Secretaria de Estado da Saúde Coordenadoria de Controle de Doenças
Instituto Adolfo Lutz
Curso de Especialização
Vigilância Laboratorial em Saúde Pública
Rosiane Emanuella Henschel Canella
AUTENTICAÇÃO DA LINHAGEM CELULAR BALB/3T3 CLONE A31, PARA
DEPÓSITO NO ACERVO DO NÚCLEO DE CULTURA DE CÉLULAS DO INSTITUTO ADOLFO LUTZ (NCC-IAL)
SÃO PAULO 2019
Trabalho de conclusão de curso de especialização apresentado ao Instituto Adolfo Lutz- Unidade do Centro de Formação de Recursos Humanos para o SUS/SP-Doutor Antônio Guilherme de Souza como requisito parcial para obtenção do titulo de Especialista em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública
Orientador: Prof.ª Dra. Aurea Silveira Cruz Garçon
AUTENTICAÇÃO DA LINHAGEM CELULAR BALB/3T3 CLONE A31, PARA DEPÓSITO NO ACERVO DO
NÚCLEO DE CULTURA DE CÉLULAS DO INSTITUTO ADOLFO
LUTZ (NCC-IAL)
São Paulo 2019
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pelo Centro de Documentação – Coordenadoria de Controle de Doenças/SES-SP
©reprodução autorizada pelo autor, desde que citada a fonte
Canella, Rosiane Emanuella Henschel
Autenticação da linhagem celular BALB/3T3 CLONE A31, Para Depósito No Acervo do Núcleo de Cultura de Células do Instituto Adolfo Lutz (NCC-IAL)/ Rosiane Emanuella Henschel Canella– São Paulo, 2019.
32 f.
Trabalho de Conclusão de Curso (Especialização-Vigilância Laboratorial em Saúde Pública)-Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, CEFOR/SUS-SP, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, 2019.
Área de concentração: Culturas Celulares e Sua Aplicação em Laboratórios de Saúde Pública
Orientação: Prof. Dra. Aurea Silveira Cruz Garçon 1-Linhagem celular, 2-Isoenzimas, 3- células 3T3 BALB.
Dedico este trabalho a todos que desejam ter força, mas por motivos que somente de quem carrega um quadro de ansiedade sabe como é difícil chegar até aqui.
Agradecimentos
Agradeço a Deus pela oportunidade da vida e tudo que tem me proporcionado até hoje!
À minha família, que me apoia em minhas realizações pessoais e profissionais sem me julgar e pelo ensinamento diário de que cada um pode fazer a diferença nos pequenos atos, o respeito mútuo, a importância da vida em sociedade, bem como cada um do grupo como parte fundamental sem diferenças. A tratar a todos de maneira amorosa mesmo que o outro não lhe traga atribuição alguma.
Agradeço com muito apreço pela dedicação, paciência e presteza de todos do Instituto Adolfo Lutz que me ajudaram a chegar até a conclusão do curso, em
especial ao Núcleo de Cultura de Células composto por pessoas maravilhosas e super competentes: Dra. Aurea Silveira Cruz Garçon, Ana Cristina Scarparo de Miranda, Tamiko Ichikawa Ikeda, Márcia Cristina Toledo Silva, Rezolina Pereira dos Santos e Miriam dos Santos Alves Marques.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fotomicrografias da monocamada celular da linhagem Balb/3T3 clone
A31, com 80% de confluência e aparência fibroblástica, após 48 horas de cultivo...23
Figura 2 - Gel de eletroforese para as enzimas a. G6PD, b. LDH e c. MDH das
linhagens NCTC clone 929 (1), HeLa (2) e Balb/3T3 clone A31 (3) 1x107 e Balb/3T3 clone A31 (4) 3x107 células...24
Figura 3 - Distribuição da frequência cromossômica em 50 metáfases da linhagem
Balb/3T3 clone A31...25
Figura 4 - Fotomicrografia do cariótipo da linhagem Balb/3T3 clone A31, contendo
metáfase com 68 cromossomos e seus respectivos marcadores. Aumento de 1000X...25
Figura 5 - Cinética de crescimento da linhagem Balb/3T3 clone A31, com a média
do número de células obtidas nos cinco dias de
contagem...26
Figura 6 - Controle de contaminação por micoplasma pela coloração de HOECHST.
