CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS
NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS
DIOGO VILAR DA FONSÊCA
ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANTI-INFLAMATÓRIA DO
SESQUITERPENO NEROLIDOL EM CAMUNDONGOS
ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANTI-INFLAMATÓRIA DO
SESQUITERPENO NEROLIDOL EM CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba para obtenção do grau de MESTRE EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS - Área de concentração: FARMACOLOGIA.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida
F676a Fonsêca, Diogo Vilar da.
Atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do sesquiterpeno nerolidol em camundongos / Diogo Vilar da Fonsêca.-- João Pessoa, 2012.
101f. : il.
Orientador: Reinaldo Nóbrega de Almeida Dissertação (Mestrado) – UFPB/CCS 1. Produtos Naturais. 2. Sesquiterpeno. 3.
Nerolidol. 4. Óleos essenciais. 5. Atividade antinociceptiva. 5. Atividade anti-Inflamatória.
ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANTI-INFLAMATÓRIA DO
SESQUITERPENO NEROLIDOL EM CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba para obtenção do grau de MESTRE EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS - Área de concentração: FARMACOLOGIA.
Aprovado em 06/12 /2012
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________
Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida Orientador – UFPB
__________________________________________ Profa. Dra. Ana Tereza Cavalcanti da Silva
Examinadora Externa – UFPB
__________________________________________ Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima
A Deus e à minha Mãe Rainha Três Vezes Admirável, os quais, em todas as horas de atribulações, motivaram-me para realização deste sonho tão desejado.
Aos meus pais, Adroilton Fonsêca e Sônia Vilar e a minha irmã,
Mariana Vilar, por sempre me apoiarem em todas as minhas decisões. É imensurável o amor que tenho por vocês. Esta vitória é NOSSA.
Aos meus avós, que sempre estiveram presentes em minha vida, torcendo e vibrando por cada vitória. Agradeço, especialmente, ao meu avô Benjamim, meu herói da vida real, pela eterna bondade e pela ajuda no custeio dos meus estudos.
À minha namorada, Emmanuella Arruda, pelo companheirismo, por todo o amor dedicado e por entender os momentos de ausência, a fim de que este e outros projetos fossem realizados.
A toda minha família pela disponibilidade de sempre quererem me ajudar sem medir esforços.
Ao meu mestre, Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida, pelo profissionalismo, pela oportunidade de continuar na família Psicofarmacologia e por ter me ensinado que poucas palavras, quando ditas com sabedoria, podem significar muito.
À Profa. Dra. Liana Clébia Soares Lima de Morais, pela amizade e pela confiança depositada, desde minha iniciação científica.
especial, às professoras Bagnólia Araújo, Edeltrudes de Oliveira Lima,
MariannaSobral e Maria deLourdesPereira.
A Profa. Dra. Márcia Regina Piuvezam, pela parceira para a realização dos testes anti-inflamatórios;
Aos meus amigos de Laboratório, em especial, Adriana Fernandes, Ana Karina, Charlane Souto, Dandara Felizardo, Fabiola Lélis, Lucas Monte, Mirian Salvadori, Paula Salgada, Rosângela Penha, Rubens Batista
e Sócrates Golzio, pela amizade e pelos momentos de descontração, os quais tornaram essa caminhada mais leve e divertida;
Aos alunos de iniciação científica, Edgar Vágner, Luciano Leite, Paula Arruda, Renan Marinho e Wendel Batista pela atenção e disposição em ajudar.
A toda minha turma de mestrado, em especial, Anne Dayse, Heloísa Mara, Mateus Feitosa, Rodrigo Santos e Tainá Souza pela amizade e companheirismo.
À José Crispim Duarte e Luis Cordeiro. por toda ajuda para realização deste trabalho.
FONSÊCA, D.V. Atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do sesquiterpeno nerolidol em camundongos. 2012. 101p. Dissertação (Pósgraduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Farmacologia) -UFPB/CCS/ João Pessoa – PB.
O nerolidol, sesquiterpeno acíclico encontrado como constituinte majoritário em vários óleos essenciais, apresenta atividade antineoplásica, antimicrobiana e leishmanicida, porém sua ação em processos dolorosos nunca foi estudada. Este trabalho visa investigar a atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do nerolidol em modelos experimentais de dor e inflamação em camundongos. Na triagem farmacológica comportamental, as diferentes doses testadas do nerolidol apresentaram alterações comportamentais psicodepressoras, tais como ambulação diminuída e analgesia. A DL50 não pôde ser determinada,
uma vez que não se observaram mortes até a dose máxima de 2000 mg/kg. A coordenação motora, avaliada no teste do rota-rod, não foi alterada nos animais tratados com nerolidol em nenhuma das doses. Em seguida, metodologias foram realizadas para avaliar a atividade antinociceptiva. O nerolidol reduziu o número de contorções abdominais induzidas por ácido acético, quando comparado ao grupo controle nas três doses testadas. No teste da formalina, foi capaz de inibir o tempo de lambida tanto na primeira fase (0-5min) quanto na segunda fase (15-30 min). No teste da placa quente, o nerolidol não alterou a latência em nenhum dos tempos observados. O mecanismo de ação da propriedade antinociceptiva do nerolidol foi avaliado através do teste da formalina. A antinocicepção produzida pelo nerolidol foi significativamente bloqueada em animais pré-tratados com bicuculina (1 mg/kg, i.p.), indicando o envolvimento do sistema GABAérgico. O efeito antinociceptivo do nerolidol, contudo, não foi revertido pela naloxona (antagonista não seletivo dos receptores opioides, 5 mg/kg, s.c.) e pela glibenclamida (bloqueador dos canais de K+ATP, 10 mg/kg, i.p.), sugerindo que o nerolidol não atua por esses
mecanismos. O tratamento com o nerolidol foi capaz de reduzir o edema de pata induzido por carragenina. No modelo da peritonite induzida por carragenina, o nerolidol diminuiu o influxo de leucócitos e também os níveis de TNF-α no lavado peritoneal. Sendo assim, esses resultados mostram que o nerolidol tem atividade antinociceptiva com possível participação do sistema GABAérgico Além disso, o nerolidol possui atividade anti-inflamatória que pode ser atribuída à inibição da produção da citocina pró-inflamatória TNF-α.
FONSÊCA, D.V. Antinociceptive and anti-inflammatory activities of the sesquiterpeno nerolidol in mice. 2012. 101p. Dissertação (Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Farmacologia) -UFPB/CCS/ João Pessoa – PB
Nerolidol, an acyclic sesquiterpene found as the major component in several essential oils, has antineoplastic, antimicrobial and antileishmanial activities, however its action in painful processes has never been studied. This study investigated the antinociceptive and anti-inflammatory activities of nerolidol in experimental pain and inflammation models in mice. On the pharmacological behavioral screening, the different doses tested by the nerolidol had psicodepressors behavioral changes such as decreased ambulation and analgesia. The LD50 could not be determined, since there were no deaths until
the maximum dose of 2000 mg/kg. Motor coordination, evaluated through the rotarod test, was not altered in animals treated with nerolidol in any of the doses used. After, methods to evaluate the antinociceptive activity were used. Nerolidol reduced the number of acetic-acid induced abdominal contractions compared to the control group in all of the three doses tested. The formalin test, inhibited licking time both in the first phase (0–5 min) and in the second phase (15–30 min). Under the hot-plate test, nerolidol did not alter latency at any of the observed time-points. The mechanism of action of the antinociceptive property of nerolidol was assessed using the formalin test. The antinociception produced by nerolidol was significantly blocked in animals pre-treated with bicuculline (1 mg/kg, i.p.), indicating the involvement of GABAergic system. However, the effect of nerolidol was not reversed by the naloxone (non selective opioid antagonist, 5 mg/kg, s.c.) and glibenclamide (K +ATP channels
bloker, 10 mg/kg, i.p.), demonstrating that at least directly, the nerolidol does not act by these mechanisms. The treatment with nerolidol was able to reduce the paw edemas induced by carragenina. At the model of peritonitis induced by carraggenan, nerolidol decreased the influx of leukocytes and also the levels of TNF-α in the peritoneal fluid. Therefore, these results indicate that nerolidol has antinociceptive activity with possible participation of the GABAergic system. Besides, nerolidol has anti-inflammatory activity that may be attributed to inhibition pro-inflammatory cytokines production TNF-α.
