UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA TECNOLÓGICA E AMBIENTAL
OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS EMPREGANDO DLLME, SPE, HPLC-DAD E
LC-ESI-MS/MS PARA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM ÁGUA SUBTERRÂNEA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Sergiane Souza Caldas
Rio Grande - RS, Brasil
2009
OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS EMPREGANDO DLLME, SPE, HPLC-DAD E LC-ESI-MS/MS PARA
DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM ÁGUA SUBTERRÂNEA
por
Sergiane Souza Caldas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental, Linha de Pesquisa Desenvolvimento e Validação de Metodologia Analítica, da Universidade Federal do Rio Grande (FURG, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de
MESTRE EM QUÍMICA
Orientador: Prof. Dr. Ednei Gilberto Primel
Rio Grande, RS, Brasil
2009
Universidade Federal do Rio Grande – FURG Escola de Química e Alimentos
Programa de Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental
A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação de Mestrado
OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS EMPREGANDO DLLME, SPE, HPLC-DAD E LC-ESI-MS/MS PARA DETERMINAÇÃO DE
AGROTÓXICOS EM ÁGUA SUBTERRÂNEA elaborada por
Sergiane Souza Caldas
como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Química
Comissão Examinadora
Prof. Dr. Ednei Gilberto Primel (Orientador - Presidente)
Prof. Dr. Renato Zanella (UFSM)
Prof. Dr. Márcio Raimundo Milani (FURG)
Prof. Dr. Fábio Ferreira Gonçalves (FURG)
Rio Grande, 06 de fevereiro de 2009.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Ednei Gilberto Primel pela oportunidade, pela orientação, pelo seu apoio, incentivo e compreensão em todos os momentos, e pela amizade cultivada no decorrer desses dois anos. Obrigada!
Ao Prof. Dr. Renato Zanella pela participação na defesa da dissertação, e pelas suas valiosas sugestões para o final deste estudo.
Ao Prof. Dr. Márcio Raimundo Milani pela participação e sugestões no exame de qualificação e na defesa da dissertação, e pelos ensinamentos enquanto professor.
A Drª. Márcia Helena Scherer Kurz pelas valiosas contribuições no exame de qualificação e por todo saber compartilhado desde que chegou ao LACOM.
Aos Prof. Dr. Fábio Ferreira Gonçalves pela disposição em participar e pela contribuição na qualificação e no exame de defesa da dissertação, suas sugestões contribuíram muito para o final deste estudo.
Aos meus pais, Sérgio e Vânia, fontes de minha inspiração, exemplos de vida, pelo amor, pelo apoio, pela minha educação, por acreditarem em mim. Pai e mãe, obrigada por tudo. Amo vocês!
Aos meus amores, Aiessa e Fred, meus amados irmãos, que sempre torcem por mim, agradeço pelo amor e apoio incondicional.
Ao meu noivo, Márcio, por seu companheirismo de todas as horas, pelas palavras que me deram força para vencer cada etapa. Pela compreensão de todos os dias não tão bem humorados (pré-prova, pré-trabalho...) e horas de estudo ausentes. Pelo teu apoio, mais uma das nossas etapas chegou ao fim. Gordo, te amo.
A todos os meus amigos, que sempre me proporcionam momentos de descontração e torcem por mim. Em especial a minha grande amiga, Sheron, minha irmã de todas as horas, e de todos os momentos. Obriga pela forma alegre e agradável que compartilhamos cada uma das nossas vitórias.
À minha amiga Adri, pelos ótimos e já inesquecíveis momentos compartilhados na frente de cromatógrafos, pelo companheirismo e todo apoio
durante esta jornada. Por todas as longas horas de trabalho e de descontração.
Obrigada!
À minha amiga Lizi, pelos seus muitos préstimos e sua boa vontade. Pelo sua calorosa receptividade de quando cheguei no LACOM. Sentirei saudades das muitas horas de convívio, descontração e bons papos durante estes dois anos.
À Fabi, minha grande companheira de coletas e de extrações em fase sólida.
Pelos bons momentos compartilhados, pela amizade, carinho e apoio.
Aos meus colegas do LACOM com os quais convivi, e que contribuíram de diversas formas, tenho um carinho muito grande por todos. Ana Laura, Lizi, Adri Demoliner, Adri Dias, Luis, Sherol, Vivi, Fabi, Ana Raisa, Flávio, Maristela, Ednei, Márcia e Fábio. Agradeço principalmente às laconetes Sherol e Adri Dias pela amizade e disposição em ajudar de sempre.
As colegas da primeira turma do Programa de Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental, pelos momentos vividos durante o decorrer desses dois anos.
À FURG pela oportunidade, principalmente pelo ensino gratuito e de qualidade.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental, os quais auxiliaram na minha formação acadêmica, proporcionando-me esta realização e formação com qualidade.
Aos moradores da Quitéria, que sempre me receberam de forma tão agradável, contribuindo para o bom andamento do trabalho;
Agradeço à Deus, pela proteção e por me conceder mais esta vitória.
RESUMO
Dissertação de MestradoPrograma de Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental Universidade Federal do Rio Grande - FURG
OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS EMPREGANDO DLLME, SPE, HPLC-DAD E LC-ESI-MS/MS PARA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM
ÁGUA SUBTERRÂNEA
AUTORA: SERGIANE SOUZA CALDAS
ORIENTADOR: PROF. Dr. EDNEI GILBERTO PRIMEL Rio Grande, 06 de fevereiro de 2009
A preocupação com a poluição das águas por agrotóxicos tem aumentado, visto que aumentou o número de detecções de agrotóxicos em águas. A falta de avaliação da qualidade da água consumida pela população de áreas rurais onde não existe o abastecimento público de água potável, deve ser considerada, pois essas águas se encontram próximo a áreas de cultivo, onde há intensa aplicação de agrotóxicos. Nessas regiões, o abastecimento de água para as residências e para a irrigação é feito geralmente através das águas de poços. Neste trabalho, um método para determinação dos agrotóxicos carbofurano, clomazona, 2,4-D e tebuconazol em água subterrânea foi desenvolvido e validado. O método utilizou a Extração em Fase Sólida (SPE) e determinação por Cromatografia Líquida de Alta eficiência com Detecção por Arranjo de Diodos (HPLC-DAD) e confirmação por Cromatografia Líquida tandem Espectrometria de Massas (LC-MS/MS).
Para a SPE utilizou-se cartuchos C18 de 200 mg, e eluição com 1 mL de metanol. Após a otimização dos parâmetros de extração e separação dos compostos, o método foi validado avaliando-se curva analítica, linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão (recuperação). Todas as curvas analíticas apresentaram valores de r maiores que 0,99. Os LOQs para o método, considerando a etapa de pré-concentração de 250 vezes, foram de 0,2 µg L-1 para todos os agrotóxicos por HPLC-DAD e, por LC-MS/MS, 4,0 ng L-1 para clomazona, carbofurano e tebuconazol e de 40,0 ng L-1 para 2,4-D. As recuperações foram entre 60,3 e 107,7% para a repetitividade e entre 67,5 e 115,3% para a precisão intermediária, com RSD de 0,8 a 20,7%
para todos os compostos por HPLC-DAD. Para o LC-MS/MS a precisão em termos de repetitividade, variou entre 0,97 e 20,7%, e as recuperações entre 67,0 e 108,9%. O método foi aplicado na determinação de agrotóxicos em amostras de águas subterrâneas durante um ano. Nas amostras foram detectados agrotóxicos em níveis de µg L-1. Dentro do contexto atual da Química Analítica, de desenvolver métodos mais rápidos, que utilizem menor quantidade de solvente, de amostra e com altos fatores de enriquecimento, foi otimizado um método de extração para os agrotóxicos carbofurano, clomazona e tebuconazol utilizando a Microextração Líquido-Líquido Dispersiva (DLLME) e determinação por LC-MS/MS. Foram otimizados alguns parâmetros que influenciam no processo de extração, como: tipo e volume dos solventes dispersores e extratores, tempo de extração, força iônica e velocidade de centrifugação. Nas condições otimizadas, as recuperações para os níveis de concentração entre 0,02 e 2,0 g L-1 variaram entre 62,7 e 120,0%, com valores de RSD entre 1,9 e 9,1%. O LOQ do método foi de 0,02 µg L-1 para todos os compostos. Quando comparado com a SPE se demonstrou rápido, simples, de baixo custo, além de necessitar de menores volumes de amostra para determinação de agrotóxicos em águas. O método mostrou-se adequado à análise dos agrotóxicos em água subterrânea e todos os parâmetros de validação obtidos estão dentro dos limites sugeridos para validação de métodos cromatográficos
Palavras-chave: agrotóxicos; água subterrânea; SPE; DLLME; HPLC-DAD; LC-MS/MS
ABSTRACT
Master’s Thesis
Programa de Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental Universidade Federal do Rio Grande
OPTIMIZATION AND VALIDATION OF METHODS USING DLLME, SPE, HPLC-DAD AND LC-ESI-MS/MS FOR THE DETERMINATION OF PESTICIDE IN
GROUNDWATER
AUTHOR: SERGIANE SOUZA CALDAS
ADVISOR: EDNEI GILBERTO PRIMEL, M. S., Ph. D.