a. Células indicadoras - controle negativo; b. Células indicadoras inoculadas com meio contendo micoplasmas - controle positivo; c. Células indicadoras inoculadas com meio de cultura da linhagem celular Balb/3T3 clone A31. Aumento de 400 X...27
LISTA DE TABELAS
LISTA DE SIGLAS
ATCC American Type Culture Collection
ATV Associação Tripsina + Versene
CO2 Dióxido de Carbono
BALB/3T3 clone A31 Linhagem celular de camundongo tipo fibroblástica
DMEM Meio de Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen
ECACC European Collection of Authenticated Cell Cultures
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
G6PD Glicose-6-Fosfato Desidrogenase
HeLa Linhagem celular originária de adenocarcinoma
humano
HLA Antígeno Leucocitário Humano
ICLAC International Cell Line Authentication Committee
JCRB Japanese Collection of Research Bioresources Cell
Bank
LDH Lactato Desidrogenase
MDH Malato Desidrogenase
NCC - IAL Núcleo de Cultura de Células do Instituto Adolfo Lutz
NCTC clone 929 Linhagem celular de camundongo do tipo epitelial
OECD Organisation for Economic Co-operation and
PBS Phosphate Buffered Saline
PES Plano Estadual de Saúde
RIKEN The Institute of Physical and Chemical Research - Cell Bank BioResource Center
RPM Rotações por Minuto
SFB Soro Fetal Bovino
SV40 Sarcoma Vírus 40
STR Short Tandem Repeat
VERO Linhagem celular de rim de primata - macaco verde
africano
WFCC World Federation for Culture Collection
β-NADP Fosfato de Dinucleotídeo de Adenina e
RESUMO
O cultivo de linhagens celulares passou a ser uma valiosa ferramenta como método alternativo ao uso de animais em experimentos. Devido ao custo reduzido em relação a manutenção de biotérios, a demanda pelo uso das culturas de células, como instrumento em pesquisas, diagnósticos, produção de fármacos e vacinas, tem aumentado consideravelmente. Neste estudo houve a realização de testes com a linhagem Balb/3T3 clone A31 para confirmação da espécie de origem, descartar presença de contaminações, tanto cruzada quanto por micro-organismos para depósito na coleção do Núcleo de Culturas de Células (NCC). Desta maneira, foi realizada a cinética de crescimento, que visou avaliar o comportamento da linhagem in vitro, identificando o momento que a população celular quadruplicou em relação ao número inicial semeado, até o período que entra em estado de latência, tendendo a senescência. O teste de isoenzimas serviu tanto para confirmar a espécie de origem murina, quanto descartar uma contaminação cruzada, com outras linhagens. O cariótipo apresentou resultados semelhantes aos relatados na literatura e a coloração por Hoechst para controle de contaminação por micoplasma revelou resultado negativo. Todos estes achados possibilitaram a autenticação e o depósito da linhagem no NCC do Instituto Adolfo Lutz, que possui uma coleção reconhecida mundialmente e as linhagens nela depositada são fornecidas, com qualidade a diferentes laboratórios de Saúde Pública, para fins de pesquisa e diagnóstico.
ABSTRACT
The cultivation of cell lines became a valuable tool as an alternative method to the use of animals in experiments. Due to the reduced cost of maintaining vivarium, the demand for the use of cell cultures as an instrument in research, diagnosis, production of drugs and vaccines has increased considerably. In this study, we carried out tests with the Balb / 3T3 clone A31 line to confirm the species of origin, to discard the presence of cross-contamination and microorganisms for deposit in the collection of the Cell Cultures Nucleus (NCC). In this way, growth kinetics were used to evaluate the behavior of the lineage in vitro, identifying the moment that the cell population quadrupled in relation to the initial number sown, until the period that enters a latency state, tending to senescence. The isoenzyme test served both to confirm the species of murine origin and to rule out cross-contamination with other strains. The karyotype presented results similar to those reported in the literature and Hoechst staining to control mycoplasma contamination revealed a negative result. All these findings made possible the authentication and deposit of the lineage in the NCC of the Adolfo Lutz Institute, which has a worldwide recognized collection and the lines deposited in it are supplied, with quality to different public health laboratories, for research and diagnostic purposes.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 13
2. OBJETIVOS ... 14
2.1 Objetivos específicos...14
3. REFERENCIAL TEÓRICO ... 14
3.1 Cultura celular in vitro...14
3.2 A importância da cultura celular na pesquisa...15
3.3 Metodologias empregadas na autenticação e depósito de linhagens celulares...16
3.4 Histórico da linhagem Balb/3T3 clone A31 para depósito no Núcleo de Culturas Celulares-IAL...17
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 17
4.1 Manutenção da linhagem celular...17
4.2 Eletroforese de isoenzimas...18
4.3 Cariótipo... 20
4.4 Cinética de crescimento...21
4.5 Controle de contaminação por micoplasma pela coloração de Hoechst...22
5. RESULTADOS ... 23
5.1 Morfologia das células...23
5.2 Eletroforese de isoenzimas...24
5.3 Cariótipo...24
5.4 Cinética de crescimento...26
5.5 Controle de contaminação por micoplasma pela coloração de Hoechst...26
6. DISCUSSÃO ... 27
7. CONCLUSÃO... 29
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1. INTRODUÇÃO
Com o avanço da biotecnologia nas diversas áreas das ciências, tornou-se possível o desenvolvimento de técnicas que servem como alternativa para realização de ensaios in vitro.