Figura 1 - Estrutura Química do timol ... 17
Figura 2 - Estrutura Química do zerumbone... 17
Figura 3 - Estrutura Química do polygodial ... 18
Figura 4 - Estrutura Química do (-)-α-bisabolol ... 18
Figura 6 – Teoria da comporta proposta por Melzack e Wall em 1965. ... 27
Figura 7 – Migração de leucócitos para o sítio inflamatório (Fonte: GHOSH; PANACCIONE, 2010). ... 29
Figura 8 - Estrutura Química do nerolidol ... 32
Figura 9 - Camundongo Swiss ... 36
Figura 10- Aparelho do rota-rod ... 38
Figura 11 - Aparelho da Placa Quente ... 38
Figura 12 – Resumo esquemático das metodologias utilizadas no estudo do nerolidol. ... 39
Figura 13 - Efeito da administração do veículo (grupo controle) e nerolidol (200, 300 e 400 mg/kg, p.o.) na função psicomotora avaliada no teste do Rota-Rod. Cada coluna representa média ± e.p.m (n=6) (ANOVA “one-way” seguido pelo Teste de Dunnett). ... 51
Figura 14 - Efeito da administração do nerolidol (NERO, 200, 300 e 400 mg/kg, p.o.), morfina (MOR,6 mg/kg, i.p.) e dexametasona (DEXA, 2 mg/kg, s.c.) nas contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. Cada coluna representa média ± e.p.m(n=8) (ANOVA “one-way” seguido pelo Teste de Dunnett). **p<0,01, ***p<0,001 versus grupo controle. ... 52
10 mg/kg, i.p.) e dexametasona (DEXA, 2 mg/kg, s.c.) na segunda fase do teste da formalina em camundongos. Cada coluna representa média ± e.p.m(n=8).
(ANOVA “one-way” seguido pelo Teste de Dunnett). ***p<0,001 versus grupo
controle. ... 54
Figura 17 - Efeito da administração do nerolidol ( 200, 300 e 400 mg/kg, p.o.) e morfina (MOR, 6 mg/kg , i.p.) no teste da placa quente. Cada coluna representa
média ± e.p.m (n=8) (ANOVA “one-way” seguido pelo Teste de Dunnett).
***p<0,001 versus grupo controle. ... 55
Figura 18 - Efeito do pré-tratamento com glibenclamida (GLIB, 10 mg/kg, i.p.) na antinocicepção causada pelo nerolidol (NERO, 400 mg/kg, p.o.), na primeira fase do teste da formalina. Cada coluna representa média ± e.p.m (n=8)
(ANOVA “one-way” seguido pelo Teste de Dunnett). **p<0,01 versus grupo controle. ... 56
Figura 19 - Efeito do pré-tratamento com glibenclamida (GLIB, 10 mg/kg, i.p.) na antinocicepção causada pelo nerolidol (NERO, 400 mg/kg, p.o.), na segunda fase do teste da formalina. Cada coluna representa média ± e.p.m (n=8)
(ANOVA “one-way” seguido pelo Teste de Dunnett).***p<0,001 versus grupo controle. ... 56
Figura 20 - Efeito do pré-tratamento com bicuculina (1 mg/kg, i.p.) na antinocicepção causada pelo nerolidol (NERO: 400 mg/kg, p.o.), na primeira fase do teste da formalina. Cada coluna representa média ± e.p.m (n=8)
(ANOVA “one-way” seguido pelo Teste de Dunnett). ***p<0,001 versus grupo
controle,###p<0,001 versus nerolidol... 57
Figura 21 - Efeito do pré-tratamento com bicuculina (1 mg/kg, i.p.) na antinocicepção causada pelo nerolidol (NERO: 400 mg/kg, p.o.), na segunda fase do teste da formalina. Cada coluna representa média ± e.p.m (n=8)
(ANOVA “one-way” seguido pelo Teste de Dunnett). ***p<0,001 versus grupo
controle, ###p<0,001 versus nerolidol... 58
controle, p<0,001 versus morfina. ... 59
Figura 23 - Efeito do pré-tratamento com naloxona (5 mg/kg, s.c.) na antinocicepção causada pelo nerolidol (NERO: 400 mg/kg, p.o.), na segunda fase do teste da formalina. Cada coluna representa média ± e.p.m (n=8)
(ANOVA “one-way” seguido pelo Teste de Dunnett). ***p<0,001 versus grupo
controle,###p<0,001 versus morfina. ... 60
Figura 24 - Efeito da administração do nerolidol (200, 300 e 400 mg/kg, p.o.) e da dexametasona (DEXA, 2 mg/kg , s.c.) no edema de pata induzida por
carragenina. Cada coluna representa média ± e.p.m (n=8) (ANOVA “one-way”
seguido pelo Teste de Dunnett). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 versus grupo controle. ... 61
Figura 25 - Efeito da administração do nerolidol (NERO: 200, 300 e 400 mg/kg, p.o.) e da dexametasona (DEXA, 2 mg/kg , s.c.) sobre a migração de leucócitos totais (A), neutrófilos (B) e mononucleares (C), na peritonite induzida por carragenina. Cada coluna representa média ± e.p.m (n=8) (ANOVA “one-way”
seguido pelo Teste de Dunnett). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 versus grupo controle ... 62
Figura 26 - Efeito da administração do nerolidol (NERO, 200, 300 e 400 mg/kg, p.o.) e da dexametasona(DEXA, 2 mg/kg , s.c.) sobre os níveis de TNF-α, no
modelo de peritonite induzida por carragenina. Cada coluna representa média ±
e.p.m (n=8) (ANOVA “one-way” seguido pelo Teste de Dunnett). **p<0,01, ***p<0,001 versus grupo controle ... 63
LISTA DE QUADROS
% Por cento
± Mais ou menos
° C Graus Celsius
® Marca registrada
α Alfa
Beta
δ Delta
κ Kappa
μ Mu
Γ Gama
μL Microlitros
μm Micrômetro
AINE Antiinflamatório não-esteroidal
AMPA Receptor ácido α -amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiônico
AMPc Monofosfato de adenosina cíclico
ANOVA Análise de variância
cm Centímetros
COX Ciclooxigenase
COX-2 Ciclooxigenase-2
DEXA Dexametasona
DL50 Dose letal que mata 50% dos animais
DN Dor Neuropática
DRG Gânglio da Raiz dorsal
E.P.M. Erro padrão da média
ERK Proteína quinase regulada por estímulos extracelular
Fe2+ Íons ferro
g Gramas
g/kg Gramas por quilogramas
GABA Ácido -amino-butírico
GABAA Receptor de ácido gama amino butírico tipo A
GP Glutationa peroxidase
h Hora
H+ Íons hidrogênio
H2O Água
IF- Interferon-gama
IL-1 Interleucina 1 i.p. Intraperitoneal
K+ Íon potássio
K+ir Canal de potássio retificador de entrada
K+V Canal de potássio dependente de voltagem
M Concentração molar
mg/kg Miligramas por quilogramas
min Minuto
mL Mililitros
mm Milímetros
mM Milimolar
MOR Morfina
n° Número
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
ng/mL Nanogramas por mililitros
Na+ Íon sódio
NERO Nerolidol
NO Óxido Nítrico
nm Nanômetro
PBS Tampão fosfato de sódio
PGE2 Prostaglandina E2
PGFβα Prostaglandina F2-alfa
p.o. Via oral
pH Potencial hidrogeniônico
r.p.m. Rotações por minuto
SG Substância gelatinosa
s.c. Subcutânea
SNA Sistema nervoso autônomo
SNC Sistema nervoso central
Tween 80 Polioxetileno Sorbitano Monoleato
1. Introdução ... 16
2. Fundamentação Teórica ... 21
2.1. Dor ... 21
2.2. Classificação da dor ... 22
2.3. Fisiopatologia da dor ... 24
2.4. Inflamação ... 28
2.5. Considerações gerais sobre óleos essenciais ... 31
2.6. Nerolidol ... 32
3. Objetivos ... 34
3.1. Objetivo Geral ... 34
3.2. Objetivos Específicos ... 34
4. Material ... 36
4.1. Animais ... 36
4.2 Condições Experimentais ... 37
4.3 Substâncias utilizadas ... 37
4.4 Aparelhagem ... 38
5. Métodos ... 39
5.1. Avaliação da toxicidade do nerolidol ... 40