February 06th, 2009, Rio Grande, RS, Brazil
The concern about water polluted by pesticides has increased due to the fact that large amounts of pesticides have been detected in these waters. The lack of evaluation of the quality of the water consumed by the population in rural areas, where there is no public supply of drinking water, should be considered, because these waters are close to agricultural areas, where the use of pesticides is intense. In these regions, the water for homes and irrigation is usually supplied by wells. In this research, a method for the determination of the pesticides carbofuran, clomazone, 2,4-D and tebuconazole in groundwaters was developed and validated. The method involves Solid Phase Extraction (SPE) and determination by High Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detector (HPLC-DAD), besides confirmation by Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS). A SPE with 200-mg C18 cartridges was used and the analytes were eluted with 1 mL methanol. After the optimization of the extraction and separation parameters, the method was validated by evaluating the analytical curve, linearity, limits of detection and quantification, precision (repeatability and intermediate precision), and accuracy (recovery). All the analytical curves presented r values above 0.99. The LOQs for the method, considering the 250-fold pre-concentration step, were 0.2 µg L-1 for all pesticides by HPLC-DAD and 4.0 ng L-1 for clomazone, carbofuran and tebuconazole and 40.0 ng L-1 for 2,4-D by LC-MS/MS. By HPLC-DAD, the recoveries ranged between 60.3 and 107.7%
for repeatability and between 67.5 and 115.3% for intermediate precision, with RSD from 0.8 to 20.7% for all compounds. The precision in terms of repeatability for the LC-MS/MS ranged between 0.97 and 20.7%, and recoveries, between 67.0 and 108.9%. The method was applied to the determination of pesticides in groundwater samples during one year.
Pesticides were detected in levels of µg L-1. In the current context of Analytical Chemistry, in order to develop fast methods that use smaller amount of solvent and sample, and have high enrichment factors, a method was optimized for the extraction of the pesticides carbofuran, clomazone and tebuconazole using the Dispersive Liquid-Liquid Micro Extraction (DLLME) and determination by LC-MS/MS. Some parameters that influence the extraction process, such as the type and volume of extraction and disperser solvents, the time of extraction, ionic strength and speed of centrifugation, were optimized. Under the optimized conditions, the recoveries ranged between 62.7 and 120.0% with RSD values between 1.9 and 9.1% (n = 3) for the concentration levels between 0.02 and 2.0 µg L-1. The LOQ of the method was 0.02 µg L-1 for all compounds. In comparison with SPE, DLLME has shown rapidity, simplicity, lower cost and has required lower volumes of samples for the determination of pesticides in waters. The method proved to be adequate for the analysis of pesticides in groundwaters and all the validation parameters were within the limits suggested for the validation of chromatographic methods
Key words: Pesticides; groundwater; SPE; DLLME; HPLC-DAD; LC-MS/MS
Lista de Figuras
Figura 1 - Percentual de municípios que informaram a ocorrência de problema ambiental impactante, segundo o tipo de problema - Brasil - 2008 (Fonte: IBGE,
2008a) ... 6
Figura 2 – Consumo nacional de agrotóxicos e afins no ano de 2005 (Fonte: IBGE 2008b) ... 9
Figura 3 – Diagrama esquemático do movimento dos agrotóxicos (Fonte: BEYRUTH; TOMITA, 2003). ... 13
Figura 4 - Etapas envolvidas na SPE: condicionamento do sorvente, adição da amostra, remoção dos interferentes e eluição do analito. ... 26
Figura 5 – Etapas envolvidas no procedimento da DLLME ... 29
Figura 6 - Diagrama de um detector de Arranjo de Diodos ... 37
Figura 7 – Componentes básicos de um espectrômetro de massas ... 44
Figura 8 – Diagrama da ESI, da formação dos íons na solução antes de serem introduzidos no MS ... 46
Figura 9 – Sistema SPE utilizado para pré-concentração dos agrotóxicos ... 60
Figura 10 – Procedimento DLLME utilizado para extração e pré-concentração dos agrotóxicos ... 62
Figura 11 - Diagrama demonstrando a forma de estabelecimento dos valores de LOD e LOQ ... 69
Figura 12 – Foto dos dois diferentes tipos de poços encontrados na região de estudo: cacimba (esquerda) e tubular (direita) ... 72
Figura 13 - Zona de amostragem e pontos de coleta ... 73
Figura 14 – Efeito dos diferentes solventes extratores na recuperação de agrotóxicos. Condições de extração: volume de amostra, 5 mL; volume do solvente extrator, 40 µL; volume do solvente dispersor, 1,5 mL de acetonitrila... 78
Figura 15 - Efeito do solvente dispersor na recuperação dos agrotóxicos. Condição de extração: volume de amostra, 5 mL; volume de solvente dispersor, 1,5 mL; solvente extrator, 40 µL CCl4 ... 79
Figura 16 - Efeito do volume de solvente extrator (CCl4) na recuperação. Condições de extração: volume de amostra, 5,0 mL; volume de solvente dispersor (acetonitrila), 2,0 mL ... 79
Figura 17 - Efeito do volume de CCl4 no volume de fase sedimentada. Condições de
extração, idem Figura 16 ... 80
Figura 18 - Efeito do volume de solvente dispersor na recuperação dos agrotóxicos. Condições de extração: volume de amostra, 5 mL; solvente dispersor, acetonitrila; volume de solvente extrator, 40 µL de CCl4 ... 81
Figura 19 - Efeito do pH na extração dos compostos expressa em termos de recuperação. Condições de extração: volume de amostra, 5,0 mL; solvente dispersor (acetonitrila) 2,0 mL e solvente extrator (CCl4) 60 µL ... 82
Figura 20 - Efeito da velocidade de centrifugação na recuperação dos agrotóxicos. Condições de extração, idem Figura 15 ... 82
Figura 21 - Espectros de absorção obtidos por HPLC-DAD de uma solução analítica contendo 2,5 mg L-1 de cada agrotóxico: (a) carbofurano, (b) 2,4-D , (c) clomazona e (d) tebuconazol ... 87
Figura 22 - Cromatograma obtido por HPLC-DAD a 220,3 nm, a partir de uma solução analítica 2,5 mg L-1 de carbofurano, 2,4-D , clomazona e tebuconazol ... 88
Figura 23 – Cromatograma total obtido para uma solução analítica contendo a mistura dos agrotóxicos (a) no modo ESI+ (carbofurano, tR = 1,01; clomazona, tR = 1,37 e tebuconazol, tR = 2,01) e (b) no modo ESI- (2,4-D tR = 1,16) ... 90
Figura 24 – Espectro de massas para os compostos obtido no modo full scan, (a) carbofurano, (b) 2,4-D, (c), clomazona e (d) tebuconazol ... 92
Figura 25 - Cromatograma MRM obtido para uma solução analítica contendo 1,0 mg L-1 dos agrotóxicos: carbofurano (tR 1,01 min), 2,4-D (tR 1,16 min), clomazona (tR 1,37 min) e tebuconazol (tR 1,97 min) ... 93
Figura 26 - Cromatogramas de uma amostra de água: (pontilhado) branco da amostra num comprimento de onda de 220,3 nm e (linha) amostra fortificada com 5 µg L-1 de uma mistura dos agrotóxicos, e os espectros de absorção dos compostos estudados ... 100
Figura 27 - Concentração de carbofurano nos poços por mês de coleta ... 101