Os testes desenvolvidos com linhagens celulares passaram a ser de grande importância, pois possibilitaram seu uso na observação de dinâmicas de metabolismo celular, neoplasias, diferenciação e interação, clonagem entre outros. (MONTEIRO et al., 2011).
Com a verificação da viabilidade celular, após o processo de congelamento, vislumbrou-se a possibilidade de montar um acervo de linhagens celulares, tanto humanas quanto animais para serem utilizadas em pesquisa e diagnóstico.
Porém, após seu uso contínuo e a padronização de ensaios de controle, percebeu-se que estas apresentavam problemas de contaminações, tanto por micro-organismos, como contaminações cruzadas entre linhagens celulares diferentes. Ainda, apresentavam identificação errada. (ICLAC, 2019).
Diante disso, foram criadas normas para o depósito de linhagens, nos bancos de recursos biológicos e desta maneira, toda linhagem celular no momento do depósito deve passar por testes que confirmem suas características, a espécie de origem e a presença de possíveis contaminações. (ECACC, 2019). Após o depósito, estes controles continuam como um monitoramento para que as linhagens fornecidas tenham um certificado de autenticidade, o que garante a confiabilidade dos resultados obtidos nos estudos realizados. (ATCC, 1992).
O Núcleo de Cultura de Células do Instituto Adolfo Lutz (NCC-IAL) possui uma coleção de linhagens celulares, que são fornecidas tanto para pesquisa quanto para fins de diagnóstico. Esta coleção segue as mesmas normas estabelecidas pelos principais biorrepositórios, como o ATCC (American Type Culture Collection) e ECACC (European Collection of Authenticated Cell Cultures), sendo reconhecida internacionalmente e cadastrada na WFCC (World Federation for Culture Collection).
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2. OBJETIVOS
Em concordância com o Plano Estadual de Saúde (PES) 2016-2019: Eixo III – vigilância em saúde.
Diretriz do PES:
9 – Fortalecer a rede laboratorial de saúde pública.
Objetivo do PES:
Desenvolver pesquisas técnico- científicas para a melhoria da qualidade diagnóstica e análise de produtos de interesse da saúde pública.
2.1 Objetivos específicos
O objetivo deste estudo é acompanhar os procedimentos de incorporação da linhagem celular Balb/3T3 clone A31 ao acervo do Núcleo de Cultura de Células do Instituto Adolfo Lutz (NCC-IAL), observando e analisando as características da linhagem, quanto a sua cinética de crescimento, morfologia, cariótipo, padrão de bandas em eletroforese de isoenzimas e ausência de contaminação por micro-organismos. Desta forma, o NCC poderá fornecer uma linhagem celular autenticada para ser utilizada, tanto no diagnóstico como na pesquisa, nas mais diversas áreas.
3. REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 Cultura celular in vitro
É o termo utilizado para designar a forma como as células se desenvolvem in vitro, fora das condições e arquitetura do tecido de origem. Esta técnica deve ser realizada de acordo com as boas praticas de laboratório para garantir o sucesso, quando utilizada para diagnósticos e pesquisa na virologia e em outras áreas.
As células podem ser cultivadas a partir de um explante, no qual o fragmento do tecido é usado para iniciar a cultura. Também, este tecido ou linhagens já estabelecidas podem ter suas células individualizadas com enzimas proteolíticas e agentes quelantes, para em seguida serem plaqueadas em frascos de vidro ou plástico. Além de crescerem ancoradas em um substrato, podem crescer em suspensão, na qual as células se multiplicam em um meio fluido, possibilitando a
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obtenção de grandes concentrações celulares, que podem ser utilizadas no preparo de antígenos virais e na produção de vacinas. (LENNETTE; SCHMIT, 1979).
Os estudos com cultura celular foram iniciados por Wilhelm Roux em 1885, com o isolamento da placa neural de um embrião de galinha que foi mantido em uma solução salina aquecida. Com esse feito conseguiu provar que a ação do fechamento do tubo neural é intrínseca destas células e não devido à pressão mecânica das estruturas adjacentes. (PARKER, 1961).
A cultura celular primária foi conceituada como aquela que tem suas células obtidas diretamente do tecido humano ou animal. E as que sofreram imortalização, através de transformações adaptativas e passaram a se multiplicar indefinidamente são conhecidas como culturas ou linhagens contínuas. De modo que, estas são as mais utilizadas nas pesquisas e experimentos por possibilitarem maior reprodutibilidade e poucas variações nos resultados. (HAYFLICK; MOORHEAD, 1961).
Em meados do século XX, a primeira linhagem contínua de células humana foi estabelecida a partir de uma biópsia de uma jovem paciente de 31 anos, chamada Henrietta Lacks, com diagnóstico de adenocarcinoma cervical severo e após a sua morte, observou-se a velocidade da evolução deste tipo de neoplasia em sua autópsia. (LUCEY; NELSON-REES; HUTCHINS, 2009).