5.1.1. Determinação da dose letal 50% (DL50) ... 40
5.2. Avaliação geral do nerolidol no sistema nervoso central ... 40
5.2.1. Efeito do nerolidol na triagem psicofarmacológica ... 40
5.2.2. Teste do Rota-Rod ... 42
5.3. Estudo da atividade antinociceptiva do nerolidol ... 42
5.3.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético .... 42
5.3.2. Teste da formalina ... 43
5.3.3 Teste da Placa Quente... 44
5.4. Avaliação dos possíveis mecanismos de ação na atividade antinociceptiva do nerolidol ... 45
5.4.3. Participação do sistema opioide ... 45
5.5. Estudo da atividade anti-inflamatória do nerolidol ... 46
5.5.1. Edema de pata induzida por carragenina ... 46
5.5.2. Peritonite induzida por carragenina ... 47
5.5.3. Dosagem de TNF-α no lavado peritoneal ... 48
6. Resultados ... 50
6.1. Avaliação da toxicidade do nerolidol ... 50
6.1.1. Determinação da dose letal 50% ... 50
6.2. Avaliação geral do nerolidol no SNC ... 50
6.2.1. Efeito do nerolidol na triagem psicofarmacológica ... 50
6.2.2. Efeito do nerolidol no teste do Rota-Rod ... 51
6.3. Estudo da atividade antinociceptiva do nerolidol ... 52
6.3.1. Efeito do nerolidol no teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético ... 52
6.3.2. Efeito do nerolidol no teste da formalina ... 53
6.3.3. Efeito do nerolidol no teste da placa quente ... 54
6.4. Avaliação dos possíveis mecanismos de ação na atividade antinociceptiva do nerolidol ... 55
6.4.1. Participação dos canais de K+ ATP ... 55
6.4.2. Participação do sistema GABAérgico ... 57
6.4.3. Participação do sistema opioide ... 58
6.5. Estudo da atividade anti-inflamatória do nerolidol ... 60
6.5.1. Efeito do nerolidol no edema de pata induzida por carragenina ... 60
6.5.2. Efeito do nerolidol na peritonite induzida por carragenina ... 61
6.5.3. Efeito do nerolidol sobre os níveis de TNF-α no lavado peritoneal63 7. Discussão ... 65
8. Conclusão ... 76
1. Introdução
Segundo a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP), a dor está definida como uma experiência sensorial e/ou emocional desagradável associada a um dano tecidual real ou potencial e descrita em termos dessa lesão (LOESER; TREED, 2008). Já a nocicepção consiste na real injúria tecidual ou em um evento potencialmente danoso transduzido e codificado por nociceptores (LOESER; TREED, 2008; SCHNAKERS et al., 2012). A experiência dolorosa é muito variável entre os indivíduos, não havendo uma correlação direta entre a ativação de nociceptores e a expressão sensorial, isto é, o estímulo nocivo pode provocar um dano sem necessariamente causar dor (OSSIPOV; DUSSOR; PORRECA, 2010).
Frequentemente, a dor está acompanhada de inflamação, quando ocorre dano tecidual. A reação inflamatória constitui uma tentativa do organismo em restabelecer a homeostasia (CHAPMAN; GRAVRIN, 1999), todavia uma resposta exacerbada pode descompensar fisiologicamente o individuo, provocando disfunção em órgãos e, até mesmo, a morte (LIEW, 2003). Os nociceptores podem ser ativados por estímulos químicos, térmicos e mecânicos, porém essa estimulação pode ser reforçada ou sensibilizada por mediadores inflamatórios, tais como bradicinina, serotonina e prostaglandinas, os quais são produzidos em uma injúria tecidual (BONNINGTON; MCNAUGHTON, 2003; HUANG; ZHANG; MCNAUGHTON, 2006).
No início do século XIX, o isolamento da morfina a partir do ópio trouxe notoriedade aos produtos naturais como uma importante fonte de novas substâncias com ação biológica (KINGHORN, 2001; SAMUELSSON, 2004). Entre os produtos naturais utilizados na prática terapêutica, os óleos essenciais despontam como potentes alvos farmacológicos, caracterizados por apresentarem compostos voláteis de forte odor, que são produzidos por plantas aromáticas como metabólito secundário (MACHADO; FERNANDES JUNIOR, 2011).
KREUGER et al., 2012). Essas atividades estão relacionadas aos seus constituintes, entre os quais se destacam os terpenoides que são compostos lipofílicos e de baixo peso molecular. Eles são classificados de acordo com o número de unidades isoprênicas em monoterpenos e sesquiterpenos. No entanto, os fenilpropanoides também são componentes importantes de alguns óleos essenciais (STEINEGGER; HANSEL, 1992).
Recentemente, muitos estudos têm demonstrado a atividade antinociceptiva e anti-inflamatória de vários terpenoides, por exemplo, o timol, zerumbone, polygodial e o (-)-α-bisabolol.
O timol é um monoterpeno fenólico presente no óleo essencial de Lippia gracilis. Em estudos experimentais, o timol foi capaz de reduzir a formação do edema induzido por carragenina e a migração de leucócitos no modelo inflamatório da peritonite (RIELLA et al., 2012). Além disso, aumentou o tempo de permanência do animal sobre a placa quente, o que pode estar relacionado ao bloqueio parcial dos canais de Na+ e de K+ dependentes de voltagem ou pela ativação direta dos receptores GABAA. Tal resultado sugere uma atividade antinociceptiva central
(ELLIOTT; ELLIOTT, 1997; HAESELER et al., 2001; MOHAMMADI et al., 2001; ANGELES-LÓPEZ et al., 2010).
O zerumbone é um sesquiterpeno acíclico encontrado nos rizomas de
Zingiber zerumbet como principal constituinte e apresenta uma capacidade anti-inflamatória in vitro e in vivo
(SULAIMAN et al., 2010). Esse
sesquiterpeno possui a capacidade de diminuir a expressão da cicloxigenase2 (COX-2) e de induzir o óxido nítrico
sintetase, justificando o amplo uso desse Química do Zerumbone Figura 2 - Estrutura Figura1 - Estrutura
rizoma na medicina popular para cura de inflamações (MURAKAMI; SHIGEMORI; OHIGASHI, 2005; MURAKAMI; OHIGASHI, 2007). Quanto à capacidade antinociceptiva, o zerumbone foi efetivo em vários testes de nocicepção químicos e térmicos, desempenhando essa atividade via inibição de alguns mecanismos de sinalização da dor (SULAIMAN et al., 2009; PERIMAL et al., 2011).
Drimyswinteri é uma planta medicinal nativa do sul do Brasil e de alguns outros países da América do Sul, utilizada para o tratamento de asma e alergia. O sesquiterpeno polygodial é o constituinte marjoritário que possui atividade anti-inflamatória e antialérgica, já que foi capaz de inibir a fosfolipase A2, enzima responsável por produzir alguns mediadores inflamatórios (CUNHA et al., 2001). A atividade antinociceptiva foi sugerida pela efetividade no teste das contorções induzidas por ácido acético e no teste da formalina com participação do sistema opioide e seritoninérigo no efeito, podendo agir também na dessensibilização neuronal (MENDES et al., 1998;2000; ANDRE et., 2004).
