Estudo por espectroscopia fotoacústica dos efeitos da hidratação em hemoproteína...

"E S T U D O P m E S P E c m o s a P IA F O T 1 J A C Ú S T J C A D O S E F E lIO S D A H lD R A T A Ç Ã O

E M H !J 1 ::F R O T E ÍN A S " ,

'---

_

.•...•. I

\

Dissertação apresentada ao Insti-tuto de Física e Químicade São Carlos, para obtenção do titulo de Mestre em Física Aplicada.

- A Profa. Rosemary Sanches, pela sua orientação .. por sua amizade e

dedicação.

- Ao PrOT. Helion VargBs, pela oportunidade e aoessibilidade ao seu

laboratório, pelo seu estimulo e pela amizade.

- Ao ProT. Otaciro R. Nascimento, pelo estimulo e .3.mizade.

- Ao Prof. José N. Onuchic, pelo estimulo e amizade.

- Aos colegas do laboratório de Bioflsica, S. Crestana, C. F"onzar, E. Koury,

L. Hartin, L. F"ernando, P. Cesar, W . Luiz, V. Barbanti, pelo companheirismo e

amizade.

- Ao colega Paulo Estevão (Juca>, pela colaboração, estimulo e amizade.

- Aos colegas do DF"CH,Elder, Marcos, Titão. Dulcinei, St.ella, Bras, Nagib ..

Artemis, ete., pelo-·seu apoio e amizade.

- Aos colegas do Laborat.ório de Elet.rônica Quântica (UNICAHP),Vinhas e

Noberto pelo seu apoio e amizade.

- Aos t.écnicos da Oficina de Eletrônica, F"erro, Valdir e João, pela amizade e

- Aos técnicos da Bioflsica., Sanches, Izabel e Roberto, pela acessoria

técnica e pela sua amizade.

- Aos técnicos do Laboratório de Eletr8nica Quântica, Dina pelo seu apoio a

amizade.

- Ao Samuel pela confecções dos desenhos.

- Também agradeço aos meus pais Manoel Cornélio da Sílva e W aldete Lapes

Cornélio .. pelo amor e dedicação.

Desejo agradecer à minha esposa Llrida da Silva Cornélio, pelo

L is ta d e T a b e la s

Lista de Figuras

R.sumo

Capitulo I

Introdução

34

•

_• , :

35

111.2.1.8 - Circuito Divisor para Obtenção

da Absoryão da Amostra 46

Figura

.L .1 -

Complexo rerro-porflrina para a mio;lobina com a

sexta coordenada desocupada

3

Figura..L..-ª. Estrutura terciária da mioglobina com o grupo

heme, onde liga-se o oxigênio 5

Figura ~ - Corte seccional da célula fotoacústica cilindrica

FiQura ll...:..â. Representação esquemática dos casos especiais

para a teoria fotoacústica dos sólidos 27

Figura 111.1 - Diagrama de bloco do espectr6metro

fotoacústico 38

Figura 111.2 - Esquema ótico do monocromador 40

Figura 111.3 - Corte seccional da célula fotoacústica 44 Figura 111.4 - Esquema de funcionamento do fe L 8013 47

Figura 111.5 Diagrama de bloco do circuito divisor para

obtenção do ~spectro da amostra 49

F ig u ra IV .S - E s p e c tro s fo to a c ú s tic o s d e m io g lo b in a a 1 1 % e 9 3 %

U R o b tid o e m e Q u ip a m e n to o o m e rc ia l a 8 0 H z e band pass 4 5 8

F ig u ra 1'",'.4 E s p e c tro s fo to a c ú s tic o s n o in fra v e rm e lh o p a ra

h e m o g lo b in a a 1 1 % U R , m o s tra n d o a s b a n d a s d e H20 e N H , o b tid a

hemoglobina mantida em várias umidades relativas nas mesmas

condições anteriores 61

Figura 1 V .6 - Gráfico da curva de isoterma de absorção 6 2

Figura ~ - Gráfico da relação entre a razão das intensidades

(11/12) e o conteúdo de água nas amostras 63

Figura ~ Espectros fotoacústicos no infravermelho para mioglobina de cavalo a 11% e 93% IJ R obtido em equipamento