Figura 28 - Concentrações de clomazona nos poços por mês de coleta ... 101
Figura 29 - Concentrações de tebuconazol nos poços por mês de coleta ... 102
Figura 30 – Gráfico da concentração máxima e mínima encontrada de cada composto versus a profundidade do poço amostrado ... 104
Figura 31 - (a) cromatograma obtido por HPLC-DAD e espectro de absorção do composto correspondente a análise de uma amostra água subterrânea onde foi detectado o agrotóxico clomazona e (b) cromatograma obtido por LC-ESI-MS/MS, no modo MRM da mesma amostra ... 105
Lista de Tabelas
Tabela 1 – Variação na taxa de aplicação de herbicidas ocorrida no século XX ... 11 Tabela 2 - Agrotóxicos com os VMP estabelecidos pela legislação brasileira, européia e americana para água potável ... 16 Tabela 3 – Valores Máximos Permitidos (VMP) e Limite de Quantificação Praticável (LQP), em µg L-1 para os agrotóxicos em estudo, segundo Resolução nº 396 ... 17 Tabela 4 – Revisão dos trabalhos publicados que utilizaram a DLLME para extração de agrotóxicos em amostras de água e os principais parâmetros de extração ... 33 Tabela 5 – Resultado do levantamento de poços na região da Quitéria, Rio Grande, em 2007 ... 71 Tabela 6 – Poços escolhidos para a coleta das amostras ... 72 Tabela 7 - Risco de contaminação da água subterrâneas baseada em critérios estabelecidas pela U.S. EPA ... 73 Tabela 8 - Recuperações obtidas utilizando diferentes cartuchos de fase estacionária (C18 - Strata® C18 e polimérico - Strata®-X) ... 75 Tabela 9 – Densidade e Solubilidade em água dos solventes extratores ... 77 Tabela 10 - Recuperação para os agrotóxicos em diferentes níveis obtidos por DLLME ... 84 Tabela 11 - Comparação entre a DLLME e a SPE para determinação dos agrotóxicos carbofurano, clomazona e tebuconazol ... 85 Tabela 12 – Composições de fase móvel e vazões testadas na otimização da separação dos agrotóxicos para o HPLC-DAD e as influências nos parâmetros cromatográficos k, Rs e α ... 86 Tabela 13 – Condições cromatográficas otimizadas para o HPLC-DAD ... 88 Tabela 14 – Condições cromatográficas otimizadas para o LC-ESI-MS/MS ... 89 Tabela 15 - Resultados da otimização das condições de análises no espectrômetro de massas para determinação dos agrotóxicos (tempo dwell 0,3 ms) ... 91 Tabela 16 – Parâmetros cromatográficos obtidos para a separação dos agrotóxicos em uma solução de concentração de 2,5 mg L-1 nas condições cromatográficas otimizadas para o HPLC-DAD ... 94
Tabela 17 - Resultados obtidos para calibração dos agrotóxicos no sistema HPLC- DAD ... 95 Tabela 18 - Resultados obtidos para calibração dos agrotóxicos no sistema LC-ESI- MS/MS ... 95 Tabela 19 - Resultados de LOD e LOQ, do instrumento e do método, para os agrotóxicos estudados ... 96 Tabela 20 - Precisão instrumental (RSD%) – repetitividade e precisão intermediária para o HPLC-DAD e repetitividade para o LC-ESI-MS/MS ... 97 Tabela 21 – Recuperação (R%), RSDr e RSDpi do método SPE e HPLC-DAD para os agrotóxicos em amostras de água fortificadas em diferentes níveis, e recuperação e RSDr do método por SPE e LC-ESI-MS/MS ... 99
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
λ – comprimento de onda α - fator de separação
2,4,5-T - ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético 2,4-D - ácido 2,4-diclorofenoxiacético ACN - acetonitrila
ANA - Agência Nacional das Águas
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APCI – Ionização Química a Pressão Atmosférica, do inglês Atmospheric Pressure Chemical Ionization
API – Ionização a Pressão Atmosférica, do inglês Atmospheric Pressure Ionization C12 - sílica modificada com hidrocarboneto linear C12
C18 – sílica modificada com hidrocarboneto linear C18, octadecilsilano C18-E – sílica modificada com hidrocarboneto linear C18, E, end capped C8 – sílica modificada com hidrocarboneto linear C8, octilsilano
CAS – Chemical Abstracts Service
CID - célula de colisão induzida, do inglês Colision Induced Cell CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente
d.i. – diâmetro interno
DAD – Detecção por Arranjo de Diodos, do inglês Diode Array Detection DDT –2,2 bis(p-clorofenil)-1,1,1-tricloroetano
DLLME - Microextração Líquido-Líquido Dispersiva, do inglês Disersive Liquid-Liquid Microextraction
DVB - divinilbenzeno
ECD – Detecção por Captura de Elétrons, do inglês Electron-Capture Detection EEC – Comunidade Econômica Européia, do inglês European Economic Community EPA – Agência de Proteção Ambiental, do inglês Environmental Protection Agency ESI – Ionização por Electrospray, do inglês Electrospray Ionization
ESI- – Ionização por Eletrospray no modo negativo, do inglês Electrospray Ionization Negative Mode
ESI+ – Ionização por Eletrospray no modo positivo, do inglês Electrospray Ionization Positive Mode
eV – elétron-Volt FE – fase estacionária
FLD – detecção por fluorescência, do inglês fluorescence detection FM – fase móvel
FPD – Detecção Fotométrico de Chama, do inglês Flame Photometric Detection FURG – Universidade Federal do Rio Grande
GC – Cromatografia Gasosa, do inglês Gas Chromatography GUS – Groundwater Ubiquity Score
ha – hectare
HF-LPME - Microextração em Fase Líquida com Fibras Ocas, do ingês Hollow Fiber Liquid-Phase Microextraction
HPAs – hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, do inglês High Performance Liquid Chromatography
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística ICH – International Conference on Harmonisation INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia ISO – International Standard Organisation
IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry k - fator de retenção
kH = Constante de Henry
Koc – Coeficiente de adsorção à matéria orgânica do solo Kow – Coeficiente de partição octanol-água
LACOM – Laboratório de Análise de Compostos Orgânicos e Metais LC – Cromatografia Líquida, do inglês Liquid Chromatography
LC-ESI-MS/MS - Cromatografia Líquida acoplada a Fonte de Ionização por Electrospray acoplada à Espectrometria de Massas tandem Espectrometria de Massas, do inglês Liquid Chromatography with Electrospray Ionization with Mass Spectrometry tandem Mass Spectrometry
LLE – Extração Líquido-Líquido, do inglês Liquid-Liquid Extraction LOD – Limite de Detecção, do inglês Limit of Detection
LOQ – Limite de Quantificação, do inglês Limit of Quantification
LPME – Microextração em Fase Líquida, do ingês Liquid-Phase Microextraction
LQP – Limite de Quantificação Praticável M – molar (mol L-1)
m/z – razão massa-por-carga
MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MEOH – metanol
MRM – Monitoramento de múltiplas reações, do inglês Multiple Reaction Monitoring MS – Espectrometria de Massas, do inglês Mass Spectrometry
MWCNTs – nanotubos de carbono de parede múltiplas, do inglês multi-walled carbon nanotubes
n – Número de medidas
NPD – Detecção por Nitrogênio-Fósforo, do inglês Nitrogen-Phosphorus Detection OMS – Organização Mundial da Saúde
p.a. – grau pró-análise
Pa – Pascal (unidade de pressão) PC – provável contaminante PDMS – polidimetilsiloxano
PMTDS – poli(metiltetradecilsiloxano) pH – potencial hidrogeniônico
