Juliana Tavares Pinheiro
Investigação de populações do complexo Lutzomyia longipalpis em Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro e Mossoró, estado do Rio Grande do Norte
Rio de Janeiro 2017
Investigação de populações do complexo Lutzomyia longipalpis em Mangaratiba, Estado do Rio de Janeiro e Mossoró, Estado do Rio Grande do Norte
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Saúde Pública, da Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, na Fundação Oswaldo Cruz, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Saúde Pública. Área de concentração:
Abordegem Ecológica de Doenças Transmissíveis.
Orientador: Prof. Dr. Fabiano Borges Figueiredo.
Coorientador: Prof. Dr. Marcos Barbosa de Souza.
Rio de Janeiro 2017
Catalogação na fonte Fundação Oswaldo Cruz
Instituto de Comunicação e Informação Científica e Tecnológica Biblioteca de Saúde Pública
P654i Tavares-Pinheiro, Juliana.
Investigação de populações do complexo Lutzomyia longipalpis em Mangaratiba, Estado do Rio de Janeiro e Mossoró, Estado do Rio Grande do Norte / Juliana Tavares Pinheiro. -- 2017.
66 f. : il. color. ; mapas
Orientador: Fabiano Borges Figueiredo.
Coorientador: Marcos Barbosa de Souza.
Dissertação (mestrado) – Fundação Oswaldo Cruz, Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, Rio de Janeiro, 2017.
1. Psychodidae. 2. Leishmaniose. 3. Fenótipo.
4. Leishmaniose Visceral. 5. Lutzomyia longipalpis. I. Título.
CDD – 22.ed. – 616.9364
Investigação de populações do complexo Lutzomyia longipalpis em Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro e Mossoró, estado do Rio Grande do Norte
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Saúde Pública, da Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, na Fundação Oswaldo Cruz, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Saúde Pública. Área de concentração:
Abordegem Ecológica de Doenças Transmissíveis.
Aprovada em: 16 de março de 2017.
Banca Examinadora
Prof.a Dra. Marina Carvalho Furtado
Fundação Oswaldo Cruz – Campus FIOCRUZ Mata Atlântica
Prof. Dr.Antonio Nascimento Duarte
Fundação Oswaldo Cruz – Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca
Prof. Dr. Fabiano Borges Figueiredo (Orientador)
Fundação Oswaldo Cruz – Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas
Rio de Janeiro 2017
Dedico, aos meus miríficos pais (in memoriam).
Primeiramente agradeço ao meu pai Thelmo Azevedo Pinheiro (in memoriam) e a minha mãe Jamil Ribeiro Tavares (in memoriam) por tudo amor, carinho e dedicação. Por terem sempre zelado pela minha educação, como semear com a expectativa da colheita. Vocês vivem em mim agora, “pois o que a memória ama fica eterno” Rubem Alves. Fazem parte do que sou hoje e dessa conquista tão almejada. Certamente estão olhando por mim nesse momento.
Obrigada por tudo, amo muito vocês!!!
Ao meu orientador Dr. Fabiano Borges Figueiredo pela orientação segura, pelo exemplo profissional e humano, sempre disposto a ajudar. Você foi fundamental na minha formação.
Muito obrigada!!!
Ao meu querido coorientador Dr. Marcos Barbosa de Souza (in memoriam) por ter aberto as portas para mim e ter compartilhado com generosidade conhecimentos sobre flebotomíneos, como especialista que era no assunto.
Aos meus companheiros de coleta, Adilson Benedito, Arthur Velho, Renato Orsini, Larissa Clara, Cézar do Santo Ponte, Ciro Vilanova e Antônio Meira. A parceria de vocês foi fundamental. Muito obrigada!!!
Aos professores da disciplina de seminários, Dra. Joseli Nogueira, Dra. Sheila Ferraz, Dr.
Francisco Paumgartten e Dra. Cecilia Paumgartten pelas valiosas contribuições nesse processo.
À Thaís Leal, pela contribuição no trabalho, com importantes sugestões e sempre solícita.
À Thaís Kazimoto, por ter cedido gentilmente os espécimes de L. longipalpis provenientes do estado do Rio Grande do Norte.
Aos técnicos em Saúde Pública do Instituto Nacional de Endemias Rurais- INERU, especialmente Sidney da Silva Alves, Cesinha do Santo Ponte, Walace Guimarães e Flávio Alcelino por todo o suporte que deram na identificação de flebotomíneos. Sempre muito gentis e antenciosos, se tornaram bons amigos. Muito obrigada a todos!!!
Stella da Silva Oliveira do laboratório de Biologia Estrutural; à Luisa Miranda e ao Dr.
Rodrigo Menezes do laboratório de dermatozoonoses por terem gentilmente ajudado a tirar as fotos dos flebotomíneos L. longipalpis.
À toda equipe do laboratório de Dermatozoonoses.
Aos funcionários da secretaria do Departamento de Ciências Biológicas da ENSP, Maria Isabel Pereira Soares, Rogéria Leite Peregrino Pinho, Rosa Maria Rodrigues Lopes e Fabiano Esteves Silva, foram sempre muito amáveis e atenciosos.
Aos amigos brasileiros, colombianos, paquistaneses, moçambicanos, angolanos e cabo- verdianos que conviveram comigo durante o mestrado no Alojamento do Centro de Referência Professor Hélio Fraga. Obrigada pela experiência intercultural!!!
Dentre os amigos agradeço especialmente ao Ramon Feliphe Souza por ter me ajudado cedendo seu tempo, sempre me incentivando e me lembrando que ostra feliz não faz pérolas.
Mergulhou tão intensamente no trabalho que agora é um historiador que sabe reconhecer as manchas nos tergitos dos machos de L. longipalpis.
À amiga Quezia Dias, por ter me apresentado ao meu Coorientador, pelo incentivo e pelas horas de estudos juntas desde a graduação ao processo seletivo do mestrado. Muito obrigada!!!
Aos moradores das áreas de estudo por terem permitido as instalações das armadilhas no peridomicílio de suas residencias.
À Marinha do Brasil, por ter concedido a realização do trabalho de campo na Restinga da Marambaia.
Ao CNPQ pelo apoio financeiro.
E a todos aqueles que de alguma forma contribuiram para essa realização.
Seguir para a vida.
Ser barco, navegar.
Começar com uma gota, de repente mar...
Ramon Feliphe Souza, amigo do Mestrado.
Lutzomyia longipalpis lato sensu (l.s) é considerado o principal vetor de Leishmania chagasi, agente etiológico causador da leishmaniose visceral nas Américas. Durante estudos pioneiros no nordeste Brasil, Mangabeira (1969) observou variações fenotípicas entre machos de L.
longipalpis que coexistiam em simpatria em Sobral no Ceará, e sugeriu que poderiam se tratar de espécies distintas. Desde então a maioria dos estudos destinados a esclarecer o verdadeiro status taxonômico de L. longipalpis, apontam para a existência de um complexo de espécies incipiente, embora o número de integrantes e suas áreas de distribuição ainda não estejam totamente resolvidos. Recentemente, estudos tem correlacionado variabilidade genética a padrões fenotípicos distintos. Essas diferenças são de grande importância para a saúde pública, não somente pela possibilidade de influenciarem na capacidade vetorial desses flebotomíneos, mas também de sua antropofilia. O presente estudo teve como objetivo analisar as características fenotípicas das populações de machos de L. longipalpis provenientes da Restinga da Marambaia, município de Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro e do bairro de Santo Antônio, localizado no município de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte, região semi- árida do nordeste brasileiro. As capturas foram realizadas durante o período de 12 meses.