Figura IV.9 - Espectro fotoacústico para a lâmpada de Xenônio obtido no equipamento montado com 15,9 Hz e largura de banda de

6,4 nm demonstra a relação sinal ruído 67

Figura 1V.10 Espectro fotoacústico de hemoglobina-CO em solução obtido a 15,9 Hz e largura de banda 6,4 nm demonstra a

reprodutibilidade do equipamento montado 68

Figura 1V.11 - Espectro Totoacústioo de hemoglobina-CO em pó a 11% UR obtido no espectrêmetro montado a 78,1 Hz e largura de

banda de 3,2 nm 70

Figura 1 V .1 2 - Espectros fotoacústicos de hemoglobina-CO em pó

Figura

V.i - Representayão

eSQuemática

do bolso heme, mostrando

Figura ~ - Representação eSQuemática do bolso heme, mostrando

No presente trabalho, realizado com hemoprotelnas na forma

de pó, o efeito da hidratação foi observado através de

espectroscopia fotoacústica. Amostras de carboxi-hemoglobina e

carboxi-mioglobina mantidas em diferentes ambientes de umidade

relativa (UR), mostraram variações em seus espectros na região

da banda de $oret. Para amostras mant.idas em baixa hidrat.aç.ão

caracterlstico do derivado ca.rboxi, em alta hidratação (acima

de aproximadamente 90% UR) o espectro era caracterlstico do

derivado oxi e na região intermediária o espectro era de uma

mistura dos dois derivados. Essa mudança de ligante observada

em alta hidratação pode ser explicada supondo Que a protelna

tem flexibilidade e atinge um estado conformacional Que

possibilita a entrada e salda do ligante. Em baixa hidratação a

estrutura da protelna é rigida e tal Que o acesso ao grupo heme

indicam a exist~ncia

SERViÇO DE BIBLICTECA E INFORt .•.IAÇAO _ IFQSC

INTRODUÇÃO

Esta dissertação, tem como objetivo o estudo do efeito da

hidratação em hemocrotelnas na forma de có. Para t.anto, foi utilizada a técnica de

escectroscocia fot.oacústica (1-3] em um e!5PectrÔfnetro comercial e em um

espectrômetro montado em nosso laboratório. Nossa escolha recaiu sobre estJa

técnica por desejarmos obter espectros da absorção de amostras opacas , o que

inviabiliza a espectroscOPia de absorção convencional.

Utilizamos dois tipos de hemoprotelnas, a hemoglobina

humana e mioglobina de cavalo. Tanto a hemoglobina como a mioglobina têm como

parte de sua função a interação com o oxigênio. A hemoglobina é a responsável

pelo transpOrte do oxigênio no sangue e a mioglobina pelo armazenamento do mesmo

nos músculos [4]. A interação com o oxigênio acontece na sexta posição de

coordenação de um lon de ferro Que está ligado a um anel porflrinico e a um amino

ácido da protelna. A figura 1.1 mostra esta região para a mioglobina [5]. No caso da

hemoglobina, formada por Quatro subunidades similares à mioglobina, existem Quatro

desses grupos.

o

.,mel porfirlnico e o 10n de ferro formam o grupo heme

Que é o responsável pela absorção de luz vislvel (grupo cromóforo). A localização

desse grupo tanto para a hemoglobina ti para a mioglobina pode ser melhor

/ F ~

FI~ 1.3:Estrutura terciária da mioglobina com o grupo heme,

coordenação do ion de ferro, observa-se uma localização das bandas de absorção,

comoé mostrado na tabela 1.1[4] para alguns derivados de hemoproteinas.