pKa – potencial de dissociação ácida PMOS - polimetiloctilsiloxano
PS-DVB – copolímero de estireno divinilbenzeno PTFE – politetrafluoretileno
QqQ – triplo quadrupolo r - Coeficiente de correlação R – Recuperação
RE – Resolução (legislação) rpm – rotação por minuto Rs – resolução cromatográfica
RSD – Desvio Padrão Relativo, do inglês Relative Standard Deviation RSDpi – Desvio Padrão Relativo para Precisão Intermediária
RSDr – Desvio Padrão Relativo para Repetitividade s – estimativa do desvio padrão absoluto
SBSE - Extração em Barra Magnética, do inglês stir bar sorptive extraction
SDME - Microextração em Gota Suspensa, do inglês Single Drop Microextraction SIM – Monitoramento do Íon Selecionado, do inglês Selected Ion Monitoring
SPE – Extração em Fase Sólida, do inglês Solid Phase Extraction
SPME – Microextração em Fase Sólida, do inglês Solid Phase Micro Extraction t’R – tempo de retenção ajustado
t1/2 – tempo de meia-vida THF – tetrahidrofurano
TIC – Cromatograma Total, do inglês total íon chromatogram tM – tempo de retenção do analito não retido
ton – tonelada
tR – tempo de retenção
US – Estados Unidos, do inglês United States UV – ultravioleta
v/v – volume por volume
VMP – Valor Máximo Permitido Wb – largura do pico na base wh – largura do pico a meia altura xm – média de medidas em réplicas
LISTA DE APÊNDICES
Apêndice A – Dados referentes às entrevistas realizadas com os moradores da localidade rural da Quitéria, localizada na cidade de Rio Grande, RS ... 121 Apêndice B – Resultados mensais referente às coletas realizadas de setembro de 2007 a agosto de 2008 ... 123
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 1
2 OBJETIVOS ... 4
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 5
3.1 Qualidade das águas ... 5
3.1.1 Águas subterrâneas ... 6
3.2 Agrotóxicos ... 7
3.2.1 Produção e uso de agrotóxicos ... 8
3.2.2 O impacto no meio ambiente ... 10
3.2.3 Avaliação do potencial de risco da poluição ambiental por agrotóxicos ... 14
3.2.4 A legislação para agrotóxicos ... 15
3.2.5 Agrotóxicos selecionados neste estudo ... 17
3.2.5.1 Carbofurano ... 17
3.2.5.2 Clomazona ... 19
3.2.5.3 Tebuconazol ... 20
3.2.5.4 2,4-D ... 21
3.3 Técnicas de extração e pré-concentração de agrotóxicos em águas ... 22
3.3.1 Extração em Fase Sólida ... 24
3.3.2 Microextração Líquido-Líquido Dispersiva ... 29
3.4 Métodos para determinação de resíduos de agrotóxicos em águas ... 34
3.4.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção por Arranjo de Diodos... 36
3.4.2 Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas ... 42
3.5 Parâmetros cromatográficos ... 47
3.5.1 Fator de retenção (k) ... 48
3.5.2 Resolução (Rs) ... 49
3.5.3 Fator de separação (α) ... 49
3.6 Validação de métodos cromatográficos ... 50
3.6.1 Curva analítica e linearidade ... 51
3.6.2 Sensibilidade ... 52
3.6.3 Limite de Detecção e Limite de Quantificação ... 53
3.6.4 Precisão (repetitividade e precisão intermediária) ... 53
3.6.5 Exatidão (recuperação)... 54
3.6.6 Seletividade e Confirmação dos Resultados ... 55
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 57
4.1 Instrumentação ... 57
4.2 Reagentes, solventes e materiais ... 58
4.3 Preparo das soluções analíticas ... 59
4.4 Amostras de água ... 59
4.5 Otimização do sistema SPE ... 59
4.5.1 Escolha do sorvente ... 60
4.5.2 Volume de amostra ... 61
4.5.3 Ajuste do pH da amostra ... 61
4.5.4 Escolha do solvente de condicionamento ... 61
4.5.5 Escolha do eluente ... 61
4.6 Otimização do procedimento DLLME ... 61
4.6.1 Escolha do solvente extrator ... 62
4.6.2 Escolha do solvente dispersor ... 63
4.6.3 Escolha do volume do solvente extrator ... 63
4.6.4 Seleção do volume de solvente dispersor ... 63
4.6.5 Efeito do pH ... 63
4.6.6 Efeito da velocidade de centrifugação ... 63
4.6.7 Outros parâmetros avaliados ... 64
4.7 Otimização do sistema cromatográfico HPLC-DAD ... 64
4.7.1 Preparo e escolha da fase móvel ... 65
4.7.2 Escolha da vazão da fase móvel ... 65
4.7.3 Determinação do comprimento de onda de máxima absorção ... 66
4.8 Otimização do sistema cromatográfico LC-ESI-MS/MS ... 66
4.8.1 Preparo e escolha da fase móvel ... 66
4.8.2 Escolha da vazão da fase móvel ... 66
4.8.3 Acidificação da fase móvel ... 67
4.8.4 Condições do sistema de detecção ... 67
4.9 Avaliação da separação cromatográfica por HPLC-DAD ... 67
4.10 Validação dos métodos ... 68
4.10.1 Curva analítica e linearidade ... 68
4.10.2 Limite de detecção e limite de quantificação ... 68
4.10.3 Precisão ... 69
4.10.4 Exatidão ... 70
4.11 Aplicação do método desenvolvido em águas subterrâneas ... 70
4.11.1 Poços amostrados na região de estudo... 70
4.11.2 Escolha dos agrotóxicos em estudo ... 72
4.11.3 Amostragem ... 73
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 75
5.1 Estudo da extração em fase sólida para os agrotóxicos ... 75
5.2 Estudo da microextração líquido-líquido dispersiva para os agrotóxicos... ... 77
5.2.1 Seleção do solvente extrator ... 77
5.2.2 Escolha do solvente dispersor ... 78
5.2.3 Seleção do volume do solvente extrator ... 79
5.2.4 Escolha do volume de solvente dispersor... 80
5.2.5 Efeito do pH ... 81
5.2.6 Efeito da velocidade de centrifugação ... 82
5.2.7 Outros parâmetros ... 83
5.2.8 Procedimento experimental otimizado para a extração dos agrotóxicos por DLLME ...83
5.2.9 Avaliação do desempenho do método ... 84
5.3 Comparação entre as técnicas de extração DLLME e SPE ... 84
5.4 Condições cromatográficas otimizadas para a determinação dos agrotóxicos por HPLC-DAD ... 85
5.4.1 Composição da fase móvel ... 85
5.4.2 Determinação do comprimento de onda de máxima absorção ... 87
5.5 Condições cromatográficas para análise dos agrotóxicos por LC-ESI- MS/MS ... 89
5.5.1 Condições do sistema de injeção e de detecção ... 90
5.6 Avaliação da separação cromatográfica ... 93
5.7 Validação dos métodos analíticos ... 95
5.7.1 Curva analítica e linearidade ... 95
5.7.2 Limite de detecção e limite de quantificação ... 95
5.7.3 Precisão ... 97
5.7.4 Recuperação ... 98
5.8 Aplicação do método ... 100
5.8.1 Análises de amostras reais ... 100
6 CONCLUSÕES ... 106
TRATAMENTO DOS RESÍDUOS GERADOS ... 108
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 109
PRODUÇÃO CIENTÍFICA REFERENTE AO TRABALHO ... 120
1 INTRODUÇÃO
A água é essencial para o planeta, pois a sobrevivência de todas as formas de vida existentes na Terra dependem dela. A água de qualidade é um direito de todos e deve possuir características de pureza, isto é, deve satisfazer a uma série de exigências que constituem as condições de potabilidade, entendendo-se como água potável aquela que não contém germens patogênicos, não possui substâncias químicas tóxicas e é dotada de aspecto físico agradável, sem cor, cheiro ou sabor.
A disponibilidade de recursos hídricos é abundante, mas é necessário levar em consideração que menos de 3% da água no mundo é doce, e subtraindo a parcela de água doce que se encontra em locais de difícil acesso ou aquela já muito poluída, restam para utilização direta, apenas 0,003% do volume total de água do planeta.