Armadilhas do tipo HP foram empregadas, iniciadas às 18 horas e encerradas às 7 horas do dia seguinte, totalizando 13 horas/coleta. Os flebotomíneos machos capturados foram identificados a nível de espécie de acordo com a nomenclatura proposta por Galati (2003) e, em seguida, os machos de L. longipalpis obtidos submetidos à caracterização fenotípica. Todos os machos de L. longipalpis provenientes da Restinga da Marambaia apresentaram o padrão morfológico de uma mancha clara no 4º tergito abdominal, morfotipo predominante também em outras áreas do Rio de Janeiro. No bairro de Santo Antônio, município de Mossoró, identificamos significativa diversidade fenotípica, composta por machos que apresentaram o padrão morfológico de uma mancha clara no 4º tergito abdominal, enquanto outros apresentaram o padrão morfológico de 2 manchas claras no 3º e no 4º tergito, além do encontro de um fenótipo intermediário representado por machos com uma mancha clara no 4º tergito e 3/4 do 3º tergito preenchido pela mancha clara. Na última região, variedades morfológicas parecem apresentar importância vetorial com fortes consequências epidemiológicas, tendo em vista a maior incidência da leishmaniose visceral na região nordeste do Brasil, sobretudo no Estado do Rio Grande do Norte.
Palavras-chave: Lutzomyia longipalpis lato sensu. Complex Lutzomyia longipalpis.
Caracterização fenotípica.
an etiological agent that causes visceral leishmaniasis in the Americas. During pioneering studies in northeast Brazil, Mangabeira (1969) observed phenotypic variations among males of L. longipalpis that coexisted in sympatry in Sobral, Ceará, and suggested that they could be different species. Since then, most of the studies aimed at clarifying the true taxonomic status of L. longipalpis point to the existence of an incipient species complex, although the number of members and their areas of distribution are still not fully resolved. Recently, studies have correlated genetic variability to distinct phenotypic patterns. These differences are of great importance for public health, not only for the possibility of influencing the vectorial capacity of these sandflies, but also for their anthropophilia. The present study had the objective of analyzing the phenotypic characteristics of the L. longipalpis males populations from Restinga da Marambaia, Mangaratiba municipality, state of Rio de Janeiro and Santo Antônio neighborhood, located in the municipality of Mossoró, state of Rio Grande do Norte, semi-arid region of Northeast Brazil. Catches were taken during the 12- month period. HP- type traps were employed, starting at 6 pm and ending at 7 pm the following day, totaling 13 hours / collection. The captured male sandflies were identified at species level according to the nomenclature proposed by Galati (2003) and then the males of L. longipalpis obtained submitted to the phenotypic characterization. All males of L.
longipalpis from the Restinga da Marambaia presented the morphological pattern of a pale spot in the 4th abdominal tergite, a predominant morphotype in other areas of Rio de Janeiro. In the Santo Antônio neighborhood, Mossoró municipality, we identified a significant phenotypic diversity composed by males that presented the morphological pattern of a pale spot in the 4th abdominal tergite, while others presented the morphological pattern of 2 pale spots completely filled in the 3rd and 4th tergite, In addition to the finding of an intermediate phenotype represented by males with a single solid spot in the 4th tergite and 3/4 of the 3rd tergite filled by the light spot. In the latter region, morphological varieties seem to present vectorial importance with strong epidemiological consequences, due to the higher incidence of visceral leishmaniasis in northeastern Brazil, especially in the State of Rio Grande do Norte.
Keywords: Lutzomyia longipalpis lato sensu. Lutzomyia longipalpis complex. Phenotypic characterization.
Figura 1 - Ciclo Biológico dos protozoários do gênero Leishmania... 21 Figura 2 - Espermateca feminina de L. longipalpis... 23 Figura 3 - Terminália genital masculina de L. longipalpis... 23 Figura 4 - Resumo das informações disponíveis sobre diferentes sons de cópula e
principais tipos de feromônios produzidos por 14 populações de L.
longipalpis do Brasil... 25 Figura 5 - Área de estudo: Ilha da Marambaia... 28 Figura 6 - Área de estudo: Mossoró……….. 29
1M Fenótipo de Lutzomyia longipalpis com uma mancha clara no quarto tergito abdominal
2M Fenótipo de Lutzomyia longipalpis com duas manchas claras uma no terceiro e outra no quarto tergito abdominal
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animal DNA Ácido Desoxirribonucléico
DPP Teste imunocromatográfico rápido em dupla plataforma ENSP Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca ELISA Ensaio Imunoenzimático
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
INI Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas INERU Instituto Nacional de Endemias Rurais
IOC Instituto Oswaldo Cruz
KDNA DNA do cinetoplasto ou DNA mitocondrial LGP Molécula lipofosfoglicana
l.s. lato sensu
LT Leishmaniose Tegumentar
LTA Leishmaniose Tegumentar Americana LV Leishmaniose Visceral
LVA Leishmaniose Visceral Americana MLEE Eletroforese Multilocus de Isoenzimas PCR Reação em Cadeia da Polimerase Pb Pares de bases
Per Gene period
WHO/OMS Organização Mundial da Saúde
1 INTRODUÇÃO... 12
2 PRESSUPOSTO TEÓRICO... 14
2.1 LEISHMANIOSES... 14
2.2 AGENTE ETIOLÓGICO... 15
2.3 CICLO BIOLÓGICO... 19
2.4 FLEBOTOMÍNEOS VETORES... 22
2.5 COMPLEXO L. longipalpis... 23
3 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA... 26
4 OBJETIVO... 27
4.1 OBJETIVO GERAL... 27
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 27
5 MATERIAIS E MÉTODOS... 28
5.1 TRABALHO DE CAMPO... 28
5.1.1 Área de estudo: Ilha da Marambaia... 28
5.1.2 Área de estudo: Mossoró... 29
5.2 CAPTURA DE FLEBOTOMÍNEOS, SELEÇÃO DE AMOSTRAS E IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA... 30 5.2.1 Caracterização fenotípica... 30
6 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 31
7 ASPECTOS ÉTICOS... 31
8 RESULTADOS... 31
8.1 ARTIGO... 32
9 CONCLUSÃO... 53
REFERÊNCIAS... 54
GLOSSÁRIO... 65
1 INTRODUÇÃO
As leishmanioses são consideradas doenças cosmopolitas de grande preocupação para a saúde pública. São doenças infecciosas causadas por protozoários do gênero Leishmania, transmitidos por vetores, os flebotomíneos. Nas Américas, essas enfermidades apresentam uma variedade de sinais clínicos agrupados basicamente sob duas formas - Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e Leishmaniose Visceral Americana (LVA) (GONTIJO;
CARVALHO, 2003).
A ampla distribuição geográfica das leishmanioses está estreitamente condicionada ao desenvolvimento bem sucedido dos flebotomíneos, espécies vetoras pertencentes ao gênero Phlebotomus no Velho Mundo e ao gênero Lutzomyia no Novo Mundo (RANGEL;
LAINSON, 2003).
Lutzomyia longipalpis lato sensu, considerado o principal vetor da LVA no Brasil, possui extensa distribuição geográfica, entretanto, em áreas focalizadas e de forma descontinua (YOUNG; DURAN, 1994). Esse cenário muito se deve a existência de barreiras geográficas, climáticas e ao curto raio de vôo do vetor (ALEXANDER et al., 1998), sendo o isolamento por distância condição reconhecida por reduzir o fluxo gênico entre as populações, atuando em processos de especiação (BAUZER et al., 2007). Nessa perspectiva, a variabilidade genética observada entre populações de L. longipalpis pode estar relacionada aos processos de deriva gênica e seleção natural, eventos graduais na escala espaço-temporal que possivelmente exercem influências sob a capacidade vetorial desses flebotomíneos, tendo fortes consequências na epidemiologia da LVA (LANZARO et al., 1993).
Durante estudos pioneiros no Nordeste do Brasil, Mangabeira (1969) observou variações morfológicas entre machos de populações simpátricas de L. longipalpis em Sobral, no Ceará, em comparação com as populações alopátricas do Pará. Foi identificada a existência de dois fenótipos distintos, compostos por machos com uma mancha clara no IV seguimento abdominal (1M), enquanto outros apresentavam manchas claras no III e IV segmentos abdominais (2M). O mesmo também observou que essas populações estavam dispostas em ambientes com condições ecológicas distintas. Com base nesses indícios, sugeriu que poderiam se tratar de espécies distintas (MANGABEIRA, 1969).
