HOZANA ANDRADE CASTILLO
ANÁLISE DA MIGRAÇÃO E DISTRIBUIÇÃO DE MELANOBLASTOS NA PELE DE EMBRIÕES DA AVE · SEDOSA JAPONESA DE
PLUMAGEM BRANCA
Monografia apresentada à disciplina Estágio I e 11 em Biologia Celular, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas da Universidade Federal do Paraná Orientadora: Prof a Claudia Feijó Ortolani-
Machado
CURITIBA
2003
• À Deus pela graça da vida e por todas as oportunidades que colocou em meu caminho.
• Aos meus pais por tudo o que sou hoje e pelo apoio moral e financeiro, sem os quais não chegaria onde estou.
• Ao meu namorado Fabiano por todo o companheirismo e amor dedicados a , mim nos últimos dois anos, além do apoio na elaboração das pranchas.
• À professora Cloris pela orientação, carinho e incentivo durante os últimos três anos.
• Àprofessora Claudia pela orientação, pelas noites mal dormidas e pela dedicação ao trabalho.
• A todos os· meus parehtes e amIgos de Campo Grande, .que mesmo à distância foram fundamentais na minha vida todos esses anos, e que me deram suporte nos momentos de fraqueza e incentivo para lutar.
• Aos amigos da graduação Anousca, Mônica, Zé, Fábio, Vítor, Ju e Vanessa pelo apoio nos momentos difíceis e pela presença nos momentos -de alegria, ..
sendo somente em parte ou -durante todo o curso.
• À dona Reinildes, dona Mari e seu Sérgio por terem sido um pouco "meus pais" durante esses anos longe da minha família.
• Aos professores· do programa de graduação por terem me proporcionado uma excelente formação.
• Aos funcionários do Setor de Ciências . Biológicas pelos serviços prestados, imprescindíveis na minha vida acadêmica, especialmente·
àRô, ao seu - Sebastião e à Geri.
• Aos colegas da graduação e todos que de uma forma ou· de outra estiveram ao meu lado durante esses quatro anos e meio.
11
sUMÁRIo
LISTA DE FIGURAS _ _ _ _ .,.--_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
lVRESUMO _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Vl1.
WTRODUÇÃO _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ l
2. OBJETIVOS 8
3. MATERIAL E MÉTODOS 9
3.1. OBTENÇÃO DO MATERIAL ... 9
3.2. FIXAÇÃO ...•...
~... 10
3.3. WCLUSÃO E MICROTOMIA ... 11
3.4. IMUNOCITOQUÍMICA ... 11
3.5. MONTAGEM ... 12 4. RESULTADOS _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 13
.,:
5. FIGURAS 14
6. DISCUSSÃO 19
7. CONCLUSÕES 22
8. REFERÊNCIAS BffiLIOGRÁFICAS 23
111
FIGURA 1 - FOTO DE EMBRIÃO EM NEURULAÇÃO ... 2 FIGURA 2 - ESQUEMA DE EMBRIÃO EM NEURULAÇÃO ... 2 FIGURA 3 - ESQUEMA DAS VIAS DE MIGRAÇÃO DAS CÉLULAS DA CRISTA
NEURAL NA REGIÃO DO TRONCO ...
.4FIGURA 4 - FOTO DE EMBRIÃO DE GALINHA NO ESTÁGIO 20 DE
DESENVOL VIMENTO ... 1 O FIGURA 5 - FOTO DE EMBRIÃO DE GALINHA NO ESTÁGIO 22 DE
DESENVOLVIMENTO ... 10 FIGURA 6 FOTO DE EMBRIÃO DE GALINHA NO ESTÁGIO 24 DE
DESENVOLVIMENTO ... 10 FIGURA 7 - FOTO DE EMBRIÃO DE GALINHA NO ESTÁGIO 38 DE
DESENVOL VIMENTO ... 10 FIGURA 8 - FOTO DE EMBRIÃO DE GALINHA NO ESTÁGIO 40 DE
DESENVOLVIMENTO ... 1 O
""
FIGURA 9 - FOTO DA PELE DA REGIÃO DORSAL ENTRE AS ASAS
DISTENDIDA EM PLACA DE DISSECÇÃO ... 11 FIGURA 10 - MELANOBLASTO NA ECTODERME DO EMBRIÃO DE SJB NO
ESTÁGIO 22 ... 15 FIGURA 11 - MELANOBLASTO NA ECTODERME DO EMBRIÃO DE SJB NO
ESTÁGIO 24 ... 15 FIGURA 12A - MELANOBLASTOS NAS VIAS DORSOLATERAL E VENTRAL
DE MIGRAÇÃO NA REGIÃO DO TRONCO DE EMBRIÕES DE SJB NO ESTÁGIO 24 ... : ... 16 FIGURA 12B- MELANOBbASTOS POSICIONADOS DORSALMENTE AO
TUBO NEURAL EM EMBRIÕES DE SJB NO ESTÁGIO 24 ... .16
IV
FIGURA 13 - MELANOBLASTOS NA EPIDERME E NA DERME DA PELE DE EMBRIÃO DE SJB COM 12 DIAS DE DESENVOL VIMENTO ... 17 FIGURA 14- MELANOBLASTOS NA EPIDERME E NA DERME DA PELE DE EMBRIÃO DE SJB COM 14 DIAS DE DESENVOLVIMENTO ... 17 FIGURA 15- MELANOBLASTOS NA PELE E PENA DE EMBRIÃO DE SJB COM 12 DIAS DE DESENVOLVIMENTO ... 18 - FIGURA 16 - MELANOBLASTOS NA PELE E PENA DE EMBRIÃO DE SJB
COM 14 DIAS DE DESENVOLVIMENTO ... 18
v
As células pigmentares têm origem na crista neural, que se forma no estágio de neurulação. Na região do tronco, as células da crista neural migram inicialmente pela via ventral, entre o somito e o tubo neural, dando origem aos neurônios e células da glia.