O (-)-α-bisabolol é um sesquiterpeno opticamente ativo, obtido a partir da destilação direta de vários óleos essencias como das espécies de Vanillosmopsis e Peperomia (VICHNEWSKI et al. 1989; LIRA et al. 2009). Matricaria chamomilla contêm até 50% de α-bisabolol o que contribui para o efeito anti-inflamatório da camomila (JAKOVLEV; VON SCHLICHTEGROLL, 1969). Essa atividade está relacionada a um downregulation da expressão gênica da INOS e COX-2 por meio da inibição da sinalização de NF-ƙB e AP-1 (KIM et al., 2011; ROCHA et al., 2011). A aplicação tópica do (-)-α-bisabolol em testes de dermatite aguda foi bastante efetivo, podendo esse fármaco servir como
Figura 3 - Estrutura Química do Polygodial
Figura 4 - Estrutura
modelo para o desenvolvimento de drogas anti-inflamatórias para o tratamento de dermatites tópicas ou psoríase (LEITE et al., 2011). Esse sesquiterpeno também foi eficiente nos modelos de nocicepção visceral, exercendo seu efeito, provavelmente, pela diminuição da excitabilidade neuronal causada pelo bloqueio irreversível dos canais de sódio dependente de voltagem (ALVES et al., 2010; LEITE et al., 2011).
2. Fundamentação Teórica
2.1. Dor
A palavra dor é usada para descrever sentimentos angustiantes e dolorosos, no entanto a sua definição é bem mais complexa, pois não envolve apenas a transdução do estímulo nocivo, mas também o processamento cognitivo e emocional pelo cérebro (JULIUS; BASBAUM, 2001 SCHOLZ; WOOLF, 2002). De acordo com a Associação Internacional da Dor, a dor é uma experiência emocional e sensorial desagradável associada com um dano tecidual real ou em potencial.
A dor possui uma natureza subjetiva caracterizada por sintomas físícos e psicológicos. A nocicepção pode ocorrer independente da dor, já que é um processo fisiológico que não apresenta um componente subjetivo (LOESER; TREEDE, 2008). O termo nocicepção é a detecção da lesão tecidual por
transdutores especializados ligados às fibras Aδ e C, as quais transmitem
sinais ao sistema nervoso central, influenciados por inflamações e por estímulos ambientais físicos ou químicos (LOESER; MELZACK, 1999). A nocicepção, portanto, refere-se à percepção consciente ou não do estímulo doloroso. Por sua vez, o processamento da dor envolve a ativação do córtex somatossensorial em áreas responsáveis pela cognição, pela emoção e pela sensação (KUPERS; KEHLET, 2006; SCHNAKERS et al., 2012).
A dor ganhou status de epidemia em todo o mundo, como mostrado em um estudo recente que revelou a prevalência da dor crônica em 37,3% e 41,1% da população adulta nos países desenvolvidos e em desenvolvimento, respectivamente (TSANG et al., 2008). No Brasil, a dor é responsável por 70% dos pacientes que buscam os consultórios, representando um terço das consultas médicas. A dor crônica compromete a atividade profissional de 94,9% dos brasileiros portadores dessa doença (TEXEIRA et al., 2001). A Organização Mundial de Saúde (WHO) revelou que indivíduos portadores de dor crônica possuem quatro vezes mais chances de terem depressão ou ansiedade que os indivíduos sem a doença (GUREJE et al., 1998).
POSSO, 2011). Além disso, os fatores psicossociais têm grande relevância na interpretação da dor e na qualidade de vida do paciente (KLOSSIKA et al., 2006). A sensibilidade à dor também tem relação com a variabilidade intrínseca entre os indivíduos, sendo apoiada, ademais, pelas diferenças genéticas e ambientais (MURALIDHARAN; SMITH, 2011). Muitos relatos sugerem que a diferença hormonal entre os sexos modificam a percepção à dor, mas essa relação é complexa e, provavelmente, multivariada (GREENSPAN et al., 2007; MANSON, 2010).
A analgesia do placebo, substância sem efeito farmacodinâmico, é um exemplo clínico da modulação cognitiva da percepção da dor. Alguns pesquisadores mostram que o placebo aumenta a atividade cerebral na região dorso-lateral do córtex pré-frontal e nas proximidades da substância cinzenta periaquedutal e diminui o desempenho de regiões associadas ao processamento dos aspectos afetivos e emocionais da dor. Essas mudanças ocorrem antes do estímulo nociceptivo, podendo exercer controle sobre outras regiões cerebrais importantes (RAMOS, 2007). A modulação cognitiva da dor envolve, pelo menos em parte, o sistema opioide endógeno. Recentemente, um estudo revelou, por meio de uma ressonância magnética em humanos, que o placebo inibe o processo nociceptivo no corno dorsal da médula espinhal (BINGEL, 2010).
2.2. Classificação da Dor
A dor pode ser classificada de diversas formas, dividindo-se em transitória, aguda e crônica, a mais importante.
A dor transitória é produzida pela ativação de nociceptores presentes na pele ou em outros tecidos na ausência de dano tecidual. Esse tipo de dor surge para proteger o homem contra danos físicos ambientais ou lesões no corpo (LOESER; MELZACLK, 1999).
sistema nervoso simpático, resultando no aumento da frequência respiratória e cardíaca, sudorese e dilatação da pupila (HELMS; BARONE, 2008).
Já a dor crônica persiste além do período esperado de cura por causa da incapacidade do corpo em restaurar-se ao estado normal (GRICHNIK; FERRANTE, 1991). A ativação do sistema nervoso simpático na dor crônica não ocorre da mesma forma na dor aguda, uma vez que há uma estimulação persistente dos nervos periféricos no sistema nervoso central (HELMS; BARONE, 2008).
Em consequência das alterações nos mecanismos de percepção e na condução dos impulsos, quando a dor aguda é muito intensa ou repetida, a resposta nociceptiva pode induzir um estado de hiperexcitabilidade persistente que conduz à dor crônica, mesmo que a lesão aguda já tenha desaparecido. A diferença entre a dor crônica e aguda não está na duração, mas na incapacidade do sistema nervoso em restabelecer a atividade neuronal para os níveis homeostáticos normais (LOESER; MELZACLK, 1999; VALE, 2000).
2.3. Fisiopatologia da dor
O conhecimento da fisiopatologia da dor é uma importante ferramenta para o entendimento dos mecanismos desencadeantes dos processos dolorosos, sejam fisiológicos ou principalmente patológicos (SALIBA; HUBER; PENTER, 2011). O início da sequência de eventos que origina o fenômeno nociceptivo é a decodificação das sensações mecânica, térmica e química em potenciais de ação, as quais são transferidas para o sistema nervoso central por meio de fibras nervosas periféricas (PISERA, 2005).
As terminações livres dos neurônios primários são chamadas de nociceptores capazes de detectar estímulos térmicos, químicos e físicos, estando presentes em todos os tecidos menos no cérebro. Os nociceptores apresentam corpos celulares localizados nos gânglios da raiz dorsal e nos gânglios trigeminal, possuindo ramificações axonais que inervam órgãos e a medula espinhal (BASBAUM et al., 2009).
As fibras sensoriais são classificadas em grupos baseados em critérios anatômicos e funcionais (JULIUS; BASBAUM, 2001). As fibras Aδ são mielinizadas e produzem uma dor aguda bem definida, chamada de “dor rápida” ou “primeira dor” (KLAUMANN; WOUK; SILLAS, 2008). A transmissão através das fibras A são tão rápidas que o reflexo do corpo pode responder mais rápido que o estímulo doloroso, provocando a retração da parte do corpo afetada antes mesmo da percepção da dor (HELMS; BARONE, 2008). Os
nociceptores Aδ são divididos em dois tipos. Os chamados tipo I correspondem
aos mecanoreceptores de alto limiar, os quais respondem tanto a estímulos térmicos (> 50o C) quanto químicos, porém são insensíveis à capsaicina. Já os
nociceptores Aδ II são sensíveis à temperatura em torno de 4γo C, isto é,
possuem um limiar para estímulo térmico menor que o tipo I (MILLAN, 1999; ALMEIDA; ROIZENBLATT; TUFIK, 2004; ROCHA et al., 2007).
Após a “primeira dor”, as fibras C transmitem lentamente a sensação de
nociceptores C “peptidérgico”, a qual libera neuropeptídios, substância P e
peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) (BASBAUM et al., 2009).
As fibras Aα e A apresentam um diâmetro maior que as demais fibras,
sendo mielinizadas e de condução rápida. Na ausência de dano tecidual ou nervoso, essas fibras transmitem impulsos referentes a estímulos inócuos, como tato, vibração e pressão (KLAUMANN; WOUK; SILLAS, 2008).
No intuito de descrever o papel da medula espinhal na transmissão da dor, é necessária uma breve descrição anatômica e fisiológica.
