi ressuspenso e posteriormente lavado com PBS. Após o descarte do sobrenadante, 1 mL de PBS foi adicionado ao pellet final e armazenado na geladeira sob abrigo da luz até a leitura no citômetro de fluxo (CF).
Para cada amostra, um tubo de marcação não específico (Faixa 1FICT / faixa 2PE / faixa 3PerCP; - Becton Dickinson, San Jose CA, EUA) foi usado.
Para a marcação de antígenos Kappa e Lambda foi utilizado 50μl de amostra de SP por tubo com 1mL de solução de albumina a 0,5% foram incubados em banho-maria a 37 ° C por 30 minutos. A suspensão foi então centrifugada e o sobrenadante descartado.
O precipitado foi ressuspenso em 5mL de PBS, centrifugado e, em seguida, o sobrenadante foi descartado. Esta etapa foi repetida mais uma vez. O precipitado foi ressuspenso em cerca de 200 μL de PBS e 50 μL de MoAb anti-Kappa ou anti-lambda foram adicionados e mantidos refrigerados a 2-8 ° C durante a noite. No dia seguinte, 5 mL de solução de lise foram adicionados à amostra e incubados no escuro por 15 minutos em temperatura ambiente. A suspensão foi centrifugada e o sobrenadante descartado. O precipitado foi ressuspenso em 5mL de PBS e então centrifugado e o sobrenadante descartado. O precipitado final foi ressuspenso em cerca de 200μl de PBS e mantido refrigerado até a aquisição de CF. Para cada amostra, foi usado um tubo de marcação não específico: Faixa 1FICT / faixa 2PE / faixa 3PerCP; - Becton Dickinson, San Jose CA, EUA.
A aquisição e análise das amostras foram realizadas em FACscScalibur FC 3 cores (Beckton Dickinson) na plataforma Machintosh (Apple), utilizando o software Cell Quest (software Beckton Dickinson Cell Quest) com aquisição (leitura) de um total de 20.000 ( FSC) em escala linear que avalia o tamanho da célula, e Side Scatter (SSC) também em escala linear, que avalia a complexidade e granularidade celular, FL1, FL2 e FL3 em escala logarítmica que detectam fluorescência verde, laranja e vermelha, o que significa o antígeno - reação de conjugado de anticorpo a FICT, PE e PerCP, respectivamente. Para cada amostra analisada, controles isotípicos não específicos foram usados, que serviram
ÉTICA
Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito de acordo com a Declaração de Helsinque.
RESULTADOS
Os dados expressados nas tabelas 1, 2, e ,3 são referentes aos aspectos clínicos, hematológicos e imunofenotípicos, obtidos da análise do sangue periférico de 23 pacientes em um estudo retrospectivo.
TABELA 01. CORRELAÇÃO IDADE, SEXO E ERITRODERMIA NOS PACIENTES COM MICOSE FUNGÓIDE.
PACIENTE IDADE (anos) SEXO ERITRODERMIA
1 69 F Presente
2 60 M Presente
3 68 M Presente
4 66 F Presente
5 55 F Presente
6 71 M Presente
7 44 F Presente
8 33 F Presente
10 57 M Presente
12 77 M Presente
14 90 F Presente
16 67 M Presente
18 58 M Presente
20 64 F Presente
22 44 M Presente
Média de idade – 62 anos, desvio padrão 14,7 anos. Feminino (56,5%) e masculino (43,5%).
Foi identificado um discreto aumento do sexo feminino de 56,5% em comparação com o sexo masculino, 43,5 %.
9 61 F Presente
11 71 F Presente
13 58 M Presente
15 86 F Presente
17 56 F Presente
19 88 M Presente
21 58 F Presente
23 38 F Presente
TABELA 02. PERFIL IMUNOFENOTÍPICO DOS LINFÓCITOS T, EM SANGUE PERIFÉRICO, ASSOCIADOS À MICOSE FUNGÓIDE/SINDROME DE SÉZARY.
A análise por citometria de fluxo possibilitou identificar o predomínio da população de células T maduras ( CD3+/CD2+/CD5+, TCRAB+ ) e de células CD4+
em 100% dos casos (23/23). Em 18 pacientes a relação CD4/CD8 apresentou-se > 10 e em 5 pacientes dos 23 analisados (21,7%)< 10, destes cinco pacientes com relação CD4/CD8<10, 3 apresentaram CD7+.
A perda de expressão de CD7 nos linfócitos T foi observada em 19 pacientes (82,6%). Todos os pacientes apresentaram positividade quanto ao marcador de células T de memória CD45RO, 23 pacientes apresentaram positividade superior ao marcador CD45RA, com exceção do caso de número 21 em que o 45RO (42%) foi inferior ao CD45RA (89%). Os casos de números 22 e 23 não foram realizadas as marcações com estes AcMo.
TABELA 3. CONTAGEM RELATIVA E ABSOLUTA DE CÉLULAS DE SÉZARY(CS) NOS PACIENTES ANALISADOS
LEUCOMETRIA LINFÓCITOS CÉLSs.SÉZARY CÉLs.CÉZARY
(mmt) (%) (%) (mmt)
1 3.600 33 17 612
2 9.800 42 17 1666
3 5.000 33 17 850
4 58.700 65 30 17610
5 8.700 85 30 2610
6 15.500 65 30 4650
7 16.300 56 22 3586
8 19.200 60 20 3840
9 52.900 99 99 52371
10 18.800 41 30 5640
11 12.000 56 22 2640
12 9.000 45 30 2700
13 11.000 60 30 3300
14 10.000 60 30 3000
15 30.200 66 30 9060
16 9.500 26 15 1425
17 16.600 56 44 7304
18 9.000 40 20 1800
19 153.000 62 44 67320
20 5.500 40 30 1650
21 22.200 36 35 7770
22 59.900 43 16 9584
23 142.000 37 24 34080
Mediante análise de CS identificamos os pacientes de números 1 e 3 com contagem absoluta de CS inferior a 1.000/mm³. No entanto, os demais pacientes apresentaram valores absolutos de CS > 1.000/mm³ de sangue periférico
Média e Desvio Padrão: 37,30 (31,6)
Linfócitos Totáis: Média e Desvio padrão: 44% (23,3) Células de Sézary: Média e Desvio padrão: 30% (17,1)
CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos, observou-se que a imunofenotipagem por citometria de fluxo mostrou ser uma metodologia eficiente na detecção de células de SS, podendo ser empregada no diagnóstico precoce e monitoramento da MS/SS.
CONFLITO DE INTERESSE Não há conflitos de interesse.
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