Aproximadamente um dia depois, migram pela via dorso lateral, entre a ectoderme e o somito, atingindo regiões periféricas do embrião e povoando a pele, onde se diferenciam em melanócitos (células pigmentares). Em embriões da galinha Sedosa Japonesa de plumagem branca (SJB) os melanoblastos, precursores dos melanócitos, além de migrarem dorsolateralmente, também migram ventralmente, o que faz com que a derme e alguns órgãos internos dessa ave sejam pigmentados, apesar de suas penas serem despigmentadas. Com o objetivo de determinar o estágio de desenvolvimento embrionário em que os melanoblastos penetram na ectoderme do embrião da galinha SJB e verificar se essas células ainda estão presentes na pele e penas de embriões de 12 e 14 dias de desenvolvimento, procedeu-se a análise imunocitoquímica em cortes da região do tronco de embriões nos estágios (ST) 20, 22, 24, 38 (12 dias) e 40 (14 dias) utilizando o soro Smyth
fine,um marcador para melanoblastos em estágios iniciais de mel ano gênese. Os melanoblastos penetram na ectoderme no ST 22 e ainda estão presentes na epiderme e derme tanto da pele quanto da pena aos 12e 14 dias de desenvolvimento. Não se conhece ainda o destino dos melanoblastos da epiderme da pele, uma vez que não dão origem a melanócitos nesse tecido. Talvez estas células migrem para povoar as penas e somente lá sofrerem diferenciação, ou talvez, o fator de sobrevivência dessas células não esteja presente na epiderme da pele, causando seu
desaparecimento.
~VI
1. INTRODUÇÃO
Os primeiros estudos com embriões de galinha reportam do século N a.c., quando Aristóteles realizou estudos bem fundamentados sobre o desenvolvimento de embriões de galinhas e outras aves, que serviram de base para estudos posteriores. Contudo, no século V a.C., Hipócrates já dizia aos romanos: "Tome 20 ou mais ovos e deixe-os serem incubados por duas ou mais galinhas. Então, a cada dia, a partir do segundo até aquele da eclosão, remova um ovo, quebre-o e examine-o. Você encontrará exatamente como eu digo, pois a natureza da ave pode ser comparada à do homem" (GARCIA et aI., 1991).
Desde então este modelo animal tem sido muito utilizado. Um dos motivos é a facilidade de se obter o embrião e manipulá-lo, uma vez que não se desenvolve dentro do corpo da mãe, como os mamíferos. Outro fator é o sistema imunológico, que se desenvolve somente em estágios tardios, possibilitando a introdução de substâncias estranhas no embrião, que sobrevive até a eclosão, permitindo o desenvolvimento de vários experimentos.
No momento da postura do ovo, o embrião de galinha já sofreu algumas clivagens
(divisões celulares) e encontra-se em um estágio chamado blastoderma ou blastodisco. O
processo de gastrulação estabelece um embrião com uma camada de endoderme interna,
uma camada de mesoderme intermediária e uma ectoderme externa. Interações entre a
mesoderme e a ectoderme posicionada acima dela, fazem com que o processo de
neurulação tenha início. Durante a neurulação (figuras 1 e 2 ), ocorre a formação do tubo
neural, órgão rudimentar que dará origem ao sistema nervoso central. A região mais
dorsal do tubo neural que está se fechando é chamada de crista neural.
Figura 1 - FOTO DE EMBRIAO EM NEURULAÇÃO
(Fonte: Gilbert, 2003)
Figura 2 - ESQUEMA DE EMBRIAO EM NEURULAÇÃO
(Fonte: WOLPERT elal., 2(00)
prega neural
fenda
Embora derivada da ectoderme, a crista neural algumas vezes tem sido chamada de
quarto folheto embrionário, devido
àsua importância (GILBERT, 2003). A crista neural
dos vertebrados é formada por uma população transiente de células. Assim que o tubo
neural se fecha, as células da crista destacam-se da porção dorsal do tubo e se dispersam,
sendo morfologicamente indistinguíveis umas das outras e capazes de dar origem a
muitos tipos celulares, como neurônios e células da glia dos sistemas nervosos sensorial,
simpático e parassimpático; células produtoras de epinefrina da glândula adrenal
(medula); as células pigmentares da epiderme; e muito dos tecidos esqueléticos e
conjuntivos que compõem a face e parte do pescoço (GILBERT, 2003).