Posiçio (nm )

capazes de ligar água através aa formação de ligação de

hidrogênio. Estes são grupos carregados ou polares Que ocorrem

entendermos como a hidratação afeta a atividade da protelna.

Apesar da desi dra tação fazer com Que a protelna perca a sua

funcionalidade, ao ser rehidratada ela recupera sua função

[10]. Portanto a protelna não sofreu nenhum dano estrutural

~ .~ .•....

,.,.~ ~ .~ ---_ ...-.---

...•

S é R V iÇ O D E B IB L IO T E C A E IN F O R M r\ç A O - IF O S C

7

A perda de funcionalidade da proteina em

baixa umidade

tem sido relacionada

com a perda de flexibilidade

compreendida a partir do fato de Que a proteína não possue uma

estrutura

rígida,

mas

oue

pode

ter

várias

conformações,

ou

hidratação e flexibilidade estrutural foi confirmada mais recentemente por várias técnicas e para várias protelnas

[12-A idéia para esta dissertação teve como trabalhos realizados anteriormente no grupo ~e

8

seis

No capitulo é fei ta uma introdução com uma

ideia geral do ei'ei to da hidrataçâo em proteínas e o problema

a ser abrangido.

No capitulo 11 temos o desenvolvimento da teoria feita por Rosencwaig-Gersho, Que é importante por ter dado as explicações básicas para o efeito fotoacústico e sua diversidade de aplicações.

No capitulo 111 temos a descrição do

espectrBmetro fotoacústico montado em nosso laboratório.

No capitulo IV mostramos os resultados obtidos para as proteinas estudadas e os testes fei tos com o eQuipamento montado.

N o resultados obtidos.

MATERIAL

DE

SUPORTE

CAMADA DA

INTERFACE G ÁS- AMOSTRA

,

GAS (AR)

LUZ

INCIDENTE

LJ-....-

l_

/C: condutividade térmica ( cal )

cm·seg··C

p: densidade (~)

cm3

c:

calor especifico (cal)

g··C

= ~ 1₀(1 + cos wt) ( I I .i )

onde

1

0 é

o

fluxo

da

luz

monocromática

incidente

(W/cm~).

9(x,t)= { b

1+ b2x+ b3exp(,IJ x) +

(u

eXP(CTaX)+V eXP(-CTax)-E exp(,ax»).

eXP(.iwt) -li~ X ~

o

onde W, U, V, E, e 9₀ são constantes complexas, b

1, b2, b3, Wo' e

F são const.antes reais 1 e 0'=( 1 + .i)a com a = (w!2a. )1/2. Em

_ ...""1.--.:.__

SLRVIÇO DE BIBLIC;TECA E INFORMr\ÇAO _ IFOSC

Quantidades W_o e F denot.am a componente d.c. da temperatura (referent.e ao ambiente> nas superficies da amostra em x= -li e

x=O, respect i vamente. As Quant i dades E e b

3 determi nadas pel a

funcão_, em (11.3), são dadas por

b =

-A

<11.9)

3 {32

A

(J 1

0 _<11.10)

E

₌

_{( ,,2}

₌

ae,

ae

a

leg

ãX

(O, t) - lea

ãX

(O, t )

ae

_s

ae

_a

I<s âx (-la, t) - I<a

ãX

(-la, t )

l

~.r~~-

··'ff'( (t~ ~

.-e

= ISIo (r-!)(b+!).eXP(0-1)-(r+!)(b-!).eXP(-0-1)+2(b-r).eXP(-1l

I)}

número cuia parte real e imaginária, ele e

z' respectivamente

Ta.c: (x I t) = e xp (-a,x )

(e

1cos (wt-a,x) -

e

2s e n (wt-a,x ))

22

J:Jndeusamos a aprox imacio e-2'1f

«

1.