A medula espinhal é constituída por uma sucessão de segmentos, sendo cada um responsável pela recepção de informações específicas. As células da medula espinhal são dispostas em forma de lâminas na direção dorso ventral, numeradas de I a X. As fibras aferentes nociceptivas terminam no corno dorsal da medula que contém as lâminas de I a VI (PORTNOI, 1999).
As fibras aferentes primárias se projetam no corno dorsal da medula espinhal, fazendo sinapse com neurônios secundários presentes nas lâminas.
Por exemplo, as fibras Aδ se projetam na lâmina I e V. As lâminas III, IV e V estão conectadas às fibras A , que respondem a um simples toque. Já as fibras C peptidérgicas se projetam mais superficialmente, nas lâminas I e II, ao contrário das aferentes não-peptidérgicas, que se conectam na região central da lâmina II. Os neurônios das lâminas VII e VIII do corno ventral podem responder a estímulos nociceptivos, mesmo que de forma mais complexa, através de conexões polissinápticas. Na porção ventral da lâmina II, encontra-se um interneurônio excitatório que expressa a isoforma gama da proteína cinase C que se relaciona a quadros de dores persistentes (Figura 5) (KLAUMANN; WOUK; SILLAS, 2008; BASBAUM et al., 2009).
Figura5 - Conexão entre fibras aferentes primárias e a medula espinhal (Fonte: BASBAUM et al., 2009).
A modulação da transmissão do sinal tanto pelas fibras aferentes quanto pelos neurônios do corno dorsal ocorre pela liberação de mediadores químicos (neurotransmissores) que atuam sobre os receptores pós-sinápticos, podendo induzir ou inibir a propagação do estímulo doloroso. Os principais aminoácidos excitatórios são glutamato e aspartato, porém as fibras C também se encontram em uma variedade de neuropeptídios como a substância P, neurotensina e peptídeo intestinal vasoativo (LAMONT; TRANQUILLI, 2000; VALE, 2000; RYGH.; HOLE; TJOLSEN, 2005).
A dor pode ser modulada endogenamente por neurônios intermediários dentro das lâminas superficiais da medula espinhal e pelo trato neuronal descendente. Os opioides endógenos e exógenos podem agir no terminal pré-sináptico dos nociceptores aferentes primários via receptor um, pelo bloqueio indireto dos canais de cálcio dependente de voltagem, como também pela abertura dos canais de potássio, resultando na inibição da liberação dos neurotransmissores das fibras aferentes primárias causando analgesia (VANDERAH, 2007).
e Wall propuseram o efeito dessa influência através da teoria da comporta que ainda possui grande aceitação na comunidade científica. Segundo esse modelo, a dor é percebida, apenas quando os neurônios nociceptivos não-específicos (T), que são responsáveis por transmitir o sinal nociceptivo para estruturas supraespinhais, são ativados. Quando ocorre ativação das fibras de
grande diâmetro (Aα e A ), ativa os interneurônios inibitórios, que podem ser
GABAérgico ou glicinérgico, localizados na substância gelatinosa (SG), impedindo a ativação do neurônio T. Esse interneurônio pode ser inibido pela
ativação das fibras nociceptivas de pequeno diâmetro (Aδ e C). Dessa forma, a ativação das fibras Aα e A aumenta a ativação inibitória do interneurônio, fechando a comporta e bloqueando a propagação para as vias supraespinhais,
enquanto a ativação das fibras Aδ e C, pela ativação dos initerneurônios
inibitórios, podem abrir a comporta, facilitando a transmissão do sinal nociceptivo. A administração de antagonistas para receptores GABAA
(bicuculina) e glicina (estricnina) reforçam fortemente a sensibilidade nociceptiva, comprovando a teoria (Figura 6) (ALMEIDA; ROIZENBLATT; TUFIK, 2004; CALVINO; GRILO, 2006; BASBAUM et al., 2009; PERL, 2011; ZEILHOFER; WILDNER; YÉVENES, 2012).
2.4. Inflamação
A inflamação corresponde a uma complexa resposta que quando acionada por lesões traumáticas ou processos infeciosos pode limitar a ação do agente causador. Essa resposta inflamatória envolve a liberação sequencial de mediadores e recrutamento de leucócitos circulantes que são ativados no local da inflamação (SIQUEIRA JÚNIOR, 1996; LAWRENCE et al., 2001).
A capacidade de desencadear inflamação é essencial para a sobrevivência, porém a exacerbação dessa resposta deixa de ser um evento benéfico para o organismo e se torna uma doença crônica como ocorre na artrite reumatoide que é caracterizada pelo acúmulo de células inflamatórias no liquido sinovial, provocando lesões articulares. Essa fase é chamada de proliferativa crônica, pois há degeneração de tecidos, lesão endotelial e fibrose (FRIDOVICH, 1997).
O processo inflamatório envolve uma cascata de eventos bioquímicos e celulares, resultando em sinais clínicos característicos como rubor, calor, edema, dor e prejuízo funcional. Os eventos iniciam com a liberação de substâncias quimiotáticas e aminas vasoativas como serotonina e histamina as quais são liberadas por mastócitos e monócitos minutos após a agressão, provocando uma vasodilatação e, consequentemente, um aumento de fluxo sanguíneo na área afetada. Por conseguinte, há um aumento na permeabilidade vascular decorrente da contração do citoesqueleto das células endoteliais que resulta na movimentação de proteínas e leucócitos do sangue para o tecido extravascular (CARVALHO; LEMÔNICA, 2008).
Os leucócitos são atraídos para os locais afetados por um gradiente de quimiocinas, no entanto o mecanismo principal para essa movimentação é o contato direto entre os leucócitos e as células endoteliais. Essa interação ocorre devido a várias moléculas presentes na superfície celular que permite o rolamento dos leucócitos ao longo das células endoteliais até pararem para a passagem do interior do vaso sanguíneo para o tecido extravascular (IMHOF; DUNON, 1995; LUSCINSKAS; GIMBRONE, 1996).
causando um fenômeno chamado de rolamento (LAWRENCE; SPRINGER, 1991). As integrinas e as imunoglobulinas (ICAM-1. VCAM-1) medeiam à adesão célula-célula e célula-matriz extracelular, sendo importantes no processo da diapedese (SANDBORN; YEDNOCK, 2003; MILES et al., 2008).
Figura 7 – Migração de leucócitos para o sítio inflamatório (Fonte: GHOSH; PANACCIONE, 2010).
Há dois tipos de células: as que estão permanentes nos tecidos, mastócitos e células endoteliais, e as que migram para o local afetado, tais como neutrófilos, macrófagos monócitos e linfócitos nos quais produzem grande quantidade de moléculas ativas como as citocinas (GÓMEZ ESTRADA; GONZÁLEZ RUIZ; MEDINA, 2011).
As citocinas são um grupo de substâncias mensageiras multifuncionais que transportam a informação de uma célula para outra, responsáveis pela indução de várias enzimas, tais como óxido nítrico sintase (NOS) e a ciclooxigenase 2 (COX-2). Elas podem ser anti-inflamatórias, por exemplo,
IL-10 e TGF- que modulam negativamente os eventos inflamatórios (GRISHAM;
JOURD’HEUILL; WINK, 1999; SZEKANECZ et al., 2006).
aumento na expressão de ICAM-1 e E-selectinas sobre o endotélio inflamado para captura de leucócitos circulantes (VAN ASSCHE; RUTGEERTS, 2005). Essas citocinas também são responsáveis por induzir as enzimas ciclooxigenases e lipoxigenases, além de provocar febre, sono e anorexia (GÓMEZ ESTRADA; GONZÁLEZ RUIZ; MEDINA, 2011).
A injúria tecidual resulta na liberação de neuromediadores inflamatórios (prostaglandinas, bradicinina, ATP, prótons e de crescimento do nervo factor) que, quando liberados por macrófagos, mastócitos, células endoteliais ou nervos traumatizados, ativam os nociceptores (fibras nervosas tipos Aδ e C)
2.5. Considerações Gerais sobre Óleos Essenciais
Os óleos essenciais são substâncias voláteis e aromáticas de consistência oleosa a temperatura ambiente, porém podem apresentar-se na forma sólida ou resinosa em diferentes colorações. Eles possuem grande aplicabilidade na indústria de perfumaria, em cosméticos, em detergente e em produtos alimentícios (REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012).