3
Segundo BRONNER-FRASER (2002), durante a neurulação, as células que darão origem à crista neural são localizadas na fronteira entre a placa neural/tubo neural e a ectodenne e a interação entre essas duas populações de células é responsável pela fonnação da crista neural. Neste local ocorrem altos níveis de BMPs (Bone Morphogenic Proteins) e Wnt6, que parecem causar a expressão de fatores de transcrição particulares naquelas células que vão se tornar a crista neural (KOS et aI., 2001; GARCIA-CASTRO et aI., 2002).
A crista neural pode ser dividida nas seguintes regiões, cada uma com derivados e funções característicos: crista neural cefálica (ou cranial) => as células migram para os arcos faríngeos para formar ossos e cartilagem da face e do pescoço; crista neural vagaI (aproximadamente somitos 1-7) e sacral (posterior ao somito 28) => formam os nervos parassimpáticos do intestino; a crista neural cardíaca (aproximadamentesomito 1-3) =>
tem um papel crítico na divisão entre a aorta e a artéria pulmonar e a crista neural do tronco (somito 6 até o final) => origina os neurônios simpáticos e as células pigmentares (melanócitos) e
umgrupo de células dessa crista fonnam a medula da glândula adrenal (GILBERT, 2003).
Existem pelo menos dois modelos para explicar como se dá a diferenciação das células da crista neural. No primeiro, acredita-se que as células da crista neural são pluripotentes, migram aleatoriamente em várias vias de migração, e uma vez nessas vias encontram sinais do meio que as direcionam para sua diferenciação. Um segundo modelo propõe que as células da crista neural estão especificadas (ou condicionalmente especificadas) antes de entrarem numa via de migração particular, e é essa especificação que indica em qual via de migração a célula deve entrar (HENION e WESTON, 1997;
REEDY et aI., 1998; F ARACO et aI., 2001).
HENION e WESTON (1997) sugerem que as células neurogênicas e
melanogênicas, sub linhagens de células da crista neural, já estão bastante especificadas
antes do início da migração, resultando em padrões temporais e espaciais distintos de
migração e localização no embrião. Já LE DOUARIN (1999) afirma que o padrão de
fonnação das células pigmentares parece ser uma interação entre as células derivadas da crista neural e as influências do meio, como os fatores de crescimento e sobrevivência e componentes da matriz extracelular.
Figura 3 - ESQUEMA DAS VIAS DE MIGRAÇAO DAS CELULAS DA CRISTA NEURAL NA REGIÃO 00 TRONCO (Fonte: GILBERT, 2(03)
... ,
Dmo=_~---
As células da crista neural seguem caminhos precisos durante sua migração. Na
região do tronco, a migração destas células se dá por dois caminhos, um ventral e outro
dorsolateral (ERICKSON, 1985), como pode ser visto na figura 3. A migração das células
da crista neural ocorre em onda antero-posterior (ERICKSON et aI., 1992). A migração
no início ocorre ventralmente, entre o tubo neural e o somito, sendo que essas células
diferenciam-se em neurônios e células da glia do Sistema Nervoso Periférico, além de
células secretoras da medula adrenaI. Aproximadamente 24h depois, quando a migração
ventral termina, as células da crista neural invadem a via dorso lateral entre a ectoderme e
os somitos, percorrida por células que se diferenciam em células pigmentares da pele
(SERBEDZIJA et aI., 1989, ERICKSON e GOINS, 1995). Esse atraso de cerca de 24h
entre o início da migração na via ventral e o início da migração na via dorso lateral se deve
a um atraso da emigração das células da crista neural melanogênicas do tubo neural. Os
estudos que indicam esse fato mostram que a especificação dos melanoblastos precede a
5
migração dórsolateral e apenas melanoblastos migram por esta via -em estágios maIS adiantados, o que sugere que a especificação dos melanoblastos é um pré-requisito para a migração dorsolateral (REEDY et aI., 1998).
Os melanoblastos são os precursores dos melanócitos e na região do tronco do embrião apenas essas células seguem a via dorsolateral de migração. Antes da migração, esses progenitores das células pigmentares proliferam e acumulam-se próximos
à regiãodorsal do tubo neural, chamada
staging area(WESTON, 1991; BEAUV AIS-JOUNEAU et aI., 1999). Segundo LE DOUARIN (1999), a crista neural da região do tronco tem uma maior capacidade de produzir melanócitos que a crista cefálica, pois a partir da crista do tronco migram mais melanoblastos, dado este detectado através de experimentos de cultivo celular e transplante de partes da crista neural de codorna para embriões de galinha da raça Leghorn Branca.
Segundo HULLEY e colaboradores (1991 ), em embriões de galinha, os melanoblastos deixam a crista neural entre 50h e 55h de incubação e se espalham no mesênquima sub-dérmico por 2 a 3 dias. A partir do 50 dia de desenvolvimento embrionário, pode-se encontrar melanização na derme, enquanto a melanização da epiderme começa predominantemente no 60 dia de desenvolvimento embrionário.