7Po _7Po

=

SV

=

SX(t)

Ll.p (t) = Q c os ( w t-'lf / 4) - Q se n ( w t-'lf / 4 )

1 2

onde Q e Q são as partes real e imaginária de Q .• q e 1/J são a

1 2

Q = Q +iQ = q·exp( -if/J)

1 2

Q .eI07Po X ( r -1 ) ( b +1 ) e x p (0'1) - (r +1 ) ( b -1 ) e x p (-0'1 )+ 2 ( b - r ) e x p (-aI)

=242

T Idga ({32_ 0'2) (9+1) (b+1 )exp(0'1) - (9-1) (b-1) exp (-0'1)

o

~= l/B com a espessura da amostra. Para cada categoria

ausorção ótica l~. Para todos os casos calculados a seguir, foi

OTICAMENTE TRASPARENTE

OTICAMENTE OPACO

I

CASO I(o) I_I

I

_I

_I

_{I I}

I I

fol

I

I I I I

I _{CASO I(b)} I _ICAS02(b)1

I

I

I

I

fol

I _I

I I

I _{CASO I(c)} I

I I

I

I

I

I I

I I _I

I

I

fol

I

I

_,

-~

fol

fol-"Q-

Ci)

'(3

=

1/(3

±CT1a

e '::'(1±CTlc ) 1

-0'1.1 e '::'0,

±c:T1a _i

e ':'&', e

Q'::' ( i-i

)(SJ.S)v

-O"la

e ~O,

Q~ y (.6-2a-i.6)~(1-i)(~)y

2~a~~ 2~ ~

-O"la

32

m.!. HATERlAIS E t-ÉToDOS

m.i.i. Prepar~ das Amostras

m.i.i.a. Hemoglobina-eo

A hemoglobina utilizada foi obtida de sangue humano.A purificação foi

feita com o seguinte procedimento: a amostra foi lavada em solução de sal~na

tamponada com pH igual a 7.4 , em seguida Toi posta para centrHugar a 3500 rpm a

uma temperatura de 4°C durante um tempo de 15 minoO sobrenadante foi, então,

descartado e o mesmo procedimento Toi repetido por mais duas vezes. Dessa

maneira conseguimos a separação das hemáceas às quais foi, então, adicionada água

destilada para que a parede celular fosse rompida liberando a hemoglobina. O

hemolizado foi centrifugado por 30 mino a 15000 rpm na mesma temperatura. O

material depositado foi descartado e nós obtivemos a hemoglobina em solução. Em

seguida esta solução foi colocada na presença de Monóxidode Ca.rbono(CO)obtido

através da reação de Ácido Fórmico (HCOOH)com Ácido Sulfúrico (H2S04). Pelo fato

d~ monóxidode carbono ser obtido em meio ácido fizemos com que o gás passasse

por uma solução de Hidróxido de Sódio (NaOH),precaução esta para evitar uma

possível desnaturação da proteína. A ligação do CO à hemoglobina fci comfirmada

por medidas de espectroscopia convencional [4J . Após a obtenção da

hemoglobina-CO ela foi congelada a temperatura de nitrogênio Üquido e foi, então, posta para

relativas, conseguidas com diferentes soluções saturadas de sais (25-26]. Após um

exatamente nesta situacão pois temos em mãos hemoprotelnas Que

5.Célula Fotoacústica

6.Detetor de Potência (Piroelétrico)

7.Locl<-In

a.Motor do Monocromador Registrador X-V

9.Circuito Divisor para Obtenyão da Absoryão da Amostra

A fonte de luz utilizada é uma lâmpada de Xenônio

da Oriel (XBO 150 W/1) cujo espectro varre todo o visível e

infra-vermelho próximo. Algumas de suas características est.ão

na tabe1a II1 .1 .

