Lucas Francisco Zanusso Cunha
Ação da piperina na genotoxicidade do câncer de cabeça e pescoço
São José do Rio Preto
2023
Lucas Francisco Zanusso Cunha
Ação da piperina na genotoxicidade do câncer de cabeça e pescoço
Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) apresentado como parte dos requisitos para obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas, junto ao Conselho de Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto.
Orientador: Profª. Drª. Flávia Cristina Rodrigues Lisoni
Coorientador: Profª Juliana Prado Gusson Zanetoni
São José do Rio Preto
2023
30 f. : il.
Trabalho de conclusão de curso (Bacharelado - Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto
Orientadora: Flávia Cristina Rodrigues Lisoni Coorientadora: Juliana Prado Gusson Zanetoni
1. Ciências Biológicas. 2. Biologia Molecular. 3. Cultura de células. 4. Danos ao DNA. 5. Fitoterápicos. I. Título.
Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto. Dados fornecidos pelo autor(a).
Essa ficha não pode ser modificada.
Lucas Francisco Zanusso Cunha
Ação da piperina na genotoxicidade do câncer de cabeça e pescoço
Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) apresentado como parte dos requisitos para obtenção do título de Bacharel em ciências biológicas, junto ao Conselho de Curso de Bacharelado em ciências biológicas, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto.
Comissão Examinadora
Profª. Drª. Flávia Cristina Rodrigues Lisoni UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto Orientador
Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga
UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto Profa. Dra. Claudia Regina Bonini Domingos UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto
São José do Rio Preto
26 de janeiro de 2023
AGRADECIMENTOS
A Deus que todos os dias ilumina e encoraja todos nós.
À minha mãe que com trabalho duro construiu os alicerces de seus filhos.
À minha avó que com carinho maternal me protegeu e ensinou a ajudar os demais.
Às paixões que a vida me trouxe, minha namorada e meu gato, que todos os dias repõem minhas energias
À minha orientadora Flávia e a coorientadora Juliana, que compartilharam comigo os seus conhecimentos e me desafiaram para colocá-los em prática.
Ao Ibilce que concede estruturas dignas de reconhecimento para o aperfeiçoamento pessoal e profissional.
Aos meus amigos que me acompanharam no meu desenvolvimento sempre me dando suporte e com quem compartilhei momentos inesquecíveis.
E a todos os professores do Ibilce que sempre sorriem para seus alunos e os ensinam a serem melhores
RESUMO
O câncer de cabeça e pescoço apresenta vários fatores que podem contribuir para um maior risco no seu desenvolvimento, tais como genéticos, ambientais e inflamatórios. Assim, estudos envolvendo diferentes agentes anti-inflamatórios, como fármacos ou fitoterápicos, estão relacionados com a diminuição do processo tumorigênico. Entre estes agentes anti-inflamatórios, a piperina (extraída da Piper nigrum) apresenta propriedades farmacológicas, ressaltando a antitumoral, cujo mecanismo de ação ainda não é bem estudado, mas pode levar as células à morte celular pela formação de danos ao DNA, ou seja, ter uma ação genotóxica. Utilizando o ensaio cometa em linhagens de células epidermoides de câncer de laringe (HEp-2) e língua (SCC-25) tratadas com o composto por 24 horas, foi possível observar os efeitos genotóxicos da piperina. Os danos ao núcleo podem levar à parada do ciclo celular e posteriormente à apoptose, por meio da ativação das proteínas p53, p21 e p27, além do recrutamento de quinases. Apesar de outras investigações apontarem como a principal causa para a genotoxicidade da piperina ser resultante da liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS), novos estudos são necessários para entendermos melhor a natureza deste efeito e as interações envolvidas na genotoxicidade.
Palavras–chave: Fitoterápico. Cultura de células. Piper nigrum. Apoptose. Ciclo celular. danos ao DNA.