Contudo, no 100 dia de desenvolvimento os melanócitos encontram-se somente na epiderme, o que indica que apesar da derme possuir o(s) sinal(is) para a diferenciação do melanócito, a derme parece ser incapaz de mantê-los após o 80 dia de desenvolvimento.
F ARACO e colaboradores (2001) investigaram o padrão de migração dos melanoblastos em embriões da raça Sedosa Japonesa, na qual células pigmentares não são apenas encontradas na pele, mas também nos tecidos conjuntivos, mesentério, peritônio e nas meninges do cérebro e da coluna vertebral, sendo que pele, mesentério e vísceras são bastante pigmentados, com coloração preto-azulado. No estudo usaram soro de galinha
Smyth fine,que marca melanoblastos antes da produção de melanina. REEDY e colaboradores (1998) detectaram que os melanoblastos começam a emigrar do tubo
neu~alno estágio 18 e entram na via dorsolateral no estágio 20. Aproximadamente no estágio 22,
um pequenb número de melanoblastos penetra no esclerótomo e migra ventralmente.
F ARACO e colaboradores (2001) observaram que depois dos melanoblastos da galinha Sedosa preencherem o espaço dorsolateral, eles dispersam-se medialmente e acumulam-se em grande número ao redor da aorta dorsal, no mesoderma intermediário e no mesentério.
Também observaram que na pele dessa ave, aos 18 dias de desenvolvimento, os melanócitos estão amplamente distribuídos na derme e ausentes na epiderme, essa ausência também é detectada em aves com pigmentação normal.
A extensiva migração ventral e mediaI de células pigmentares na ave Sedosa Japonesa não é encontrada em aves com pigmentação normal. Estudos sugerem que isto ocorre devido a diferenças do ambiente interno da ave Sedosa Japonesa e das outras aves.
F ARA C O e colaboradores (2001) demonstraram que o padrão atípico de migração ventral tardio dos melanoblastos, e a migração mediaI do espaço dorsolateral nos embriões de Sedosa Japonesa estão relacionados com a perda de barreiras moleculares, que possivelmente restringem a migração dentro dessas regiões, detectado pela ausência de moléculas PNA-ligantes ( o PNA -Iectina aglutinina de amendoim- é um marcador para tecidos que agem como barreiras para a migração). Já os embriões com pigmentação e
..
·distribuição de melanócitos normais possuem essas moléculas nas vias usadas para melanoblastos em migração. Além disso, o acúmulo de melanoblastos na região ventral na Sedosa Japonesa é acentuado pela sua contínua proliferação, como mostrado pela incorporação de BrdU (um marcador de divisão celular) (FARACO et aI., 2001).
Segundo LE DOUARIN (1999), a diferenciação do melanócito, evidenciada pela
deposição do pigmento melanina, ocorre no 9° dia de desenvolvimento embrionário, em
galinha. Isso é precedido por um período em que os melanoblastos epidermais dos brotos
das penas em desenvolvimento se dividem ativamente. Apenas os melanoblastos
localizados na pena embrionária se diferenciam. Células da crista neural que povoaram a
epiderme entre os brotos das penas ou permaneceram na derme não adquirem pigmento
(LE DOUARIN, 1999). Porém, HULLEY e colaboradores (1991), no trabalho com
embriões das raças New Hampshire Red e Black Australorp detectaram melanização na
denne a partir do · 50 dia de desenvolvimento embrionário, enquanto a melanização na epidenne começa predominantemente no 6
- 0 dia de desenvolvimento embrionário, sugerindo que o início da melanogênese apresenta variações de acordo com a espécie.
Os melanoblastos penetram na ectoderme no estágio 22 (3 dias e meio de incubação) e posteriormente se diferenciam em melanócitos (ERICKSON et al., 1992).
Sendo a ectoderme o tecido germinativo formador da epiderme, essas células deveriam estar presentes na epidenne nos estágios de desenvolvimento posteriores. Estudos realizados em nosso laboratório mostraram que há melanócitos na polpa do broto e no epitélio da pena do embrião no estágio 38 (12 dias de incubação) da ave Sedosa Japonesa de plumagem branca, porém os mesmos não são observados na epiderme da pele (dados ainda não publicados).
No presente trabalho pretendemos investigar a migração dos melanoblastos e sua
invasão na ectoderme nos estágios 20, 22 e 24 (3 dias, 3 dias e meio e 4 dias de
incubação, respectivamente), e verificar se esta invasão se dá mais precocemente do que
já descrito. Além disso, procuraremos verificar se há melanoblastos na epiderme do
embrião da ave Sedosa Japonesa de
plumag~mbranca nos estágios 38 e 40 (12 e 14 dias
de incubação, respectivamente). Para detectar os melanoblastos, foi utilizado o soro de
galinhas Smyth
Une.Essas galinhas produzem um autoanticorpo contra a enzima
melanogênica tirosinase relacionada a proteína-l (TRP-l ),e marca especificamente
melanoblastos em estágios muito precoces de diferenciação (AUSTIN et aI., 1995).