Tampo de Vida 1200 hs

Voltagem de Operayão 20 volts

Corrente de Operação 7,5 amp

~ ~ ~

---FIBRA ÓTI.CA MOTOR DE PASSO DETETOR P I ROELETR ICO

\

WJ---oo-lM ---

-LENTE

CONDENSADORA

LENTE COLETIVA

DA FENDA

FENDA

DE

~ ~ E N T R A D A

GRADE

DE

DIFRAÇÃO

ESPELHO

CÔNCAVO

FEr,JDA DE

SAlDA

~ I/

L:~TE

CORRETORA

S e R V iÇ O 6E 'B '~ii'LIL~ttE Â

E

IN FõR M AÇ X'Ô _ IF Q S C

caracterlsticas da grade de difracão.

I

Características

da grade de difracão

A Figura 111.3 ilustra o eSQuema da oélula

SUPORTE PARA O CORPO DA CÉLULA

FOTOACÚSTICA

! ! !

CORPO DA CÉLULA FOTOACÚ STICA

(CANAL ACÚSTICAMENTE)

Quando o perlodo de modulacão torna-se mais curto I

47

Para Que o mesmo trabalhe como um divisor de sinais o seu

funcionamento é baseado no seguinte, como mostra o eSQuema

r- __ ~"~''''',;t>."_..•••.~,,..•..•A''':.,;':''~''''''''A.~>I_>.~''''''-'',.i~'''~""""""""' •••••• __ ••• SERViÇO DE BiBLI0ECA E INFORMAÇAü - IFQSC

OUT PUT • 10 Zin Xin

LN741 4

VEI!

ICL SOl3 878.10

Yos

V-3) Com Zin= O V e _{Xin= -10,0 V ajuste} Vos para obter-se

zero na voltagem de salda.

variação mínima da salda, Quando _{Xin varia de -10 V até -1 V.}

Os resultados apresentados são dividos em dois grupos: o

primeiro deles são referentes a dados obtidos de medidas realizadas na UNICAMP

junto ao grupo de Eletrônica QlJântica. em colaboração com o Prof. DI"'. Helion

'..largas, utilizando o espectrômetl"'o fotoacústico comercial "edt researoh DAS

400". Estas primeiras medidas foram feitas para a hemoglobina e

mi ogl obi na em pó. O segundo grupo de resul tados foram

conseguidos com o espectrômetro fotoacústico montado em nos'so

laboratório. Os resultados iniciais na região do vislvel foram

repetidos e foi feito um estudo mais detalhado sobre o efeito

da hidratação na hemoglobina. Também estão mostrados alguns

testes realizados com o eQuipamento montado, reprodutibilidade.

A seguir são mostrados dados obtidos pelo espectrômetro

fotoacústico comercial.

preparação da amostra foi feita de modo Que a hemoglobina

tivesse como seu ligante inicial o monóxido de carbono (CO).

Este derivado se caracteriza por picos da absorção em 4!9 nm

5 4

o espectro Totoacústico para a hemoglobina em PÓ onde pode-se

ver perTei tamente a banda de Soret am 419 nm. Já as bandas ~ e 13

nio sio bem resolvidas, mas sio vislveis em torno das posiç5es

esperadas. A semelhança entre este espectro e o espectro ótico

já era esperada e já havia sido observada para 0$ derivados oxi

e meta hemoglobina

(33].

Com rel ação

mant i da seca

à hidratação, foi observado que

11% de um idade relativa (UR) a

banda de Soret estava em 419 nm, caracterlstica do derivado

hem oglobina-CO (figura IV.2). Para as am ostras m ais úm idas a

banda se desloca para valores m enores I sendo que para 9 3 % 'de

419

419

I

414

I

350

400

500

alta umidade (93X) a posição da banda muda para 418 nm. Para a

mioglobina também não ~oi possivel resolver as bandas a e ~,

intensidade da banda de água nos dá uma medida da hidratação da

400

COMPRIMENTO

DE ONDA

(nm)

422

I

400

NH

!

1,8

I

2,0

I

2,2

1,90

2,00

2,10

f.lm

58,5

%.

UMIDADE

RELATIVA

DAS AMOSTRAS

ScRVIÇO D-iE;:B~-MEC::-A~E'":"~N~F O~"'-'::R·tv~1~A""Ç~Ã""'0-_-'-FQ-S

-c"

0,6

-

_<t

0,5

.~.