ABSTRACT
Head and neck cancer presents several factors that may contribute to a higher risk in its development, such as genetic, environmental and inflammatory factors. Thus, studies involving different anti-inflammatory agents, such as drugs or herbal medicines, are related to the reduction of the tumorigenic process. Among these anti- inflammatory agents, piperine (extracted from Piper nigrum) has pharmacological properties, emphasizing its antitumor properties, whose mechanism of action is not yet well studied, but it can lead cells to cell death through the formation of DNA damage, i.e. , have a genotoxic action. Using the comet assay on laryngeal (HEp-2) and tongue (SCC-25) epidermoid cancer cell lines treated with the compound for 24 hours, it was possible to observe the genotoxic effects from piperine. Damage to the nucleus can lead to cell cycle arrest and subsequently to apoptosis, through the activation of p53, p21 and p27 proteins, in addition to the recruitment of kinases. Although other investigations look for the main cause for piperine genotoxicity to be resulting from the release of reactive oxygen species (ROS), further studies are needed to better understand the nature of this effect and the guests involved in the genotoxicity.
Keywords: Herbal medicine. Cell culture. Piper nigrum. Apoptosis. Cell cycle, DNA damage.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Estrutura química da piperina
Figura 2 - Fotomicrografias de fluorescência de núcleos das células HEp-2 e SCC-25
16 21
Figura 3 - Índice de danos à linhagem celular HEp-2 22 Figura 4 - Índice de danos à linhagem celular SCC-25 23
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DNA Ácido desoxirribonucleico
SCCHN Carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço HPV Papilomavírus humano
TCGA Atlas do Genoma do Câncer ROS Espécies reativas de oxigênio
HEp-2 Linhagem de carcinoma escamoso de laringe SCC-25 Linhagem de carcinoma escamoso de língua LMP Low Melting Temperature agarose
PBS Phosphate Buffer Solution NMP Normal Melting agarose ID Índice total de danos DMSO Dimetilsulfóxido Chk1 Checkpoint Quinase 1 Chk2 Checkpoint Quinase 2 P53 Proteína de tumor
LISTA DE SÍMBOLOS
µM Micromolar
% mM ºC ml
Porcentagem Milimolar Graus Celcius mililitros
G Gramas
M Molar
V Volts
Kva Volt-ampère N Normalidade
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 13
2 OBJETIVOS 16
3 MATERIAIS 17
3.1 Linhagens celulares 17
3.2 Piperina 17
4 MÉTODOS 17
4.1 Cultivo Celular
4.2 Ensaio Cometa Alcalino 4.3 Análise microscópica 4.4 Análise estatística
17 18 19 19 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Danos ao material genético na linhagem HEp-2 5.2 Danos ao material genético na linhagem SCC-25 6 DISCUSSÃO
7 CONCLUSÕES REFERÊNCIAS
19 21 22 23 25 25
1 INTRODUÇÃO
O câncer é a segunda principal causa de morte no mundo, tendo sido estimado 10 milhões de mortes em 2020 (YIN et al, 2021), podendo ser caracterizado por células anormais que se proliferam de forma atípica e surgem a partir de qualquer órgão ou estrutura do corpo. Ocasionalmente é detectado de forma acidental em exames de rotinas, testes laboratoriais, exames radiológicos ou diversas razões diferentes, mas normalmente o câncer deve alcançar o tamanho de 1 centímetro ou ser composto de 1 milhão de células antes de ser detectado (SAIKIA e ROY, 2016).
As células que compõem o câncer possuem seu fenótipo transformado a partir de uma série de mutações genéticas e epigenéticas, estas mudanças quando ocorrem nos genes que expressam proteínas podem agir em uma grande variedade de vias de sinalização, assim, podendo promover características como auto renovação, proliferação e formação de tumores (HANAHAN e WEIDBERG 2011). Para isso é necessário que os eventos mutagênicos ocorram de forma consecutiva, ao ponto de superar o reparo do DNA e os processos apoptóticos (CLEAVER, 2012). Em estudos recentes utilizando o genoma inteiro foi constatado que pessoas normais podem carregar mutações “condutoras” do câncer desde a primeira década de vida e aumentarem sua carga com o envelhecimento (MOORE et al, 2020).