2. OBJETIVOS
• Identificar, através da imunocitoquímica, a migração de melanoblastos e sua invasão na ectoderme de embriões da ave Sedosa Japonesa de plumagem branca nos estágios 20, 22 e 24 (3 dias, 3 dias e meio e 4 dias de incubação, respectivamente);
• Verificar a ocorrência de melanoblastos na epiderme do embrião
dessa ave nos estágios 38 e 40 (12 e 14 dias de incubação, respectivamente).
9
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. OBTENÇÃO DO MATERIAL
F oram utilizados ovos embrionados da galinha (Gallus gallus) da raça Sedosa Japonesa de plumagem branca, fornecidos pelo aviário do Setor de Ciências Biológicas, da Universidade Federal do Paraná.
Após higienização, os ovos foram colocados em incubadora, a temperatura de 38°C, com umidade e ventilação controladas, até atingirem os seguintes estágios de desenvolvimento (segundo HAMBURGER e HAMILTON, 1951):
• Estágio (ST) 20 (70-72 horas de incubação). Os brotos das patas são um pouco maiores que os das asas. Existem de 40 a 43 somitos (figura 4).
• Estágio 22 (três dias e meio de incubação). Os brotos dos membros estão alongados. Os somitos se estendem até o final do embrião (figura 5).
• Estágio 24 (quatro dias de incubação). Os brotos dos membros estão mais compridos que largos. A placa digital na asa ainda não está demarcada. A placa dos dedos no broto da pata está distinta (figura 6).
• Estágio 38 (12 dias de incubação). As pontas dos dedos apresentam uma cornificação no centro. As almofadas plantares estão bem desenvolvidas quando vistas de perfil (figura 7).
• Estágio 40 (14 dias de incubação). A cornificação dos dedos se estende da base até a porção exposta da unha. Toda a superfície plantar das falanges é coberta com papilas bem desenvolvidas (figura 8).
Dos embriões nos estágios 20, 22 e 24 foi dissecada a região do tronco e dos embriões nos estágios 38 e 40 foi recortado um pedaço da pele dorsal da região entre as asas (mesma região utilizada nos estágios anteriores).
Figura 4 - ST 20
20
Figura 7 - ST 38
3.2. FIXAÇÃO
Para a fIxação do material foi utilizado parafonnaldeído 4% diluído em PB S
(salina tamponada com fosfato). A região do tronco dos embriões nos estágios 20, 22 e 24
foi imersa no fIxador por 2h. A pele recortada da região dorsal entre as asas dos embriões
nos estágios 38 e 40 primeiramente foi distendida em uma placa de dissecção (figura 9) e,
então, imersa em solução fIxadora também por 2h. Após a fixação o material foi lavado
em PB S para retirar resíduos do fIxador.
Figura 9 - Pele da região dorsal entre as asas, distendida em placa de
dissecção
3.3. INCLUSÃO E MlCROTOMIA
11
o material foi imerso em sacarose 5% em PBS por 2h e, em seguida, colocado em sacarose 15% em PBS, durante a noite, a 4°C. No dia seguinte foi feita a embebição do material em gelatina 7,5% e sacarose 150/0 em PBS, a 37°C (em banho-maria), com cinco trocas de 50min, sendo que, na última, o material foi posicionado em molde plástico e depois congelado em nitrogênio líquido.
Os blocos obtidos foram cortados em criostato (-20°C) com espessura de
16Jlme os cortes coletados em lâminas gelatinizadas.
Aslâminas foram guardadas a -20°C até ser feita a imunocitoquímica.
3.4. IMUNOCITOQUÍMlCA
As lâminas foram retiradas do freezer e deixadas em temperatura ambiente por
15min. Depois foram colocadas em uma cuba de vidro com PBS por IOmin e lavadas comágua destilada durante 5min. Em seguida, foram lavadas em solução de PBS + Glicina
O,IM durante 10min (para bloquear autofluorescência) e foram lavadas em PBS durante
5min. Os sítios inespecíficos foram bloqueados incubando-se os cortes em solução de
soro albumina bovina (BSA) 1 % em PBS, durante 30min, a temperatura ambiente. A seguir, os cortes foram incubados como anticorpo primário Smyth Une (IgG) em PBS
+
BSA 0,1%, numa diluição de 1 :400. As lâminas permaneceram em câmara úmida e escura, a 4°C, por uma noite. Após a incubação, as lâminas foram lavadas 4 vezes em PBS durante 5min cada e bloqueadas em PBS+
BSA 1%, durante 15min, a temperatura ambiente. Em seguida, os cortes foram incubados com o anticorpo secundário anti-IgG de galinha+
FITe, numa diluição de 1:100, em PBS. Foi colocado 200111 da solução sobre cada lâmina, que permaneceu em câmara úmida e escura, a temperatura ambiente, por 90min. Em seguida as lâminas foram lavadas 3 vezes em PBS, durante 10min cada.Nas lâminas controle foi realizado todo o procedimento, exceto a incubação com o soro Smyth Une.
3.5. MONTAGEM
As lâminas foram montadas com Gelmount e lamínula, esmalte foi passado nas bordas da lamínula para evitar evaporação: Depois foram colocadas na geladeira até serem observadas e fotografadas em microscópio Zeiss Axiophot com epifluorescência, usando-se o filtro para fluoresceína.