3.2 A importância da cultura celular na pesquisa
O uso de culturas celulares passou a ser visado como método alternativo ao uso de animais em experimentos laboratoriais, desde a elaboração do princípio dos 3R’s desenvolvido por Russel e Burch em 1959, que se baseia no Refinement, Replacement e Reduction. Sendo que, o refinamento trata-se da redução do grau de dor ou sofrimento nos animais, a substituição e a redução tratam-se respectivamente, da eliminação ou diminuição do numero de animais em experimentos. (FLECKNELL, 2002).
Atualmente seu uso é imprescindível na produção de vacinas e anticorpos, na avaliação das dinâmicas de produtos farmacológicos, na avaliação metabólica de produtos bioquímicos, entre outras aplicações. (FRESHNEY, 2005).
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3.3 Metodologias empregadas na autenticação e depósito de linhagens celulares
A qualidade da linhagem celular é fundamental para que a pesquisa ou trabalho tenha resultados satisfatórios. Assim, são necessário que sejam realizados testes periódicos que garantam que esta linhagem seja corretamente identificada e que seja livre de contaminações cruzadas ou por micro-organismos.
Dentre as recomendações para assegurar a qualidade, está a obtenção das matrizes originais das linhagens celulares, a partir de fontes confiáveis, como nos principais biorrepositórios: American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank (JCRB), Institute of Physical and Chemical Research - Cell Bank BioResource Center-RIKEN e European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC).
Estes biorrepositórios mantêm bancos de células autenticadas de acordo com os parâmetros exigidos e também realizam o monitoramento periódico das linhagens celulares em cultura, prezando sempre pelas boas práticas de laboratório.
As técnicas utilizadas para identificação de espécies servem também, para a detecção de contaminações cruzadas, dentre elas: a análise de isoenzimas, estudo cromossômico através da cariotipagem, técnicas de genotipagem de DNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e de perfis de Short Tandem Repeat (STR), obtida através de um PCR multiplex. (PERKEL, 2011).
A análise de isoenzimas é uma ferramenta para monitorar a autenticidade de linhagens e possíveis contaminações cruzadas, que consistem na separação de enzimas presente nas espécies, porém sua forma varia entre estas, que quando expostas a eletroforese apresentam padrões de corrida diferentes entre as espécies. (MACHADO; MIRANDA; CRUZ, 2016).
O método de cariotipagem é um teste simples que pode revelar alterações, tanto numéricas como estruturais nos cromossomos das linhagens celulares e essas podem representar as transformações que a linhagem sofre depois de várias passagens. (GERAGHTY, 2014).
Os testes para avaliar contaminações por micro-organismos, como fungos, bactérias e micoplasma são muito importantes na rotina, durante a manutenção de
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linhagens celulares, bem como no momento do depósito nas coleções. Estes testes podem ser por semeadura em meios de cultura específicos, tanto para fungos quanto bactérias. No caso para detecção de micoplasma podem ser utilizados métodos de cultura, coloração e moleculares. (ATCC, 1992).
3.4 Histórico da linhagem Balb/3T3 clone A31 para depósito no Núcleo de Culturas Celulares-IAL
A linhagem Balb/3T3 clone A31 foi estabelecida a partir da linhagem Balb/3T3, oriunda de um macerado do embrião de camundongo tipo Balb/c, com idade entre 14 a 17 dias. Seu isolamento foi ao acaso, quando os pesquisadores mantinham a linhagem Balb/3T3 para estudos de susceptibilidade ao sarcoma vírus (SV-40). (AARONSON; TODARO, 1968).
A expressão 3T3 trata de um protocolo, o qual estabelece que a cada três dias seja realizada a transferência de um inoculo de 3 x 105 células para placas de 60 mm . Este protocolo tem o objetivo de evitar, que as linhagens de origem murina nas primeiras passagens, sofram transformações e perca a inibição de contato, fato muito comum em linhagens celulares desta espécie animal. (PAUL, 1975).
Quando esta linhagem é mantida até altas passagens e com mais de 80% de confluência, ela tende a sofrer transformações e perde a inibição de contato (GREEN; TODARO, 1963), passando a apresentar células com formatos diferentes, ou seja, tipo “cobblestone”, semelhante a células epiteliais. (ATCC, 2019).
Atualmente, a linhagem Balb/ 3T3 clone A31 tem sido utilizada em testes de citotoxicidade in vitro, padronizados de acordo com o protocolo número GD 129 da OECD (Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico). (OECD, 2010).