No entanto, o comportamento anormal destas células não é dependente apenas dos fatores genéticos, sendo que a tumorigênise pode ser promovida por fatores ambientais como excesso de ingestão de calorias, infecções, abuso de substâncias como álcool, cigarro e etc., que aumentam o risco do desenvolvimento de diversos tipos de cânceres (CALLE, 2004; YILMAZ, 2018; SUDO et al, 2008).
Aberrações do sistema imune que impossibilitam a detecção e destruição das células cancerígenas recém-formadas também contribuem para a formação e disseminação do câncer (HANAHAN e WEIDBERG, 2011).
Anteriormente evidenciado, o câncer pode ter como ponto de partida, células tronco cancerígenas (CLEVERS, 2011), aquisição e hibridização do DNA de bactérias (DONG e XING, 2018), células embrionárias remanescentes (KREMENEVSK et al, 2020), parada no amadurecimento celular (SELL e PIERCE, 1994), diferenciação de células maduras (SELL 2004), mutações em células tronco (LYTLE, BARBER e REYA, 2018) e transformação de células progenitoras (REYA, 2001).
Desse modo, os carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço
(SCCHN) são definidos como tumores malignos que surgem das superfícies mucosas localizadas no trato aerodigestivo superior. Esse tipo de câncer ocorre 40% na cavidade oral, 15% na faringe e 25% na laringe, os demais em glândulas salivares e tireoide (BRAGANTE, et al. 2011). É uma doença caracteristicamente heterogênea devido à complexidade das estruturas anatômicas em que se desenvolve e a vasta variedade de mudanças moleculares que podem acarretar a carcinogênese deste tipo de tumor (LEEMANS, 2018).
Trata-se do sexto câncer mais comum no mundo com 900 mil novos diagnósticos e 450 mil mortes ao ano (SUNG et al, 2020). No Brasil a estimativa é de surgirem 36.620 novos casos em 2022, sendo 19.480 em homens e 17.140 em mulheres (SBCCP, 2022). O consumo de tabaco e álcool são os principais fatores de risco para o câncer de cabeça e pescoço, (MCLAUGHLIN, 1988) seguido pela infecção do papilomavírus humano (HPV), estudos realizados na Europa e América do Sul atribui a proporção de 22.4% para orofaringe, 4.4% para cavidade oral e 3.5%
para laringe, nos casos de câncer relacionados com a infecção de HPV (SANJOSÉ e SERRANO et al. 2018).
Os fatores genéticos associados à doença foram publicados pelo Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) em 2015 na forma de um catálogo molecular. O estudo analisou dados genômicos de 279 tipos de câncer de cabeça e pescoço, listando entre 50 e 100 genes que estariam substancialmente mutados em casos de SCCHN sendo, portanto, candidatos a genes promotores (CANCER GENOME ATLAS NETWORK, 2015). A maior parte das mutações estão associadas com genes supressores de tumor que atuam no controle do ciclo celular, crescimento e sobrevivência celular, na via de sinalização da WNT–β-catenina e fatores epigenéticos (LEEMANS et al, 2018).
A alteração genética mais frequente na carcinogênese de cabeça e pescoço, é a perda dos cromossomos 3p e 9p, concomitante com mutações no gene TP53 (LEEMANS et al, 2011; CALIFANO et al, 1996). O cromossomo 9 abriga o gene supressor de tumor CDKN24A responsável por inibir as ciclinas CDK4 e CDK6, com o gene ausente as células são capazes de passar pelo checkpoint G1-S levando a replicação não programada do DNA; este evento causa danos ao DNA e ativa a proteína p53, sintetizada a partir do gene TP53 (TOLEDO et al, 2017) e capaz de interromper o ciclo celular e induzir a apoptose (LEVINE e OREN, 2009) no entanto entre 60 a 80% dos casos de câncer de cabeça e pescoço incluem mutações
somáticas no gene TP53, como perda dos alelos ou do número de cópias. A soma destes fatores contribui para a carcinogênese de SCCHN (LAWREN et al. 2015).