Tais achados impulsionaram o desenvolvimento de novas pesquisas, no sentido de solucionar a questão enigmática posta em debate, que ainda hoje pretende responder se as populações de L. longipalpis, de diferentes regiões geográficas do Brasil, correspondem a uma única espécie ou a um complexo de espécies a ser investigado. Estudos comparativos a
nível inter-populacional utilizaram diferentes metodologias no intuito de esclarecer o verdadeiro status taxonômico de L. longipalpis, principalmente a partir das populações encontradas na América do Sul e Central. A maioria deles fornecem fortes evidências para a existência do complexo L. longipalpis (URIBE, 1999; SOARES; TURCO, 2003; BAUZER et al., 2007), embora ainda não haja consenso quanto ao número de espécies integrantes e as suas áreas de distribuição (ARRIVILLAGA et al., 2003; BAUZER et al., 2007).
Por conseguinte, a epidemiologia complexa da LVA e sua distribuição heterogênea, com manifestações de amplo espectro clínico produzidas por L. chagasi, podem ser explicadas pelo envolvimento de diversas espécies crípticas dentro do complexo L.
longipalpis. Deste modo, a importância dos processos de especiação para a saúde pública é de tal ordem que torna-se necessário o conhecimento do vetor em cada foco de transmissão (ARRIVILLAGA et al., 2003).
É nesse contexto que foi realizado o primeiro estudo com o objetivo de analisar as características fenotípicas das populações de L. longipalpis provenientes da Restinga da Marambaia, município de Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro e do bairro de Santo Antônio, município de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte, área de transmissão silenciosa e intensa dessa protozoose, respectivamente.
2 PRESSUPOSTO TEÓRICO 2.1 LEISHMANIOSES
As leishmanioses, na sua forma tegumentar (LT) e visceral (LV), constituem um grupo de protozooses infecto-parasitárias de grande importância em saúde pública no mundo (GRIMALDI; TESH, 1993). São endêmicas em 88 países, infectando cerca de 12 milhões de pessoas em todo mundo. Cerca de 350 milhões estão sob risco de adquirir a doença, com incidência anual de 1 a 1,5 milhões de novos casos de leishmaniose cutânea e 500.000 novos casos da forma visceral. Nas Américas, o Brasil é o país com mais registros de casos, tanto da forma tegumentar quanto visceral (WHO, 2010).
As leishmanioses são zoonoses importantes, que acometem o ser humano e outras espécies de mamíferos silvestres e domésticos, sob a forma de doenças infecciosas crônicas com diversas manifestações clínicas (GRIMALDI; TESH, 1993). São causadas por protozoários do gênero Leishmania e a sua principal forma de transmissão ocorre através da picada de insetos vetores da subfamília Phlebotominae. São relacionadas entre as seis principais endemias do mundo (MARZOCHI; MARZOCHI, 1994; WHO, 2010).
No Brasil, a LV é um problema de saúde pública cada vez mais importante devido à frequência com que ocorre e a habilidade de se espalhar rapidamente (BRASIL, 2006). É causada por L. infantum, comumente transmitida pelo flebotomíneo Lutzomyia longipalpis. A densidade populacional desses insetos no peridomicílio pode alcançar níveis muito altos (WARD et al., 1985).
O ciclo para manutenção da L. infantum envolve populações de raposas no ambiente silvestre (DEANE; DEANE, 1962; LAINSON; SHAW, 1969) e cães domésticos que habitam no peridomicílio e servem como reservatórios dos parasitas. Embora gambás possam ser naturalmente infectados (SHERLOCK et al., 1984; CORREDOR et al., 1989), seu papel epidemiológico como reservatório permanece desconhecido.
Os cães domésticos são altamente susceptíveis para a infecção por L. infantum e a principal fonte de infecção para o vetor, devido ao intenso parasitismo na pele, independente da apresentação clínica (MOLINA et al., 1994; MICHALSKY et al., 2007; GIUNCHETTI et al., 2006). Tem sido identificado como o principal reservatório de L. infantum, além do que a doença no cão ter se tornando uma doença emergente e reemergente, dependendo da área de ocorrência, como indicado pelo número de cães soropositivos para LV e a expansão geográfica da doença (COURA-VITAL et al., 2014).
Medidas de controle usadas para LV no Brasil são focadas na busca ativa de pacientes
humanos e tratamento, eutanásia dos cães soropositivos e controle do vetor por meio de dedetização dos domicílios e canis (LACERDA, 1994).
Alguns autores sugerem que o controle efetivo requer uma elevada proporção de cães infectados removidos imediatamente após detecção para alcançar uma redução na transmissão da doença (QUINNELL et al., 1997; COURTENAY et al., 2002). O estudo de Costa e colaboradores (2013) demonstra que os métodos citados, dependendo da intensidade da transmissão canina, se aplicados de forma contínua, com remoção dos cães infectados em até quatro meses após coletados, podem reduzir significativamente a prevalência da LVC ao longo do tempo (COSTA et al., 2013).
Desde 2011, após um estudo realizado pelo Ministério da Saúde, o teste imunocromatotográfico rápido em dupla plataforma (DPP®) tem sido utilizado como exame de referência na triagem da LVC, em substituição ao ensaio imunoenzimático (ELISA) anteriormente utilizado. Contudo, resultados positivos no DPP® devem ser confirmados por ELISA (NOTA TÉCNICA N° 01/2011) para posterior eutanásia dos cães positivos para LV.
Com o propósito de melhorar o diagnóstico para a retirada do animal e consequentemente melhor controle da doença.
As técnicas de biologia molecular baseadas na detecção de ácidos nucléicos como a reação em cadeia pela polimerase (PCR) tem demonstrado ser uma importante ferramenta para o diagnóstico de diferentes doenças infecciosas, dentre elas as leishmanioses (HARRIS et al., 1998).
Na detecção do DNA de Leishmania, a PCR apresenta a vantagem de utilização de uma extensa variedade de amostras clínicas como, por exemplo, aspirados de linfonodos (REALE et al., 1999; MANNA et al., 2004), sangue (REITHINGER et al., 2000; MANNA et al., 2004), medula óssea (REITHINGER et al., 2000), pele (ROURA et al., 1999), “swab” oral e conjuntival (LOMBARDO et al., 2012), e pelos (BELINCHON-LORENZO et al., 2013).
2.2 AGENTE ETIOLÓGICO
No mundo, a leishmaniose visceral tem como agentes etiológicos os protozoários da ordem Kinetoplastida, da família dos tripanossomatídeos, pertencentes ao subgênero Leishmania, do gênero Leishmania. Esses parasitos integram o complexo donovani, o qual é constituído por três espécies: Leishmania donovani incriminada pelo calazar Indiano, L. (L.) infantum responsável pela enfermidade no continente Europeu, Africano e Asiático e L. (L.) chagasi de ocorrência nas Américas (LAINSON et al., 1987), apesar dessa classificação
taxonômica ainda hoje ser questionada (DANTAS-TORRES, 2006a; DANTAS-TORRES, 2006b; SHAW, 2006).
Em 1937, L. chagasi (CUNHA; CHAGAS, 1937) foi descrita como uma nova espécie do gênero Leishmania responsável por causar a LVA, após ter sido demostrada a incapacidade do protozoário parasita de produzir experimentalmente infecções viscerotrópicas em seu principal reservatório, o cão doméstico, o que a distinguiu de L. infantum, o primeiro agente causal descrito por Nicole (1908), outrora incriminado pelo calazar Europeu na região Mediterrânea (NICOLLE, 1908).
Entretanto no ano seguinte, Cunha (1938) reconheceu que L. chagasi, a espécie recém descrita, e L. infantum eram morfologicamente indistinguíveis (CUNHA, 1938). Tal declaração inevitavelmente, representou o estopim para a realização de novos estudos, no sentido de prestar maiores esclarecimentos sobre a verdadeira etiologia e taxonomia do parasita visceral de ocorrência nas Américas (DANTAS-TORRES, 2006a). Os resultados dos estudos produzidos desde então fundamentam posicionamentos taxonômicos divergentes. Por convenção, mesmo à parte da discussão sobre o staus taxonômico dos agentes causais da leishmaniose visceral no Novo e Velho Mundo, respeitamos no presente estudo o posicionamento taxonômico defendido por cada autor citado para fazer referência a ambos os parasitos, de acordo com as denominações deliberadas em suas obras.