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Manutenção da linhagem celular
A linhagem celular Balb/3T3 clone A31 (CCIAL 089) foi mantida em garrafas de 25 cm² (Corning®), com Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), com
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alta concentração de glicose (4,5 mg/ L) e 10% de Soro Fetal Bovino (SFB). Estas garrafas foram incubadas em estufa a 37ºC, com atmosfera de 5% CO2 (Forma
Scientifica 3158) e repicadas a cada três dias, usando ATV (Associação de Tripsina 0,2% e Versene 0,02%) em solução salina balanceada sem cálcio e magnésio, na ausência de antibióticos. Toda a manipulação da linhagem foi realizada em câmara asséptica com procedimentos baseados em boas práticas em culturas celulares.
4.2 Eletroforese de isoenzimas
O teste de eletroforese foi realizado em cuba horizontal LCV 7x8 (Loccus Biotecnologia, Cotia, SP, Brasil), para as isoenzimas G6PD (Glicose-6-Fosfato Desidrogenase), LDH (Lactato Desidrogenase) e MDH (Malato Desidrogenase).
Nesse ensaio o padrão de migração das enzimas da linhagem celular testada, foi comparado com o das linhagens de origens humana (HeLa) e murina (NCTC clone 929), que são consideradas controle e padrão, respectivamente. (ATCC, 1992).
Para este procedimento foi preparado o extrato da linhagem celular Balb/3T3 clone A31 a partir de garrafas de cultura com a monocamada confluente, que teve suas células tripsinizadas com ATV e ressuspendidas em 10 mL de meio de cultura e desta suspensão uma alíquota de 0,5 mL foi adicionada a 1,5 mL de violeta genciana 0,1% em ácido cítrico 0,1M para a contagem das células em um hemocitômetro (retículo de Neubauer).
O restante da suspensão foi centrifugado a 150 x g por 5 minutos a 8 °C, na centrifuga (Hettich 320R). O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em 5 mL de PBS (Phosphate Buffered Saline) gelado e novamente centrifugado, depois a etapa foi repetida com 2 mL de PBS gelado e por último o sedimento foi ressuspendido em volume necessário de tampão de extração (Triton X-100 2% em Tris 50 mM e EDTA 1 mM, pH 7,5), para uma concentração final de 1 X 107 células ou 3 X 107 células, de acordo com o número de células obtidas na contagem realizada anteriormente. A suspensão ficou em banho de gelo por 15 minutos, para que ocorresse a lise celular. No final, esta suspensão foi centrifugada a 1900 x g por 5 minutos a 8° C e o sobrenadante armazenado a – 80 °C.
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Para a eletroforese, foi preparado o gel de agarose 2% (BioBasic®, Ontario, Canada) em solução de Tris 0,375 M (Sigma-Aldrich®, St. Louis, USA) pH 8,8 e após 30 minutos, o gel foi colocado na cuba com o tampão de corrida gelado Tris 25 mM/ glicina 0,19 M (Sigma-Aldrich®, St. Louis, USA), pH 8,3. Os extratos celulares com azul de bromofenol 0,06 %/ glicerol 10%, na proporção 3:1 foram aplicados no gel. A corrida de eletroforese foi realizada a uma corrente de 100 V a 4 °C por 90, 120 e 180 minutos, para as enzimas G6PD, LDH e MDH, respectivamente. Somente para a enzima G6PD foi acrescentado 1 mL do cofator β-NADP (10 mg/ mL Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) na solução de corrida.
Ao final foi feita a revelação das bandas com a solução contendo os cofatores e substratos específicos para cada enzima, 10 a 20 minutos em estufa a 37 °C, como mostra a tabela 1. As distâncias entre as bandas foram medidas a partir do meio dos poços até meio da banda obtida.