O tratamento para a doença difere quanto a acessibilidade anatômica da região e ao estágio de desenvolvimento, visando aumentar a sobrevivência e preservar as funções do teciduais, tumores menores e sem envolvimento dos linfonodos são categorizados como de estágios iniciais (estágios I e II) (AMIN et al. 2017) podendo ser tratados apenas com cirurgia ou radioterapia (PFISTER et al, 2014). No entanto mais de 60% dos pacientes com SCCHN. Apresentam os estágios tardios, caracterizado por uma doença local avançada somada a invasão de estruturas adjacentes no estágio III, ou com metástases em tecidos distantes no estágio IV (CHOW, 2020). Neste caso o tratamento padrão consiste em altas doses de cisplatina com seções de radioterapia, que garante maior sobrevivência em pacientes com boa performance, no entanto, devido aos efeitos tóxicos tanto a curto quanto a longo prazo a cisplatina é administrada apenas em pacientes não idosos ou que não tenham quaisquer tipos de condição de saúde adversa (ADELSTEIN et al. 2017; PIGNON et al. 2009).
Além da cisplatina, todos os quimioterápicos disponíveis compartilham adversidades como o ressurgimento do câncer, resistência às drogas pelas células cancerosas e efeitos tóxicos nos tecidos saudáveis, podendo restringir o prosseguimento do tratamento e diminuir a qualidade de vida (PRITCHARD, 2012).
Estes fatores promoveram a busca por fontes alternativas de tratamento, entre estes os fitoterápicos, que possuem a capacidade de agir em populações heterogêneas de câncer e regular as vias de sinalização que estão envolvidas no desenvolvimento tumoral. Além de possuir um perfil mais seguro, mesmo em altas doses.
(CHOUDHARI, 2020)
Entre os fitoterápicos a piperina (Figura 1) é um dos grandes atrativos, trata-se de um amino alcaloide encontrado nas espécies Piper nigrum (pimenta do reino) e Piper longum (pimenta longa), sendo a principal molécula responsável pelas propriedades medicinais da pimenta. Que além de conhecidamente intensificar a disposição de drogas e nutrientes, pela absorção intestinal ou regulação do transporte e metabolismo de moléculas, podendo ser administrada em conjunto com outras drogas (SMILKOV et al. 2019). Possui funções anti-inflamatórias, neuro protetivas, imunomoduladora, cardioprotetora, antialérgica, antimicróbica e anticâncer (HAQ et al. 2021).
Figura 1: Estrutura química da piperina
Fonte: GUNNASEKARAN, et al. 2017
Os estudos das ações antitumorigênicas da piperina descobriram seu potencial em promover a apoptose e autofagia, parada do ciclo celular e inibir a formação de metástase (TURRINI et al. 2020). Dentre as características anticancerígenas da molécula, destaca-se também a potente atividade oxidativa capaz de estimular a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células cancerígenas quando em altas concentrações (ACHARYA et al. 2010). As ROS podem ser, superóxido, peroxido de hidrogênio e radicais hidroxila, que quando em excesso, podem causar estresse oxidativo nas células cancerígenas, o que é um mecanismo apoptótico conhecido (SIMON et al. 2000).
O acúmulo de peróxidos está relacionado com acidificação do pH citosólico, desencadeando os processos apoptóticos mediados por proteínas Bax concomitante com a inativação de genes da família Bcl-2 (GUNASEKARAN et al. 2017). Além deste mecanismo, o estresse oxidativo é capaz de promover danos aos ácidos nucleicos de forma a quebrar a conformação de fitas duplas, levando à parada do ciclo celular e apoptose (YAFFE et al. 2013).