A síntese dos óleos essenciais pelas plantas pode acontecer em estruturas secretórias e são estocados em vários órgãos como folhas, flores, raízes, madeira, sementes e frutos. Os óleos essenciais são produzidos pelas plantas com a função de protegê-las contra patógenos, predadores e também para atrair alguns insetos para polinização ou, até mesmo, repeli-los (BAKKALI et a., 2008). Essa função repelente está presente nos óleos essenciais e representa, do ponto de vista econômico, um produto eficiente e mais seguro para os seres vivos (NERIO; OLIVERO-VERBEL; STASHENKO, 2010).
Os óleos essenciais são constituídos por uma mistura complexa de compostos lipofílicos classificados como terpenos e fenilpropanoides. Os terpenos formam uma família numerosa e estruturalmente variada, a qual contém unidades isoprênicas (C5) em sua estrutura química. De acordo com o número dessas unidades, podem ser classificados em monoterpenos (C10), que correspondem a 90% dos óleos, e sesquiterpenos (C15) (DE SOUSA, 2011; MACHADO; FERNANDES JUNIOR, 2011).
2.6. Nerolidol
O nerolidol é um sesquiterpeno acíclico, presente em vários óleos essenciais como composto majoritário (GELINSKI et al., 2007; MATTANA et al., 2010; MARQUES et al., 2011). Algumas propriedades farmacológicas já foram atribuídas a esse composto, como atividade antimicrobiana (MARQUES et al., 2011), antineoplásica (WATTENBERG, 1991) e leishmanicida (ARRUDA et al., 2005). Segundo Park (2009), o nerolidol possui uma ação antifúngica contra Trichophyton mentagrophytes, em virtude do rompimento de organelas e membranas celulares. O nerolidol é utilizado em vários cosméticos, como fragrância, e em alimentos, foi aprovado nos Estados Unidos da América pela agência reguladora Food and Drug Administration (FDA) como um agente flavorizante (ARRUDA et al., 2005; MCGINTY et al., 2010). Esse terpeno, em altas concentrações, induz uma clastogenicidade e uma fraca genotoxicidade, por isso, deve-se ter cuidado ao consumi-lo (PÍCULO et al., 2011). De acordo com Nogueira Neto et al.(2012), o nerolidol apresenta efeito ansiolítico e sedativo em modelos experimentais por meio de um mecanismo de ação ainda desconhecido.
3. Objetivos
3.1. Objetivo Geral
Avaliar a atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do nerolidol em modelos experimentais, utilizando estímulo químico e térmico.
3.2. Objetivos Específicos
Pesquisar os efeitos tóxicos do nerolidol em camundongos;
Caracterizar o efeito do nerolidol sobre o SNC;
Verificar a coordenação motora em animais tratados com o nerolidol no teste do rota-rod;
Analisar a ação antinociceptiva do nerolidol em modelos de nocicepção químicos e térmicos;
Investigar a participação dos sistemas opioides, GABAérgico e dos canais de potássio sensíveis à ATP na antinocicepção causada pelo nerolidol no teste da formalina;
Examinar a atividade anti-inflamatória do nerolidol no edema de pata induzido por carragenina;
Avaliar a influência do nerolidol na migração de células no modelo da peritonite induzida por carragenina;
Quantificar os níveis de TNF-α no lavado peritoneal de animais tratados
4. Material
4.1. Animais
Nos experimentos, foram utilizados camundongos (Mus musculus) Swiss (Figura 9), machos e fêmeas, com três meses de vida, pesando entre 25-35 g, provenientes do Biotério - Prof. Dr. Thomas George da Universidade Federal da Paraíba.
Os animais foram mantidos no biotério, em gaiolas de polietileno, contendo, no máximo, 20 camundongos por caixa, os quais permaneceram sob condições controladas de temperatura (21 ± 1o C), com livre acesso a uma
dieta de ração tipo pellets (Purina®) e água disponível em garrafas de polietileno. Os animais foram mantidos em ciclo claro/escuro de 12 horas, sendo a fase clara de 6:00 às 18:00 horas.
4.2 Condições Experimentais
No dia do experimento, as gaiolas de polietileno, contendo quatro animais em cada, foram levadas à sala de experimentação, a fim de proporcionar uma adaptação ao novo ambiente, para minimizar possíveis alterações comportamentais. Os camundongos foram privados de ração 4 horas antes do experimento.
As bancadas metálicas e os aparelhos utilizados foram higienizados com álcool 70%, entretanto, durante os testes, foi utilizado etanol com baixa graduação (10%), na tentativa de diminuir possíveis odores que possam interferir no comportamento dos animais.
Todos os procedimentos experimentais aconteceram no período entre 12:00 e 17:00 horas, sendo previamente aprovados pelo CEPA - Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFPB -, sob a certidão de no 0409/2009.
4.3 Substâncias utilizadas
Ácido acético glacial (Reagen - Brasil);
Bicuculina (Sigma – E.U.A);
Carragenina (Sigma – E.U.A);
Cloreto de sódio (Merck – E. U. A.);
Cloridrato de morfina (Merck – E. U. A.);
Dexametasona (Sigma – E.U.A)
Etanol (LTF / UFPB – Brasil);
Formaldeído 37% (Vetec – Brasil);
Glibenclamida (Sigma – E.U.A);
Hidrocloridrato de naloxona (Research Biochemical – E.U.A);
Kit para dosagem de TNF-α (eBioscience – E.U.A);
Nerolidol (Sigma – E.U.A);
Solução tampão fosfato (Sigma – E.U.A);
As substâncias utilizadas foram preparadas minutos antes do início do teste, sendo dissolvidas em água destilada, e, quando necessário, adicionou-se Tween 80, no intuito de facilitar a solubilização.
As doses foram calculadas de forma a possibilitar a injeção de 0,1 mL/10 g de peso do camundongo, com exceção da formalina e carragenina, as
quais foram injetadas por via intraplantar na quantidade de β0μL.
4.4 Aparelhagem
Aparelho de rota-rod (Insight – Brasil) (Figura 10);
Aparelho de placa quente (Panlab – Espanha) (Figura 11);
Caixa de observação para o teste da formalina (Brasil);
Citocentrífuga (Bio Research – E.U.A);
Micrômetro digital (Great – Brasil);
Microscópio óptico (Olympus – Japão);
Leitor de microplaca ELISA (Titertek Multiskan Reader – E.U.A).
Figura 10- Aparelho do rota-rod
Fonte: http://insightltda.com.br/
Teste da placa quente
5. Métodos
O delineamento metodológico do estudo da atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do nerolidol em camundongos está esquematizado na Figura 12.
Figura 12 – Resumo esquemático das metodologias utilizadas no estudo do nerolidol. TESTES PRELIMINARES
Determinação da toxicidade aguda
AVALIAÇÃO GERAL DO NEROLIDOL NO SNC
Triagem farmacológica comportamental
Teste do rota-rod
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO NEROLIDOL
Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
Teste da formalina
MECANISMO DE AÇÃO
Participação dos canais de K+ATP
Participação do
sistema GABAérgico sistema opioide Participação do
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO NEROLIDOL
Edema de pata induzido por carragenina
Peritonite induzida por carragenina
5.1. Avaliação da toxicidade do nerolidol
5.1.1. Determinação da dose letal 50% (DL50)
A determinação da dose letal 50% permite avaliar a toxicidade aguda de uma droga, pois, a partir da descoberta de uma dose capaz de provocar óbito em 50% dos animas, pode-se determinar uma margem de segurança para o estudo farmacológico (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006).
A determinação da toxidade aguda ou dose letal 50% (DL 50%) foi realizada em camundongos machos (n=4) e fêmeas (n=4), utilizando seis grupos de oito animais, tratados com nerolidol nas doses de 100, 500, 700, 1000 e 2000 mg/kg, por via oral. O grupo controle recebeu uma solução de água destilada mais três gotas de Tween 80 (veículo). As possíveis mortes ocorridas em consequência dos tratamentos iniciais foram registradas por 14 dias.