13IBUlWECA DE'
C'~NCJAS
BIOlÓGICAS I UFPR 134. RESULTADOS
Através de imunofluorescência, utilizando o soro de galinha Smyth fine, pôde-se observar que em embriões de galinha da raça Sedosa Japonesa de plumagem branca (SJB) no estágio 20 de desenvolvimento embrionário os melanoblastos já se destacaram do tubo neural. Eles estão posicionados dorsalmente ao tubo neural, próximos à ectoderme numa região denominada staging area, porém ainda não penetraram nesse folheto germinativo e estão apenas iniciando a invasão da via dorsolateral de migração. Os primeiros melanoblastos dentro da ectoderme foram detectados no estágio 22 de desenvolvimento.
Nesse estágio também foram detectadas células na via dorsolateral de migração (figura 10). No estágio de desenvolvimento 24 os melanoblastos já povoam a ectoderme (figura 11), porém estão mais avançados na via de migração dorsolateral e já iniciaram a migração ventral (figura 12A). Apesar dessa migração avançada, ainda existem melanoblastos próximos ao tubo neural, entrando na ectoderme (figura 12B).
Aos 12 dias de desenvolvimento embrionário foram detectados muitos melanoblastos na epiderme e derme da pele (figuras 13 e 15) e na epiderme e derme das penas (figura 15). Em embriões com 14 dias de desenvolvimento embrionário os melanoblastos ainda estão presentes em grande quantidade na epiderme e derme da pele (figura 14) e também na epiderme e derme da pena (figura 16).
Tabela 1- Resumo dos resultados obtidos.
ST20 ST22 ST24 ST38 ST40
(12 dias) (14 dias) Melanoblastos se destacando da crista neural X X
Melanohlastos apenas na staging area X
Melanoblastos na ectoderme X X
Migração pela via dorso lateral X X
Migração pela via ventral X
Melanoblastos na epiderme e derme da pele X X
Melanoblastos na epiderme e derme da pena X X
5. FIGURAS
FIGURA 10 - Corte transversal da região do tronco de embrião da raça SJB no estágio 22 de desenvolvimento, marcado com Smyth Une. Observe a presença de melanoblastos ( ... ) na ectoderme (e) e na via dorso lateral (dI) de migração. Aumento:
400X.
FIGURA 11 - Corte transversal da região do tronco de embrião da raça SJB no estágio 24 de desenvolvimento, marcado com Smyth Une. Nota-se que muitos melanoblastos ( ... ) estão presentes na ectoderme (e). Aumento: 400X.
FIGURA 12 - Corte transversal da região do tronco de embrião da raça
sm
no estágio 24 de desenvolvimento, marcado com Smyth Une. A - Po e-se observar melano blastos (-+) tanto na viadG:.~oollateral (dI) de migração quanto na via ventral v). (e) ectodenne, (s) somito. Aumento: 400X.
IS3 _. Nesse estágio os melanoblastos (-+) também eSltOO presentes-acima do tubo neural (tn) e dentro da,
eç~dl~EilíIle (e). Aumento: 400X.
FIGURA 13 - Corte transversal da pele de embrião da raça SJB com 12 dias de desenvolvimento, marcado com Smyth fine.
Observe a presença de melanoblastos (~) na epiderme (E) e na derme (d) desse tecido.
Aumento 400X.
FIGURA 14 - Corte transversal da pele de embrião da raça SJB com 14 dias de desenvolvimento, marcado com Smyth Une. Notar a presença de melanoblastos ( . . ) na epiderme (E) e na derme (d) desse tecido. Aumento 400X.
FIGURA 15 - Corte transversal da pele e longitudinal da pena de embrião da raça SJB com 12 dias de desenvolvimento, marcado com Smyth Une. Os melanoblastos ( .. ) estão presentes na epiderme (E) e na derme (d) tanto da pele (PI) quanto da pena (Pn). Aumento 400X.
FIGURA 16 ... Corte transversal da pele e da pena de embrião da raça SJB com 14 dias de desenvolvimento, marcado com Smyth Une. Os melanoblastos ( .. ) estão presentes na epiderme (E) e na derme (d) tanto da pele (PI) quanto da pena (Pn).
Aumento 400X.
19
6. DISCUSSÃO
A ave Sedosa Japonesa de plumagem branca apresenta um padrão diferenciado de migração das células pigmentares. Além de migrarem dors o lateralmente , essas células também migram ventralmente, fato que promove a pigmentação da derme e órgãos internos (F ARACO et al., 2001). Apesar dessa vasta pigmentação interna, as penas e epiderme da ave adulta são despigmentadas. Este trabalho foi desenvolvido com o propósito de analisar a migração das células pigmentares nessa ave em estágios iniciais de desenvolvimento e detectar sua presença e distribuição.