2

O

0,5

CA)

FIGURA IV.7:Gráfico da relação entre a razão das intensidades

([1/12) e o conte6do de água nas amost~as.

o

gráfico não mostra barras de erro porQue as medi das não puderam ser repet idas. Esses dados prel imi nares

ESDectros simi1ares aos da hemogl obi na foram obt.idos Dara a mioglobina-CO de cavalo nesta mesma região do infravermelho, como está mostrado na figura IV.S para amostras mant.idas em 11% e em 93% de umidade relativa.

o estudo para a mioglobina não foi mais detalhado devido a pouca Quantidade do material disponlvel.

1\ I \ I \ I \ I \ I \

I " • • .• .• .\

I \ ,/

I \ I

I \_ /

I I I I I \ I \ I , I

,

...•.

I

419

I

570

I

540

69 Fizemos ainda um espectro da hemoglobina-CO em pó a

i1%

UR} como mostra a figura

IV.ii.

A posição das bandas é a esperada para este derivado da hemoglobina [23]. Além disso o espectro é bastante similar ao obtido com o espectr8metro Totoacústico comercial para a mesma amostra (ver figura IV.i>.

UMIDADE

RELATIVA

DAS AMOSTRAS

400

COMPRIMENTO

450

DE

ONDA

(nm)

8501.

93,50/.

72

Observa-se Que a banda or i~i nalmente em torno de

420nm cara amostras mais secas, desloca-se cara valores menores

ao se aumentar a hidrata9âo da amostra. Para a hidrata9âo mais alta utilizada (93,5% de umidade relativa) a banda se encontra em torno de 414 nm.

banda de Soret como efeit.o da hidr.t.a9ão fizemos um gráfico da posi9ão dessa banda em fun9ão da umidade relat.iva (figura

IV.13).

Os valores assinalados foram obt.idos da média de cinco medidas a partir das Quais foram obtidos também os erros, indi cados pel as barras. Apesar do erro ser grande, é

o

o

•

o

73 O)

•

O CD

•

O

I"-•

O <O

•

-

~

O

-

o

lC)

a:::

~

•

O qo

•

O rt)

o

m CD I"- <O I I I qo rt)

C\J

-

-

-

-qo qo qo qo qo qo _qo qo

(WU) _{\'fONO 30 01N3WI ~dW O::>}

FIGURA IV.~3:Gráfico da variação da banda de Soret com

Pelos dados obtidose QUe foram apresentadosno capitulo IV podemos comparar o espectrometrofotoacústicomontado em nosso laboratório com o eQuipamentocomercial.Também foi possivelperceber o deslocamentona banda de Soret causado pela hidratação [12]. O eQuipamento não está em sua melhor performance, isto deve-se a problemas ou melhor a limitações da própria montagem, como por exemplo,

fonte de luz com pouca potência, monocromador com rede de difração espectral apenas no visivel, eficiência de apenas 47% do monocromador onde diminui ainda mais a potência de luz incidente sobre a amostra. Mesmo com estes peQuenos detalhes é nos possivel perceber a versatilidade do eQuipamento.

76

deve ser devido às próprias oscilações de intensidade da fonte de luz ut.ilizada. Isto mostra Que os espectros posteriormente obtidos são confiáveis Quanto a localização dos máximos de absorção. Como teste final do eQuipamento comparamos o espectro de hemoglobina-CO à 11% de umidade relativa (UR) obtido com o eauipamento montado

comerei aI (figura

e

Que

eauipamento são bastanta simi lares, tanto na posição das bandas Quanto na forma das

linhas.

infravermelho (figura IV.5) uma cal ibração (figura IV. 7) é posslvel

nas amost.ras a partir do próprio espectro. Este fat.o é de extrema importância no nosso caso, pois a hidratação pode variar durante o manuseio da amost.ra. Se é ut.ilizado o próprio espectro, a Quantidade de água obtida é aquela presente na amostra na hora da medida. Seria interessante, ant.ão, obter uma melhor curva de calibração.