De acordo com Shaw (2006), sempre houve uma forte tendência de considerar a origem geográfica do parasito viscerotrópico no momento de decidir sobre o seu status taxonômico, prática que possivelmente motivou a denominação L. chagasi para incriminar o agente causal da LVA. Para ele é possível que existam diferentes linhagens de leishmanias viscerotrópicas nas Américas, sejam elas nativas e ou introduzidas (SHAW, 2006).
Outros pesquisadores (KILLICK-KENDRICK, 1984; RIOUX et al., 1990) sustentam a hipótese de que L. infantum fora introduzida nas Américas por cães infectados trazidos durante o período da colonização portuguesa e espanhola, sendo o complexo donovani constituído por apenas duas espécies: L. donovani e L. infantum. Logo L. chagasi é desconsiderada como espécie. Porém, o encontro de altas taxas de infecção benigna e assintomática em reservatório silvestre (Cerdocyon thous), no Parque Ambiental do Utinga- Amazônia brasileira, área sem relatos de casos humanos e caninos, sugere a existência de ciclos enzoóticos fechados antigos, possivelmente decorrente de milhares de anos de interação adaptativa entre a ação patogênica do parasito a resposta imune do hospedeiro (LAINSON E SHAW, 2005; SILVEIRA; CORBETT, 2010). Além disso L. (L.) infantum adaptada ao flebotomíneo vetor Phlebotomus dubosqi nos países europeus, teria que se adaptar num curto
período de tempo a L. longipalpis, espécie de febotomíneo autóctone do continete americano, o qual vive sob condições climáticas e ecológicas muito distintas às encontradas no continente Europeu (SILVEIRA; CORBETT, 2010).
Por outro lado, no final da década de 90, Mauricio e colaboradores (1999) avaliaram relações genotípicas dentro do complexo donovani, por métodos moleculares de ligação da sonda Lmet9 específica para L. chagasi e Leishmania spp do Velho Mundo, sequenciamento parcial do gene MSPC, além da utilização da técnica de amplificação aleatória de DNA polimórfico a partir de diferentes isolados de leishmanias viscerotrópicas provenientes do Novo e Velho Mundo. Ao comparar os perfis genéticos traçados, verificou-se que L. chagasi e L. infantum eram geneticamente indistinguíveis. Frente a esses achados, eles consideraram que L. chagasi e L. infantum são sinonímias e, por conseguinte, concluíram que L. chagasi não deveria ser considerada como espécie. Adiciona-se a isso, o fato dos padrões filogeográficos obtidos nesse estudo indicarem a origem monofilética de ambos os parasitos dentro do complexo donovani, o que sugere a introdução de L. infantum no Novo Mundo (MAURICIO et al., 1999a).
Em contraposição, Lainson e Shaw (2005) publicaram uma vasta revisão do gênero Leishmania e, amparados por evidências consistentes, tais como: aspectos ecoepidemiológicos da LVA na América Latina, interação do parasito com o seu principal vetor L. longipalpis e reservatório silvestre, sugeriram o status taxonômico para ambos os parasitos a nível subespecífico, com a denomição L (L.) infantum chagasi para o agente etiológico da LV de origem americana e L. (L.) infantum infantum para o agente causal da enfermidade natural do Velho Mundo (LAINSON; SHAW, 2005).
Posteriormente, análises multilocus de microssatélites, marcadores moleculares altamente polimórficos (KUHLS et al., 2011) e, comparações de perfis isoenzimáticos por eletroforese multilocus de isoenzimas – MLEE, identificaram que a baixa variabilidade genética encontrada entre os parasitos em questão não foi significativa a ponto de separá-los a nível específico ou subespecífico (RIOUX et al., 1990), sendo a última técnica considerada
“padrão ouro” para a classificação taxonômica do gênero Leishmania (WHO, 1990).
Entretanto, uma nova abordagem combinada de ensaios fluorogênicos identificou heterogeneidade genética significativa entre parasitas viscerais provenientes do Velho Mundo, com o encontro de cinco grupos distintos dentro do complexo donovani, cujos membros foram tipados por zimodemas (QUISPE-TINTAYA et al., 2005), o que indica a existência de mais de uma linhagem com a mesma origem geográfica (SHAW, 2006). O alto poder discriminatório da técnica empregada foi compatível com a percepção de evolução do gênero
e revelou discrepância na atual taxonomia baseada em MLEE (QUISPE-TINTAYA et al., 2005).
As demais análises comparadas de perfis genéticos traçados a partir de fragmentos de DNA do cinetoplasto ou mitocondrial (KDNA) obtidos por digestão enzimática de restrição (JACKSON; WOHLHIETER; HOCKMEYER, 1982; JACKSON et al., 1984), o uso de impressão digital de DNA (ELLIS; CRAMPTON, 1991), a identificação de Leishmania spp por radiorrespirometria (DECKER- JACKSON et al., 1980), e ainda o não reconhecimento das proteínas de superfície de formas promastigotas de L. chagasi a anticorpos monoclonais glicoconjugados (SANTORO et al., 1984) forneceram evidências consistentes de diferenças significativas entre as duas linhagens dentro do complexo donovani. Achados esses, interpretados por Maurício e colaboradores (2000), como “menores diferenças” genotípicas e fenotípicas utilizadas como critérios para justificar a separação em duas espécies ou subespécies (MAURICIO; STOTHARD; MILES, 2000; DANTAS-TORRES, 2006a). Em contraposição, Rangel (2006) ressalta as análises de sorodemas e zimodemas como adventos promissores da biologia molecular capazes de aumentar a consciência sob “menores diferenças” entre isolados parasitários de leishmanias viscerais, os quais futuramente podem ser considerados como subespécies, denominação essa, indicativa da estreita relação entre L.
(L.) infantum chagasi e L. (L.) infantum infantum, o que reforça a existência de processos de especiação recentes na produção de “menores diferenças”, como se referem os autores supracitados (DANTAS-TORRES, 2006b).
Na opinião de Shaw (2006) estamos testemunhando um processo de especiação atribuído a seleção natural espécie-específica de parasitas viscerais no vetor (SHAW, 2006).
Existem diferenças nas galectinas intestinais secretadas por flebotomíneos, responsáveis por intermediar a adesão específica do parasito à parede intestinal do vetor, atuando por consequência no sucesso da transmissão (KAMHAWI et al., 2004; SHAW, 2006). Assim a adaptação a novos vetores irá depender da compatibilidade entre os glicolipídeos de superfície do protozoário parasito às galectinas secretadas no tubo digestivo do flebotomíneo vetor durante a digestão do alimento sanguíneo (SHAW, 2006).
De fato, ainda hoje a questão é polêmica e, por não haver consenso sobre o real status taxonômico do agente causal da LV nas Américas, várias denominações são utilizadas para fazer referência ao mesmo parasito, o que é inaceitável do ponto de vista científico (DANTAS-TORRES, 2006b). Frente a esses entraves taxonômicos, muitos pesquisadores (MOMEN; GRIMALDI; DEANE, 1986; RIOUX et al., 1990; MAURICIO et al., 1999b;
MAURICIO; STOTHARD; MILES, 2000; DANTAS-TORRES, 2006a; DANTAS-TORRES,
2006b; LUKES et al., 2007; KUHLS et al., 2011) sugerem a reclassificação do agente causal da LVA dentro do complexo donovani.
Sobre esse aparente dilema taxonômico, Shaw (2006) argumenta com propriedade que justamente por ainda existirem muitas questões a serem respondidas sobre a etiologia, identidade e epidemiologia do parasito americano, sinonimizar o nome chagasi com infantum, significaria excluir linhagens passíveis de investigação antes mesmo de ser cogitada a sua existência (SHAW, 2006). Além disso, desqualificar L. (L.) chagasi com base apenas em sua similaridade genética com L. (L.) infantum representaria desconsirar cinquenta anos de conhecimento acumulado sobre o agente etiológico responsável pela LVA (SILVEIRA;
CORBETT, 2010).
Mesmo para os evolucionistas os processos de especiação representam um grande desafio para a identificação de agentes infecciosos. Na maioria dos casos é possível atribuir uma denominação a nível específico a agentes patogênicos de impotância médica, sendo fundamental para os tomadores de decisão, mas tal deliberação requer uma abordagem integrada na qual devem ser considerados aspectos biológicos, filogenéticos, fenéticos e fenotípicos. Logo, a combinação desses princípios aliados ao advento das tecnologias moleculares modernas podem contribuir para a manipulação desses conceitos (TIBAYRENC, 2006).