Os melanoblastos foram detectados pela primeira vez dentro da ectoderme e na via dorso lateral de migração no estágio 22, dado equivalente ao encontrado por ERICKSON e colaboradores (1992), em embriões de galinha Leghorn. Nesse trabalho também foi analisada a migração dos melanoblastos pela via dorsolateral nos estágios 20, 22 e 24, porém estes autores não encontraram nenhuma célula da crista neural na ectoderme acima do tubo neural nos estágios examinados, entretanto, nossos resultados mostram que os melanoblastos invadiram esta área já no estágio 22. REEDY e colaboradores (1998) analisaram a migração dos melanoblastos em embriões de galinha Sedosa Japonesa inclusive nos estágios 20, 22 e 24, sendo os nossos resultados semelhantes aos encontrados por estes autores.
Sendo a ectoderme o tecido germinativo formador da epiderme, os melanócitos deveriam estar presentes na epiderme nos estágios de desenvolvimento posteriores.
Estudos realizados em nosso laboratório demostraram que na epiderme da pele do embrião de Sedosa Japonesa de plumagem branca nos estágios 38,40,42 e 44 (12, 14, 16 e 18 dias de incubação, respectivamente) e no embrião recém-eclodido não ocorre a presença· de melanócitos, que são as células pigmentares diferenciadas. Porém, no presente trabalho, seus precursores (os melanoblastos) foram detectados nesse tecido nos estágios 38 e 40 (12 e 14 dias de incubação, respectivamente). Na epiderme da pena
também existem melanoblastos, porém esses se diferenciam em melanócitos durante o desenvolvimento embrionário dessa ave. Ainda não se conhece o destino dos melanob lastos da epiderme da pele, uma vez que não dão origem a melanócitos nesse tecido. Talvez o destino dessas células seja povoar as penas e somente lá sofrer diferenciação, permanecendo na epiderme da pele apenas como uma população estoque.
O microambiente da pena parece ser favorável
àdiferenciação, pois melanoblastos e melanócitos são observados durante o desenvolvimento embrionário. Ou talvez, o fator de sobrevivência dessas células não esteja presente na epiderme da pele, causando seu desaparecimento. Algumas moléculas foram descritas como sendo fundamentais no desenvolvimento e sobrevivência de células pigmentares, porém ainda não se sabe se alguma delas está ausente na epiderme da pele destas galinhas. KA W AKAMI e colaboradores (2002) afirmam que o
Stem cell factor é essencial para a migração ediferenciação de melanócitos durante a embriogênese e também é requerido para a sobrevivência de precursores de melanócitos enquanto migram para a pele. Além disso, dizem que o fator de crescimento TGF- 131 tem sido implicado na proliferação e diferenciação dessas células. REID e colaboradores (1996) afirmam que o
Steel factor(SLF), um fator de sobrevivência e proliferação dos progenitores de melanócitos, regula o desenvolvimento de melanócitos através de sobrevivência seletiva e proliferação de seus progenitores, que exclusivamente expressam c-kit. Esse trabalho também mostra que membros da família das endotelinas, principalmente a endotelina 3, não apenas agem regulando o número de células progenitoras de melanócitos, mas também induzem a pigmentação nessas células. Assim, elas estimulam a diferenciação de progenitores de melanócitos em melanócitos completamente diferenciados.
Os melanoblastos também foram detectados, em grande quantidade, na derme da pele nos embriões nos estágios 38 e 40 (12 e 14 dias de incubação, respectivamente), sendo que nesse tecido ocorre a diferenciação total dessas células em melanócitos.
Contudo, células pigmentares geralmente são encontradas na derme somente em situações
patológicas (FITZPATRICK et aI., 1981). Nas galinhas SJB a pigmentação da maioria
21
dos órgãos internos e também da derme é explicada devido ao fato das células pigmentares percorrerem a via ventral de migração, além da dorso lateral. Não se conhece o papel dos melanócitos na derme ou nos tecidos conjuntivos intelTIOS desta ave. Em invertebrados inferiores, células pigmentares encontradas em regiões internas foram relacionadas com a função de armazenar calor nos órgãos ou de proteger contra a luz
(WEIDENREICH, 1912).Futuras pesquisas devem ser desenvolvidas para descobrir qual é o destino da
população de melanoblastos presente na epiderme da pele, saber se essa população de
células permanece na epiderme sem se diferenciar totalmente ou se é perdida devído
àfalta de algum fator de sobrevivência.
7. CONCLUSÕES
Através de análises imunocitoquímicas realizadas em embriões da ave Sedosa Japonesa de plumagem branca podemos concluir que:
• No estágio 20 de desenvolvimento, os melanoblastos já se destacaram do tubo neural, porém ainda não penetraram na ectoderme, permanecendo na staging
area;• A entrada dos melanoblastos na ectoderme e início da migração pela
ViadorsolateraI ocorre no estágio 22 de desenvolvimento;
• No estágio 24 de desenvolvimento os melanoblastos estão mais avançados na migração pela via dorsolateral e já iniciaram a migração pela via ventral;
• Os melanoblastos ainda estão presentes na epiderme e denne, tanto da pele
quanto da pena, aos 12 e 14 dias de desenvolvimento.
23
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AUSTIN, L.M.; BOISSY, R.E. Mammalian tyrosinase-related protein-l is recognized by autoantibodies from vitiligous Smyth chickens. Am. J. Path., v.146, p.1529-1541, 1995.