TABELA 1 Enzimas e seus cofatores com seus respectivos volumes Cofatores\E nzimas (vol. 15 mL) G6PD LDH MDH H2O Milli-Q 9 mL 10,5 mL 10,5 mL Glicose-6-fosfato 0,025M 1,5 mL Lactato de Na 1 M 1,5 mL Ácido Málico 10 mg/mL 1,5 mL Tris 0,5 M pH 7,5 1,5 mL 1,5 mL Tris 0,5 M pH 7,1 1,5 mL
20 MgCl2.6H2O 0,1 M 1,5 mL NADP 0,005 M 1,5 mL NAD 2,5 mg/mL 1,5 mL NAD 10 mg/mL 1,5 mL MTT 0,0015 g 0,0015 g 0,0015 g PMS 0,0006 g 0,0006 g 0,00045 g Fonte: NCC-IAL, 2018. 4.3 Cariótipo
Uma garrafa da linhagem Balb/3T3 clone A31 na passagem 110 foi repicada e usada quando completou 72 horas, tempo necessário para apresentar alto índice de mitoses. Após este período, retirou-se 2,5 mL do meio de crescimento da garrafa e adicionou-se 2,5 mL da solução de colchicina 0,16 µg/ mL, que depois de colocada em uma proporção de 1:1, sua concentração final passou a ser 0,08 µg/ mL. Em seguida, a garrafa foi mantida em estufa por um período de 5 horas, seu conteúdo (meio + colchicina) foi coletado em um tubo cônico e reservado. Em seguida, a monocamada de células foi lavada com 1,5 mL de ATV, o qual foi coletado e adicionado ao mesmo tubo cônico. Outro volume de 1,5 mL de ATV foi colocado na garrafa, permanecendo em contato com as células até a abertura da monocamada. Feito isso, o ATV foi depositado junto ao volume contido no tubo e realizado o desprendimento das células, sendo que para a ressuspensão destas, coletou-se 3,0 mL do volume do tubo cônico, que foi novamente depositado no mesmo tubo ao final desta etapa. Este tubo foi centrifugado por 5 minutos a 1000 rpm, desprezando-se o sobrenadante. Ao sedimento foram adicionados 2,5 mL de cloreto de potássio 0,075 M e deixado em contato por 5 minutos, depois se acrescentou 1,5 mL de citrato de
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sódio 1%, permanecendo por mais 5 minutos em contato. Após foi adicionado 1 mL do fixador de Carnoy (metanol + ácido acético glacial, proporção 3:1) e todo este material foi ressuspendido e adicionado mais 3 mL de fixador, que foi novamente ressuspendido e centrifugado por 5 minutos a 1000 rpm. O sobrenadante foi descartado e novamente adicionado 4 mL de fixador e a suspensão mantida em geladeira por 1 hora a 4 °C.
Após esse período, a suspensão foi centrifugada e o volume de 1 mL de fixador foi adicionado ao sedimento para ressuspensão, de modo que essa etapa foi repetida por mais 2 vezes. Depois de feito esse processo, adicionou-se um volume entre 0,5 a 1,0 mL de fixador com uma pipeta Pasteur, com a qual o sedimento foi ressuspendido. As lâminas que foram previamente mantidas em água destilada na geladeira foram apoiadas em bastões de vidro e o excesso de água retirado e com auxílio da pipeta Pasteur a suspensão celular foi homogeneizada, pingando-se 3 a 4 gotas em cada lâmina, obedecendo a uma altura de +/- 30 cm na deposição do material. Estas foram fixadas em bico de Bünsen e depois ficaram apoiadas nos bastões para secagem total, seguindo para coloração com Giemsa 0,5% por 2 minutos, depois de secas puderam ser observadas ao microscópio (Nikon Eclipse-80i) no aumento de 1000 X.
4.4 Cinética de crescimento
Para este procedimento foi necessário repicar uma garrafa da linhagem celular Balb/3T3 clone A31 na passagem 113 e realizar a contagem das células para a formulação da suspensão celular que compõe o preparo das microplacas da cinética de crescimento contendo a concentração desejada de 8 x 10³ células/ poço. A solução com volume de 10 mL foi feita com meio de cultura DMEM com 10% soro, e suspensão celular, que foi usada no preparo de 20 poços, correspondente a 5 placas com 4 poços cada, e mantidas em estufa a 37 °C com CO2. Feito isso, as
placas foram analisadas nos períodos de 24, 48, 72, 96 e 168 horas, após o plaqueamento. Na etapa de contagem, que foi realizada diariamente, a placa escolhida foi virada sobre uma almofada, previamente preparada para a secagem do meio presente, em seguida foi adicionado o ATV (Associação de tripsina 0,2% e versene 0,02%) para liberar as células da monocamada aderida à placa e para
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ajudar na tripsinização a placa foi mantida em estufa a 37 °C por 15 minutos. Depois de retirada da estufa, a essa foi adicionado meio de cultura (0,5 mL) para inativar a ação do ATV, ressuspendido e coletado 0,5 mL da suspensão celular e adicionado em um tubo preparado com 1,5 mL de corante violeta genciana 0,1% em ácido cítrico 0,1 M, foi coletada uma amostra com um capilar de vidro e distribuída no hemocitômetro (retículo de Neubauer). Com os valores obtidos em cada poço foi calculada a média do número de células para cada período. Ao final, todos os valores foram plotados em um gráfico para construção da curva de crescimento.
4.5 Controle de contaminação por micoplasma pela coloração de Hoechst
Foi preparada uma suspensão celular com as células Vero, usadas como indicadoras da presença ou ausência de contaminação, as quais foram semeadas em microplacas com lamínulas e incubadas em estufa a 37 °C, com atmosfera de 5% de CO2. Após 24 horas, os poços foram inoculados com 100 µL do meio de
cultura das garrafas a serem testadas, Balb/3T3 clone A31 e Balb/3T3 clone A31, sabidamente contaminada por micoplasma, como controle positivo. Como controle negativo foram utilizados poços inoculados apenas com as células indicadoras. As placas ficaram em estufa a 37 °C, com atmosfera de 5% de CO2, sem mexer por 2
dias, tempo de incubação previamente testado, para que as células não atingissem uma alta confluência, evitando a sobreposição de células, o que pode dificultar a visualização dos resultados no final do teste.