O Brasil ostenta uma posição privilegiada perante a maioria dos países, sendo considerado um país rico em disponibilidade de recursos hídricos, com cerca de 10% da água doce disponível no mundo (REBOUÇAS et al., 2002).
A água que se encontra no subsolo é chamada de água subterrânea. A água subterrânea está disponível em todas as regiões da Terra, constituindo importante recurso natural, e tem sido utilizada para irrigação em áreas rurais, para fins industriais e principalmente como fonte alternativa de abastecimento de água para o consumo humano. Em algumas áreas do Brasil, a água subterrânea representa o principal recurso hídrico, desempenhando importante papel no desenvolvimento socioeconômico do país.
Os agrotóxicos além de serrem úteis na produção agrícola, são poluidores potencias tanto das águas superficiais como das subterrâneas, principalmente quando utilizados de forma inadequada. É importante ressaltar que, em alguns casos, menos de 0,1% da quantidade de agrotóxicos aplicados alcançam o alvo, enquanto que o restante (99,9%) tem potencial para se mover para outros compartimentos ambientais, como as águas superficiais e subterrâneas (RIBEIRO et al., 2007).
Em decorrência do crescimento populacional e do aumento da demanda por alimentos, o uso de agrotóxicos vem se intensificando a cada ano. O uso destes compostos na atividade agrícola é considerada uma atividade difícil de ser avaliada,
uma vez que o comportamento dos diversos agrotóxicos é ainda pouco conhecido, e varia muito de região para região.
Quase nenhum conhecimento existe, por exemplo, quanto à concentração de agrotóxicos nas águas que abastecem a população, constituindo uma crescente preocupação. Dessa forma, como muitos poluentes orgânicos são direta ou indiretamente introduzidos no ambiente aquático, à determinação de resíduos de agrotóxicos em água tornou-se de importância fundamental para identificar, quantificar e solucionar problemas ambientais, biológicos e de saúde pública.
Por isso, um esforço conjunto entre governo, academia e sociedade visando estabelecer limites seguros de concentração aceitáveis para as águas foram estabelecidos.
No Brasil, a Portaria nº 518/04 do Ministério da Saúde, e a Resolução nº 357/05 do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) estabelecem limites para águas superficiais; e para as águas subterrâneas, em 2008, foi publicada a Resolução nº 396/08 do CONAMA.
Devido ao padrão de pureza estabelecido pelas agências regulamentadoras, é necessário o desenvolvimento de procedimentos analíticos sensíveis, seletivos, exatos e precisos que permitam determinar quantitativamente os agrotóxicos. Assim como, existe a necessidade de técnicas de preparo de amostra que possibilitem extrair e/ou pré-concentrar os analitos presentes na matriz de forma compatível com o sistema de detecção.
Desta forma, pode-se compreender o papel importante desempenhado pela Química Analítica, ciência que estuda e desenvolve novos métodos capazes de identificar e quantificar constituintes de uma amostra.
Nesse sentido, técnicas de preparo de amostra como a Extração em Fase Sólida (SPE, do inglês Solid Phase Extraction) vêm sendo amplamente utilizadas, e novas técnicas, miniaturizadas, como a Microextração Líquido-Líquido Dispersiva (DLLME, do inglês Dispersive Liquid-Liquid Microextraction) desenvolvidas.
Para determinação destes compostos, técnicas cromatográficas bem estabelecidas, como a Cromatografia Líquida (LC, do inglês Liquid Chromatography) e a Cromatografia Gasosa (GC, do inglês Gas Chromatography) são usadas. Por sua vez, estas técnicas cromatográficas podem ser acopladas a diversos sistemas de detecção, entre eles, a Detecção por Arranjo de Diodos (DAD, do inglês Diode Array Detection) e a Espectrometria de Massas (MS, do inglês Mass Spectrometry).
O desenvolvimento de novos métodos que possam ser utilizados para o monitoramento destes compostos no meio ambiente é de grande importância, pois a qualidade da água influencia também na saúde da população.
A localidade rural da Quitéria, situada na cidade do Rio Grande, no estado do Rio Grande do Sul (RS) desenvolve diversas atividades agrícolas, onde é feita aplicação de agrotóxicos. Não há dados de caracterização das águas dos poços da localidade, as quais são utilizadas para abastecimento doméstico sem nenhum tratamento prévio.
Considerando-se a importância da utilização de águas subterrâneas como fontes de abastecimento, a importância do uso de agrotóxicos para o controle de pragas para atender a demanda mundial crescente de alimentos; e a conseqüente possibilidade destes contaminarem o meio ambiente e o homem, os objetivos deste trabalho foram: (i) desenvolver e validar um método simples, sensível e eficiente para determinar os agrotóxicos carbofurano, 2,4-D (ácido–2,4-diclorofenoxiacético), clomazona e tebuconazol em águas subterrâneas empregando SPE, HPLC-DAD e LC-ESI-MS/MS; (ii) otimizar um método para determinar os agrotóxicos carbofurano, clomazona e tebuconazol em águas subterrâneas por DLLME e determinação por LC-ESI-MS/MS; (iii) aplicação do método desenvolvido por SPE, HPLC-DAD e LC- ESI-MS/MS para monitorar amostras de águas subterrâneas utilizadas para abastecimento doméstico, a fim de avaliar a possível contaminação por resíduos dos agrotóxicos selecionados.
Ressalta-se que este estudo torna-se importante como forma de proteção à saúde da população usuária e imprescindível, diante da inexistência de dados de caracterização destas águas. Além de contribuir para o desenvolvimento de metodologias analíticas validadas empregando técnicas modernas de extração e determinação de agrotóxicos.
2 OBJETIVOS
Os objetivos do trabalho foram:
Geral
Desenvolver e validar uma metodologia analítica empregando pré- concentração e extração por SPE e DLLME e determinação por HPLC-DAD e LC- ESI-MS/MS dos agrotóxicos carbofurano, clomazona, tebuconazol e 2,4-D em águas de poços de uma área rural do município de Rio Grande.
Específicos
Testar diferentes composições de fase móvel e de fases estacionárias a fim de obter a melhor separação dos analitos;
Otimizar os parâmetros para o HPLC-DAD e para o LC-ESI-MS/MS;
Comparar a eficiência de extração entre dois tipos de cartuchos de SPE contendo diferentes sorventes;
Otimizar a metodologia de extração das amostras por SPE e por DLMME;
Fazer um comparativo entre a SPE e a DLLME;
Validar as metodologias, avaliando: curva analítica, linearidade, sensibilidade, limites de quantificação e detecção, precisão e exatidão;
Verificar os poços existentes na localidade rural da Quitéria (sub distrito da Vila da Quinta – Município do Rio Grande - RS) e caracterizá-los quanto a profundidade e localização;
Escolher 10 poços dentre os caracterizados para avaliar a qualidade da água através da qualificação e quantificação de agrotóxicos;
Investigar a ocorrência dos agrotóxicos clomazona, 2,4-D, carbofurano e tebuconazol, nas águas subterrâneas empregando SPE e HPLC-DAD, e confirmação por LC-ESI-MS/MS;
Informar a comunidade da Quitéria sobre a qualidade da água por eles consumida em relação à presença de resíduos de agrotóxicos.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Qualidade das águas
A água encontra-se disponível sob várias formas e é um dos recursos mais comuns existentes na natureza, cobrindo 70% da superfície do planeta. Todos os organismos necessitam de água para sobreviver, sendo a sua disponibilidade um dos fatores mais importantes a moldar os ecossistemas. Apesar de existir em abundância, nem toda água é diretamente aproveitada pelo homem. Do total estimado de 265.400 trilhões de toneladas de massa total de água existentes no planeta, somente 0,5% representa água doce extraível do ponto de vista tecnológico e econômico (BRAGA et al.,2005).