Dito isso, nas últimas décadas o ensaio cometa se tornou metodologia padrão na quantificação de testes de genotoxicidade, aplicado para mensurar quebras na fita de DNA (HARTMANN et al. 2003). Trata-se de um ensaio simples que, in vitro, envolve a lise de células com detergentes e sais após estas serem imbuídas em gel de agarose, seguido por eletroforese. Desta forma, membranas, citoplasma e nucleoplasma são separados do nucleossoma, restando apenas uma matriz nuclear composta por RNA, proteínas e o próprio DNA, chamada de nucleóide (ÖSTLING e JOHANSON, 1984). Utilizando o brometo de etídio, que intercala o DNA, a
conformação de dupla hélice é relaxada e parte do material genético extravasa para fora do nucleóide, formando um “halo”, que representa a cauda do cometa, enquanto o material não extravasado representa a cabeça do cometa (COLLINS, 2004). Por fim, adicionando corante fluorescente à lâmina será possível enxergar os cometas e quantificar os danos causados às células pela intensidade com a qual o corante se liga à cauda, sendo que, a cauda corada intensamente representa maior material genético extravasado e consequentemente indicando maior quantidade de danos ao DNA, a cauda e a cabeça são inversamente proporcionais, de forma que se o material genético estiver integro, este continuará dentro da matriz. (COLLINS et al. 1997).
Em função disso, utilizaremos dessa técnica (ensaio cometa) para verificarmos a ação da piperina na formação de danos ao material genético, que comumente consiste na quebra das ligações entre os ácidos nucleicos, em células escamosas de câncer de laringe e língua, na perspectiva de entender melhor o processo tumorigenico do câncer de cabeça e pescoço.
2 OBJETIVOS
Em função da importância da atividade antitumoral da piperina, foi proposto o presente trabalho que teve como objetivo geral avaliar o seu potencial efeito na genotoxicidade, mediante a técnica do ensaio cometa, observando como esse fitoterápico age e como essas alterações podem participar do processo tumoral.
3 MATERIAIS
3.1 Linhagens celulares
Para o presente estudo foram utilizadas duas linhagens tumorigênicas de cabeça e pescoço: (HEp-2, células escamosas laringe) e (SCC-25, células escamosas de língua), ambas de origem epidermoides.
3.2 Piperina
A piperina utilizada foi adquirida da empresa Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Nos grupos de tratamento foi utilizada em doses de 150 μM, diluídas em DMSO
em concentrações inferiores a 0,5%, concentração previamente definida nos ensaios de viabilidade, trabalhados pelo grupo deste mesmo laboratório como não tóxica.
4 MÉTODOS
4.1. Cultivo celular
As linhagens celulares de câncer escamoso de laringe (HEp-2) foram semeadas em meio completo MEM-Earle medium (Cultilab) e para a linhagem de câncer de língua (SCC-25) foi utilizado o meio DMEM-HAM-F12 (Cultilab). Ambas foram suplementadas da mesma maneira com 10% de soro fetal bovino (Cultilab), 1%
antibiótico/antimicótico (Invitrogen), 1% L-glutamina (200 µM) (Sigma Aldrich), 1% de aminoácidos não essenciais 10mM (Sigma Aldrich) e 1% de piruvato de sódio 100 mM (Sigma Aldrich).
As células foram mantidas a 37ºC e atmosfera de 5% de CO2 por 24 hora para a fixação das mesmas ao substrato. Após o período de fixação, as células foram para a etapa de sincronização celular, trocando o meio com soro fetal bovino para um meio sem soro; após 24 horas no meio sem soro as células voltaram a receber meio com soro fetal bovino, com isso todas as células estarão na mesma etapa do ciclo celular.