Dos espectros para a hemoglobina na região do vislvel percebemos o efeito da hidratação através da mudança na posição da banda de Soret. A prot.elna preparada com CO e mantida a baixa umidade relativa tem a banda de Soret fim torno de 419

nm, Que é caract.erística deste derivado [4J. No ent.anto, ao se

71

relativa. A banda de Soret nesta posição caracteriza o derivado oxi [4]. Parece, então, Que o oxigênio consegue deslocar o CO do grupo heme.

Abaixo de cerca de 33% podemos perceber Que a proteina permanece com o CO como ligante. Acima de cerca de 33% de umidade relativa temos uma mistura dos derivados oxi e carbonil. Apenas am 93% de UR é Que encontramos um espectro do derivado oxi puro.

o

objetivo já anteriormente citado era de comparar os resultados para a hemoglobina na forma de pó obtidos por espectroscopia convencional, onde a amostra Toi dissolvida em água, com os resultados da mesma protelna mantida na forma de pó obtidos por espectroscopia fotoacústica. Para os dados em Que a amostra foi

cerca de 45% de UR os derivado carbonil [12J. Na

protelna pode real izar a troca entre o CO e O₂, Isto é

importante porQue a função das hemoprotelnas é de servirem como portadores para a molécula de O_2, Portanto podemos concluir Que a funcionalidade da proteína não foi afetada pela desidrata9ão

pelo menos até 33% de UR).

hidratação já havia sido estudada para a lisozima [37,38]. Foi visto Que a baixa umidade relativa a funcionalidade da proteína era comprometida. A explicação dada foi Que a proteína perdia a flexibilidade, Que é essencial para a sua função. No entanto, com o aumento da hidratação a funcionalidade era readiQuirida devido ao restabelecimento da flexibilidade conformacional. Este mesmo efei to de rlgi dez na estrutura deve ser observado para as hemoprotelnas com baixa hidratação. Então, o Que conseguimos com a desidratação é algo como o congelamento da sua estrutura. A desidratação causa, então, o mesmo efeito Que a diminuição de temperatura, isto é, o congelamento de relaxações conformacionais que são essenciais para a atividade da proteina [39,40].

Uma interpretação plauslvel para os dados ob tidos, Quando a prote

1

na é ma n tida a ba ixa um ida de re 1a tiva .

sol ução. PorQue em sol ução não é observado a t.roca do CO por

~ ~

Arg(Lis)45 ':f. His6~

!Vv'< --~: ~

N

~'=~

....

"

O'

P

I

1. tempo de varredura do intervalo espectral maior Que o do espectrometro comercial. Este tempo pode ser melhorado se tivermos um motor de passo mais rápido;

Z. efeitos de flutuações na rede e na fonte Que podem ser corrigidos com estabilizador e um feedback, respectivamente;

3. não interfaceamento com microcomputador onde os dados poderiam ser trabalhados. Por exemplo, fazer diferença espectral, deconvolução de bandas, etc... Isto pode ser solucionado tão logo sejam terminadas as placas de interfacei

4. regi ão espectral 1imi tada ao v islvel . Um novo monocromador Que chega até a região do infravermelho já. está

sendo adiQuirido.

É

nossa intenção, procurar efetuar as sol uções

Os resultados preliminares obtidos na região do infravermelho mostram Que é possivel Quantitar a hidratação da proteína através do próprio espectro. Como foi visto podemos relacionar o conteúdo de água na proteína com a intensidade das bandas 11 e 12- A obtenção de uma boa curva de calibração é um

foram realizados para a região do visível, onde vimos a mudanya

as duas conformações. Portanto, o ligante pode ser trocado quando a estrutura da protelna chega na forma abl!rta. O mesmo

-SE.-R-V-IÇ-O••••.D•..E~B I~B":"'L~IO~·o::"1E~C;::-:'A~E~1

1. Rosencwai9, A.R e v . S e i. I n s t r u m . , 48, (9) 1133-1137 (1977).

2. Rosencwai 9, A., e Gersho ,. A. 1. A . o . o l. P h y s . 47, (1) Ei4-69

(1976).