Além dos problemas relacionados com a quantidade de água, como estiagens, cheias e escassez, há também aqueles relacionados com a qualidade da água. A poluição de mananciais aquáticos impede, por exemplo, seu uso para abastecimento humano. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 25 milhões de pessoas morrem por ano no mundo em virtude de doenças transmitidas pela água. A OMS indica que nos países em desenvolvimento 70% da população rural e 25% da população urbana não dispõem de abastecimento adequado de água potável (BRAGA et al., 2005); e de acordo com estimativas das Nações Unidas, entre 2 a 7 bilhões de pessoas serão afetadas pela sua falta até 2050 (ROCHA et al., 2004). Por isso é necessário que a sociedade brasileira se mobilize para garantir a saúde e a vida das nossas fontes de água doce, como por exemplo: os rios, açudes, lagos, riachos, córregos e nascentes (PRIMEL, 2003).
A Figura 1 apresenta o percentual de municípios que informaram a ocorrência de problema ambiental impactante no Brasil; e como pode ser observado, a poluição do recurso água foi indicada por 41,7% dos municípios brasileiros, e de acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) (2008a) sua ocorrência foi mais informada por municípios das regiões mais urbanizadas e economicamente mais desenvolvidas do País, como o Sudeste (43,6% dos municípios da região) e o Sul (43,2%).
Figura 1 - Percentual de municípios que informaram a ocorrência de problema ambiental impactante, segundo o tipo de problema - Brasil - 2008 (Fonte: IBGE, 2008a)
3.1.1 Águas subterrâneas
A denominação de “águas subterrâneas” para as águas do subsolo é considerada mais apropriada, desde que a abordagem evoluiu do objetivo tradicional de determinação de reservas de água disponíveis no subsolo, para uma análise mais abrangente das suas condições de uso e proteção (REBOUÇAS et al., 2002).
Sendo definida recentemente pela legislação como águas que ocorrem naturalmente ou artificialmente no subsolo (BRASIL, 2008).
As águas subterrâneas estão disponíveis em todas as regiões da Terra, constituindo importante recurso natural. Essas são utilizadas freqüentemente para abastecimento doméstico, irrigação em áreas rurais e para fins industriais (TUNDISI, 2003).
Apesar da inexistência de dados completos sobre a dimensão da sua utilização, estima-se que cerca de 51% da água potável do Brasil provém dos aqüíferos subterrâneos (MEDEIROS et al., 2003); e que existem no país pelo menos 400.000 poços (ANA, 2007).
No Brasil, 15,6% dos domicílios utilizam exclusivamente água subterrânea, 77,8% usam rede de abastecimento de água e 6,6% usam outras formas de abastecimento. O Brasil não possui uma rede nacional de monitoramento de águas
subterrâneas. Por isso, existe uma grande carência de dados a respeito da qualidade das águas, especialmente de abrangência regional (ANA, 2007).
As águas subterrâneas têm sido consideradas como uma forma pura de água.
Devido a sua filtração através do solo e ao longo tempo de permanência no subsolo, ela contém uma quantidade muito menor de matéria orgânica natural e menos microrganismos causadores de doenças que as águas dos rios e lagos (BAIRD, 2002). Entretanto, nas últimas décadas, as atividades antrópicas têm comprometido significativamente alguns aqüíferos. Entre as principais fontes de poluição das águas subterrâneas pode-se citar o uso de insumos agrícolas, como agrotóxicos e fertilizantes (ANA, 2007).
O impacto das atividades agrícolas modernas sobre a qualidade das águas subterrâneas tornou-se conhecido em alguns países industrializados durante a década de 1970. (RIBEIRO et al., 2007). A experiência internacional mostra que, em áreas de intensa atividade agrícola, são cada vez mais comuns as ocorrências de agrotóxicos nas águas subterrâneas (ANA, 2007).
3.2 Agrotóxicos
Desde os primórdios da civilização, o homem tem continuamente se esforçado para melhorar sua condição de vida. Seu esforço para aumentar a produção de alimento contrapôs às devastações causadas pelas pragas, dando origem, então, aos compostos denominados de agroquímicos, incluindo fertilizantes e agrotóxicos (SILVA; FAY, 2004).
Pela legislação brasileira, os agrotóxicos são definidos como “produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas nativas ou plantadas, e de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento”
(BRASIL, 2002).
Os agrotóxicos abrangem um grande número de moléculas químicas, com diferentes modos de ação e toxicidade podendo ser classificados de acordo com a formulação, emprego, modo de ação e estrutura química (SILVA; FAY, 2004).
Quanto a toxicidade os agrotóxicos são dividido em 4 classes: I – extremamente tóxico, II – altamente tóxico, III – mediamente tóxico e IV – pouco tóxico (BARBOSA, 2004).
A principal classificação é quanto ao seu emprego, sendo classificados em inseticidas, herbicidas, fungicidas, acaricidas, moluscicidas, raticidas, entre outros (SILVA; FAY, 2004; KURZ, 2007).
3.2.1 Produção e uso de agrotóxicos
O desenvolvimento da síntese orgânica durante a Segunda Guerra Mundial e a consolidação do padrão tecnológico da agricultura chamada moderna tiveram importância fundamental no desenvolvimento da indústria mundial de agrotóxicos. A descoberta das propriedades inseticidas do organoclorado dicloro-difenil- triclororetano (DDT), em 1939, é tida como um marco de transição nas técnicas de controle fitossanitário das culturas agrícolas (SPADOTTO et al., 2004).
A introdução de agrotóxicos organossintéticos no Brasil teve início em 1943, quando chegaram às primeiras amostras do inseticida DDT (SPADOTTO et al., 2004).
O valor do mercado mundial para agrotóxicos foi estimado em US$32 bilhões em 2000, correspondendo à comercialização de mais de 3000 ingredientes ativos.
As vendas totais de agrotóxicos variam muito com a categoria, sendo que os herbicidas representam 48%, os inseticidas 28%, os fungicidas 19% e os outros produtos 5% (BARBOSA, 2004).
No Brasil, o consumo de agrotóxicos passou de 16 mil toneladas em 1964 para mais de 128 mil toneladas em 1998; portanto, o aumento no consumo de agrotóxicos foi de 700% neste período (SPADOTTO et al., 2004). A partir de 1994, as vendas de agrotóxicos no Brasil vêm crescendo continuamente, tendo ultrapassado os US$ 2 bilhões, correspondendo a 6% do mercado mundial (BARBOSA, 2004). Em 2001, para 50,7 milhões de hectares plantados, o Brasil
utilizou 158,7 mil toneladas de agrotóxicos, com uma média de 3,13 kg/ha (ANA, 2007).
O consumo desses produtos difere nas várias regiões do país, nas quais se misturam diversas atividades agrícolas (SPADOTTO et al., 2004). Destacam-se quanto à utilização de agrotóxicos os estados de São Paulo, Paraná, Mato Grosso, e Rio Grande do Sul (Figura 2) (IBGE, 2008b).
Figura 2 – Consumo nacional de agrotóxicos e afins no ano de 2005 (Fonte:
IBGE 2008b)
Como pode ser observado, os agrotóxicos mais intensamente aplicados são os herbicidas, seguidos pelos inseticidas, fungicidas e acaricidas (IBGE, 2008b).
3.2.2 O impacto no meio ambiente
Os agrotóxicos que inauguraram o ciclo que ainda hoje caracteriza a tecnologia predominante no combate às pragas agrícolas têm cerca de 50 anos.
Eles foram sintetizados na busca de um efeito duradouro de sua aplicação. Surgiu, então, o DDT, em 1939, como o primeiro inseticida organoclorado de elevada resistência à decomposição no ambiente. Essa resistência justificou o sucesso do DDT em programas de saúde pública e na contribuição para o aumento da produtividade agrícola. Entretanto, essa permanência no ambiente ampliava a oportunidade de sua disseminação na biosfera, seja por meio de fenômenos físicos, ou seja, pelas cadeias alimentares dos ecossistemas presentes no local de sua aplicação original (BRAGA et al., 2005).
Estes compostos são sintetizados para afetar determinadas reações bioquímicas de insetos, microrganismos, animais e plantas que se deseja controlar ou eliminar, mas determinados processos bioquímicos são comuns a todos os seres vivos e, assim, o efeito pode então atingir não só o organismo que se espera controlar, como também outros seres do ambiente (BAIRD, 2002).
Os seres humanos não estão isentos desta contaminação e os agrotóxicos acumulam-se no organismo em tecidos lipídicos, fígado, rins, cérebro e coração.