Após a sincronização o meio foi trocado a cada dois ou três dias, ou até que o meio apresentasse confluência. Diariamente as células foram avaliadas em microscópio invertido, quando a densidade se mostrou alta, o material passou por tripsinização para divisão em réplicas.
4.2 Ensaio Cometa Alcalino
Para o ensaio cometa as células foram cultivadas em placas de cultura de 6 poços em concentrações de 10 x 104 divididas em grupo controle e grupo experimental e foram para a etapa de sincronização celular.
Após 24h da sincronização celular, as células receberam o tratamento de 150 μM de piperina diluídas em DMSO, enquanto o grupo controle recebeu apenas DMSO, sendo essa condição experimental realizada no tempo de 24 horas.
Após o tratamento as células foram tripisinizadas e colocadas em tubos falcon de 15ml para serem centrifugadas, sendo separadas do meio, que foi desprezado, sobrando apenas o “pellet” de células.
No “pellet” de células formado, foi misturada agarose de baixo ponto de fusão/Low Melting Temperature agarose (LMP). Utilizando uma pipeta esse pellet foi adicionado sobre lâminas de extremidade fosca previamente preparadas, tendo sido mergulhadas em mistura de PBS (Phosphate Buffer Solution) e agarose de fusão normal/Normal Melting agarose (NMP), formando uma fina película do composto sobre a lâmina. O experimento foi realizado em triplicata.
Sequencialmente as lâminas passaram para a etapa de lise, etapa essa aplicada para que as membranas celulares sofressem rompimento, separando assim o material nuclear. A substância de lise utilizada foi feita a partir de uma solução estoque, composta por NaCL (2,5M), EDTA (100mM), Tris (10mM), Lauril e NaOH.
Misturada com 1ml de Triton X-100 e 10 ml de DMSO para formar a solução de lise.
Despois da etapa de lise, as lâminas puderam então ser submetidas a eletroforese, sendo essas lâminas mantidas refrigeradas a 4ºC por 20 minutos a 100V e 300Kva, em tampão de eletroforese alcalino, composto por 2,5ml de EDTA 200Mm, 15ml de NaOH 10N e 500ml de água destilada. Em seguida, ocorreu a etapa de neutralização das lâminas em tampão composto por 21,25 gramas de Tris 0,4 M e 500ml de água destilada. Após isso, as lâminas foram fixadas em álcool etílico 100%
em cubas por cerca de dez minutos. Por fim, as lâminas foram deixadas em temperatura ambiente para ocorrer a secagem das mesmas, e depois foram acondicionadas na geladeira para posterior análise.
Todas as amostras (lâminas) foram mantidas em ausência de luz e calor, evitando possíveis danos ao DNA que poderia ser causado pelo procedimento experimental.
4.3 Análise microscópica
Após a etapa experimental, as lâminas foram coradas com solução de Gel Red 10000x, NaCl 1M e água destilada, para então serem analisadas em microscópio de fluorescência em aumento de 100x. Cada grupo experimental foi composto por 100 células. Os núcleos celulares foram classificados em 4 classes de danos, sendo esses danos determinados de acordo com intensidade e tamanho da cauda do cometa (KOBAYASHI, 1995), como mostrado na figura 2.
Classe 0 - sem danos aparentes;
Classe 1 - cauda curta, menor que o diâmetro do núcleo;
Classe 2 - comprimento da cauda correspondendo 1 ou 2 vezes o diâmetro do núcleo;
Classe 3 - comprimento da cauda maior que o dobro do diâmetro do núcleo.
4.4 Análise estatística
O índice total de danos (ID) foi calculado pela fórmula: ID total = 0. (n Classe 0) + 1. (n Classe 1) + 2. (n Classe 2) + 3. (n Classe 3). Onde n significa o número total de células de cada classe. Os dados estatísticos foram trabalhados utilizando a análise de variância não paramétrica, seguida do teste t, onde os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados para indicar resultados estatisticamente significativos. O experimento foi analisado utilizando o software Prisma GraphPad.
versão 5.00.