3. McDonald, F. A., e Wetsel Jr., G. C. J. Appl. P h y s . 49, (4)

2313-2322 (1978).

4. Antonini I E. e Brunori, M. " , L - / e m o g lo b in a n d M ': io g lo b in in their

R e a e t io n s w it h L ig a n d " . NORTH-HOLAND, (1971).

5. Cantor, C. R. 61 Schimmel, P. R. " B io . o h y s ie a l C h e m is t r y P a r t I " . W. H. Freeman and Company (1980).

6. Oi ck erson , R. E. e Ge i5, I. " T h e Struture a n d A e t o in of P r o t e in " W. A. BENJAMIN, INC. (1976).

7. Oi ck erson I R.

e: .

e Ge i 5, I. " , L - / e m o g lo b in : Struture, F u n e t io n , E v o lu t io n , a n d P a t h o lo g y " , W. A. BENJAMI N, I NC . (1983).

8. Kuntz, I. D. e Kauzmann, W. A d v . P r o t e in C h e m . 28, 239-345

(1974).

9. Fi nney, J. L. e Pool e, P. L. C o m m e n t s M o I . C e ll. B io . o h y s . 2 ,

129 (1984).

1 0 . Maricic, S., Pifat., G. e Pravidic, G. B e r ic h e t d e r B u n s e n g e s e lls d r llf t fur . o h y s ik a lis h e C h e m ie (fruher Z e e t s e h r if t fur Elektrochemie)

68,787-793 (1964).

16. Rupley, J. A., Gratton, E. e Careri, G. T r e n d s B io c h e m .

Sei. 8, 18 (1983).

17. Rosencwa i9 I A. " P h o t o a e o u s t i e a n d Photoaeoustie Spectroseop'::r".

JOHN WILEY

&

SONS (1980).

21. Carpentier, R., Hatthijs, H. C. P. I Leblanc, R. H.,

Hind, G. Cano J. P h ': : J s . 64,1136 (1986).

26. Schnei der, H. J. e Schnei der I A. S. J. Membr.Biol. 9,

Monocromator 2a. adição - USA.

29. W. L. de B. MeIo Tese de Dissertação de Hestrado DFCM, IFQSC, USP (1985).

30. PRINCETON APPLIED RE5EARCH Manual LIGHT CHOPPER MODEL 125A:

31. I NTERS I L " C o m p o n e n t Data C a t a lo g " . I NTERS I L, I NC. 1987.

32. HEWLETT - PACKARO - Opera t í ng and Serv í oe Manua I X- Y RECORD 7004B.

35. W. C. MoCabe, S. Subramani an e H. F. F í sher. J. ,ch'is.

C h e m . 74 ,4360 (i 970) .

36. N. Ressler, Zíauddín, C. Vygantas, W. Janzen e K. Karachour lu. A p p lie d SpectroscoPlJ 3 0 ,295 (i 976) .

89

41. Kuriyan, J., Wilz, S., Karplus, H., e Petsko, G. A. J.

42. Brown 111, W. E., Sutcliffe, J. W. e Pulsinelli, P. D.

B i o c h e m i s t r y , Z Z , 2914-2923 (1983).

43. Ringe, D., Petsko, G. A., Kerr, D. E. e de

Montellano, P. R. O. B i o c h e m i s t r y . - Z 3 , 2-4 (1984).

44. Hartin, L. N., Nascimento, O. R., Tabak, M. e

Caracell i, 1. B i o c h i m . B i o p h y s . Acta, 956, 189-196 (1988).

45. Bohm, S. e Abaturov, L. V. FEBS Letters 77, (1) 21-24