5.2. Avaliação geral do nerolidol no sistema nervoso central
5.2.1. Efeito do nerolidol na triagem psicofarmacológica
A triagem farmacológica comportamental é o primeiro passo para a identificação e a caracterização de uma droga no SNC e SNA, avaliada por meio de um protocolo experimental (Quadro 1), proposto por Almeida e Oliveira (2006). Essa metodologia permite o direcionamento do estudo farmacológico para testes mais específicos (FRANCO, 2003).
Após as administrações, os camundongos foram colocados em gaiolas de polietileno para a visualização dos parâmetros comportamentais durante um período de quatro horas, divididas em intervalos de 30, 60, 120 e 240 minutos dos tratamentos iniciais (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006).
Quadro 1 – Protocolo experimental utilizado na triagem farmacológica comportamental
ATIVIDADE FARMACOLÓGICA Quantificação dos efeitos (0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito aumentado, (++) efeito intenso
até 30` 1h 2h 3h 4h
1 – SNC
a – Estimulante
Hiperatividade Irritabilidade Agressividade Tremores Convulsões Piloereção
Movimento intenso das vibrissas Outras_____________________
b – Depressora
Hipnose Ptose palpebral Sedação Anestesia Ataxia
Reflexo do endireitamento Catatonia
Analgesia
Resposta ao toque diminuído Perda do reflexo corneal Perda do reflexo auricular
c – Outros comportamentos
Ambulação Bocejo excessivo Limpeza Levantar Escalar Vocalizar Sacudir a cabeça Contorções abdominais
Abdução das patas do trem posterior Pedalar
Estereotipia
2 - SN AUTÔNOMO
Diarréia Constipação Defecação Respiração forçada Lacrimejamento Micção Salivação Cianose Tono muscular Força para agarrar
3 – MORTE
5.2.2. Teste do Rota-Rod
O teste do rota-rod, inicialmente descrito por Dunham e Miya (1957), avalia uma possível propriedade miorelaxante ou neurotóxica de algumas drogas com perfil depressor no SNC (COPASSO et al., 1996; DE SOUSA et al., 2007). Nessa metodologia, a coordenação motora é verificada por meio da capacidade do animal em permanecer sobre uma barra giratória em intervalos de tempo pré-estabelecidos (MATTEI; FRANÇA, 2006).
Vinte quatro horas antes do experimento, houve uma pré-seleção dos animais, sem administração de qualquer substância, sendo excluídos aqueles que não conseguiram permanecer sobre a barra giratória (7 r.p.m.) por, pelo menos, um minuto em três tentativas.
Os animais selecionados foram divididos em grupos (n=6) e, em seguida, tratados com veículo ou nerolidol (200, 300 e 400 mg/kg, p.o.), uma hora antes da realização do teste. Cada camundongo teve seu tempo de permanência na barra giratória cronometrado, e as observações ocorreram aos 60, 120 e 180 minutos dos tratamentos iniciais.
5.3. Estudo da atividade antinociceptiva do nerolidol
5.3.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
A administração intraperitoneal de ácido acético 1% provoca uma irritação no peritônio, desencadeando um efeito nociceptivo representado por uma contração na musculatura abdominal seguida de uma extensão dos membros posteriores. Essa contorção acontece em virtude da ativação de canais de cátions não-seletivos em neurônios nociceptivos periféricos, como também na liberação de vários mediadores inflamatórios (MING-TATT et al., 2012).
anticonvulsivantes, anticolinérgicas e anti-histamínicas (STEPANOVIC-PETROVIC et al., 2008; HUANG et al., 2010).
Os animais foram separados em grupos contendo oito camundongos machos, os quais receberam os seguintes tratamentos: veículo, nerolidol (200, 300 e 400 mg/kg, p.o.), morfina (6 mg/kg, i.p.) ou dexametasona (2 mg/kg, s.c.). Transcorridos 30 minutos, houve a administração intraperitoneal de uma solução de ácido acético 1%, e, em seguida, os camundongos foram colocados, individualmente, em caixas de polietileno, para que houvesse o registro do número de contorções abdominais em 10 minutos de observação. A atividade antinociceptiva foi determinada pela inibição significativa do número de contorções abdominais dos animais tratados com o nerolidol, quando comparada ao grupo controle.
5.3.2. Teste da formalina
Inicialmente descrito por Hunskaar, Fasmar e Hole (1985), essa metodologia consiste na administração subcutânea de 20µL de uma solução de formalina na pata direita do animal. Após a injeção do estímulo doloroso, os camundongos foram colocados em um aparato triangular composto por duas paredes espelhadas e uma de vidro transparente, facilitando a visualização do animal, para que seja cronometrado o tempo de lambida da pata em duas fases (SHIBATA et al., 1989). A primeira (0-5 min) ocorre imediatamente, após a administração da formalina, provocando uma resposta nociceptiva decorrente da estimulação química direta dos nociceptores e liberação de aminoácidos excitatórios (TJOLSEN et al., 1992). Depois, há um período chamado de interfase (5-15 min), que é caracterizado pelos mecanismos endógenos de supressão da dor (HENRY et al., 1999; GAUMOND.; SPOONER; MARCHAND, 2007). A segunda fase (15-30 min) é conhecida por um processo inflamatório, levando a liberação de mediadores como a serotonina, histamina, bradicinina e prostaglandina (PARADA et al., 2001).
ou morfina (10 mg/kg, i.p.). Após 30 minutos dos tratamentos, injetou-se uma solução de formalina 2,5% na região subplantar da pata direita dos camundongos, provocando um comportamento nociceptivo que foi registrado nas duas fases citadas acima. Uma redução dessa resposta dolorosa nos animais tratados com o sesquiterpeno em estudo, quando comparado ao grupo controle, indicará uma atividade antinociceptiva.
5.3.3 Teste da Placa Quente
O teste da placa quente consiste em quantificar o tempo que o animal permanece sobre uma superfície metálica previamente aquecida a 56 ± 1oC. O tempo em segundos que o animal leva para lamber, levantar ou morder uma das patas foi cronometrado e considerado como um indicativo de dor, já que são respostas nociceptivas integradas supraespinhalmente (YAMAMOTO; NOZAKI-TAGUCHI;CHIBA, 2002). Esse evento é caracterizado por uma
ativação dos nociceptores (fibras C e Aδ) que conduzem o impulso nervoso ao
corno dorsal da medula espinhal e aos centros corticais (DICKENSON; BESSON, 1997).
Inicialmente, os animais foram submetidos a uma pré-seleção, sem administração de qualquer substância, sendo considerado apto aquele que obtivesse um tempo de resposta à dor inferior a dez segundos, quando colocado sobre a placa quente.
5.4. Avaliação dos possíveis mecanismos de ação na atividade antinociceptiva do nerolidol
A fim de esclarecer os possíveis mecanismos de ação envolvidos na antinocicepção induzida pelo nerolidol, utilizaram-se agonistas e antagonistas em doses já estudadas na literatura (VIDYALAKSHMI et al., 2010; KHALID et al., 2011). A reversão da atividade antinociceptiva do nerolidol por um bloqueador de uma via importante na modulação da dor indica um possível mecanismo de ação do mesmo. Para tanto, foram utilizados o teste da formalina e a dose de 400 mg/kg de nerolidol, pois foi a que obteve melhor desempenho no modelo selecionado.
As vias de neuromodulação escolhidas foram a opioidérgica, a GABAérgica e os canais de K+ sensíveis à ATP devido as suas importâncias na sinalização da dor.
5.4.1. Participação do sistema opioide
Com a finalidade de avaliar a influência do sistema opioide na resposta antinociceptiva do nerolidol, grupos de animais foram tratados com o antagonista opioide não-seletivo (naloxona, 5 mg/kg, s.c.), quinze minutos antes da administração da morfina (6 mg/kg, i.p.) ou do nerolidol (400 mg/kg, p.o). Decorridos trinta minutos da administração da morfina e uma hora do tratamento do nerolidol, os camundongos foram submetidos ao teste da formalina.