Como um agravante, muitos dos alimentos que fazem parte da dieta humana sofrem enriquecimento em relação à concentração inicial de agrotóxicos, como o leite, peixes de água doce ou salgada, crustáceos e vegetais (BAIRD, 2002).
Devido aos problemas causados ao meio ambiente e a organismos não alvos, um grande número de compostos vem sendo sintetizado, partindo do mesmo objetivo inicial, mas com a preocupação crescente de torná-los cada vez mais eficazes, mais seletivos e menos agressivos ao meio ambiente. Isso foi e está sendo conseguido devido à evolução espetacular em todas as áreas do conhecimento que vem ocorrendo desde o século XX, e que teve reflexo direto na indústria de agrotóxicos (BRAGA et al., 2005; BARBOSA, 2004).
Considerando o número total de produtos, houve nos últimos anos uma redução da produção dos agrotóxicos mais tóxicos, pertencentes às classes I e II (IBGE, 2008b). Dados do IBGE (2008b) mostram que de 1992 para 2004 houve um aumento de 114 agrotóxicos em linha de comercialização, totalizando em 2004 600 agrotóxicos. Nesse mesmo intervalo, a produção de agrotóxicos pertencentes à classe I e a classe II, diminuíram 8 e 10,2% respectivamente; enquanto os pertencentes as classes III e IV, aumentaram em 2,6 e 9,4%.
Para ilustrar a evolução ocorrida no desenvolvimento de produtos mais ativos, alguns dados são apresentados na Tabela 1. Pode ser observado que no início do século XX os herbicidas inorgânicos era os únicos disponíveis comercialmente.
Esses compostos eram utilizados em grandes quantidades, chegando-se a aplicar até 5 toneladas por hectare. A partir de 1930 surgiram os agrotóxicos sintéticos, e na década de 1980 herbicidas extremamente potentes como é o caso das sulfoniluréias foram desenvolvidos. Estes compostos chegam a ser aplicado em doses tão baixas quanto 2 g por hectare.
Tabela 1 – Variação na taxa de aplicação de herbicidas ocorrida no século XX
Década Produto Dose (g ha-1)
1900 Metaborato de Sódio 1.900.000 – 5.000.000
1910 Clorato de sódio 22.000 – 600.000
1930 2-metil-4,6-dinitrofenol 11.000 1940 Ácido (4-cloro-2-metilfenóxi)acético 1.000 – 2.000
1960 Trifluralina 500 – 1.000
1980 Fluazifope de butila 250
1980 Sulfoniluréias 2 – 25
Fonte: BARBOSA, 2004
Mesmo com os avanços tecnológicos alcançados nas últimas décadas, é praticamente impossível prever com precisão o real impacto que os produtos químicos poderão causar, no longo prazo, ao meio ambiente. Isso ocorre porque, uma vez liberado para o meio, com o objetivo de controlar a população de uma
praga em particular, o agrotóxico pode contaminar águas, ar, solos e alimentos (BARBOSA 2004).
Parcela considerável do total aplicado para fins agrícolas atinge os rios, lagos, aqüíferos e oceanos por meio do transporte por correntes atmosféricas, despejo de restos de soluções, limpeza de acessórios e recipientes empregados na aplicação desses produtos e também pelo carreamento do material aplicado no solo pela ação erosiva da chuva (BRAGA et al., 2005). Graças aos mecanismos de transporte característicos dos meios aquáticos, alguns desses defensivos têm sido detectados em todas as regiões geográficas incluindo aquelas mais distantes de sua liberação original, como oceanos, desertos e até na região antártica (BAIRD, 2002;
SPADOTTO et al., 2004; BRAGA et al., 2005). Estima-se que aproximadamente 700.000 toneladas de agrotóxicos sejam lançadas anualmente no meio ambiente, sendo boa parte utilizada na agricultura e aplicada diretamente em plantas ou solo (BARBOSA, 2004).
Os agrotóxicos são geralmente aplicados sobre plantas ou diretamente nos solos. Mesmo quando aplicados sobre as plantas, cerca de 50% da dose total aplicada poderá ter como destino final o solo, independentemente da forma como foi realizada essa aplicação (FARIA, 2004). Após a aplicação, vários processos físicos, químicos, físico-químicos e biológicos determinam seu comportamento, como mostra a Figura 3. O destino dos agrotóxicos no meio ambiente é governado por processos de retenção (sorção, absorção), de transformação (degradação química e biológica) e de transporte (deriva, volatilização, lixiviação e carreamento superficial), e por interações destes processos. Além da variedade de processos envolvidos na determinação do destino ambiental dos agrotóxicos, diferenças nas estruturas e propriedades das substâncias químicas, e nas características e condições ambientais, podem afetar estes processos (SPADOTTO et al., 2004).
Figura 3 – Diagrama esquemático do movimento dos agrotóxicos (Fonte:
BEYRUTH; TOMITA, 2003).
No que diz respeito aos mananciais aquáticos, principalmente os subsuperficiais, a lixiviação desses compostos é uma das principais formas de contaminação. O processo de lixiviação refere-se ao movimento descendente dos agrotóxicos na matriz do solo, ou com a água do solo, sendo sua intensidade dependente das características físico-químicas do produto e das características de solo e clima (INOUE et al., 2003).
Os efeitos para o meio ambiente ocasionados por um agrotóxico dependem intrinsecamente da sua ecotoxicidade a organismos terrestres e aquáticos. Além disso, dependem diretamente das concentrações atingidas nos diferentes compartimentos ambientais (solo, água, planta e atmosfera) que, por sua vez, dependem do modo e das condições de aplicação, das propriedades físico- químicas, da quantidade ou dose usada, das condições ambientais e do comportamento e destino do agrotóxico no meio ambiente (SPADOTTO et al., 2004;
ROCHA et al., 2004).
O cultivo e manejo do solo exercem grande influência na qualidade das águas subterrâneas e nas taxas de recarga de alguns aqüíferos, pois as atividades realizadas neste solo podem ameaçar a qualidade da água subterrânea, uma vez que a recarga das águas no subsolo ocorre, na maioria dos casos, devido à
infiltração da água de chuva em excesso no solo. Sendo assim, deve-se estar atento em relação a poluição dos recursos subterrâneos, pois quando agrotóxicos são aplicados, os recursos hídricos, sejam superficiais ou subterrâneos, são os principais destinos dos agrotóxicos. E, embora a contaminação das águas subterrâneas não seja tão visível e comentada como a das águas superficiais, e sua exploração seja muito distribuída; se a contaminação se torna perceptível tardiamente, geralmente já atingiu uma larga extensão (RIBEIRO et al., 2007).
A utilização dos agrotóxicos no meio rural brasileiro tem trazido uma série de conseqüências tanto para o ambiente como para a saúde do trabalhador rural. Em geral, essas conseqüências são condicionadas por fatores intrinsecamente relacionados, tais como o uso inadequado dessas substâncias, a alta toxicidade de certos produtos, a falta de utilização de equipamentos de proteção e a precariedade dos mecanismos de vigilância (OLIVEIRA-SILVA et al., 2001). A aplicação indiscriminada conduz, geralmente à graves problemas, pois dependendo de sua composição e toxicidade, os agrotóxicos podem ser classificados como cancerígenos, mutagênicos, teratogênicos e mimetizadores de hormônios (BAIRD, 2002).
3.2.3 Avaliação do potencial de risco da poluição ambiental por agrotóxicos
O grau de dificuldade na avaliação de riscos de contaminação de ambientes aquáticos decorrente do uso de agrotóxicos é grande, devido a grande quantidade de processos envolvidos nessa dinâmica (DORES; DE-LAMONICA-FREIRE, 2001).
A interação entre os solos e agrotóxicos dificulta a avaliação do comportamento no ambiente; isto porque estes compostos apresentam propriedades como tempo de meia-vida (t1/2), constante da Lei de Henry (KH), coeficiente de adsorção à matéria orgânica (Koc) e solubilidade, que interagem com as propriedades dos solos tais como teor da matéria orgânica, potencial de erosão, etc (FERRACINI et al., 2001).