2.3 CICLO BIOLÓGICO
A cadeia de transmissão dos protozoários do gênero Leishmania envolve interações complexas entre parasitas, vetores e hospedeiros susceptíveis em ambientes com características ecológicas distintas (DANTAS-TORRES et al., 2012).
Nas Américas, L. (L.) chagasi é o único agente etiológico causador da leishmaniose visceral, comumente transmitido pela fêmea do flebotomíneo L. longipalpis. Dentro da fauna flebotomínica apenas as fêmeas são hematófagas, desenvolveram o hábito de alimentar-se do sangue de animais vertebrados, nutrição necessária para o amadurecimento do folículo ovariano e a produção de ovos, o que as deixou susceptíveis a invasão de microorgamismos como os protozoários do gênero Leishmania (RANGEL; LAINSON, 2003).
L. (L.) chagasi, pode apresentar-se na natureza sob duas principais formas necessárias para completar seu ciclo evolutivo digenético: promastigotas, formas extracelulares presentes no tubo digestivo de fêmeas infectadas e as amastigotas, formas intracelulares obrigatórias que parasitam o sistema fagocítico mononuclear de hospedeiros vertebrados (PETERS;
KILLICK-KENDRICK, 1987; RANGEL; LAINSON, 2003). As amastigotas são imóveis, apresentam morfologia ovoide, contendo um flagelo internalizado próximo ao cinetoplasto situado abaixo do núcleo. Já as promastigotas são formas móveis, com flagelo livre e aparente, possuem corpo alongado, com cinetoplasto na parte anterior ao núcleo centralizado (MOLYNEUX; KILLICK-KENDRICK; PETERS, 1987).
Durante o repasto sanguíneo num vertebrado infectado, a fêmea flebotomínea causa um pequeno hematoma no ponto da picada, de onde ingere macrófagos parasitados com formas amastigotas de L. chagasi (COURA, 2008). Na luz do trato digestivo da fêmea vetora, as formas amastigotas diferenciam-se em poucos dias de formas intermediárias a promastigotas (RANGEL; LAINSON, 2003). Esse processo é intertermediado pela matriz peritrófica, uma membrana amorfa semipermeável, a qual atua como barreira física com a função de evitar danos ao epitélio intestinal do vetor e confere proteção contra o ataque de microorganismos patogênicos ingeridos no momento da hematofagia (PIMENTA et al., 1997). No entanto, a formação da matriz peritrófica pode minimizar a ação de enzimas digestivas sob verdadeiros ninhos de leishmanias concentrados do meio do bolo alimentar. O escape da matriz peritrófica permite a adesão do parasito ao epitélio intestinal do vetor e impede que as formas promastigotas sejam excretadas junto com o alimento não digerido (PIMENTA et al., 1997; RANGEL; LAINSON, 2003). Em seguida, inicia-se o processo de metaciclogenese e a emergência de promastigotas metacíclicas, altamente infectantes, que logo migram para a porção anterior do trato digestivo em direção a probóscide. O aglomerado de metacíclicas causam a desfunção da válvula cárdea ou estomodeal, a qual em seu estado normal funciona como um esfíncter que impede o refluxo do alimento sanguíneo ingerido (SCHLEIN; JACOBSON; MESSER, 1992).
Ao realizar um novo repasto sanguíneo a fêmea infectada regurgita o conteúdo intestinal com formas promastigotas metacíclicas de L. chagasi, as quais possuem tropismo pelas vísceras, interiorizadas principalmente por macrófagos do fígado, baço e da medula óssea do hospedeiro vertebrado (COURA, 2008). Posteriormente as promastigotas metacíclicas são encerradas por vacúolos parasitófaros, os fagolisossomas. As leishmanias são capazes de resistir a atividade leishmanicida dentro dos fagolisossomas, devido a expressão da molécula lipofosfoglicana (LGP) de superfície, existente apenas nas formas promastigotas metacíclicas que inibe a exposão oxidativa decorrente da atividade respiratória dos macrófagos, o que confere proteção contra a lise (SCHLEIN; SCHNUR; JACOBSON, 1990;
RANGEL; LAINSON, 2003). Ainda no interior dos fagolisossomas as formas promastigotas metacíclicas diferenciam-se em formas amastigotas, essas multiplicam-se ativamente por
bivisão binária e abarrotam aqueles macrófagos causando a sua ruptura e o estrapolamento para o meio extracelular, aptas a infectar novas células do sistema fagotícico mononuclear (COURA, 2008), como pode ser observado abaixo (figura 1):
Ciclo Biológico
Figura 1. Esquema do ciclo biológico das leishmanioses (adaptado traduzido para o português).
Fonte: www.cdc.gov/dpdx/leishmaniasis/index.html
Recentemente, Warburg e colaboradores (1994) observaram que em países da América do Sul, como Colômbia e Brasil, L. chagasi transmitido pela fêmea do flebotomíneo L. longipalpis, geralmente causa a leishmaniose visceral, enquanto que na América Central, mais especificamente em Costa Rica, L. chagasi produz leishmaniose cutânea atípica. Eles evidenciaram que a variabilidade no curso da infecção pode ser atribuída a diferenças na composição da substância salivar indutora de eritema (maxidilan), secretada no momento da hematofagia por flebotomíneos L. longipalpis da América do Sul e Central. O peptídeo maxidilan de populações de L. longipalpis encontradas no Brasil e Colômbia é mais potente e está em maior quantidade exacerbando a infecção cutânea menor, causando a leishmaniose visceral. Já nas populações de L. longipalpis da Costa Rica, o maxidilan apresenta pouca quantidade e baixa atividade vasodilatadora, portanto, o parasito não visceraliza permanecendo na pele. Frente a esses achados foi sugerido que L. longipalpis representa um complexo de espécies cuja a capacidade vetorial de seus integrantes diferem, com efeito de modular a patologia da enfermidade que transmitem (WARBURG et al., 1994).
2.4 FLEBOTOMÍNEOS VETORES
No Brasil, segundo atualizações do Ministério da Saúde (2010), as espécies com maiores competências vetoriais de LTA são: Lutzomyia flaviscutellata, Lutzomyia whitmani, Lutzomyia umbratilis, Lutzomyia intermedia e Lutzomyia migonei. Outras espécies como Lutzomyia neivai e Lutzomyia fisheri são frequentemente encontradas em áreas endêmicas, porém ainda não são incriminadas na transmissão do parasito (BRASIL, 2010). Até o momento, as espécies de flebotomíneos L. longipalpis e L. cruzi estão relacionadas com a transmissão de LV, sendo essa última recentemente incriminada no estado do Mato Grosso do Sul (MISSAWA et al., 2011). Rangel e Lainson (2003) afirmam que, no Brasil, 19 espécies são suspeitas ou incriminadas de transmitir Leishmania spp. e capazes de infectar humanos.
L. longipalpis, apresenta ampla distribuição geográfica, abrangendo as Américas Central e do Sul (FORATTINI, 1973; LAINSON; RANGEL, 2005). No Brasil, este flebotomíneo apresenta ampla distribuição geográfica, sendo registrado em todas as regiões político-administrativas, incluindo 21 estados (BRASIL, 2003).
Este vetor apresenta atividade, tanto intradomiciliar como extradomiciliar, ressaltando sua capacidade de adaptação aos ambientes antrópicos (DEANE; DEANE, 1957; DE SOUZA et al., 1981; RESENDE et al., 2006; DIAS et al., 2007). Esta adaptação é fruto de sua habilidade de se alimentar tanto de animais domésticos como de animais sinantrópicos (DEANE; DEANE, 1957; FORATTINI, 1973; RANGEL; LAINSON, 2003; BARATA et al., 2005) e, juntamente de sua antropofilia, favorece a manutenção e transmissão da doença em ambientes modificados (CONCEIÇÃO-SILVA; ALVES, 2014). É evidente a importância de tais fatores para a saúde pública, somado aos impactos gerados pelas alterações ambientais, determinadas principalmente pelas ações humanas, uma vez que podem influenciar no padrão epidemiológico da LVA (DESJEUX, 2004; NUNES et al., 2008; MARZOCHI et al., 2009).