Após o período de incubação foi adicionado 0,5 mL de fixador de Carnoy (metanol + ácido acético glacial, na proporção 3:1), em cada poço e deixado agir por 2 minutos. Esta solução foi retirada, acrescentado mais 0,5 mL de fixador, que permaneceu agindo por 5 minutos, repetindo esta etapa por mais uma vez. Em seguida, todo o volume de fixador foi retirado, as lamínulas ficaram secando por 5 minutos e após foram cobertas com a solução de Hoechst 33258 (bisbenzimida H 33258, Sigma) 0,5 µg/ mL por 30 minutos, protegido da luz. Após esse tempo, as lamínulas foram lavadas 2 vezes com água destilada e colocadas em lâminas previamente limpas com uma gota de solução de montagem [5 mL de tampão McIlvaine pH 7,0 + 5,0 mL de glicerol (Reagen)] para cada lamínula. As lâminas
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foram observadas no microscópio de fluorescência (Nikon- D-FL EPI- Fluorescence Attachment) com filtro para DAPI/Hoechst no aumento de 400 X ou 1000 X.
5. RESULTADOS
5.1 Morfologia das células
A linhagem celular Balb/3T3 clone A31 ao longo da execução deste trabalho apresentou morfologia tipo-fibroblástica, como mostra a figura 1.a. Esta mesma morfologia foi observada nos registros encontrados na literatura conforme figura 1.b. (ATCC, 2019).
Fonte: NCC-IAL, 2018. Fonte: ATCC.
Figura 1- Fotomicrografias da monocamada celular da linhagem Balb/3T3 clone
A31, com aproximadamente 80% de confluência (a) e aparência tipo-fibroblástica conforme na literatura (b). Aumento de 100 X
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5.2 Eletroforese de isoenzimas
Na figura 2 podemos observar o número de bandas e suas posições nos géis de eletroforese para as enzimas analisadas, nas linhagens padrão (NCTC clone 929), controle (HeLa) e na linhagem Balb/3T3 clone A31.
Nas enzimas G6PD e MDH foi observada somente uma banda para cada linhagem. Na enzima LDH foram observados 3 bandas para a linhagem NCTC clone 929, 5 bandas para a linhagem HeLa e 5 bandas para a linhagem Balb/3T3 clone A31, quando foi utilizado o extrato mais concentrado (3 X 107 células).
Fonte: NCC, 2018.
Figura 2 - Gel de eletroforese para as enzimas a. G6PD, b. LDH e c. MDH das
linhagens NCTC clone 929 (1), HeLa (2) e Balb/3T3 clone A31 (3) 1x107 células e Balb/3T3 clone A31 (4) 3x107 células
5.3 Cariótipo
Das 72 metáfases fotografadas foram escolhidas 50, que apresentavam melhor visualização dos cromossomos para a contagem. Nestas metáfases foi observada uma variação de 56 a 136 cromossomos, com um número modal de 68 a 69 cromossomos, conforme mostrado na figura 3. Na figura 4 pode ser observada uma das metáfases escolhidas para análise da linhagem Balb/3T3 clone A31, com 68 cromossomos.
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3
25
Fonte: NCC-IAL, 2018.
Figura 3 - Distribuição da frequência cromossômica em 50 metáfases da linhagem
Balb/3T3 clone A31
Fonte: NCC, 2018.
Figura 4 - Fotomicrografia do cariótipo da linhagem Balb/3T3 clone A31, contendo
metáfase com 68 cromossomos e seus respectivos marcadores. Aumento de 1000 X
0 1 2 3 4 5 6 56 58 60 61 64 65 66 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 124 125 127 131 133 N º d e c é lu las Nº de cromossomos
Distribuição cromossômica
Número modal Cromossomos metacêntricos26
5.4 Cinética de crescimento
Na cinética de crescimento pode ser observado que o número de células semeadas inicialmente, praticamente quadruplicou após 24 horas. Nos intervalos seguintes, a taxa de crescimento exponencial diminui, mas não foi verificada uma fase estacionária ao final do período de análise.
Fonte: NCC, 2018.
Figura 5- Cinética de crescimento da linhagem Balb/3T3 clone A31, com a média do
número de células obtidas nos cinco dias de contagem
5.5 Controle de contaminação por micoplasma pela coloração de Hoechst
Como pode ser observado na Figura 6(a), o controle negativo apresenta marcação fluorescente apenas nos núcleos das células Vero, usadas como indicadoras. O controle positivo Figura 6(b) apresentou marcação fluorescente por toda a lamínula, além dos núcleos das células Vero. Na linhagem Balb/3T3 clone A31, não se observou marcação fluorescente entre os núcleos, como no controle negativo, confirmando a ausência de contaminação por micoplasma na Figura 6(c).