Entretanto, existem modelos de screening que permitem uma avaliação preliminar do risco potencial em função das características das substâncias usadas e do ambiente em estudo (DORES; DE-LAMONICA-FREIRE, 2001).
Vários autores têm proposto métodos de seleção para verificar se determinado agrotóxico apresenta possibilidade de lixiviar. Alguns cientistas têm
tentado estabelecer valores limites para uma propriedade física ou conjunto de propriedades que, quando excedidos, indicariam que o agrotóxico apresenta potencial de lixiviação (SCORZA JÚNIOR et al., 2005); mas para predizer o risco potencial de contaminação de águas subterrâneas, os métodos mais utilizados são:
o critério da Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos – EPA; e o critério de GUS – Groundwater Ubiquity Score (DORES; DE-LAMONICA-FREIRE, 2001;
PRIMEL et al., 2005; CABRERA et al., 2008).
Os critérios da EPA apontam que o coeficiente de adsorção, meia-vida no solo, solubilidade em água e constante de Henry são as propriedades físico- químicas dos agrotóxicos mais relevantes no resultado final para sua classificação em relação à contaminação das águas (FERRACINI et al., 2001).
É importante notar que as propriedades físico-químicas diferem grandemente entre os diversos compostos, tornando extremamente difícil a tarefa de fazer generalizações sobre os destinos e impactos de agrotóxicos no ambiente. Mas é possível avaliar teoricamente, através das propriedades físico-químicas dos agrotóxicos, se eles apresentam algum risco potencial de poluição das águas superficiais e subterrâneas (PRIMEL, 2003).
3.2.4 A legislação para agrotóxicos
A preocupação com a contaminação de ambientes aquáticos aumenta, principalmente, quando a água é usada para o consumo humano. Por muitos dos mananciais de água serem fontes de água potável, muitas agências ambientais têm imposto legislação rigorosa a respeito da qualidade dessas águas.
A legislação mais rígida foi estabelecida pela Comunidade Econômica Européia (EEC, do inglês European Economic Community), onde, para água potável, a concentração máxima permitida é 0,1 µg L-1 para agrotóxicos individuais e 0,5 µg L-1 para a soma de agrotóxicos, incluindo produtos de transformação tóxicos (EEC DRINKING WATER DIRECTIVE, 1980).
A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (US-EPA) estabelece os níveis máximos para agrotóxicos individuais em água destinada ao consumo humano, baseados em estudos toxicológicos e epidemiológicos (DORES; DE- LAMONICA-FREIRE, 2001; EPA, 2003).
No Brasil, a Portaria nº 518, de 25 de março de 2004, que estabelece os procedimentos e responsabilidades relativas ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e o seu padrão de potabilidade, inclui as concentrações máximas de alguns agrotóxicos em águas para abastecimento humano (BRASIL, 2004). Há também no Brasil, a Resolução no 357, do CONAMA, de março de 2005, a qual estabelece níveis de qualidade para águas ambientais, avaliados por parâmetros e indicadores específicos, de modo a assegurar o uso das águas doce, salgada e salobra (BRASIL, 2005). No entanto, estas legislações não contemplam a maioria dos agrotóxicos em uso atualmente, como muitos inseticidas, fungicidas e grande parte dos herbicidas.
A Tabela 2 apresenta os Valores Máximos Permitidos (VMP) para os agrotóxicos em estudo, na Portaria nº 518, Resolução nº 357, EEC80 e US-EPA.
Observa-se que, de maneira geral, os limites estabelecidos pela Resolução do CONAMA são menores que os estabelecidos pela Portaria do Ministério da Saúde.
O único composto em estudo que possui limites na legislação brasileira para águas superficiais é o 2,4-D.
Tabela 2 - Agrotóxicos com os VMP estabelecidos pela legislação brasileira, européia e americana para água potável
Agrotóxico VMP (µg L-1)
Portaria 518 Resolução 357 EEC/80 EPA/EUA
Carbofurano - - 0,1 40,0
Clomazona - - 0,1 -
2,4-D 30,0 4,0 0,1 70,0
Tebuconazol - - 0,1 -
Com relação às águas subterrâneas, a Resolução nº 396, de 03 de abril de 2008, a qual dispõe sobre a classificação e diretrizes ambientais para o enquadramento, prevenção e controle da poluição das águas subterrâneas, estabelece os VMP para os agrotóxicos com maior probabilidade de ocorrência em águas subterrâneas. Na Tabela 3, pode ser observado o VMP e o Limite de Quantificação Praticável (LQP) para os agrotóxicos em estudo presentes na legislação. Tebuconazol e Clomazona não possuem VMP e LQP nesta legislação.
Tabela 3 – Valores Máximos Permitidos (VMP) e Limite de Quantificação Praticável (LQP), em µg L-1 para os agrotóxicos em estudo, segundo Resolução nº 396
Agrotóxico
Usos Preponderantes da água Consumo LQP
Humano Dessedentação de
animais Irrigação Recreação
Carbofurano 7,0 45,0 - 30,0 5,0
2,4-D 30,0 - - 100,0 2,0
3.2.5 Agrotóxicos selecionados neste estudo
Para escolher os agrotóxicos a serem estudados foi realizada uma entrevista com os agricultores da região da Quitéria, no município de Rio Grande. Além de dados relativos aos agrotóxicos utilizados e as culturas, foram levantados dados sobre a época do ano de plantio, recebimento ou não de informação agronômica, uso de medicamentos em animais, tipo de poço, profundidade, utilização da água do poço e número de pessoas abastecidas.
Dentre os agrotóxicos empregados na região, optou-se por desenvolver métodos para determinar resíduos dos compostos carbofurano, clomazona, tebuconazol e 2,4-D.
As características dos compostos abaixo foram obtidas no The e-Pesticide Manual (TOMLIN, 2003) e na Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (SIA, 2007).
3.2.5.1 Carbofurano
Grupo químico: metilcarbamato de benzofuranila
Nome químico (IUPAC): 2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofurano-7-metilcarbamato Classe: inseticida, nematicida
OCONHCH3
O CH
3CH
3Fórmula molecular: C12H15NO3
Número no Chemical Abstracts Service (CAS): 1563-66-2 Massa molar: 221,3 g mol-1
Log Kow: 1,52
Classe toxicológica: I, extremamente tóxico
Nomes comerciais: Carboran®, Fersol®, Diafuran®, Furacarb®, Ralzer®, Furadan®
Os agrotóxicos derivados dos carbamatos têm sido sintetizados e vendidos desde 1953. São principalmente utilizados na agricultura, como inseticidas, herbicidas, fungicidas, nematicidas, acaricidas, sendo utilizados também como biocidas industriais e outras aplicações, como para uso doméstico. Atualmente, são uma das maiores classes de agrotóxicos orgânicos sintéticos e são usados em larga escala através do mundo (GOU et al., 2000; SILVA;FAY, 2004).
A maioria dos carbamatos tem alto ponto de fusão e baixa pressão de vapor.
Pelo índice GUS, são identificados como potenciais lixiviadores e são normalmente distribuídos nos ambientes aquáticos devido a sua alta solubilidade em água.
Estudos têm demonstrado que os carbamatos e seus produtos de degradação são contaminantes de recursos ambientais e alimentos. Eles estão na lista de compostos prioritários do US-EPA e sua determinação em fontes de água merece atenção (GOU et al., 2000).
O agrotóxico carbofurano está incluído no grupo dos derivados dos carbamatos. É um produto fitosanitário no mercado a mais de 30 anos, e registrado no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) sob nº 2088591 (PLESE et al., 2005).
Carbofurano tem sido um dos inseticidas mais usados no mundo, e em 1995 foi reportado o uso de mais de 2 mil toneladas do composto aplicado nos EUA (MAHALAKSHMI et al., 2007). Na cultura do arroz irrigado, é aplicado na água de irrigação, assim que houver o aparecimento de bicheira-da-raiz, mas também é utilizado em culturas como algodão, amendoim, banana, café, cana-de-açúcar, cenoura, fumo, repolho, tomate e trigo (PLESE et al., 2005).
Embora o carbofurano demonstre uma boa eficiência agronômica, esse agrotóxico apresenta restrições ambientais, devido ao risco de contaminação. Seu