BEAUVIS-JOUNEAU, A.; PLA, P.; BERNEX, F.; DUFOUR, S.; SALAMERO, J.;
FASSLER, R.; PANTHIER, J.; THIERY, J.P.; LARDE, L. A novel model of study the dorsolateral migration of melanoblasts. Mechanisms of Development., v.89, p.3-14, 1999.
BRONNER-FRASER, M. Molecular analysis of neural crest formation. Journal of Physiology - Paris, v.96, p.3-8, 2002.
ERICKSON, C.A. Control of neural crest cell dispersion in the
trunkof the avian embryo.
Devo Biol., v.l11, p.138-157, 1985.
ERICKSON, C.A.; DUONG, T.D.; TOSNEY, K.W. Descriptive and Experimental Analysis of the Dispersion of Neural Crest Cells along the Dorsolateral Path and Their Entry into Ectoderm in the ChickEmbryo. Devo BioI., v.151, p.25 1-272, 1992.
ERICKSON, C.A.; GOINS, T.L. Avian neural crest cells can migrate in the dorsolateral path only ifthey are specified as melanoblasts. Development., v.121, p.915-924, 1995.
F ARACO, C.D.; V AZ, S.A.S.; PASTOR, V.D.; ERICKSON, C.A. Hyperpigmentation in
the Silkie Fowl correlates with abnormal migration of fate-restricted melanoblasts and
loss ofenvirorunental barrier mólecules. Dev. Dyn., v.220, p.212-225, 2001.
FlTZPATRICK, T.B.T:; KUKlTA, A.; MORIKAWA, F.; SEUl,
M.;SOBER, AJ.;
TODA, K. Biology and Diseases of Dermal Pigmentation. Toquio: University of Toquio Press, pp51-62, 1981.
GARCIA, S.M.L.; JECKEL NETO, E.; GARCIA, C. Embriologia. la ed. Porto Alegre:
Artes médicas, pp.13-15, 1991.
GARCIA-CASTRO, M.I.; MARCELLE, C.; BRONNER-FRASER, M. Ectodermal Wnt function as a neural crest inducer. Science., v.297, p.848-851, 2002.
GlLBERT, S.F. DevelopmentalBiology. 7
a •ed Sunderland: Sinauer Associates, pp.427- 434,2003.
HAMBURGER, V.; HAMILTON, H.L. A series ofnormal stage
in the development ofthe chick embryo. J. Morphol., v.88, p.49-92, 1951.
..
HENION, P.D.; WESTON, J.A. Timing and pattem of cell fate restrictions in he neural crest lineage. Development., v.124, p.4351-4359, 1997.
HULLEY, P.A.; STANDER, C.S.; KIDSON, S.H. Terminal migration and early differentiation of melanocytes
inembryonic chick skin. Dev. Biol., v.145, p.182-194, 1991.
KAWAKAMl, T.; SOMA, Y.; KAWA,Y.; ITO, M.; YAMASAKl, E.; WATABE, H.;
HOSAKA, E.; Y
AJIMA,K.; OHSUMI, K.; MIZOGUCHI, M. Transforming growth
factor fi 1 regulates melanocyte proliferation and differentiation in mouse neural crest cells
via Stem cell factorlkit signaling. J. Invest. Dermatol., v.118, p.471-478, 2002
25
KOS, R.; REEDY, M.V.; JOHNSON, R.L.; ERICKSON,. C.A. The winged-helix transcription factor FoxD3 is important for establishing the neural crest lineage and repressing melanogenesis in avian embryos. Development, v.128, p.1467-1479, 2001.
LE DOUARIN, N.M. The neural crest. 2
a •ed. Cambrigde University Press, pp.252-293, 1999.
REEDY, M.V.; F ARACO, C.D.; ERICKSON, C.A. The delayed entry of thoracic neural crest cells into the dorsolateral path is a consequence of the late emigration of melanogenic neural crest cells from de neural tube. Dev. Biol., v.200, p.234-246, 1998.
REID, K.; TURNLEY, A.M.; MAXWELL, G.D.; KURIHARA, Y.; KURlliARA, H.;
BARTLETT, P.F.; MURPHY, M. Multiple roles for endothelin in melanocyte development: regulation of progenitor number and stimulation of differentiation.
Development, v.122, p.3911-3919, 1996.
SERBEDZIJA, G.N.; BRONER-FRASER, M.; FRASER, S.E. A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration. Development, v.l06.
p.809-816, 1989.
WESTON, I.A. Sequencial segregation and fate of developmental restricted intermediate cell populations in the neural crest lineage. Curr. Top. Dev. Biol., v.25, p.133-153, 1991.
WEIDENREICH F. Die Lokalisation des Pigmentes und ibre Bedeutung in Ontogenie
und Phylogenie der Wirbeltiere. Z. Morphol. Anthropol., v.2, p.59-140, 1912.
WOLPERT, L.; BEDDINGTON, R.; BROCKES,
J.;
JESSEL, T.; LAURENCE, P.;MEYROWITZ, E. Biologia do Desenvolvimento. Porto Alegre: Artes médicas