5 RESULTADOS
O índice de danos do ensaio cometa permitiu a avaliação dos efeitos genotóxicos da piperina nas linhagens celulares HEp-2 e SCC-25 (figura 2) durante o período de 24 horas. Apontando a ação da piperina nas células cancerígenas nos grupos tratados quando comparado aos grupos controles (DMSO).
Nas duas linhagens, HEp-2 (Figura 3) e SCC-25 (Figura 4) foi constatado maiores índices de danos ocasionados no material genético dessas células, ou seja, um aumento considerável na quantidade de DNA fragmentado, nas células tratadas com o composto piperina, sendo estes fragmentos indicadores de possíveis lesões no núcleo. Mesmo que a fragmentação do DNA tenha sido em geral maior na linhagem SCC-25 do que na HEp-2, estes dados corroboram para a hipótese de que há uma susceptibilidade destes tipos celulares à genotoxicidade causada pela ação da piperina.
Figura 2: Fotomicrografias de fluorescência de núcleos das células HEp-2 e SCC-25 com diferentes tipos de danos avaliados pelo ensaio cometa após o tratamento com piperina, em que 0 (sem danos aparentes), 1 (pouco dano), 2 (dano médio) e 3 (dano grande). Aumento de 100 X, escala de 10μm.
Fonte: Gusson-Zanetoni, J. P.
5.1 Danos ao material genético na linhagem HEp-2
Na linhagem de carcinoma de laringe (HEp-2) o índice total de danos mais do que dobrou no grupo tratado com piperina em comparação ao grupo DMSO (Figura 2), com a significância estatística rejeitando a hipótese nula (de que não há interações entre as variáveis, índice de danos e a utilização da piperina). Demonstrando que as
células expostas a piperina por 24 horas apresentam efetivas formações de danos ao material genético quando comparado ao grupo DMSO.
Figura 3: Índice de danos à linhagem celular HEp-2 tratadas com 150 uM de piperina no tempo de 24 horas. ** diferença estatística significante do tratamento em relação aos controles, com p≤ 0,05.
Fonte: Gusson-Zanetoni, Juliana Prado
5.2 Danos ao Material genético na linhagem SCC-25
Na linhagem de carcinoma de laringe (SCC-25) o índice total de danos foi maior do que o observado na linhagem HEp-2 para os dois grupos (Figura 3), com significância estatística similar ao da linhagem celular anterior. Ao compararmos com o grupo DMSO, podemos afirmar que o tratamento com piperina por 24 horas foi capaz de apresentar os efeitos genotóxicos da molécula nas células.
Figura 4: Índice de danos à linhagem celular SCC-25 tratadas com 150 uM de piperina no tempo de 24 horas. ** diferença estatística significante do tratamento em relação aos controles, com p≤ 0,05.
Fonte: Gusson-Zanetoni, Juliana Prado
6 DISCUSSÃO
O presente trabalho evidencia o potencial genotóxico da piperina em células de câncer epidermóide de cabeça e pescoço, nas linhagens HEP-2 e SCC-25, após 24 horas de aplicação, com elevado aumento de danos ao material genético. Apesar do acúmulo de danos ao DNA se relacionar intimamente com a instabilidade genômica, que é uma característica de células cancerígenas, este é também o princípio pelo qual outras terapias de tratamento como a radioterapia e quimioterapia se baseiam (O’CONNOR, 2015.).
Estudos apontam que o mecanismo por trás das propriedades genotóxicas da piperina fundamenta-se em sua atividade pró-oxidante, uma vez que nos experimentos de Fofaria e colaboradores (2014) e Yaffe e colaboradores (2013) quando a piperina foi aplicada em células que haviam recebido pré-tratamento com agentes antioxidantes seu efeito genotóxico foi suprimido (FOFARIA et al. 2014;
YAFFE et al. 2013).