Segundo Barata e colaboradores (2005), L. longipalpis é uma espécie oportunista, pois realiza o repasto sanguíneo em diversas espécies de vertebrados. Vale ressaltar tais aspectos, uma vez que a LVA já é abordada como uma doença com forte tendência a urbanização (DESJEUX, 2004; COSTA, 2008; FRANCA-SILVA et al., 2005, MARZOCHI et al., 2009), por conta dos achados em áreas urbanas (DE OLIVEIRA; FALCAO; BRAZIL, 2000;
FRANCA-SILVA et al., 2005; RANGEL; VILELA, 2008; SANTOS; FERREIRA; BISETTO JUNIOR, 2012).
Os indivíduos adultos são de porte médio em relação a outras espécies de flebotomíneos e de tonalidade castanho amarronzada. A espermateca das fêmeas possui corpo
anelado, embora não tão evidente, no qual podem ser contados aproximadamente 10 anéis e seus dutos são longos e estreitos (Figura 2). Já os machos possuem espinhos geniculados bem característicos da espécie, além de um tufo basal de 4 cerdas longas e delgadas no basistilo, enquanto que o dististilo é dotado de 4 espinhos desenvolvidos e anexados em posições diferentes; o parâmero apresenta parte distal triangular com várias cerdas, com pequenas cerdas enfileiradas na parte inferior do parâmero; o lobo lateral é simples e mais longo que o basistilo; a bomba ejaculadora apresenta extremidades simples e afiladas e três vezes mais longas que as mesmas (FORATTINI, 1973; YOUNG; DURAN, 1994), (Figura 3).
Fonte: http://www.scielo.br/pdf/paz/v51n27/01.pdf .(SHIMABUKURO et al., 2011)
Os machos de L. longipalpis podem apresentar dois fenótipos distintos de acordo com manchas nos tergitos abdominais, um deles com presença de um par de manchas claras no 4º tergito e o outro com um par adicional de manchas claras no 3º tergito. O primeiro registro dessa característica foi descrito por Mangabeira (1969) no Nordeste do Brasil.
As duas formas apresentam distribuição variada, sendo a forma 1M com distribuição mais ampla, do sul do México ao norte da Argentina (LANZARO et al., 1993; YOUNG e DUNCAN, 1994), enquanto que a forma 2M apresenta uma distribuição mais restrita, sendo encontrada apenas na Bolívia, Paraguai e algumas localidades do Brasil (WARD et al., 1983;
DUJARDIN et al., 1997; BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; ARAKI et al., 2009;
ARAKI et al., 2013).
2.5 COMPLEXO L. longipalpis
A evidência da formação de híbridos ou acasalamentos não aleatórios, consequência do processo de diferenciação genética (MAINGON et al., 2008), parece existir com populações de L. longipalpis. Costa Rica, Colômbia e Brasil produzem machos híbridos (LANZARO et al., 1993). A seleção sexual também já é registrada entre populações que vivem em simpatria, como as de Sobral (CE), nas quais fêmeas reconhecem feromônios e
Figura 2. Espermateca feminina de L. longipalpis.
Figura 3. Terminália genital masculiana de L. longipalpis.
sons de corte, produzidos especificamente pelo sexo oposto, dados esses concordantes com o padrão de manchas nos tergitos dos machos (WARD et al., 1988; HAMILTON; DAWSON;
PICKETT, 1996; SOUZA et al., 2004; HAMILTON et al., 2005). A participação dos feromônios e sons de corte é forte no processo de seleção sexual, agindo como barreira reprodutiva (BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; BOTTECCHIA et al., 2004;
WATTS et al., 2005; MAINGON et al., 2008), na escolha dos parceiros no momento do acasalamento (JONES; HAMILTON, 1998). Apesar dos fortes indícios de fluxo gênico e introgressão em populações simpátricas, como é o caso de populações de Sobral (CE) (ARAKI et al., 2013), há evidências de que o isolamento reprodutivo entre tais populações é mais forte do que entre irmãs alopátricas do complexo L. longipalpis (WARD et al., 1983;
SOUZA et al., 2008).
Considerando somente os dados de manchas – 1M para machos com uma mancha clara no 4º tergito e 2M para machos com duas manchas claras (3º e 4º tergito) – Ward e colaboradores (1983) induziram o cruzamento entre os esses dois grupos, de populações alopátricas (Morada Nova, Lapinha e Marajó) e simpátricas (Sobral - CE) do Brasil, nos quais a inseminação falhou para praticamente todos eles. Observou-se também esse insucesso em machos alopátricos com padrão igual de manchas, indicando o isolamento reprodutivo e consequentemente a existência do complexo (WARD et al., 1983). Ainda é clara a falta de consenso a respeito da existência ou não do complexo. Alguns autores apontam tal fato como fruto da recente ou incompleta separação dessas populações, permanecendo ainda características genéticas do ancestral comum (WARD et al., 1983; BAUZER et al., 2002a;
ARAKI et al., 2009). Além disso, a introgressão genética também é apontada, tanto em L.
longipalpis, como em outros flebotomíneos (BAUZER et al., 2002b; MAZZONI et al., 2008;
ARAKI et al., 2009; ARAKI et al., 2013), levando ao atual mosaico genético encontrado na literatura científica.Os estudos apontam para a existência de dois grupos principais dentro das populações brasileiras de L. longipalpis. De acordo com características moleculares e químicas, o primeiro grupo é constituído de um complexo morfologicamente semelhante, mas vivem em alopatria (LANZARO et al., 1993; MUTEBI et al., 1998; BAUZER et al., 2002a).
Este forma um grupo mais homogênico que apresenta som de corte (“love song”) do tipo explosão (“brust-type) e produção de um mesmo feromônio, C20. Já o segundo grupo é mais heterogêneo e interessantemente, ocorre em simpatria. Tal grupo apresenta padrões de sons de corte variáveis, em pulso (“Pulse-type”), além de apresentarem composição de diferentes feromônios C16 ( Figura 4 ), (SOUZA et al., 2004; ARAKI et al., 2009).
Figura 4 - Resumo das informações disponíveis sobre diferentes sons de corte e principais tipos de feromônios produzidos por 14 populações de L. longipalpis do Brasil (ARAKI et al., 2009).
No Brasil, apesar das diferenças apresentadas entre os marcadores genéticos (URIBE, 1999; SOARES; TURCO, 2003; BAUZER et al., 2007; ARAKI et al., 2013), alguns estudos apontam, de acordo com análises mais amplas através de características fenotípicas, comportamentais e genéticas, que existem espécies crípticas, simpátricas ou alopátricas, em diferentes processos de diferenciação (WARD et al., 1983; LANZARO et al., 1993;
BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; MAINGON et al., 2003; ARAKI et al., 2009;
LINS et al., 2012; ARAKI et al., 2013).
Marcadores moleculares estudados em L. longipalpis voltam-se principalmente para a questão do complexo de espécies. Incluem estudos que vão desde bandeamento cromossômico (YIN et al., 1999), polimorfismo em gens de especiação (MAZZONI et al., 2002; BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; ARAKI et al., 2009; ARAKI et al., 2013) e expressão gênica (MCCARTHY et al., 2013).
Dentre vários marcadores, os apontados como mais confiáveis para o estudo de populações de L. longipalpis são, segundo Araki e colaboradores (2013), per, para, up e sec22. Um bom marcador molecular precisa ser capaz de diferenciar duas espécies simpátricas (Ex: Sobral 1M vs Sobral 2M) e não necessariamente um que é capaz de distinguir duas espécies alopátricas (Ex: Lapinha 1M vs Pancas1M), (ARAKI et al., 2013).
3 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA
Este foi o primeiro estudo destinado a analisar variações fenotípicas a partir de populações de L. longipalpis provenientes da Restinga da Marambaia, município de Mangaratiba, Rio de Janeiro, e do bairro de Santo Antônio, município de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte, sendo de grande contribuição para a maior compreensão da epidemiologia da leishmaniose visceral em área de transmissão silenciosa e intensa dessa protozoose, respesctivamente. Além disso, fornecerá subsídios essenciais para análises comparadas a outras populações de L. longipalpis dentro de um complexo de espécies crípticas do Brasil, ainda desconhecidas.
4OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a ocorrência de populações do complexo Lutzomyia longipalpis na Restinga da Marambaia, Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro e no bairro de Santo Antônio, Município de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
I. Identificar populações do complexo Lutzomyia longipalpis provenientes da Restinga da Marambaia, município de Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro, através das características fenotípicas utilizando o padrão morfológico de 1 mancha (1M) e 2 manchas (2M) dos tergitos abdominais dos machos;
II. Identificar populações do complexo Lutzomyia longipalpis provenientes do bairro de Santo Antônio, município de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte, através das características fenotípicas utilizando o padrão morfológico de 1 mancha (1M) e 2 manchas (2M) dos tergitos abdominais dos machos;
III. Comparar os padrões fenotípicos encontrados nas duas áreas de estudo com os achados descritos na literatura.
5 MATERIAIS E MÉTODOS 5.1 TRABALHO DE CAMPO
5.1.1 Área de estudo: Restinga da Marambaia
A Restinga de Marambaia faz parte da Baía de Sepetiba, localizada no município de Mangaratiba (entre 23°04’S e 43°53’ W), ao litoral sul do estado do Rio de Janeiro (Figura 5).
Corresponde a uma Área de Proteção Ambiental (BRASIL, 2014), com clima tropical úmido e ecossistemas diversificados contíguos ao bioma Mata Atlântica, tais como: pântanos, restingas, dunas, praias e mangues. O pico da Marambaia é considerado o ponto culminante, atinge cerca de 647 metros de altura. O território possui 79 km² e uma estreita faixa de areia com 40 km de extensão o conecta ao continente. Embora a Restinga da Marambaia não seja cercada de água por todos os lados, recebe também a denominação de Ilha da Marambaia, por seu relevo e topografia característicos (CONDE et al., 2005; MATTOS, 2005; CARMO et al., 2013), por exemplo, durante a maré alta a extensa faixa de restinga torna-se inundada.
A região é administrada pelas Forças Armadas do Brasil e recebe militares de origem nacional e internacional para treinamentos, além de visitantes brasileiros de regiões endêmicas de leishmaniose. A Restinga da Marambaia ainda é habitada por remanescentes quilombolas. Alonso e colaboradores (2014) relataram a existência de 100 residências na região, distribuídas por oito praias, algumas junto à costa e outras próximas da mata. Há coleta de lixo, mas as condições sanitárias ainda não correspondem as ideais. No peridomicílio a maioria dos moradores locais possuem criações de animais para consumo. Os cães de estimação geralmente são deixados soltos e retornam as residências ao anoitecer, período de maior atividade dos flebotomíneos. Ademais, casos de leishmaniose visceral canina foram identificados em inqueritos sorológicos realizados na região (ALONSO et al., 2014; CARMO et al., 2013).
Figura 5 - Mapa da Costa Verde, litoral sul do estado do Rio de Janeiro, em destaque a Restinga da Marambaia, localizada no município de Mangaratiba.
5.1.2 Área de estudo: Mossoró
O município de Mossoró, está situado no estado do Rio Grande do Norte, mesorregião do Oeste Potiguar, sobre as seguintes coordenadas geográficas: Latitude 5º 11’ 15” Sul, e longitude: 37º 20’ 39” Oeste. Possui área de aproximadamente 2.110,21 km² e com altitude em relação a sede do município de 16 metros. Natal, a capital do estado, está distante cerca de 285 km do município de Mossoró. O tipo de clima é muito quente e semi-árido, com baixa precipitação pluviométrica, de aproximadamente 703.7mm/ano. Apresenta duas estações bem marcadas, cujo o período chuvoso ocorre de fevereiro a abril, seguido da estação seca, com Umidade Relativa Média Anual em torno de 70% (IDEMA, 2008).
Para a realização do estudo foi selecionada uma área com transmissão intensa para LVA, no município de Mossoró, seja ela: o bairro de Santo Antônio (Figura 2). Cabe ressaltar, que na localidade há soroprevalência de leishmaniose visceral canina (KAZIMOTO et al 2016).
Figura 6 - Mapa do município de Mossoró, em destaque o bairro de Santo Antônio.
5.2 CAPTURA DE FLEBOTOMÍNEOS, SELEÇÃO DE AMOSTRAS E IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA
As capturas foram realizadas entre o período de agosto de 2015 a agosto de 2016, totalizando 12 meses de captura em cada área de estudo. Para isso, armadilhas luminosas do tipo HP foram empregadas, iniciadas às 18 horas e encerradas às 7 horas do dia seguinte, totalizando 13 horas/coleta.
As armadilhas foram instaladas em pontos onde levantamentos entomológicos anteriores evidenciaram a presença de L. longipalpis e no peridomicílio das residências as quais inquéritos sorológicos caninos relataram a ocorrência de casos de leishmaniose visceral canina. No peridomicílio foram selecionados os locais mais propícios à proliferação dos flebotomíneos, como os abrigos de animais, principalmente galinheiros e canis.
Os insetos capturados foram entorpecidos com éter e em seguida foi realizada uma triagem para separar flebotomíneos de não flebotomíneos. Todos os flebotomíneos obtidos na triagem foram alocados em tubos plásticos contendo álcool a 70%, devidamente rotulados de acordo com o local de captura e enviados para o laboratório de entomologia do Instituto Nacional de Endemias Rurais (INERU/FIOCRUZ).
No laboratório, com o auxílio de uma lupa estereoscópica os flebotomíneos foram submetidos a uma segunda triagem para a separação de machos e fêmeas. Os machos obtidos foram montados em lâminas para a visualização dos caracteres morfológicos em microscópio óptico, e então identificados a nível de espécie de acordo com a nomenclatura proposta por Galati, 2003. Após a identificação taxonômica os espécimes machos de L. longipalpis foram separados para posterior caracterização fenotípica.
5.2.1 Caracterização fenotípica
A caracterização fenotípica dos machos de L. longipalpis provenientes das duas áreas de estudo, consistiu em identificar por meio de visualização em lupa estereoscópica o padrão morfológico de 1 mancha (1M) e ou de 2 manchas (2M) nos segmentos abdominais dos machos, de acordo com a metodologia proposta por Mangabeira (1969), incluindo os fenótipos intermediários descritos em estudo prévios (WARD et al., 1983; WARD et al., 1988; MUKHOPADHYAY et al., 1998; SOUZA et al., 2008).
6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada de forma descritiva.
7 ASPECTOS ÉTICOS
O presente estudo não necessita de aprovação pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) por se tratar de um estudo desenvolvido com insetos.
8 RESULTADOS
Os resultados e discussão dessa dissertação serão apresentados em formato de artigo científico submetido para publicação na Revista Acta Amazônica.
8.1 ARTIGO
Investigação de populações do complexo Lutzomyia longipalpis em Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro e Mossoró, estado do Rio Grande do Norte.
Autores: Tavares-Pinheiro, J. ¹*; De Souza, M. B.²; Amora, S. S. A.³; Kazimoto, T. A.³;
Figueiredo, F. B 4.
¹Programa de Pós-Graduação em Saúde Pública- ENSP/ Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil;
²Escola Nacional de Saúde Pública Sérgio Arouca- ENSP/ Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil;
³Programa de Pós-Graduação em Ambiente, Tecnologia e Sociedade – Universidade Federal Rural do Semi- Árido, Mossoró, RN, Brazil;
4 Laboratório de Biologia Celular, Instituto Carlos Chagas/Fiocruz, Curitiba, PR, Brazil.
*Corresponding author: Tel.:(+5521) 3865-9536
E-mail address: julianalongipalpis@gmail.com (Tavares-Pinheiro, J).