5.4.2. Participação do sistema GABAérgico
A fim de evidenciar o envolvimento do sistema GABAérgico na ação antinociceptiva do nerolidol, os animais foram pré-tratados com a bicuculina (antagonista GABAA, 1 mg/kg, i.p.), quinze minutos antes da administração do
solução de formalina na pata direita do animal para avaliação do comportamento nociceptivo.
5.4.3. Participação dos canais de K+ ATP
Na tentativa de investigar o papel dos canais de K+ATP na
antinocicepção causada pelo nerolidol, os camundongos foram pré-tratados com a glibenclamida (bloqueador dos canais de K+ATP, 10 mg/kg, i.p.) e, quinze
minutos depois, receberam o nerolidol (400 mg/kg,i.p.). O efeito nociceptivo foi avaliado no teste da formalina.
5.5. Estudo da atividade anti-inflamatória do nerolidol
5.5.1. Edema de pata induzida por carragenina
A administração de 20 µL de carragenina (1%) na região subplantar provoca uma inflamação aguda com consequente formação de edema e hiperalgesia (GONÇALVES et al., 2011).
Para a realização desse experimento, os camundongos foram divididos randomicamente em grupos (n=7) tratados com veículo, nerolidol (200, 300 e 400 mg/kg, p.o.) ou dexametasona (2 mg/kg, s.c.). Antes do início do experimento, a espessura das patas traseiras, esquerda e direita, de cada animal foram medidas com o auxílio de um micrômetro digital, sendo a diferença entre elas considerada a medida basal.
Após uma hora, os animais receberam 20 μL de uma solução de
carragenina (1%) na região subplantar da pata posterior direita e 20 μL de
salina na pata posterior esquerda. O grupo controle negativo recebeu apenas a solução salina nas duas patas.
estímulo nocivo. A variação da espessura da pata esquerda e direita de cada animal foi o parâmetro analisado neste experimento.
5.5.2. Peritonite induzida por carragenina
Com a finalidade de avaliar a capacidade do nerolidol em inibir a migração celular após a administração de um estímulo inflamatório, utilizou-se o modelo da peritonite induzida por carragenina (PANTHONG et al., 2003).
Nesse propósito, os camundongos foram separados em grupos e tratados com veículo, nerolidol (200, 300 e 400 mgkg, p.o.) ou dexametasona (2 mg/kg, s.c.). Após 1 hora dos tratamentos, administrou-se uma solução de carragenina (1%) por via intraperitoneal para indução da inflamação.
Depois de 4 horas do desafio com carragenina, os animais foram eutanasiados, e 300µL de PBS gelado foram injetados na cavidade peritoneal. Cautelosamente, o peritônio foi massageado, e o lavado peritoneal foi puncionado e colocado em tubos tipo eppendorf, para que fossem centrifugados a 1500 rpm, por 5 minutos, a 4oC. O sobrenadante foi removido e armazenado a -20oC, para posterior dosagem da citocina TNF-α.
As células presentes nos pellets foram suspensas de novo, e cada amostra foi diluída com a solução de Turk na proporção 1:10. Com a ajuda de uma pipeta automática, a amostra diluída preencheu o espaço contido entre a superfície espelhada e a lamínula presentes na Câmara de Neubauer. A contagem ocorreu em um microscópio óptico na objetiva de 40X.
5.5.3. Dosagem de TNF-α no lavado peritoneal
A determinação dos níveis de TNF-α foi realizada a partir do
sobrenadante do lavado peritoneal, utilizando kit de ELISA específico. A leitura das microplatas foi feita a 450 nm, e a quantidade da citocina foi calculada a partir da curva-padrão. Todos os procedimentos foram executados de acordo com as instruções do fabricante.
5.6. Análise estatística
Os resultados foram analisados utilizando o método de Análise de Variância (ANOVA) “one-way” seguido do teste de Dunnett para comparação entre as médias. Os dados obtidos foram expressos como média ± e.p.m (erro padrão da média), sendo os valores considerados significativos, quando apresentassem um nível de significância (p) menor que 0,05.
A porcentagem de inibição foi determinada pela comparação entre as médias do grupo controle e experimental, calculadas pela seguinte fórmula (OYEMITAN et al., 2008; IJEOMA et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2012; TAHER, 2012).
6. Resultados
6.1. Avaliação da toxicidade do nerolidol
6.1.1. Determinação da dose letal 50%
A toxicidade aguda do nerolidol foi avaliada por meio da contabilização do número de mortes por um período de 14 dias. No final da observação, constatou-se que o nerolidol não promoveu mortalidade nos camundongos até a dose de 2000 mg/kg, por via oral. Diante disso, não foi possível calcular a DL50, uma vez que essa possui valores maiores que 2000 mg/kg.
6.2. Avaliação geral do nerolidol no SNC
6.2.1. Efeito do nerolidol na triagem psicofarmacológica
Os camundongos tratados por via oral com o nerolidol apresentaram diferenças comportamentais importantes, quando comparados ao controle. Na dose de 100 mg/kg, o sesquiterpeno não apresentou atividade no sistema nervoso central, entretanto as doses de 300, 500, 700, 1000 e 2000 mg/kg provocaram uma analgesia intensa, principalmente, na primeira hora de observação, persistindo durante as quatro horas analisadas. Esse parâmetro foi avaliado pelo tempo de reação do animal ao ter sua cauda pressionada por uma pinça.
Uma redução na resposta ao toque diminuído e na ambulação foi observada nas duas primeiras horas da administração do nerolidol na dose de 500 mg/kg, como também nas doses de 1000 e 2000 mg/kg, a qual perdurou durante toda a análise.
algumas perturbações no sistema nervoso autônomo como diminuição na força de agarrar e constipação.
6.2.2. Efeito do nerolidol no teste do Rota-Rod
Nesta metodologia, não ocorreram alterações significantes na coordenação motora dos camundongos tratados com nerolidol nas doses de 200, 300 e 400 mg/kg, após a avaliação da capacidade do animal em permanecer sobre a barra giratória nos tempos de observação de 60 (180,0 ± 0,0, 177,7 ± 2,3, 159,0 ± 14,0), 120 (180,0 ± 0,0, 177,7 ± 2,3, 161,2 ± 18,8) e 180 (179,0 ± 1,0, 180,0 ± 0,0, 164,7 ± 15,3) minutos dos tratamentos iniciais, quando comparado ao grupo controle nos mesmos períodos de avaliação (179,0 ± 1,0, 178,5 ± 1,5, 180,0 ± 0,0)(Figura 14).
60 120 180
0 50 100 150 200 Controle 200 mg/kg 300 mg/kg 400 mg/kg
Tempo de observação (min)
Te m po d e pe rma nê nc ia na b ar ra g ir at ór ia ( se g)
Figura 13 - Efeito da administração do veículo (grupo controle) e nerolidol (200, 300 e 400 mg/kg, p.o.) na função psicomotora avaliada no teste do Rota-Rod. Cada coluna representa
6.3. Estudo da atividade antinociceptiva do nerolidol
6.3.1. Efeito do nerolidol no teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
De acordo com o apresentado na Figura 15, o nerolidol foi capaz de diminuir o número de contorções abdominais induzidas por ácido acético em camundongos nas doses de 200 (17,3 ± 1,1), 300 (18,0 ± 4,7) e 400 (24,7 ± 2,2) mg/kg, representadas, respectivamente, pelas seguintes porcentagens de inibição, quais sejam, 54,9%, 53,0% e 35,5%, quando comparado ao grupo controle (38,3 ± 1.9). Como esperado, a morfina (6 mg/kg, i.p.) produziu uma inibição de 93,2% (2,6 ± 1,2), e a dexametasona (2 mg/kg, s.c.) 55,9% (16,9 ± 3,2) em relação ao grupo controle.
Controle 200 300 400 6 2
0 10 20 30 40 50
***
***
**
***
***
NERO (mg/kg) MOR DEXA
N
o d
e
co
nt
or
çõ
es
a
bd
omi
na
is
Figura 14 - Efeito da administração do nerolidol (NERO, 200, 300 e 400 mg/kg, p.o.), morfina (MOR,6 mg/kg, i.p.) e dexametasona (DEXA, 2 mg/kg, s.c.) nas contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético. Cada coluna representa média ± e.p.m(n=8) (ANOVA “one-way”