As ROS são capazes de causar danos ao material genético, pois as células cancerígenas quando comparado com células normais, possuem níveis basais moderadamente mais elevado de ROS, concomitante com um sistema de defesa antioxidante desenvolvido, permitindo que evoluam suas características malignas ao mesmo tempo em que mantenham a homeostase, mas em contrapartida, deixando-
as mais sensíveis à citotoxicidade quando expostas aos agentes que estimulam ainda mais o estresse oxidativo (GUNASEKARAN et al., 2017).
No mesmo estudo citado acima, de Fofaria e colaboradores (2014), os pesquisadores conseguiram relacionar a parada do ciclo celular na fase G1 em células de melanoma com o dano ao DNA causado pela ação oxidante da piperina, que ocorreu devido a ativação das vias das quinases Chk1 e Chk2, em resposta aos danos. Estas duas vias são ativadas como forma de reparar o dano ao genoma durante o ciclo celular, podendo pará-lo ou levar à apoptose (BARTEK, 2004).
Enquanto em células de carcinoma oral a parada do ciclo pode ocorrer na fase G2/M, devido ao aumento na expressão da proteína p21, responsável por inibir as ciclinas dependentes de quinase A e B, necessárias para a progressão entre S e G2/M. Outra proteína com expressão aumentada em células tratadas com piperina é a p27, capaz de bloquear a ativação das CDK4 e CDK6, parando o ciclo em fase G1 ou podendo levar à apoptose. (SIDDIQUI et al. 2017).
Há outras vias apoptóticas conhecidamente ativadas pela piperina, mas não intimamente relacionadas com os danos causados ao material genético. Como demonstrado no estudo realizado por Yaffe e colaboradores (2015) onde foi observado que a piperina induziu o estresse oxidativo no reticulo endoplasmático, levando as células à apoptose por meio da ativação de caspases. Além disso. o estresse do reticulo e o estresse oxidativo na célula formam um mecanismo capaz de promover a morte celular imunogênica, que envolve a ativação do sistema imune adaptativo para promover a imunidade anticâncer. (GALLUZZI et al. 2020).
A piperina também é capaz de ativar vias apoptóticas que não estão necessariamente relacionadas com a formação de ROS e suas consequências (dano ao material genômico ou estresse oxidativo). Sua influência nas vias intrínsecas é relatada pela ativação de caspases e liberação do citocromo C em câncer de mama (DO et al.2013), próstata (SAMYKUTTY et al. 2013), cólon (YAFFE et al. 2015), melanoma (FOFARIA et al. 2014) e ovário (SI et al. 2018). Ou pela regulação de proteínas da família Bax e Bcl-2 em melanoma, hepatocarcinoma, leucemias e tumores de mama, pulmão, próstata e ovário (KHAMIS et al. 2018; ZENG et al. 2018;
LIN et al. 2014; YOO et al. 2019; GUNASEKARAN et al. 2017; QIU et al. 2019; LI et al 2020). Portanto, sabe-se que a piperina é capaz de atuar em diversas vias que levam à parada do ciclo celular ou apoptose, a depender das concentrações e em
quais tipos celulares será aplicada, no entanto ainda não se tem conhecimento exato de quais interações proteicas resultam nestes efeitos.
7 CONCLUSÕES
Conclui-se que a piperina, nas células HEp-2 e SCC-25, mostrou um efeito genotóxico. Esse efeito pode estar relacionado com a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), que são capazes de aumentar o pH citosólico, recrutando proteínas que impedem a continuidade do ciclo celular e são capazes de induzir à apoptose. No entanto, pouco se conhece sobre quais interações moleculares estão envolvidas nesse efeito, sendo necessário novos estudos para entender a natureza da ação genotóxica da piperina.
REFERÊNCIAS
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