Resumo
Lutzomyia longipalpis lato sensu (l.s) é considerado o principal vetor de Leishmania chagasi, agente etiológico causador da leishmaniose visceral nas Américas. Durante estudos pioneiros no nordeste Brasil, Mangabeira (1969) observou variações fenotípicas entre machos de L. longipalpis que coexistiam em simpatria em Sobral no Ceará, e sugeriu que poderiam se tratar de espécies distintas. Desde então a maioria dos estudos destinados a esclarecer o verdadeiro status taxonômico de L. longipalpis, apontam para a existência de um complexo de espécies incipiente, embora o número de integrantes e suas áreas de distribuição ainda não estejam totalmente resolvidos. Recentemente, estudos tem correlacionado variabilidade genética a padrões fenotípicos distintos. Essas diferenças são de grande importância para a saúde pública, não somente pela possibilidade de influenciarem na capacidade vetorial desses flebotomíneos, mas também de sua antropofilia. O presente estudo teve como objetivo analisar as características fenotípicas das populações de machos de L. longipalpis provenientes da Restinga da Marambaia, município de Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro e do bairro de Santo Antônio, localizado no município de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte, região semi-árida do nordeste brasileiro. As capturas foram realizadas durante o período de 12 meses. Armadilhas do tipo HP foram empregadas, iniciadas às 18 horas e encerradas às 7 horas do dia seguinte, totalizando 13 horas/coleta. Os flebotomíneos machos capturados foram identificados a nível de espécie de acordo com a nomenclatura proposta por Galati (2003) e, em seguida, os machos de L. longipalpis obtidos submetidos à caracterização fenotípica. Todos os machos de L. longipalpis provenientes da Restinga da Marambaia apresentaram o padrão morfológico de uma mancha clara no 4º tergito abdominal, morfotipo predominante também em outras áreas do Rio de Janeiro. No bairro de Santo Antônio, município de Mossoró, identificamos significativa diversidade fenotípica, composta por machos que apresentaram o padrão morfológico de uma mancha clara no 4º tergito abdominal, enquanto outros apresentaram o padrão morfológico de 2 manchas claras no 3º e no 4º tergito, além do encontro de um fenótipo intermediário representado por machos com uma mancha clara no 4º tergito e 3/4 do 3º tergito preenchido pela mancha clara. Na última região variedades morfológicas parecem apresentar importância vetorial com fortes consequências epidemiológicas, tendo em vista a maior incidência da leishmaniose visceral na região nordeste do Brasil, sobretudo no Estado do Rio Grande do Norte.
Palavras-chave: Lutzomyia longipalpis lato sensu, complexo Lutzomyia longipalpis, caracterização fenotípica.
Abstract
Lutzomyia longipalpis lato sensu (l.s) is considered the main vector of Leishmania chagasi, an etiological agent that causes visceral leishmaniasis in the Americas. During pioneering studies in northeast Brazil, Mangabeira (1969) observed phenotypic variations among males of L. longipalpis that coexisted in sympatry in Sobral, Ceará, and suggested that they could be different species. Since then, most of the studies aimed at clarifying the true taxonomic status of L. longipalpis point to the existence of an incipient species complex, although the number of members and their areas of distribution are still not fully resolved. Recently, studies have correlated genetic variability to distinct phenotypic patterns. These differences are of great importance for public health, not only for the possibility of influencing the vectorial capacity of these sandflies, but also for their anthropophilia. The present study had the objective of analyzing the phenotypic characteristics of the L. longipalpis males populations from Restinga da Marambaia, Mangaratiba municipality, Rio de Janeiro State and Santo Antônio neighborhood, located in the municipality of Mossoró, state of Rio Grande do Norte, semi-arid region of Northeast Brazil. Catches were taken during the 12- month period. HP- type traps were employed, starting at 6 pm and ending at 7 pm the following day, totaling 13 hours / collection. The captured male sandflies were identified at species level according to the nomenclature proposed by Galati (2003) and then the males of L. longipalpis obtained submitted to the phenotypic characterization. All males of L.
longipalpis from the Restinga da Marambaia presented the morphological pattern of a pale spot in the 4th abdominal tergite, a predominant morphotype in other areas of Rio de Janeiro. In the Santo Antônio neighborhood, Mossoró municipality, we identified a significant phenotypic diversity composed by males that presented the morphological pattern of a pale spot in the 4th abdominal tergite, while others presented the morphological pattern of 2 pale spots completely filled in the 3rd and 4th tergite, In addition to the finding of an intermediate phenotype represented by males with a single solid spot in the 4th tergite and 3/4 of the 3rd tergite filled by the light spot. In the latter region, morphological varieties seem to present vectorial importance with strong epidemiological consequences, due to the higher incidence of visceral leishmaniasis in northeastern Brazil, especially in the State of Rio Grande do Norte.
Key words: Lutzomyia longipalpis lato sensu, Lutzomyia longipalpis complex, phenotypic characterization.
INTRODUÇÃO
Lutzomyia longipalpis lato sensu (l.s) é considerado o principal vetor envolvido no ciclo de transmissão de L. chagasi, agente etiológico causador da LVA. Durante estudos pioneiros no Nordeste do Brasil, Mangabeira (1969) observou variações fenotípicas entre machos de populações simpátricas de L. longipalpis em Sobral, no estado do Ceará e alopátricas no estado do Pará. Foi identificada a existência de dois fenótipos distintos, compostos por machos com uma mancha clara no IV segmento abdominal (1M), enquanto outros apresentavam duas manchas claras, uma no III e outra no IV segmento abdominal (2M). O mesmo também observou que em Sobral, apesar de coexistirem em simpatria, essas populações estavam dispostas em ambientes com características ecológicas distintas.
Com base nesses indícios, sugeriu que poderiam se tratar de espécies distintas (MANGABEIRA, 1969). Tais achados impulsionaram o desenvolvimento de novas pesquisas, no sentido de solucionar a questão enigmática posta em debate, que ainda hoje pretende responder se as populações de L. longipalpis, de diferentes regiões geográficas do Brasil, correspondem a uma única espécie ou a um complexo de espécies a ser investigado (BAUZER et al., 2007).
A evidência da formação de híbridos ou acasalamentos não aleatórios, consequência do processo de diferenciação genética (MAINGON et al., 2008), parece existir com populações de L. longipalpis. Costa Rica, Colômbia e Brasil produzem machos híbridos (LANZARO et al., 1993). A seleção sexual também já é registrada entre populações que vivem em simpatria, como as de Sobral (CE), nas quais fêmeas reconhecem feromônios e sons de corte, produzidos especificamente pelo sexo oposto, dados esses concordantes com o padrão de manchas nos tergitos dos machos (WARD et al., 1988; HAMILTON;
DAWSON; PICKETT, 1996; SOUZA et al., 2004; HAMILTON et al., 2005). A participação dos feromônios e sons de corte é forte no processo de seleção sexual, agindo como barreira reprodutiva (BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; BOTTECCHIA et al., 2004; WATTS et al., 2005; MAINGON et al., 2008), na escolha dos parceiros no momento do acasalamento (JONES; HAMILTON, 1998).
No Brasil, apesar das diferenças apresentadas entre os marcadores genéticos (URIBE, 1999; SOARES; TURCO, 2003; BAUZER et al., 2007; ARAKI et al., 2013), alguns estudos apontam, de acordo com análises mais amplas através de características fenotípicas, comportamentais e genéticas, que existem espécies crípticas, simpátricas ou alopátricas, em diferentes processos de diferenciação (WARD et al., 1983; LANZARO et al., 1993; BAUZER et al., 2002a; BAUZER et al., 2002b; MAINGON et al., 2003; ARAKI et al., 2009; LINS et al., 2012; ARAKI et al., 2013).
Lutzomyia longipalpis (l.s), possui extensa distribuição geográfica no Brasil, entretanto, em áreas focalizadas e de forma descontinua (YOUNG; DURAN, 1994). Esse cenário muito se deve a existência de barreiras geográficas, climáticas e ao curto raio de vôo do vetor (ALEXANDER et al., 1998), sendo o isolamento por distância condição reconhecida por reduzir o fluxo gênico entre as populações, atuando em processos de especiação (BAUZER et al., 2007). Nessa perspectiva, a variabilidade genética observada entre populações de L. longipalpis pode estar relacionada aos processos de deriva gênica e seleção natural, eventos graduais na escala espaço-temporal que possivelmente exercem influências sob a capacidade vetorial desses flebotomíneos, tendo fortes consequências na