0 50 100 150 200 250 300 0 24 48 72 96 120 144 168 n ° d e cé lu la s x 10 3 cé lu la s/ m L horas de crescimento Cinética de crescimento
27
Fonte: NCC, 2018.
Figura 6 - Controle de contaminação por micoplasma pela coloração de Hoechst. a.
Células indicadoras - controle negativo; b. Células indicadoras inoculadas com meio contendo micoplasma - controle positivo; c. Células indicadoras inoculadas com meio de cultura da linhagem celular Balb/3T3 clone A31. Aumento de 400 X
6. DISCUSSÃO
O Núcleo de Cultura de Células do Instituto Adolfo Lutz possui uma coleção de linhagens celulares autenticadas de origem humana e animal, que são usadas no diagnóstico ou na pesquisa, por diversos laboratórios de todo o país. Assim é de extrema importância a manutenção da qualidade destas linhagens para garantia dos resultados, principalmente com relação à comprovação da espécie e da ausência de contaminantes.
A linhagem celular Balb/3T3 clone A31 foi depositada recentemente no acervo, para ser utilizada em estudos de toxicidade in vitro, na padronização de metodologias alternativas aos ensaios em animais de laboratório. Desta forma é essencial que esta seja avaliada, quanto as suas principais características no processo de depósito, objetivo deste estudo.
No depósito da linhagem houve a necessidade de confirmação da espécie de sua origem, que foi realizado por eletroforese, analisando o padrão de corrida das bandas das isoenzimas G6PD, MDH e LDH, em comparação com as linhagens padrão e controle. Neste ensaio pudemos verificar que a linhagem Balb/3T3 clone A31 é de origem murina, assim como a linhagem NCTC clone 929, pois ambas apresentaram o mesmo padrão de migração e o mesmo número de bandas nas 3 isoenzimas, com exceção da LDH, que apresentou 2 bandas a mais, quando foi usado o extrato mais concentrado. Estes dados são esperados para esta enzima, pois é citado na literatura que existem diferenças no número de bandas entre diferentes tecidos da mesma espécie. (ATCC, 1992).
28
Na tentativa de confirmar a espécie de origem, também foi realizado o estudo do cariótipo desta linhagem. Os resultados obtidos neste estudo, quando comparados ao do ATCC (1994), apresentaram divergência com relação ao número modal de cromossomos. O ATCC encontrou 17 metáfases com 78 cromossomos e neste estudo foram encontradas 10 metáfases com 68-69 cromossomos, esta diferença pode estar relacionada com o tempo de cultivo, pois nesta avaliação a linhagem foi utilizada em uma passagem bem mais alta, o que pode ter ocasionado esta alteração.
Ainda, a literatura cita que o cariótipo desta linhagem apresenta principalmente cromossomos acrocêntricos e telocêntricos, além de um ou dois metacêntricos, que podem ser considerados como cromossomos marcadores da espécie (AARONSON; TODARO, 1968). Estes dados também foram confirmados nos resultados deste estudo.
Com relação à avaliação do crescimento da linhagem celular Balb/3T3 clone A31, não ficou evidente a existência de uma fase LAG, conhecida como repouso, comumente encontrada após o repique das linhagens. Estas células cresceram muito nas primeiras 24 horas, como cita a referência sobre o isolamento da linhagem (AARONSON; TODARO, 1968). Nos intervalos seguintes, continuou crescendo, mas em uma velocidade menor, sem ser observado a presença de uma fase estacionária no período analisado.
Outro fator importante na autenticação de linhagens celulares é verificar a ausência de contaminação microbiológica, especialmente por micoplasma, um dos agentes mais comuns em culturas celulares. Esta linhagem já havia sido testada previamente por PCR em tempo real, apresentando resultado negativo.
Para confirmar esta ausência foi realizada neste estudo, a coloração fluorescente por Hoechst, que é uma técnica amplamente utilizada nas coleções de cultura e indicada como ensaio complementar, no controle de qualidade das linhagens celulares, devido sua simplicidade, baixo custo e rapidez (ATCC, 1992). Nossos resultados comprovaram que esta linhagem está livre de micoplasma.
29
7. CONCLUSÃO
A linhagem celular Balb/3T3 clone A31 é de origem murina, não apresenta contaminação cruzada com outras linhagens, nem por micoplasma e outros micro-organismos. Assim, pode ser confirmado seu depósito no acervo do Núcleo de Cultura de Células do IAL, que possui uma coleção reconhecida mundialmente e as linhagens nela depositada são fornecidas, com qualidade a diferentes laboratórios de Saúde Pública, para fins de pesquisa e diagnóstico. Ainda, esta linhagem pode ser usada com segurança durante a padronização do teste de citotoxicidade in vitro, de acordo com o protocolo da OECD GD 129.
Na coleção do NCC-IAL esta linhagem recebeu o número de acesso CCIAL 089.
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